TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.

HCM
KHOA ĐÀO TẠO ĐẶC BIỆT - NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

BUỔI 2 - TÁCH CHIẾT DNA VÀ ĐẶT PHẢN ỨNG PCR
Môn: Trị liệu bệnh ở người
GVHD: TS. Lê Thị Trúc Linh

Nhóm 1:
• Võ Lê Thanh Thúy - 1953010099
• Trần Trương Lam Ngọc - 1953012056
• Lê Trần Hà Thư - 1953012104
 NỘI DUNG THỰC HÀNH
Bài 2. Tách chiết DNA và đặt phản ứng PCR
2.1. VẶT LIỆU
2.2. TÁCH CHIẾT DNA
a. Nguyên tắc
b. Thiết bị và hóa chất
c. Thực hiện
2.3. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DNA THU NHẬN
a. Nguyên tắc
b. Thiết bị và hóa chất
c. Thực hiện
d. Kết quả đo OD ở bước sóng 260nm
2.4. PHẢN ỨNG PCR
• Chuẩn bị
• Thực hiện
• Chu kỳ PCR
• Kết quả điện di sản phẩm PCR
 NỘI DUNG
2.1. Vật liệu
Tế bào SW1353
2.2. Tách chiết DNA
a. Nguyên tắc:
Sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA. Trong đó, màng tế
bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh. Sau đó protein sẽ được biến tính
bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ. DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh.
b. Thiết bị và hóa chất
1 Phenol Merck
2 Chloroform Merck
3 SDS 10%
4 NaCl 5M
5 Tris HCl 1M (pH=8)
6 EDTA 0.5M (pH=8)
7 NH4OAc 5M
8 Ethanol 100% Việt Á
9 Ethanol 70% Việt Á
10 Proteinase K Fermentas
11 Máy ly tâm lạnh Hettich

c. Thực hiện
• Lắc mạnh, hút 200ul protein (SW1353) vào eppendorf (epp 1.5ml).
• Hút 2ul proteinase K cho vào epp.
• Vortex mạnh, ủ 56°C trong 1h.
• Thêm 200ul phenol:chloroform isopropanol (tỉ lệ 1:1), lắc đều.
• Ly tâm 13000 rpm trong 10 phút ở 4°C.
 • Hút 100ul dịch nổi sau ly tâm chuyển sang epp mới.
• Thêm 100ul chloroform vào epp.
• Ly tâm 13000 rpm trong 10 phút ở 4°C.
• Hút 75ul dịch nổi chuyển sang epp mới. Và tủa bằng 150ul ethanol 100%
• Hút bỏ dịch sau ly tâm (chú ý thao tác để không hút trúng tủa DNA).
• Rửa tủa: Thêm 500ul dung dịch ethanol 75% vào epp chứa DNA
• Tiếp tục ly tâm trong 10 phút ở 4°C.
• Hút bỏ dịch ly tâm và ly tâm nhẹ 1000rpm trong khoảng 10 giây
• Để khô 5 phút ở nhiệt độ phòng
• Hút 10ul H20 vào epp. Đến đây, hoàn thành quy trình tách chiết.
• Đến bước pha loãng để đo OD: Hút 92uL H2O + 8uL DNA tổng là 100uL vào epp
mới rồi đem đo.
• Trong tube DNA gốc sẽ dư lại 2uL để làm phản ứng PCR ở thí nghiệm kế tiếp.
2.3. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận
* Phương pháp đo quang phổ
a. Nguyên tắc:

Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng
260 nm. Giá trị mật độ quang OD260nm (Optical Density 260nm) của các mẫu DNA cho
phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với A260nm= 1.0 OD = 50 µg/ml DNA sợi
đôi). Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280. Có thể xem DNA thu nhận
đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,4-2.

b. Thiết bị và hóa chất

• Máy đo quang phổ: Bio Rad
• Nước cất hai lần.
c. Thực hiện:

DNA sau khi tách chiết được pha loãng 6 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó chuyển
tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở bước sóng 260nm. Độ tinh sạch của
dung dịch được xác định bằng OD260/OD280.
 d. Kết quả đo OD ở bước sóng 260nm

Hình 1. Kết quả đo OD bước sóng 260nm

Concentration = 2,7650 ug/ml
A260/A280 = 4,6361
A260 = 0.005
A280 = 0.001

Kết quả: OD260/OD280 > 2 → Mẫu không tinh sạch

Nồng độ DNA là 2,765 ug/ml → Sau tách chiết thu được ít DNA.
Thảo luận:
Những nguyên nhân ảnh hưởng đến quá trình tách chiết DNA:
• Hóa chất: trường hợp này bị loại bỏ vì nhóm khác làm cùng loại hóa chất và thu
được mẫu DNA bình thường.
• Kỹ thuật:
- Quan sát sau khi ly tâm ở bước tủa bằng ethanol 100% có mẫu tủa ở đáy
epp, do đó mẫu có thể bị mất ở bước hút bỏ dịch sau khi tủa hoặc rửa tủa
DNA.
- Hoặc khi đo OD, thao tác hút không đủ 100ul, còn sót lại dịch trong ống
epp dẫn đến kết quả bị sai số.

Cách khắc phục – kỹ thuật:

- Dùng pipette 20 hoặc 200ul khi hút dịch ethanol gần với tủa DNA để tránh
tình trạng hút quá mạnh làm mất tủa DNA.
- Trộn đều mẫu và hút đúng lượng mẫu cần để tránh kết quả bị sai số.

2.4. PHẢN ỨNG PCR

• Chuẩn bị
• Thực hiện
• Pha loãng primer vào eppendorf 1.5mL:
Epp 18-F: 2ul primer 18-Forward + 18ul H2O
Epp 18-R: 2ul primer 18-Reverse + 18ul H2O
• Mix Primer: thêm 2ul primer đã pha loãng mỗi loại vào epp và suspend.
• Pha master mix:

Master mix Thể tích

Buffer 5X 1ul
DNTP 0.5 ul

Phire Tag 0.25 ul

H2O 2.25 ul
 • Epp PCR gồm:
Master mix 4ul
Primer (F và R) 0.5ul
Template DNA 0.5ul

• Chu kỳ PCR:
P
Gen Trình tự mồi (5’-3’) L Tm (1) (2) (3)
(bp)
EGFR
- -
F: AGGGCTGAGGTGACCCTTGT 20 60.9
0.61 7.74 -
E-18 227
R: - 6,37
20 58.5 0.77
TCCCCACCAGACCATGAGAG 5.38
Trong đó, Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi, (1) là mức năng lượng liên kết tự do
cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop, (2) là mức năng lượng liên kết tự do cho
khả năng hình thành cấu trúc homodimer, và (3) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả
năng hình thành cấu trúc heterodimer. F-mồi xuôi, R-mồi ngược.

Tm: 59,7° = (60,9 + 58.5)/2

Time: 13 giây = (60 giây x 0,227)

Chu kỳ PCR:

Bước Nhiệt độ(0C) Thời gian Chu kỳ

1 95 5 phút 1
95 35 giây
2 60 17 giây 35
72 30 giây
3 72 6 phút 1
 Hình 2. Cài đặt chu kỳ PCR

2.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR

a. Nguyên tắc
Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di
chuyển về phía cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và
cấu trúc của phân tử DNA. Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia
tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của
acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ=300nm). Kích thước của các
acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn.
b. Thiết bị hóa chất:
• Buồng điện di
• Máy đọc gel Bio Rad
• Gel agarose Bio Basic
• 20X TAE Buffer Bio Basic
• Ethidium bromide Bio Rad
c. Các bước tiến hành:
Hút 5 μl sản phẩm PCR chạy điện di với gel agarose 1.5% ở hiệu điện thế 135V trong 30
phút. Nếu phổ điện di của dung dịch DNA đã tách chiết sau khi hiện hình cho một dải băng
rộng hoặc cho nhiều vạch thì chứng tỏ DNA đã bị gãy đoạn nhiều, hoặc lẫn DNA với RNA.
Phổ điện di là băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy và không lẫn tạp.
a. Kết quả điện di trên gel agarose 1.5%

Band mục tiêu:

227bp

PCR
~75-100bp

Hình 3. Điện di trên gel agarose 1,5% sản phẩm DNA PCR (Thang 50bp)

Kích thước sản phẩm PCR vùng Exon 18 mục tiêu là 227bp
Kích thước sản phẩm PCR vùng Exon 18 là ~75-100bp
à Không có sản phẩm PCR