‫מגן לחלבון‬

‫שכפול ‪ - DNA‬חלק ‪2‬‬

‫סמסטר א' תשפ"א ‪2020-2021‬‬

‫נועה גודין ‪godinn@post.bgu.ac.il‬‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫מניעת התנתקות של ‪ DNA‬פולימרז ‪ DNA -‬קלאמפ‬
‫בעיה‪:‬‬
‫לכל ‪ DNA‬פולימרז יש יכולת פרוססינג מוגבלת‪ ,‬למרות שהיא גבוהה‬
‫יחסית‬

‫פתרון‪:‬‬
‫סליידינג ‪ DNA‬קלאמפ )‪(clamp‬‬
‫קומפלקס חלבוני טבעתי‬ ‫‪-‬‬

‫כל החלבונים על אותו פפטיד או על פפטידים נפרדים‪ ,‬תלוי‬ ‫‪-‬‬

‫באורגניזם‬

‫מנגנון הפעולה זהה בכולם‬ ‫‪-‬‬

‫מבנה טבעתי סוגר על ה ‪DNA‬‬ ‫‪-‬‬

‫נקשר ל ‪ DNA‬פולימרז‬ ‫‪-‬‬

‫מבנה טבעתי הוא סגור ולא יכול ליפול ממולקולת ה ‪DNA‬‬ ‫‪-‬‬

‫סיכוי של ה ‪ DNA‬פולימרז ליפול קטן‬ ‫‪-‬‬

‫הגברה של הפרוססיביות‬ ‫‪-‬‬

 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫מניעת יצירת ‪ DNA‬חד גדילי בגדיל המעכב‬

‫בעיה‪:‬‬
‫‪ DNA‬חד גדילי עלול להצטבר בגדיל המעכב מכיוון שהוא משוכפל לאט‬
‫יותר‬

‫פתרון‪:‬‬
‫קומפלקס חלבוני שמקשר את ‪ DNA‬פולימרז בכל אחד מהגדילים‬
‫ומסנכרן ביניהם מבחינת קצב‬
‫‪) holoenzyme III pol DNA -‬אנזים מלא של ‪ DNA‬פולימרז(‪:‬‬
‫‪ -‬זרועות ‪ T‬גמישות קושרות כל אחת מהפולימרזות‬
‫‪ -‬קומפלקס גמא קושר את הטבעת‬

‫הגדיל המעכב מתכופף )‪ 180‬מעלות( ‪ -‬מייצר כיווניות דומה לשתי‬ ‫‪-‬‬

‫הפולימרזות‬

‫הליקאז יעבוד בתיאום עם קומפלקס הפולימרזות‪:‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪ -‬מחובר לקומפלקס – הוא עובד מהר יותר‬
‫‪ -‬מנותק מהקומפלקס – הוא עובד לאט יותר‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫מנגנון השכפול באי קולי‬

‫על ידי ‪ DNA‬פולימרז ‪III‬‬ ‫‪-‬‬

‫הליקאז פותח את מזלג ההכפלה ויוצר שני חד‪-‬גדילים‬ ‫‪-‬‬

‫גדיל מוביל מסונתז ברצף‬ ‫‪-‬‬

 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫מנגנון השכפול באי קולי‬

‫בגדיל המעכב ‪ RNA‬פרימאז מייצר פריימר ‪ RNA‬ואז‬ ‫‪-‬‬

‫משתחרר‬

‫בינתיים )בגדיל המעכב( ‪ DNA‬פולימרז ‪ III‬מסיים‬ ‫‪-‬‬

‫לסנתז מקטע אוקזקי קודם‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫מנגנון השכפול באי קולי‬

‫‪ -‬הסליידינג קלאמפ נקשרת מסביב למבנה‬

‫פריימר חדש‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫מנגנון השכפול באי קולי‬

‫‪ DNA‬פולימרז חדש נקשר לקומפלקס‬ ‫‪-‬‬

‫ולטבעת‬

‫סינתזה של מקטע אוקזקי חדש‬ ‫‪-‬‬

‫קישור הליקאז לקומפלקס מזרז את קצב‬ ‫‪-‬‬

‫הפרדת הגדילים‬

‫שימו לב לכיוון הסינתזה והקריאה‪ ,‬עוזר מאוד בהבנת התהליך!‬

 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫אתחול השכפול ‪ -‬פרוקריוטים‬

‫נקודת אתחול השכפול )‪(Ori - Origin of replication‬‬ ‫‪-‬‬

‫קישור חלבונים לנקודת ה‪Ori -‬י)‪(DNAa‬‬ ‫‪-‬‬

‫עיוות של ה ‪ DNA‬בנקודת הקישור ודה‪-‬נטורציה מקומית של ה‪DNA -‬‬ ‫‪-‬‬

‫נוצרים שני מזלגות שכפול לכיוונים מנוגדים‬ ‫‪-‬‬

‫בכל אחד ממזלגות השכפול גדיל אחר הוא המוביל‬ ‫‪-‬‬

‫בניסוי ‪ -‬ככל שהבועה גדלה‪ ,‬המרחק ממקור השכפול גדל לשני הכיוונים‬ ‫‪-‬‬
‫= שני מזלגות הכפלה‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫אתחול השכפול ‪ -‬אאוקריוטים‬

‫קצב שכפול נמוך יחסית לפרוקריוטים‬ ‫‪-‬‬

‫יותר ‪DNA‬‬ ‫‪-‬‬
‫יותר בקרה‬ ‫‪-‬‬

‫בכל כרומוזום אלפי נקודות ‪Ori‬‬ ‫‪-‬‬

‫יחידת ‪ DNA‬בין שני ‪ Ori‬נקראת רפליקון‬ ‫‪-‬‬

‫נפתחים במקביל בכל הכרומוזום‪/‬ים‬ ‫‪-‬‬

‫לקיצור זמן שכפול ה ‪ DNA‬וחלוקת התא‬ ‫‪-‬‬

‫קישור חלבונים לנקודת ה‪Ori -‬י)‪(initiator proteins‬‬ ‫‪-‬‬

‫קיימת תחרות בין חלבונים אלה לבין חלבונים המונעים פתיחת‬ ‫‪-‬‬
‫בועת שכפול‬
‫לפי כמות כ"א מהחלבונים נקבע האם יתקיים שכפול או לא‬ ‫‪-‬‬

‫עיוות של ה‪ DNA -‬בנקודת הקישור ודה‪-‬נטורציה מקומית של ה ‪DNA‬‬ ‫‪-‬‬

‫נוצרים שני מזלגות שכפול לכיוונים מנוגדים‬ ‫‪-‬‬

‫בכל אחד ממזלגות השכפול גדיל אחר הוא המוביל‬ ‫‪-‬‬

 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫סיכום תהליך השכפול )אאוקריוטים ופרוקריוטים(‬
‫ה ‪ DNA‬נפתח )הפרדת שני הגדילים( בנקודה ספציפית הקרויה ‪Origin of Replication‬‬ ‫‪-‬‬

‫אנזים הליקאז מקדם את מזלג הכפול ומפריד בין שני הגדילים לשני הכיוונים ממזלג השכפול‬ ‫‪-‬‬

‫חלבונים קושרי חד‪-‬גדיל )‪ (ssbp‬נקשרים לכל אחד מהגדילים ע"מ למנוע זיווג בסיסים‬ ‫‪-‬‬

‫טופואיזומראז )גיראז( נקשר באיזור המקדים להליקאז )בכיוון התנועה של הליקאז( כדי למנוע סופר‪-‬קוילינג‬ ‫‪-‬‬

‫פרימאז מייצר פריימרים של ‪ RNA‬על ה ‪DNA‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪ DNA‬פולימרז מתחיל לסנתז גדיל חדש ‪ -‬מוסיף נוקלאוטידים לקצה ‪ '3‬של הגדיל המתהווה ‪ -‬אלונגציה של הגדיל‬ ‫‪-‬‬
‫המוביל והמעכב יחד‬

‫פריימרים של ‪ RNA‬מוסרים על‪-‬ידי פעילות של אקסונוקלאז )פרוקריוטים ‪ DNA -‬פולימרז ‪ ,II‬אאוקריוטים ‪RNAseH -‬‬ ‫‪-‬‬
‫ואקסונוקלאז(‬

‫מילוי קשרים פוספודיאדטריים חסרים )בין גדיל חדש שסונתז לבין פריימר שהיה קיים( על‪-‬ידי ‪ DNA‬ליגאז‬ ‫‪-‬‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫סיום השכפול באאוקריוטים ‪ -‬בעיית הטרמינציה‬

‫בעיה‪:‬‬
‫‪ DNA‬פולימרז יכול לסנתז את הגדיל החדש על הגדיל‬ ‫‪-‬‬
‫המוביל עד הקצה של הגדיל המוביל‪.‬‬

‫בגדיל המעכב‪ ,‬כדי לסנתז על כולו גדיל חדש‪ ,‬פריימר ה‬ ‫‪-‬‬

‫‪ RNA‬האחרון צריך להיות בקצה‬

‫אחרי הסרת הפריימר נשאר ‪ DNA‬חד גדילי שאי אפשר‬ ‫‪-‬‬

‫לזווג כי אין טמפלט לפניו‬

‫קצה הגדיל המעוכב לא יכול להיות משוכפל‬ ‫‪-‬‬

‫הכרומוזום מתקצר בכל שכפול‬ ‫‪-‬‬
‫עלולים להפגע גנים חיוניים‬ ‫‪-‬‬
‫איך אפשר למנוע איבוד של מידע גנטי חשוב?‬ ‫‪-‬‬

‫פתרון‪:‬‬
‫האנזים טלומרז‬ ‫‪-‬‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫סיום השכפול באאוקריוטים ‪ -‬בעיית הטרמינציה‬

‫האנזים טלומרז‬

‫יודע לעשות פעילות של ‪reverse transcriptase‬‬ ‫‪-‬‬

‫יצירת ‪ DNA‬על בסיס תבנית ‪RNA‬‬ ‫‪-‬‬

‫מכיל טמפלט של ‪ RNA‬שמשלים ומסוגל להיות מזווג לקצוות של‬ ‫‪-‬‬

‫כרומוזומים ליניארים‬

‫פעילות של ‪ DNA‬פולימרז‬ ‫‪-‬‬

‫נקשר לקצה של הכרומוזום שצריך להאריך דרך זיווג בסיסים עם ה‬ ‫‪-‬‬

‫‪ DNA‬הלא מזווג‬

‫נשאר מקטע ‪ RNA‬חופשי של הטלומרז‬ ‫‪-‬‬

‫‪ DNA‬פולימרז מתיישב על ההטרו‪-‬קומפלקס ומייצר את סוף הכרומוזום‬ ‫‪-‬‬

‫מ ‪ '5‬ל ‪ '3‬של הגדיל החדש עד השלמתו‬

‫קצה הכרומוזום נקרא "טלומר"‬ ‫‪-‬‬

 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫סיום השכפול באאוקריוטים ‪ -‬בעיית הטרמינציה‬
‫טלומרז קיים במרבית האורגניזמים‬ ‫‪-‬‬

‫נמצא בתאי המין וקצת בשלבים הראשונים של יצירת הזיגוטה‬ ‫‪-‬‬

‫תאי המין מייצרים טלומרים ארוכים לדור הבא כדי לאפשר לתאים בוגרים שאין‬ ‫‪-‬‬
‫בהם טלומרז לא לאבד תפקוד‬

‫תאים סומטיים הומנים חסרים פעילות טלומרז‬ ‫‪-‬‬

‫הטלומר מתקצר בזמן השכפול של ה‪ DNA -‬בתא סומטי‬ ‫‪-‬‬

‫בתאים סומטיים הרצף המשלים ל ‪ RNA‬של הטלומרז חוזר על עצמו פעמים רבות‬ ‫‪-‬‬
‫כתוצאה מפעילות הטלומרז בתאי מין בראשית ההתפתחות‬

‫גם אחרי הארכת הקצה של ה ‪ DNA‬נשאר ‪ DNA‬חד גדילי שלא ניתן להשלים‬ ‫‪-‬‬

‫כרומוזומים מסתיימים בחריגה של הגדיל המוביל מעבר לאורך הגדיל המעכב‬ ‫‪-‬‬
‫קצה הגדיל המוביל הוא ‪'3‬‬ ‫‪-‬‬
‫לחריגה קוראים ‪overhang‬י‪'3‬‬ ‫‪-‬‬
‫מבנה מעגלי להגנה מפני עיכול אנזימטי‬ ‫‪-‬‬
‫קצה ללא חריגה נקרא ‪blunt end‬‬ ‫‪-‬‬
 ‫שכפול ‪DNA‬‬
‫שכפול ‪ DNA‬בוירוסים ובפלסמידים‬

‫מנגנון ‪rolling circle‬‬ ‫‪-‬‬

‫יצירת ניק )פירוק קשר פוספודיאסטרי(‬ ‫‪-‬‬

‫קצה ‪ '3‬משוחרר וקצה ‪ '5‬משוחרר‬ ‫‪-‬‬

‫הפרדה של הגדיל מכיוון ‪'5‬‬ ‫‪-‬‬

‫הוספת נוקלאוטידים לקצה ‪'3‬‬ ‫‪-‬‬

‫נוצרת מולקולה דו גדילית תוך שחרור מולקולה חד גדילית‬ ‫‪-‬‬

‫הגדיל החדש מתאחד בקשר פוספודיאסטרי עם המולקולה החד‪-‬‬ ‫‪-‬‬

‫גדילית שהשתחררה‬

‫גדיל חדש מסונתז על החד גדילית‬ ‫‪-‬‬