研究原著 中国组织工程研究

Chinese Journal of Tissue Engineering Research www.CJTER.com

聚丙烯酸 / 琼脂糖三维培养构建细胞球的方法

1 2，3，4 2 2，3，4 2，3，4 2，3，4

https://doi.org/10.12307/2022.091 何云影 ，李玲婕 ，张舒淇 ，李雨舟 ，杨 生 ，季 平
投稿日期：2021-02-06
送审日期：2021-02-08 文章快速阅读： 细胞球培养方法筛选
采用日期：2021-04-10 文章特点— 比较成球效果和效率
在线日期：2021-06-02 △探索商品化细胞球培养
小鼠前体成骨细胞 聚丙烯酸模具
中图分类号： 微孔板的廉价替代品并
R459.9；R318.08；R-331 进行效果验证，促进细 明胶 / 海藻酸钠层层自组装 以琼脂糖复制模具微孔结构
胞球三维培养模型在骨
文章编号： 层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞 琼脂糖凝胶微孔板 小鼠前体成骨细胞
组织工程领域的应用推
2095-4344(2022)04-00553-07 广。
文献标识码：B △利用层层自组装技术改
层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球 小鼠前体成骨细胞球
善细胞球内部缺氧环境，
维持细胞的成骨活性。

比较细胞球大小及球体内部活细胞占比、死细胞占比和成骨活性

文题释义：
细胞球：是一种简单且被广泛应用的多细胞三维培养模型，细胞在隔绝与基底的黏附作用后，由于聚集倾向而相互靠拢形成细胞球。这种立
体结构促进了细胞与周围细胞在空间上的交流，符合体内细胞的生长状态，一定程度上还原了细胞在体内的生存环境，生理学相关性强。
琼脂糖：是一种提取自藻类的多糖，可溶解在沸腾的溶液中，冷却后形成凝胶。琼脂糖凝胶无细胞毒性，且不携带细胞黏附位点，因此人
和动物的细胞不能附着在该水凝胶之上。

摘要
背景：细胞球三维培养模型在组织工程领域应用前景广泛，但使用商品化超低吸附培养板进行细胞球培养的实验成本较高，因此需探寻一
种细胞球成形的替代策略，推动细胞球在相关研究领域的应用。
目的：采用琼脂糖和聚丙烯酸模具，并利用层层自组装技术构建细胞球三维培养模型，部分模拟细胞体内生存的微环境。
方法：体外培养小鼠前体成骨细胞，依次使用明胶与海藻酸钠对小鼠前体成骨细胞进行层层自组装处理(层层自组装-小鼠前体成骨细胞)，
同时分别制备明胶包裹与海藻酸钠包裹的小鼠前体成骨细胞。分别制备琼脂糖凝胶涂层培养板与琼脂糖凝胶微孔板，观察上述不同处理的
细胞在两种培养板中的成球效果，采用Live/Dead染色法检测细胞球的活性，采用碱性磷酸酶染色法、RT-PCR 实验检测细胞球的成骨能力。
结果与结论：①光学显微镜下可见，在琼脂糖凝胶涂层孔板中，未经处理与经3种涂层处理的小鼠前体成骨细胞均未成球；在琼脂糖凝胶
微孔板中，未经处理与层层自组装处理的小鼠前体成骨细胞形成了理想的细胞球，其中层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的直径大于未经
处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)；②Live/Dead染色显示，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球内的细胞活性高于未经处理小鼠前体成骨细
胞球(P < 0.05)；③层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的碱性磷酸酶活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)，Ⅰ型胶原和Osterix基因
表达高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)，两组Runx2基因表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明，采用琼脂糖凝胶结
合层层自组装技术成功建立了细胞球三维培养模型，此方法便捷、经济、高效且细胞活性良好，保留了细胞成骨分化能力，在骨组织工程
和再生医学领域具有潜在应用价值。
关键词：细胞球；三维培养；琼脂糖；小鼠前体成骨细胞；层层自组装；细胞活性；骨组织工程

Method of constructing cell spheroids based on agarose and polyacrylic molds

He Yunying1, Li Lingjie2, 3, 4, Zhang Shuqi2, Li Yuzhou2, 3, 4, Yang Sheng2, 3, 4, Ji Ping2, 3, 4
1
College of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 2Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing
401147, China; 3Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; 4Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral
Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China

1 2 3
重庆医科大学口腔医学院，重庆市 401147； 重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 401147； 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市
401147；4 重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆市 401147
第一作者：何云影，女，1992 年生，重庆市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
通讯作者：季平，博士，主任医师，博士生导师，重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 401147；口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市
401147；重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆市 401147
共同通讯作者：杨生，博士，主任医师，博士生导师，重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 401147；口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重
庆市 401147；重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆市 401147
https://orcid.org/0000-0003-4820-7468 ( 何云影 )
基金资助：国家自然科学基金 (82071115)，项目负责人：季平；国家自然科学基金 (81500894)，项目负责人：杨生；国家自然
科学基金 (82001081)，项目负责人：李玲婕；重庆市研究生导师团队建设项目 (dstd201806)，项目负责人：季平
引用本文：何云影，李玲婕，张舒淇，李雨舟，杨生，季平 . 聚丙烯酸 / 琼脂糖三维培养构建细胞球的方法 [J]. 中国组织工程研究，
2022，26(4):553-559.

Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 26｜No.4｜February 2022｜553

 中国组织工程研究 研究原著
www.CJTER.com Chinese Journal of Tissue Engineering Research
He Yunying, Master candidate, College of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China
Corresponding author: Ji Ping, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China;
Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical
Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China
Co-corresponding author: Yang Sheng, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147,
China; Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical
Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China

Abstract
BACKGROUND: The application prospect of cell spheroids is wide in tissue engineering, while the experimental cost of using commercial ultra-low adsorption
culture plates to form spheroids is relatively high. Therefore, it is necessary to explore an alternative strategy for cell spheroids formation to promote the
application of cell spheroids in related research fields.
OBJECTIVE: Combined with agarose and polyacrylic mold, three-dimensional cell spheroids are established by layer-by-layer self-assembly technology, and so
that the micro physiological environment of cells are partially restored.
METHODS: In vitro, MC3T3-E1 cells of mice were coated with gelatin and sodium alginate respectively, through layer-by-layer self-assembly technology (LBL-
MC3T3-E1). Gelatin-coated and sodium alginate-coated MC3T3-E1 cells were prepared as well. Agarose-coated plates and agarose microwell plates were
prepared respectively. The cellular spheroids formation effect of the above treated cells in these culture plates was observed. The Live/Dead staining method
was used to detect the viability of cell spheroids. The alkaline phosphatase staining and real-time PCR were used to confirm the osteogenesis of cell spheroids.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) As seen under the light microscope, in agarose-coated well plates, both untreated and treated MC3T3-E1 cells did not form
into spheroids; and in agarose microwell plates, untreated and LBL-MC3T3-E1 cells formed ideal cell spheroids, in which the diameter of LBL-MC3T3-E1 cell
spheroids was larger than that of untreated MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05). (2) The results of Live/Dead staining showed that the cellular viability within
LBL-MC3T3-E1 cell spheroids was better than that of MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05). (3) The alkaline phosphatase activity of LBL-MC3T3-E1 cell spheroids
was higher than that of MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05). Collagen-I and Osterix gene expression levels were higher than those of MC3T3-E1 cell spheroids
(P < 0.05), and the difference in Runt-related transcription factor 2 gene expression was not significant between the two groups (P > 0.05). (4) These results
showed that a three-dimensional culture model of cell spheroids was successfully established by using agarose and polyacrylic acid molds combined with layer-
by-layer self-assembly technology. This method is convenient, economical, efficient, and has good cell viability, preserves the osteogenic differentiation ability
of cells, thus having potential applications in the field of bone tissue engineering and regenerative medicine.
Key words: cell spheroid; three-dimensional culture; agarose; MC3T3-E1; layer-by-layer; cell viability; bone tissue engineering

Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 82071115 (to JP); the National Natural Science Foundation of China, No. 81500894 (to YS); the
National Natural Science Foundation of China, No. 82001081(to LLJ); the Chongqing Postgraduate Tutor Team Construction Project, No. dstd201806 (to JP)
How to cite this article: He Yy, Li Lj, Zhang Sq, Li Yz, Yang S, Ji P. Method of constructing cell spheroids based on agarose and polyacrylic molds. Zhongguo
Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2022;26(4):553-559.

0 引言 Introduction
细胞球三维培养方法可部分程度模拟体内细胞生存微
环境，因而在骨组织工程及再生医学领域中被广泛应用
目前用于构建细胞球的商品化超低吸附培养板的作用原理
是：隔绝细胞与培养板基底之间的黏附作用，使细胞在重
力作用下自发聚集成球，即细胞的聚集培养。然而，目前
市场上的商品化超低吸附培养板多依赖进口，价格昂贵且
[4-6]
为一次性使用耗材
的低碳、可循环及可持续发展的战略要求。因此，探寻一
种细胞球成形的新策略将有利于细胞球在相关研究领域的
进一步推广。
聚丙烯酸模具的灵感来自于自行车反光灯，具备市场常
见、价格低等优点，其内部为多个倒金字塔样微孔结构整齐
排列，与商品化超低吸附培养板构造相近，然而，聚丙烯酸
模具不适合直接用于细胞培养。因此课题组提出利用生物相
容性材料复制聚丙烯酸模具倒金字塔样微孔的构想，还原其
凹底造型，为细胞聚集成球提供空间，模拟细胞在商品化培
养板中的行为。
为了完整地复制出聚丙烯酸模具内倒金字塔结构并应
用于细胞培养，应选择一种既具备生物安全性又能用于模具
复制的材料。琼脂糖是一类具备良好生物安全性的高分子材
料，易获取且成本低。琼脂糖凝胶表面细胞黏附性较低 ，
同时凝胶制备对实验设备和实验环境要求较低，因此可被看
作一种理想的超低吸附材料。在高温加热时琼脂糖呈溶液状
[8]
态，而当温度降至 37 ℃以下时会出现凝胶现象 ，这赋予
了琼脂糖极佳的可塑性，可用于复制聚丙烯酸模具内的倒金
[1-3]
。 字塔微孔结构，进而替代商品化超低吸附培养板进行细胞培
养，在隔绝细胞黏附的同时促进细胞聚集成球。细胞聚集培
养过程还原了生理条件下细胞间的立体空间关系，即细胞在
生物体内的宏观生存环境，从而在体外培养过程中维持细胞
[9]
特性 。
，不符合中国及广大科技工作者倡导 然而，聚集培养虽然恢复了细胞的宏观三维环境，但
[10-11]
忽略了在生理条件下细胞的独特微观环境 ，细胞的微
观环境由细胞 - 细胞、细胞 - 细胞外质间的相互作用组成，
[12]
对细胞功能及其状态进行调整 ，因此在进行细胞培养时
应同时考虑宏观和微观环境对细胞的影响。层层自组装技
术通过在细胞表面沉积具有生物相容性的材料进行细胞表
[13] [5]
面修饰 ，重塑细胞外基质微环境 。层层自组装技术中
常用的明胶为聚合阳离子生物材料，海藻酸钠为聚合阴离
[14]
子材料 ，互相反应能在细胞表面交替沉积形成外基质层，
以实现恢复细胞微观环境的目的；而且以往研究已证明这
两种材料的生物相容性较好，应用到不同类型的细胞上均
有促进细胞功能的作用，因此在组织工程领域被广泛使
[15-16]
用 。
综上所述，实验着力于寻求一种商品化超低吸附培养板
[7]
的替代方案，对重塑细胞宏观和微观环境的方法进行探索与
比较，为未来细胞球培养应用于骨组织工程领域提供思路和
依据。

554｜中国组织工程研究｜第26卷｜第4期｜2022年2月

研究原著
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 体外细胞学实验，采用单因素 ANOVA 进行统计分
析。
1.2 时间及地点 实验于 2019 年 12 月至 2020 年 11 月在重
庆医科大学附属口腔医院口腔疾病与生物医学重庆市重点实
验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 小鼠前体成骨细胞 (MC3T3-E1，中科院上海细胞
库 )。
1.3.2 主要实验试剂 胎 牛 血 清 (GeneX 公 司 )；0.25% 胰
酶 -EDTA、α-MEM 培养基、明胶、海藻酸钠、PKH26 染色试
剂盒 (Sigma 公司 )；琼脂糖 ( 索莱宝科技公司 )；青霉素 - 链
霉 素 - 两 性 霉 素 B 混 合 溶 液、DPBS 溶 液 (Hyclone 公 司 )；
无水氯化钙 ( 麦克林有限公司 )；Live/Dead 染色试剂盒 ( 贝
博试剂公司 )；碱性磷酸酶染色试剂盒、DAPI 染色试剂 ( 碧
云天公司 )；CCK-8 试剂盒 (MCE 公司 )；细胞裂解液 Trizol、
RNA 反转录试剂盒、SYBR 定量 PCR 试剂盒、无酶水 (TaKaRa
公司 )。
1.3.3 主要仪器和耗材 激光共聚焦显微镜、荧光倒置显微
镜 ( 徕卡公司 )；酶标仪 (Enspir 公司 )；实时荧光定量 PCR
仪 ( 赛默飞公司 )；细胞培养皿、细胞培养板、离心管 ( 洁特
生物公司 )；针式过滤器 (Millipore 公司 )。
1.4 实验方法
1.4.1 孔板的制备 精密称量琼脂糖，加入一定量的 α-MEM
培养基，制成 1.5% 的琼脂糖悬液，加热沸腾至琼脂糖充分
融解，使用针式过滤器过滤。首先，制备琼脂糖凝胶涂层培
养板，在每孔细胞培养板 (6 孔板 ) 中添加 1 mL 琼脂糖溶液，
待其完全凝固后作为对照组备用。随后制备琼脂糖凝胶微孔
板，聚丙烯酸模具 ( 自行车反射器经拆除后的反光片部分 )
紫外光照消毒，用 2 mL 琼脂糖溶液完全覆盖模具表面，待
其冷却成凝胶后，用无菌刀片将凝胶修剪成 6 孔细胞培养板
每孔大小，作为实验组使用。
6 8 -1
1.4.2 层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞的制备 1×10 个小
鼠前体成骨细胞收集于离心管中，离心去除旧培养基后加入
5 mL 0.1% 明胶溶液 ( 称取 0.1 g 明胶溶解于 100 mL 去离子水中 )， 然后置于 37 ℃细胞培养箱中分别培养 24，96 h。去除每孔
置于 4 ℃条件下孵育 10 min。待孵育结束后以 1 500 r/min 离
心 5 min，去掉明胶溶液。加入 5 mL DPBS 溶液洗涤细胞，再
次离心、去除上清液。然后加入 5 mL 0.1% 海藻酸钠溶液 ( 称
取 0.1 g 海藻酸钠溶解于 100 mL 去离子水中 ) 重悬细胞，4 ℃
环境下再次孵育 10 min，重复离心、去上清、洗涤步骤。最
后明胶和海藻酸钠的涂层过程各自依次重复一次，至此层层
自组装 - 小鼠前体成骨细胞制备完成。使用相同的涂层手法
制备仅为明胶包裹的明胶 - 小鼠前体成骨细胞和仅为海藻酸
钠包裹的海藻酸钠 - 小鼠前体成骨细胞。
1.4.3 细胞球制备 将 3 种涂层处理的小鼠前体成骨细胞或
未经处理的小鼠前体成骨细胞重悬后，制备成细胞浓度为
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2×108 L-1 的悬液，在对照组和实验组 6 孔板中每孔加入 2 mL
细胞悬液和 0.1 mol/L 的氯化钙溶液 10 µL，置于 37 ℃细胞培
养箱中培养 24 h，光学显微镜下观察细胞成球效果。
1.4.4 制备流程 采用层层自组装技术处理小鼠前体成骨细
胞，以及利用聚丙烯酸模具制备琼脂糖凝胶微孔板及细胞球
的流程如图 1a 所示。聚丙烯酸模具见图 1b，其内部为整齐
排列的倒金字塔结构。而以聚丙烯酸模具为模板制备的琼脂
糖凝胶微孔板完整复刻出倒金字塔结构，见图 1c，可进一步
用于细胞球的培养。
1.4.5 细胞膜荧光标记 消化细胞前，使用 PKH26 染色试剂
盒对小鼠前体成骨细胞胞膜进行荧光标记，随后进行上述层
8 -1
层自组装处理，随后以 0.5×10 L 的细胞浓度制备成细胞球，
成球后使用 DAPI 染色试剂标记细胞核，激光共聚焦显微镜
下观察并采集图片。
1.4.6 细胞活性检测 以 0.5×108 L-1 的细胞浓度制备出层层
自组装 - 小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球后，用
DPBS 溶液将细胞球清洗 2 遍，根据 Live/Dead 染色试剂盒说
明书配制成染色工作液，加入细胞球中，避光孵育 20 min，
荧光显微镜下观察并采集图片。对细胞球内细胞活力、死细
胞占比进行统计分析，细胞活力 = 活细胞数 / 细胞总数，死
细胞占比 = 死细胞数 / 细胞总数。
1.4.7 氯化钙溶液细胞毒性检测 取处于对数生长期的小鼠
8 -1
前体成骨细胞用胰蛋白酶消化，配制成细胞浓度为 0.5×10 L
的细胞悬液，96 孔细胞培养板中每孔加入 100 µL 细胞悬液，
然后置于 37 ℃细胞培养箱中培养 24 h。24 h 后，去除每孔中
的培养基，换入新鲜培养基，每孔再加入 0.625 µL 不同浓度
的氯化钙溶液 ( 浓度分别为 0，0.05，0.1，0.2 mol/L)，每组
设置 5 个复孔。氯化钙溶液处理 4 d 后，再次去除每孔旧培
养基，加入含有 10%CCK-8 溶液的新鲜培养基，培养箱中继
续孵育 2 h。孵育结束后，使用酶标仪测定激发波长 450 nm
处光吸收值。
1.4.8 细胞增殖检测 层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞和小
鼠前体成骨细胞重悬后，制备成细胞浓度为 0.25×10 L 的
细胞悬液，96 孔细胞培养板中每孔加入 100 µL 细胞悬液，
中的培养基，加入含有 10%CCK-8 溶液的新鲜培养基，培养
箱中继续孵育 2 h。孵育结束后，使用酶标仪测定激发波长
450 nm 处光吸收值。
1.4.9 细胞成骨活性检测 以 0.5×108 L-1 的细胞浓度制备出层
层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球，于
完全培养基中继续培养 4 d，将细胞球收集于离心管中，离心
并去除培养基，用 DPBS 溶液清洗 2 遍。根据碱性磷酸酶染
色试剂盒说明书配制染色工作液，加入离心管中，避光孵育
15 min，光学显微镜下观察并采集图片。统计分析碱性磷酸
酶染色结果，碱性磷酸酶染色百分比 = 染色阳性区域面积 /
细胞球总面积 ×100%。
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细胞球在完全培养基中继续培养 4 d 后，将细胞球收集 脂糖凝胶微孔板中细胞间彼此聚集形成了理想的细胞球，见
于离心管中，1 500 r/min 离心 5 min，去掉旧培养基。每只 图 2d。
离心管中加入 1 mL Trizol 试剂，反复吹打，然后按照 Trizol 2.2 琼脂糖凝胶微孔板的成球效率 琼脂糖凝胶微孔板能在
试剂说明书提取细胞总 RNA。根据反转录试剂盒说明书和各 一次实验中批量形成细胞球，见图 3a。同时，通过改变细胞
组 RNA 浓度计算应用于反转录的各样本加样量，采用 10 µL 悬液浓度可精准调控微孔中形成的细胞球大小，见图 3b。激
体系将 RNA 反转录为 cDNA，然后进行 real-time PCR 实验。 光共聚焦显微镜下观察发现，层层自组装 - 小鼠前体成骨细
反应体系为 10 µL，即 cDNA 0.8 µL、上下游引物各 0.4 µL、 胞球内部连接紧密，在收集及染色过程中不易破碎、分解，
SYBR 5 µL、无酶水 3.4 µL；按 SYBR 说明书设定相应反应程序： 见图 3c。在相同的细胞铺板密度下 (0.5×108 L-1)，层层自组装 -
95 ℃反应 3 min；之后 95 ℃反应 10 s，60 ℃反应 1 min，该 小鼠前体成骨细胞所形成的细胞球直径为 (74.49±2.69) µm，
反应过程循环 40 次；然后 65 ℃反应 5 s；最后 95 ℃处理 5 s 小鼠前体成骨细胞球直径为 (62.1±1.41) µm，二者之间比较
结束反应。每个样品设 3 个复孔。引物序列如下，GADPH 为 差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图 3d。
内参。引物设计见表 1。 2.3 层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细

表 1 ｜引物序列
胞球的活性比较 Live/Dead 染色发现，层层自组装 - 小鼠
Table 1 ｜ Primer sequences 前体成骨细胞球内细胞活性较未经处理的小鼠前体成骨细
基因 引物序列 胞 球 更 好， 见 图 4a； 层 层 自 组 装 - 小 鼠 前 体 成 骨 细 胞 球
Ⅰ型胶原 F: GGC TCT AGA GGT GAA CGT GG 内的活细胞占比高于小鼠前体成骨细胞球 (0.489±0.021，
R: CAC CAG GGG CAC CAT TAA CT
Osterix F: CCT CTC GAC CCG ACT GCA GAT C 0.386±0.014，P < 0.05)，而球内的死细胞占比低于小鼠前
R: AGC TGC AAG CTC TCT GTA ACC ATG AC
体 成 骨 细 胞 球 (0.511±0.021，0.614±0.0136，P < 0.05)， 见
Runx2 F: GAA TGG CAG CAC GCT ATT AAA TCC
R: GCC GCT AGA ATT CAA AAC AGT TGG 图 4b。
GAPDH F: TGA GGT GAC CGC ATC TTC TTG
R: TGG TAA CCA GGC GTC CGA TA
小鼠前体成骨细胞与各浓度氯化钙溶液共培养后，各组
在激发波长为 450 nm 处的吸光度值间均未表现出明显差异
1.5 主要观察指标 显微镜下观察琼脂糖凝胶微孔板的成球 (P > 0.05)，见图 4c，表明细胞成球时使用的 0.1 mol/L 氯化
效果及成球效率，染色比较球体内部细胞活性及细胞成骨活 钙溶液并不会影响细胞活性。
性。 除此之外，实验中还检测了层层自组装技术对细胞增
1.6 统计学分析 Image J 软件用于图片分析，所有数据表示 殖能力的影响，与小鼠前体成骨细胞组相比，第 1 天和第 4
-
为 x±s，组间比较使用 SPSS 19.0 软件，进行单因素 ANOVA 天层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞并没有表现出增殖受抑制
分析。P < 0.05 被认为差异有显著性意义。Graph pad Prism 5 的现象；第 4 天时其增殖能力甚至较小鼠前体成骨细胞有
软件用于绘制统计图表。 所改善，两组之间比较差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图
4d。
2 结果 Results 碱性磷酸酶染色结果表明在没有添加成骨诱导液的条件
2.1 层层自组装技术及琼脂糖凝胶微孔板的细胞成球效果 下，层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球的成骨活性较小鼠前
为了验证倒金字塔结构和琼脂糖凝胶对细胞成球的有效性， 体成骨细胞球维持得更好，而且在染色过程中层层自组装 -
将不同实验条件进行组合并进行验证，得到以下结果：未经 小鼠前体成骨细胞球形态保持良好，小鼠前体成骨细胞球则
处理的小鼠前体成骨细胞在普通孔板中贴壁生长；在琼脂糖 已部分破裂，见图 5a；统计分析结果显示，层层自组装 -
凝胶涂层孔板中，细胞与基底的黏附被隔绝，散在悬浮于培 小鼠前体成骨细胞球的成骨活性高于小鼠前体成骨细胞球
养基中；而在琼脂糖凝胶微孔板中，未经处理的小鼠前体成 (0.519±0.027，0.314±0.058，P < 0.05)，见图 5b。
骨细胞聚集成球，见图 2a。经过海藻酸钠涂层处理的小鼠 RT-PCR 检测结果表明，层层自组装 - 小鼠前体成骨细
前体成骨细胞在普通孔板中贴壁生长，细胞形态同未经处理 胞球中的Ⅰ型胶原和 Osterix 基因表达高于小鼠前体成骨细
的小鼠前体成骨细胞相近；在琼脂糖凝胶涂层孔板中呈单个 胞球组 (P < 0.05)，两组间 Runx2 基因表达比较差异无显著性
细胞悬浮状态；在琼脂糖凝胶微孔板中未能形成理想的细胞 意义 (P > 0.05)，见图 5c。
团块，见图 2b。使用明胶涂层的小鼠前体成骨细胞，在普
通孔板中细胞黏附性好，细胞铺展略受限；在琼脂糖凝胶涂 3 讨论 Discussion
层之上仍为散在悬浮状；而在琼脂糖凝胶微孔板中也未能实 细胞之间互相黏附聚集成团块是发生在胚胎形成和器官
[17]
现细胞间的聚集，见图 2c。层层自组装 - 小鼠前体成骨细 形成中的一种自然现象 ，细胞球三维培养模型还原了这一
[3，18]
胞在普通孔板保持贴壁状态，但早期呈未完全铺展的细胞形 生理过程，使细胞特性得以更好地维持 ，因此该模型在
[19]
态；位于琼脂糖凝胶涂层孔板中时悬浮于培养基中，而在琼 骨组织工程领域得到广泛认可 。

556｜中国组织工程研究｜第26卷｜第4期｜2022年2月
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a b c
明胶 海藻酸钠 明胶 海藻酸钠

层层自组装 - 小鼠前
体成骨细胞预处理

丙烯酸模具 琼脂糖凝胶微孔板

琼脂糖 氯化钙 图注：a 为层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球和琼脂糖凝胶微孔板的制

琼脂糖凝胶微孔板及 溶液
细胞球制备 备示意图；b 为聚丙烯酸模具；c 为以聚丙烯酸模具为模板制备的琼脂
丙烯酸模具 琼脂糖凝胶微孔板
糖凝胶微孔板，白色箭头为琼脂糖凝胶微孔板中的倒金字塔样微孔
图 1 ｜琼脂糖凝胶微孔板制备及细胞球成形示意图
Figure 1 ｜ Schematic diagram of the preparation of agarose microwell plate and cell spheroids formation
层层自组装 - 小鼠
a 小鼠前体成骨细胞球 前体成骨细胞球 b
普通细胞培养板 琼脂糖凝胶涂层培养板 琼脂糖凝胶微孔板 0.6 P < 0.05
a

活细胞占比
0.4
小鼠前体成骨细胞
0.2

0
海藻酸钠 - 小鼠前体 1 2
成骨细胞
b

0.8 P < 0.05

0.6

死细胞占比
明胶 - 小鼠前体成骨 c 0.4
细胞
0.2
0
1 2

层层自组装 - 小鼠 d c d 1
前体成骨细胞 1.6 5 P < 0.05 2
1.5 4
1.4 3
A值

A值
1.3 2
1.2 1
1.1 0
图注：a 为未经处理的小鼠前体成骨细胞在 3 种培养板上的成球效果， 0 0.05 0.1 0.2 第1天 第4天
氯化钙浓度 (mol/L)
在琼脂糖凝胶微孔板聚集成球；b 为海藻酸钠包裹的小鼠前体成骨细胞
在 3 种培养板上的成球效果，均未成球；c 为明胶包裹的小鼠前体成骨 图注：a 为两种细胞球 Live/Dead 染色结果，比例尺 =100 µm；b 为 Live/
细胞在 3 种培养板上的成球效果，均未成球；d 为层层自组装 - 小鼠前 Dead 染色结果的统计分析，1 代表小鼠前体成骨细胞球，2 代表层层自
体成骨细胞在 3 种培养板上的成球效果，在琼脂糖凝胶微孔板聚集成球。 组装 - 小鼠前体成骨细胞球；c 为氯化钙溶液的 CCK-8 细胞毒性测试，
比例尺 =100 µm 氯化钙溶液未影响细胞活性；d 为两种细胞球中细胞的增殖能力检测，
图 2 ｜层层自组装技术及琼脂糖凝胶微孔板的细胞成球效果 1 代表小鼠前体成骨细胞球，2 代表层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球
Figure 2 ｜ Effects of agarose microwell plate and layer-by-layer self- 图 4 ｜小鼠前体成骨细胞球和层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球的细胞
assembly technology in cell spheroids formation 活力和增殖能力比较
Figure 4 ｜ Comparison of cell viability and osteogenesis of MC3T3-E1 cell
spheroids and LBL-MC3T3-E1 cell spheroids in mice
a b
层层自组装 - 小鼠 b
a 小鼠前体成骨细胞球 前体成骨细胞球 80
碱性磷酸酶染色百分比

P < 0.05
60

40
0.25×108 L-1 0.5×108 L-1
20

0
PKH26/DAPI 明场 1 2
d 100
c P < 0.05 c
P < 0.05
细胞球直径 (μm)

80
Ⅰ型胶原 mRNA 表达量

Runx2 mRNA 表达量

Osterix mRNA 表达量

1.5 1.5 2.0

P < 0.05
60 1.5
1.0 1.0
40 1.0
0.5 0.5
20 0.5
0 鼠 0 0 0
成 - 小球 1 2 1 2 1 2
体 装
前 球 组 细胞
鼠 自
小 细胞 层 成骨 图注：a 为两种细胞球碱性磷酸酶染色结果，比例尺 =100 µm；b 为碱
骨 层 体
前 性磷酸酶染色结果统计分析，1 代表小鼠前体成骨细胞球，2 代表层层
图注：a 为琼脂糖凝胶微孔板批量制备的细胞球，比例尺 =100 µm；b 自组装 - 小鼠前体成骨细胞球；c 为 RT-PCR 技术检测细胞球成骨相关基
8 -1 8 -1
为在 0.25×10 L 和 0.5×10 L 两种细胞浓度下形成的不同大小的细胞球， 因表达的结果，1 代表层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球，2 代表小鼠
比例尺 =100 µm；c 为细胞膜染色后，激光共聚焦显微镜下观察层层自 前体成骨细胞球
组装 - 小鼠前体成骨细胞球，比例尺 =25 µm；d 为小鼠前体成骨细胞球 图 5 ｜小鼠前体成骨细胞球和层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球的成骨
和层层自组装 - 小鼠前体成骨细胞球大小比较 活性比较
图 3 ｜琼脂糖凝胶微孔板的成球效率 Figure 5 ｜ Comparison of the osteogenesis of MC3T3-E1 cell spheroids and
Figure 3 ｜ Efficiency of agarose microwell plates in spheroids-forming LBL-MC3T3-E1 cell spheroids in mice

Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 26｜No.4｜February 2022｜557

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此次实验基于商品化超低吸附培养板的成球原理，对不
同培养条件进行摸索和组合，见图 6，结果表明只有琼脂糖
凝胶微孔板能形成大小均匀、形态规则且致密的细胞团块，
即细胞球。首先，聚丙烯酸模具内部结构与商品化超低吸附
培养板相似，整齐排列的倒金字塔微孔结构为细胞聚集提供
空间。琼脂糖凝胶具有良好的可塑性，其表面缺乏细胞黏附
[7，20]
位点 ，通过复刻聚丙烯酸模具内部结构制备出培养细胞
成球的凝胶微孔板。细胞成球过程中分配到每个微孔中的细
胞数量恒定，形成的细胞球大小均匀、形态规则，有利于实
验的展开；一次实验中能批量形成细胞球，实现量产；通过
改变细胞密度实现细胞球大小的精准调控，可以满足不同的
实验需求。上述实验结果均验证了琼脂糖凝胶微孔板在提高
实验效率方面的可行性。其次，在节约经济成本方面，聚丙
烯酸模具和琼脂糖均价格低廉、易获取，且可以反复消毒和
使用。此外，在节约时间成本方面，制备一块琼脂糖凝胶微
孔板大约需要 15 min，在较短的时间内可以并行制备多块，
提高了细胞球的成球效率，进一步提升了琼脂糖凝胶微孔板
的性价比。综上所述，此次实验中构建的琼脂糖凝胶微孔板
可以作为商品化超低吸附培养板的良好替代品。
层层自组装技术 琼脂糖凝胶涂层培养板
层层自组装
琼脂糖凝胶
聚丙烯酸模具
成球效果
图 6 ｜细胞球三维培养条件组合及成球效果总结
Figure 6 ｜ Combination of three-dimensional culture conditions and the
summary of cell spheroids forming effects
在琼脂糖凝胶微孔板的辅助下细胞聚集成球，恢复了
生理条件下的空间结构，但这也只是在宏观层面上对细胞的
生存环境进行了重塑，还原了宏观环境，而细胞所处的细胞
[21]
外基质也可以在微观层面上影响其命运，调节其功能 。 玲婕、张舒淇和李雨舟在数据处理及论文写作中给予帮助，季平和杨生
因此为了恢复细胞外微观环境，实验中采取了层层自组装技 审校。
[4]
术，利用明胶和海藻酸钠进行细胞表面修饰 。明胶是一类 81500894，82001081) 及重庆市研究生导师团队建设项目 (dstd201806)”
生物安全性良好的胶原水解产物，与生理性细胞外基质相 的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观
，带正电荷的明胶虽然能沉积在带负电荷的细胞表面， 结果的统计分析及其报道。
[22-23]
似
为细胞重塑细胞外基质，但是细胞之间缺乏相互聚集黏附的 存在利益冲突。
条件，因此不适合单独应用于细胞球培养。而海藻酸钠是一
[24-25]
种广泛应用到组织工程中的聚合阴离子生物材料 ，能与
钙离子交联形成凝胶，但电荷相斥导致海藻酸钠不能沉积在 重。
细胞表面，不能进行细胞外基质的重塑。二者联合应用时，
明胶既能与细胞表面结合，也可以与海藻酸钠反应，在细胞
表面形成明胶 / 海藻酸钠超薄基质层，并在氯化钙作用下细 家审核。
558｜中国组织工程研究｜第26卷｜第4期｜2022年2月
研究原著
胞互相聚集黏附形成细胞球，实现宏观环境和微观环境的双
重重塑。此外，明胶和海藻酸钠还具备细胞因子负载和释
放的能力，可以进一步用于细胞改造，改善细胞状态及功
[26-28]
能 。
在培养过程中明胶 / 海藻酸钠基质层一定程度上限制了
细胞的伸展，使其更接近于那些生理条件下在无定形外基质
中的细胞。而明胶 / 海藻酸钠基质层的加入使细胞间的连接
更紧密，球体的力学强度得到改善，形成的细胞球在染色过
程中不易分解，这一性能的改善也为后续实验的展开带来了
更多的可操作性。通过层层自组装技术获得的细胞外基质层
增大了单个细胞的表面积 / 体积比，在球内撑开了细胞间的
间隙，为氧气、营养物质和代谢产物在球内的交换和运输提
[5，26，29]
供了通道 ，从而改善了细胞球内部的细胞死亡现象，
更好地维持了细胞的成骨能力。
实验也存在一定的局限性：尽管证明了层层自组装技
术和琼脂糖凝胶微孔板可应用于小鼠前体成骨细胞球三维培
养，并改善了球体内部细胞的活性，但其在体外培养过程中
的成骨能力还有待进一步验证，能否应用于体内骨组织再生
还有待进一步研究。由于理想的骨组织再生涉及血管重建问
[30-31]
题 ，因此在未来使用基于层层自组装 - 小鼠前体成骨细
琼脂糖凝胶微孔板
胞和上皮细胞的三维共培养模型，可能有助于进一步探索骨
组织再生策略。
综上所述，实验结合琼脂糖凝胶和聚丙烯酸模具成功
建立了一种新的细胞球三维培养模型，即琼脂糖凝胶微孔
板，该方法成本低廉、实验条件简单，是商品化超低吸附
培养板的良好替代品。进一步使用层层自组装技术及明胶
和海藻酸钠进行细胞外基质重塑，在此基础上成功构建细
胞球，同时还原了细胞宏观及微观生理环境，并验证了明
胶 / 海藻酸钠基质层改善细胞球内部氧气、营养物质及代谢
产物转运困难的能力，为骨组织工程进一步研究提供依据
和思路。
致谢：特别感谢重庆医科大学重庆市口腔疾病与生物医学重点实验
室及各位工作人员对实验的指导和帮助。
作者贡献：实验设计与实施为何云影，实验评估为季平和杨生，李
经 费 支 持： 该 文 章 接 受 了“ 国 家 自 然 科 学 基 金 (82071115，
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与
报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行 3 次查
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符
合期刊发稿宗旨。
生物统计学声明：该文统计学方法已经重庆医科大学生物统计学专
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文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协 [15] EMAMI Z, EHSANI M, ZANDI M, et al. Controlling alginate oxidation
议。 conditions for making alginate-gelatin hydrogels. Carbohydr Polym.
开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》 2018;198:509-517.
“署名 - 非商业性使用 - 相同方式共享 4.0”条款，在合理引用的情况下， [16] MAJIDI SS, SLEMMING-ADAMSEN P, HANIF M, et al. Wet electrospun
允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任 alginate/gelatin hydrogel nanofibers for 3D cell culture. Int J Biol
何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为 Macromol. 2018;118(Pt B):1648-1654.
之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。 [17] ACHILLI TM, MEYER J, MORGAN JR. Advances in the formation, use
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