Odredjivanje enzimske aktivnosti

Mikroorganizami imaju različite metabolitičke puteve. Oni se međusobno

razlikuju po enzimima koje sintetišu što određuje koje hranljive materije mogu da koriste
za rast i koji su krajnji produkti njihovog metabolizma. Ove razlike su određene
genetičkim karakteristikama odnosno strukturom molekula DNK.
Svi mikroorganizmi imaju endoenzime koji se nalaze unutar ćelija
mikroorganizama. Endoenzimi mogu da učestvuju u katabolitičkim putevima razgradnje
organskih jedinjenja ili u anabolitičkim procesima sinteze organskih jedinjenja u ćeliji.
Neki mikroorganizmi imaju i egzoenzime koji se sintetišu unutar ćelija, a zatim difunduju
u spoljašnju sredinu ili mogu da budu vezani za ćelijski zid. Većina egzoenzima su
hidrolitički enzimi što znači da razgrađuju veće molekule (makromolekule) na manje.
Makromolekuli su isuviše veliki da bi mogli da uđu u ćeliju mikroorganizma direktno.
Oni se prvo razgrađuju egzoenzimima na manje molekule (šećere, amino kiseline,
glicerin i masne kiseline) od kojih se sastoje. Manji molekuli ulaze u ćeliju i uključuju se
u različite metabolitičke puteve.
Najznačajnije grupe makromolekula koje živi organizmi mogu da koriste kao
izvore energije i za rast su polisaharidi , proteini i masti (lipidi).
Skrob je polisaharid koji se sastoji od molekula glukoze. Neke bakterije (Bacillus
ssp.) mogu da produkuju hidrolitičke egzoenzime- amilaze koje razlažu skrob do
disaharida maltoze i monosaharida glukoze. Drugi enzim, maltaza dalje razgrađuje
maltozu do glukoze koja je dovoljno mala da može da prođe kroz ćelijsku membranu u
citoplazmu bakterijske ćelije. I disaharidi mogu da uđu u bakterijsku ćeliju pomoću
enzima permeaze koji se nalazi u ćelijskom zidu bakterija. Šećeri se u bakterijskoj ćeliji
dalje koriste za proizvodnju energije u obliku adenozin tri fosfata –ATP-a. Ispitivanje
hidrolize skroba vrši se na skrobnom agaru. Nakon inokulacije i inkubacije ploča sa
skrobnim agarom Petri ploče se prelivaju Lugolovim rastvorom. Kako se skrob boji plavo
Lugolovim rastvorom oko kolonija koje ne vrše hidrolizu skroba zadržava se plava boja,
dok oko kolonija mikroorganizama koji razgrađuju skrob podloga postaje bela.
Proteini su makromolekuli koji se sastoje od aminokiselina vezanih peptidnom
vezom. Ukoliko bakterije imaju egzoenzime proteinaze mogu da razgrađuju proteine do
polipeptida, peptida i amino kiselina koji dalje ulaze u ćeliju i učestvuju u metabolizmu.
U ovoj vežbi ispitivaćemo da li određeni mikroorganizmi mogu da razlažu proteine
kazein i želatin.
Kazein je protein velike molekulske mase koji predstavlja osnovnu proteinsku
komponentu mleka. Mlečni agar koji sadrži obrano mleko u prahu je neprovidan zbog
velike molekulske mase kazeina. Ukoliko mikroorganizam koji je zasejan na ovakav agar
proizvodi proteinaze, veliki molekuli kazeina biće razgrađeni na manje molekule tako da
je podloga oko takvih kolonija prozračna.
Želatin je protein koga mogu da razgrađuju bakterije koje imaju enzime
želatinaze. Prisustvo želatinaza prati se u hranljivom želatinu. Ukoliko mikroorganizam
ima želatinaze dolazi do rastapanja (likvefakcije) želatin.
Neki mikroorganizmi mogu da razlažu masti na glicerol i masne kiseline. Ovakvi
mikroorganizmi imaju egzoenzime lipaze. Lipolitička aktivnost mikroorganizama prati se
na tributirin agaru koji je neproziran, Ukoliko mikroorganizmi imaju lipaze oko njihovih
kolonija pojaviće se prozirne zone usled razlaganja masti.
 Biohemijski diverzitet mikroorganizmima je jako bitna karekteristika. Pre svega,
različiti metabolitički potencijali mikroorganizama omogućavaju da mikroorganizmi
naseljavaju različite sredine. Drugo, ove razlike su osnova za interakcije između
razčličitih vrsta mikroorganizama. Jedna vrsta može da razgrađuje određene supstance
koje druga vrsta proizvodi.
Biohemijski diverzitet se u mikrobiologiji koristi za identifikaciju i klasifikaciju
mikroorganizama. Razlike unutar jedne vrste se mogu koristiti za izdvajanje sojeva za
industrijsku proizvodnju.

Potreban materijal
Skrobni agar
Mlečni agar
Tributirin agar
Hranljivi želatin u epruvetama

POSTUPAK
1. Razliti sterilno otopljene podloge i obeležiti Petri ploče
2. Dno Petri ploče podeliti na 4 dela, obeležiti svaki deo imenom
mikroorganizma koji se zasejava
3. Inokulisati Petri ploče određenom vrstom mikroorganizma tako što
sterilnom ezom nanesete uzorak u jednom potezu od centralnog dela Petri
ploče ka perifernom
4. Inkubirati ploče 48 sati na 30oC
5. Epruvete sa želatinom zasejavati bakteriološkom iglom
Očitavanje rezultata
1. Preliti skrobni agar Lugolovim rastvorom. Nakon 20 minuta pogledati boju
podloge oko kolonija. Bela boja oko kolonija ukazuje na prisustvo amilaze
2. Ako oko kolonija na mlečnom agaru postoje prozirne zone, mikroorganizam
produkuje proteinazu koja razlaže kazein
3. Epruvete sa želatinom staviti u frižider 15-20 minuta. Ako kultura proizvodi
želatinaze hranljivi zelatin biće tečan jer su molekuli mali tako da ne mogu da
formiraju gel
4. Ako oko kolonija na tributirin agaru postoje prozirne zone kultura produkuje
lipaze i razlaže lipide
 STARTER KULTURE

Da bi se u industrijskim uslovima uspostavila kontrola kvaliteta dobijenog

proizvoda koriste se određeni sojevi različitih vrsta mikroorganizama. koji su
označeni kao starter kulture. Starter kulture čine odabrane vrste mikroorganizama koje
poseduju određena svojstva da započnu i izvedu željeni proces do kraja dajući visoko
kvalitetan proizvod. U starter kulturama može da se koristi jedna vrsta mikroorganizama
ili više različitih vrsta a mogu se podeliti na nedefinisane i definisane startere. U razvoju
definisanih starter sistema važno je selekcionisanje sojeva na osnovu određenih
karakteristika koje su značajne za dobijanje kvalitetnog proizvoda. Ove karakteristike
mogu da budu različite i zavise od vrste proizvoda koji se dobija. Tako se za proizvodnju
antibiotika koriste posebni sojevi Penicilliuma sp. ili Streptomyces sp. koji mogu da pod
određenim uslovima produkuju veću količinu antibiotika u odnosu na predstavnike iste vrste
kod kojih je ta količina proizvedenog antibiotika manja. Sa druge strane kvasac
Sacharomyces cerevisie koristi se u industriji piva i vina ali i u pekarskoj industriji. U
industriji piva koriste se sojevi ove vrste koji mogu da produkuju veću količinu alkohola,
dok se u pekarskoj industriji koriste sojevi kvasca koji sintetišu enzime. U mlekarskoj
industriji koriste se određene vrste bakterija mlečne kiseline (BMK) koje imaju sledeća
svojstva: proizvode dovoljnu količinu mlečne kiseline, sintetišu aromatična jedinjenja
razlaganjem citrata, poseduju proteolitičke enzime i sintetišu egzopolisaharide.
Karakteristike startera zavise od njihovog metabolitičkog sistema odnosno
prisutnih ekstacelularnih i intracelularnih enzima. Upoznavanje bihemijskih
karakteristika sojeva mikroorganizama koji se koriste u starterima naročito je značajno
ukoliko se više vrsta mikroorganizama koriste u starter kulturi jer se između takvih
mikroorganizama javljaju različiti odnosu poput inhibicije ili stimulacije rasta i
metabolitičkih procesa. Tako se za proizvodnju jogurta kao starter kulture koriste BMK
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus između kojih se
javlja simbiotski odnos. Laktobacili omogućavaju rast streptokokama jer razlažu proteine
i oslobađaju aminokiseline, dok streptokoke produkuju formnu kiselinu koja stimuliše
rast laktobacila.
Pre upotrebe sojeva mikroorganizama u starter kulturama potrebno je tačno
definisati uslove pod kojima oni mogu da budu najproduktivniji (temperaturu, podlogu,
pH, kiseonik) jer svaki korak u tehnološkom procesu dobijanja proizvoda utiče na njegov
krajnji kvalitet.
Cilj ove vežbe je upoznavanje nekih svojstava BMK koja su bitna za njihovu
upotrebu u starter kulturama.
Sinteza egzopolisaharida
BMK, kao i mnoge druge bakterije, mogu da sintetišu nekoliko različitih tipova
polisaharida koji su klasifikovani prema njihovom položaju u odnosu na ćeliju.
Egzopolisaharidi se izlučuju van ćelije ili mogu biti labavo vezani za površinu ćelije. U
industriji mlečnih proizvoda sojevi BMK koji sintetišu EPS-e utiču na poboljšanje
teksture i viskoznosti proizvoda. Po nekim istraživanjima EPS imaju imunostimulatorno i
antitumorno dejstvo, dok fosfatne grupe u EPS-ma imaju ulogu u aktivaciji makrofaga i
limfocita. Takođe, postoje podaci da EPS mogu da utiču na snižavanje nivoa holesterola
u krvi .Najpoznatiji egzopolisaharid koji sintetišu BMK iz roda Leuconostoc je dekstran
koji se široko koristi u istraživanjima, industriji i medicini.
 Za ispitivanje sinteza EPS-a koristi se MSE podloga.
Postupak
1. Razliti MSE podlogu u Petri ploču
2. Podeliti dno Petri ploče na četiri dela
3. U svakom delu zasejati određeni mikroorganizam
4. Inkubirati Petri ploče na 30oC
Oni mikroorganizmi koji formiraju EPS-e stvaraju sluzave kolonije na površini
MSE podloge.

Proteolitička aktivnost
Proteolitička aktivnost BMK je od velike važnosti jer direktno utiče na
organoleptička svojstava mlečnih proizvoda, hidrolizu gorkih peptida i oslobađanje
slobodnih amiokiselina koji su prekursori aromatičnih jedinjenja. Razlaganjem proteina
BMK oslobađaju biogene peptide koji imaju povoljno dejstvo na zdravlje ljudi.
Postupak
1. Pripremiti tri epruvete sa 10 ml sterilnog mleka
2. Zasejati epruvete 1% inokulumom određene bakterije
3. Inkubirati epruvete na 30oC 24 sata
4. Izmeriti pH mleka u epruvetama
Nakon inkubacije proveriti u epruvetama da li je stvoren gruš (mleko gruša
ukoliko je pH mleka ispod 4.7). pH mleka nakon inkubacije ukazuje na količini stvorene
mlečne kiseline kao i na dobar proteolitički sistem bakterija.

Sinteza aromatičnih jedinjenja

BMK mogu da razlažu mnoga jedinjenja među koje spada i citrat. Citrat se nalazi u
mnogim prirodnim supstratima kao što su mleko, povrće i voće, ulazi u sastav živih ćelija i
važan je izvor energije za bakterije. Kao krajnji proizvod razgradnje citrata stvara se
aromatično jedinjenje diacetil koje utiče na ukus i miris mlečnih proizvoda.
Za dokazivanje sinteze diacetila koriste se dva testa.
Test za razgradnju citrata
1. Razliti mlečni citratni agar u Petri ploču
2. Podeliti dno Petri plođe na četiri dela
3. U svakom delu zasejati određeni mikroorganizam
4. Inkubirati Petri ploče na 30oC
Ukoliko posle inkubacije kolonije imaju plavu boju to potvrđuje da mogu da razlažu
citrate.
Test za dokazivanje diacetila
1. Nakon inkubacije epruveta sa mlekom iz svake epruvete prebaciti po 1ml
mleka u novu epruvetu
2. Dodati 1ml 30% NaOH
3. Dodati malo kreatinina
Ukoliko se pojavi crveni prsten to ukazuje da kultura kojom je zasejano mleko proizvodi
diacetil
 UPOTREBA STARTERA ZA DOBIJANJE FERMENTISANE HRANE

Uticaj različite temperature inkubacije na kvalitet jogurta

Za proizvodnju jogurta koriste se BMK Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus

i Streptococcus thermophilus. Obe vrste su homofermentativne, koriste laktozu iz mleka
kao izvor energije i proizvode mlečnu kiselinu kao krajnji produkt razlaganja laktoze. U
početku St. thermophilus je dominantna vrsta ali kasnije stvorena mlečna kiselina inhibira
njen rast. U drugoj fazi proizvodnje, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus nastavlja
da razgrađuje zaostalu laktozu i snižava pH mleka od 6.5 do 4.5. Obe vrste su termofilne.
Postupak
1. Obeležiti 5 sterilnih erlenmajera 1. 4oC, 2. 37oC, 3. 37oC kuvano, 4.
60oC i 5 kontrola. Erlenmajere prekriti aluminijumskom folijom
2. Aseptično dodati 20 ml mleka u svaki erlenmajer
3. Mleko u trećem erlenmajeru prokuvati pre dodavanja inokuluma
4. Inokulisati svaki erlenmajer sa 0.5ml svežeg jogurta i promečati dobro
sadržaj
5. Prekriti erlenmajere aluminijumskom folijom i inkubirati ih na određenim
temperaturama
6. Nakon 24 sata sve erlenmajere staviti u frižider do sledećeg termina vežbi
7. Izmeriti pH mleka.
 PROBIOTIČKA SVOJSTVA BMK

U novije vreme BMK se koriste u mlečnim proizvodima kao probiotici što znači
da mogu da imaju pozitivan efekat na zdravlje ljudi. Kako se neke BMK nalaze u
normalnoj mikroflori crevnog trakta probiotičko dejstvo se uglavnom odnosi na
normalizaciju crevne mikroflore. Da bi neki mikroorganizam mogao da se smatra
probiotikom potrebna su ispitivanja na životinjama ali početni testivi se odnose na
preživljavanje mikroorganizama u prisustvu žučnih soli i na niskom pH jer su ovo uslovi
koji postoje u crevnom traktu.
Rezistentnost na želudačnu kiselinu i žuč predstavljaju najbitnija svojstva koja
ukazuju na sposobnost mikroorganizma da preživi put kroz gestrointestinalni trakt.
Preživljavanje bakterija u želudačnoj kiselini zavisi od njihove sposobnosti da tolerišu
nisku pH vrednost. Vrednost pH HCl koja se luči u želucu iznosi 0,9, međutim, prisustvo
hrane dovodi do porasta pH vrednosti na 3. Nakon unošenja hrane potrebno je 2-4 h da bi
se želudac ispraznio.
Bakterije koje prežive uslove koji vladaju u stomaku pri prolasku kroz duodenum
izložene su dejstvu žuči i žučnih soli. Žučne soli se sintetišu iz holesterola u jetri,
skladište u žučnoj kesi i oslobađaju u tanko crevo pri unošenju masti u organizam. Kako
imaju ulogu sličnu deterdžentu, izloženost mikroorganizama žuči može dovesti do
rezgradnje ćelijske membrane koja je sastavljena od lipida i masnih kiselina. Zbog toga,
važno je da bakterije koje se koriste kao probiotici poseduju rezistentnost na žučne soli. S
druge strane, neki mikroorganizmi imaju sposobnost hidrolize žučnih soli pomoću
enzima hidrolaze žučnih soli (BSH) pri čemu dovode do smanjenja njihove
rastvorljivosti, a što oslabljuje njihovo dejstvo kao deterdženta. Takođe, dekonjugacija
žučnih soli dovodi do smanjenja nivoa holesterola u krvi.
Rast u prisustvu žučnih soli
Postupak
1. Razliti enteroagar u Petri ploču
2. Podeliti dno Petri ploče na 4 dela
3. U svakom delu zasejati određeni mikroorganizam
4. Inkubirati Petri ploče na 30oC
Ukoliko mikroorganizmi stvaraju crne kolonije to ukazuje da mogu da rastu u
prisustvu žučnih soli.
Rast u pri niskim pH vrednostima
Postupak
1. Mikroorganizme zasejati u MRS bujon čija je pH vrednost podešena na 3, 4, 5
i6
2. Epruvete inkubirati na 30oC
Pratiti rast mikroorganizama u epruvetama nakon inkubacije.
 MIKROBIOLOŠKA ISPRAVNOST PROIZVODA

Korišćenje mikroorganizama u industrijskom dobijenju određenih

proizvoda odvija se pod manje ili više aseptičnim uslovima uz primenu čistih ili
odabranih mešovitih kultura. Međutim, moguće je da se u proizvodima razvijaju i
mikroorganizmi koji nepovoljno utiču na kvalitet krajnjeg proizvoda. Ovi
mikroorganizmi nazivaju se kontaminenti i u proizvode mogu da dospevaju iz
različitih izvora (nepravilno održavane starter kulture, iz sirovina za proizvodnju
ili sa opreme koja se koristi).
Najčešći kontaminenti u mlekarskoj industriji su bakterije Escherichia coli,
Staphilococcus sp., Proteus sp kao i različite vrste kvasaca i plesni. U industriji
mesa i mesnih prerađevina najčešće se kao kontaminenti javljaju bakterije
Salmonella sp., Shigella sp., kao i vrste iz roda Clostridium. Pri alkoholnoj
fermentaciji osim kvasaca koje su najčešći kontaminenti javljaju se i bakterije
mlečne kiseline. Nepoželjni mikroorganizmi u industrijskim proizvodima mogu da
utiču na boju, teksturu i aromu proizvoda ali neki od njih koji su patogene za
čoveka mogu da izazovu ozbiljne zdravstvene probleme.
Kontrola mikrobiološke ispravnosti proizvoda predstavlja proveru prisustva
nepoželjnih mikroorganizama u toku različitih faza industrijske proizvodnje. Za
ispitivanje prisustva određenih grupa mikroorganizama razvijeni su posebni
testovi na osnovu kojih se brzo i sigurno može utvrditi da li se mikroorganizmi
nalaze u određenim proizvodima. Ovi testovi počinju zasejavanjem uzorka u
određene obogaćene podloge koje su selektivne za neku grupu mikroorganizama a
sprečavaju rast drugih grupa. Nakon toga uzorak se sa selektivne podloge
prebacuje na određene diferencijalne podloge na kojim mikroorganizmi daju
kolonije sa tačno određenim makromorfološkim karakteristikama. Kao krajnja
faza ispitivanja izolovanog mikroorganizma sa diferencijalne podloge radi se
identifikacija na osnovu morfoloških, fizioloških i fermentacionih testova.
Test za utvrđivanje prisustva E. coli obuhvata zasejavanje uzorka u
McConkey bujon sa Durhamovom cevčicom. Kako je ova bakterija jedna od
retkih koja može da raste u prisustvu žučnih soli a da iz laktoze formira gas,
pozitivna reakcija za prisustvo E. coli je pojava gasa u Durhamovoj cevčici. Da bi
se test potvrdio, uzorak iz bujona se zasejava na Endo agar na kome E. coli
formira zelene kolonije sa metalnim odsjajem.
Kako bi se utvrdilo prisustvo bakterija iz rodova Salmonella i Shigella,
uzorak se prvo zasejava u selenit bujon koji sprečava rast većine drugih bakterija.
Iz selenit bujona uzorak se prebacuje na SS agar na kome vrste ovih rodova
formiraju kolonije roze boje.
Karakteristika vrsta iz roda Staphylococcus da mogu da rastu u prisustvu
velike količine NaCl iskorišćena je za dokazivanje ovih vrsta u proizvodima.
Uzorak se prvo zasejava u hranljivi bujon sa 10%NaCl a zatim nakon inkubacije
na Bard Parkerov agar. Pojava crnih kolonija na ovom agaru je pokazatelj
prisustva ove bakterije u ispitivanom uzorku.
 Prisustvo vrsta iz roda Proteus dokazuje se inkubacijom zasejanog uzorka u
hranljivi bujon, a zatim na Brilijant zeleni agar. Vrste iz roda Proteus formiraju
sluzave providne kolonije na ovom agaru.
Postupak
1. 10 ml uzorka aseptično prebaciti u 90ml sterilnog fiziološkog
rastvora i dobro promešati sadržaj
2. po 1ml rastvorenog uzorka prebaciti u pripremljene sterilne
obogaćene podloge (McConkey bujon, selenit bujon, hranljivi bujon
i slani hranljivi bujon)
3. Inkubirati epruvete 24sata na 37oC
4. Nakon inkubacije zasejati iz bujona uzorke na čvrstu podlogu (Endo
agar, SS agar, Brilijant zeleni agar i Bard-Parkerov agar)
5. Inkubirati Petri ploče 24 sata na 37oC
 Izolovanje i identifikacija sulfitoredukujućih klostridija

Rod Clostridium spada u familiju Bacillaceae i sadrži više vrsta od kojih je za ljude
najznačajnija C. perfrigens.
U rod Clostridium spadaju štapićaste, grampozitivne, sporogene bakterije. Neke vrste
obrazuju kapsulu. Većina vrsta su saprofiti, žive u vodi, zemljištu i raspadnutim
organskim materijama životinjskog i biljnog porekla. Skoro sve vrste su snadbevene
flagelama i pokretne su. Položaj spora može biti plektridijalni (na jednom polu) ili
(klostridijalni). Na osnovu položaja spora može se vršiti identifikacija vrsta
rodaClostridium. Veoma interesantna osobina je gubitak grampozitiviteta u toku
kultivisanja.
Većina vrsta su striktni anaerobi, dok neke mogu rasti u prisustvu male koncentracije
kiseonika. Vrste roda Clostridium su biohemijski aktivne i sintetišu veliki broj enzima
koji im između ostalih daju saharolitičke i proteolitičke osobine. C. perfrigens se
optimalno razmnožava na 37 oC do 44 oC.
Vrste roda Clostridium sintetišu jake egzotoksine koji se ponašaju kao antigeni i sadrže
više antigenskih faktora. C. perfrigens sintetiše pet letalnih egzotoksina i jedan
endotoksin, a takođe i više hemolizina i enzima koji se smatraju štetnim po čoveka jer
imaju ulogu u širenju patoloških procesa.
C. perfrigens spada u sulforedukujuće bakterije, jer ima sposobnost redukcije
natrijumsulfita (Na2SO3) do natrijumsulfida (Na2S). Na osnovu ove osobine se vrši
njihova identifikacija, kroz sulfidni agar. Nastali natrijumsulfid sa solima gvožđa stvara
gvožđesulfid (FeS) koji daje karakterističnu boju kolonijama klostridija.
Postupak:

1 ml odgovarajućeg osnovnog razređenja uzorka prenese se u epruvetu. Epruveta

se uroni u vodu, koja je u kupatilu prethodno zagrejana nas 80 oC i ostavi 10
minuta. Posle toga se epruveta nalije pripremljenim otopljenim sulfitnim agarom
tako da udaljenost od čepa ne bude veća od 1 cm, a visina razlivene podloge ne
bude niža od 14 cm. Zasejana podloga se inkubira 3 do 5 dana na 37 oC. Porast
karakterističnih crnih kolonija u dubini podloge, ili difuzno crnjenje cele podloge
uz stvaranje plina i cepanje podloge ili bez stvaranja plina, označava se kao
pozitivni prethodni ogled, odnosno kao znak verovatnog prisustva
sulfitoredukujućih klostridija u uzorku. Dalje se ogled izvodi tako da se od
karakterističnih crnih kolonija napravi razmaz i oboji po Gramu. Istovremeno se
kultura ezom prenese na krvni agar koji se inkubira aerobno 48 časova na 37 oC.

Nalaz Gram pozitivnih štapića, sa ili bez spora, u mikroskopskom preparatu i

izostanak rasta na krvnom agaru smatra se pozitivnim potvrdnim ogledom,
odnosno dokazom prisustva sulfitoredukujućih klostridija u ispitivanom uzorku.
Sulfitni agar:
- tripton 15,0 g,
- ekstrakt kvasca 10,0 g,
- destilovana voda 750 ml,
- voda za piće (aqua fontis) 250 ml.
Sastojci se postupnim zagrejavanjem otope, podesi se pH na 7,0, razlije u boce po
100 ml i steriliše se 15 minuta na 120oC. Podloga se čuva na 6 do 8oC.
Neposredno pre upotrebe, na 100 ml otopljene i na oko 45 oC ohlađene podloge
dodaju se rastvori:
- 1 ml 5% vodenog rastvora citrata gvožđa (FeC6H5O7 5H2O),
- 1 ml 5% vodenog rastvora natrijum sulfita (Na2SO1 - 2H2O),
- 1 ml 1% vodenog rastvora kalijum permanganata (KMnO4)
Sulfitoredukujuće klostridije, na ovoj podlozi, rastu u obliku okruglih crnih
kolonija. Crna boja kolonija i njihove okoline nastaje stvaranjem gvožđa sulfida, u
redukciji vodonikovog sulfida, s prisutnim trovalentnim gvožđem.

Određivanje broja aerobnih mezofilnih sporogenih bakterija

Bacillus subtilis spada u familiju Bacillaceae. B. subtilis su štapićaste grampozitivne,
katalazapozitivne, sporogene bakterije. Smatraju se striktnim aeorobima, međutim neka
istraživanja pokazuju da mogu biti i fakultativni anaerobi. Obrazuju endospore, koje su
veoma otporne na temperaturu, kiselost sredine i soli, što im omogućuje preživljavanje
ekstremnih uslova spoljašnje sredine B. subtilis se ne ubraja u patogene za čoveka,
međutim može izazvati neispravnost prehrambenih proizvoda i trovanje. Luči
proteolitički enzim subtilisin.

Tečne namirnice ili osnovno razređenje uzorka u količini od 10 ml, urone se u

ključalu vodu za vreme od 5 minuta. Ohlade se pod tekućom hladnom vodom. Po
potrebi, naprave se dalja osnovna razređenja. Otpipetira se 1 ml u Petrijeve ploče i
zalije otopljenim i na 45oC ohlađenim hranljivim agarom. Ploče se inkubiraju 72
časa na 30oC. Posle inkubacije, izbroje se izrasle kolonije, kao pri određivanju
broja mikroorganizama u g ili ml i iskazuju kao broj aerobnih sporogenih bakterija
u jednom gramu ili jednom mililitru.

Određivanje broja termofilnih bakterija

Otpipetira se 1 ml tečnog uzorka ili odgovarajućeg razblaženja u Petrijeve ploče i

zalije otopljenim i na 45oC ohlađenim hranljivim agarom. Ploče se inkubiraju 72
časa na 45oC. Posle inkubacije, izbroje se izrasle kolonije, kao pri određivanju
broja mikroorganizama u g ili ml i iskazuju kao broj termofilnih bakterija u
jednom gramu ili jednom mililitru.