FISIOLOGIA I METABOLISME MICROBIANS

2ª Setmana

Catabolisme de carbohidrats.

GUIA DE LECTURA

Aquest document acompanya el paquet de tres articles que es citen a continuació.

ARTICLE nº 1
Peekhaus N, Conway T. 1998. What's for dinner?: Entner-Doudoroff metabolism in Escherichia
coli. J Bacteriol. 180:3495-3502.

ARTICLE nº 2
Chang DE, Smalley DJ, Tucker DL, Leatham MP, Norris WE, Stevenson SJ, ANderson AB,
Grissom JE, Laux DC, Cohen PS, Conway T. 2004. Carbon nutrition of Escherichia coli in the
mouse intestine. Proc Natl Acad Sci USA. 101:7427-7432.

ARTICLE nº 3
Fuhrer T, Fischer E, Sauer U. 2005. Experimental identification and quantification of glucose
metabolism in seven bacterial species. J Bacteriol. 187:1581-1590.

Tradicionalment, s'ha considerat que la glucosa és un substrat gairebé universal, i que la

degradació de glucosa per la via d'Embden-Meyerhoff-Parnas que és la que utilitzen els
eucariotes, és també la predominant en procariotes. Aquesta creença ha estat reforçada pel fet
que Escherichia coli que és el microorganisme més extensament estudiat en el laboratori, degrada
la glucosa per aquesta via. Aquests articles ens proporcionen informació que qüestiona aquest
punt de vista. En els articles 1 i 2 veurem com en el seu habitat natural, Escherichia coli NO creix
utilitzant glucosa i NO utilitza la via d'Embden-Meyerhoff-Parnas. En l'article 3 veurem indicis que
pot-ser la via d'Embden-Meyerhoff-Parnas NO és la via degradativa universalment utilitzada que
sempre havíem pensat que era.

ARTICLE 1

En aquest article es fa una revisió del metabolisme d' Escherichia coli quan creix en l'intestí. La
revisió és extensa i tracta diferents aspectes del que es coneix del metabolisme d'aquest bacteri.
La meva recomanació, però, és que et concentris en els quatre primers apartats:
 - Introduction
- Overview of the ED pathway
- Ecology of the mammalian large intestine
- Substrates of the ED pathway may provide a nutritional niche for E. coli in the large intestine.
així com en la Discussió

QÜESTIONS

A grans trets, quina és la distribució filogenètica de la via d'Entner-Doudoroff

Es troba als tres grans dominis filogenètics

Desde un punt de vista evolutiu, quina seria més antiga, la via d'Entner-Doudoroff o la de Embden-
Meyerhoff-Parnas?

La via d’Entner-Doudoroff

Apart de la via d'Entner-Doudoroff -quines dues altres vies de degradació de carbohidrats són
importants en procariotes?

La d’Embden-Meyerhoff-Parnas i la de la pentosa fosfat

La degradació de carbohidrats fins a piruvat es pot portar a terme per diferents vies degradatives.
Quines són?

La d’Entner-Doudoroff i la d’Embden-Meyerhoff-Parnas

Aquestes vies degradatives presenten una seqüència de reaccions idèntica en totes elles. De
quina seqüència de reaccions es tracta?

Totes les reaccions comencen amb glúcids amb 6 carbonis que es fosforilen i després una
aldolasa trenca la molècula, fent-ne 2 de 3 carbonis. La diferència es troba en els glúcids de 6
carbonis.

Tant la via d'Emben-Meyerhoff-Parnas com la via d'Entner-Doudoroff activen sucres de 6 carbonis

per fosforilació, i posteriorment els trenquen en fragments més petits mitjançant aldolases. Quin és
l'enzim clau que diferencia aquestes dues vies?

L’enzim 6-fosfogluconat deshidrogenasa que es troba a la via d’Entner-Doudoroff

Quantes especies bacterianes es pensa que coexisteixen en l'intestí?

Entre 400 i 500 espècies diferents

Quina teoria s'ha utilitzat per explicar aquesta coexistència? Explica-la.

Es creu que és degut a la teoria del nínxol, és a dir, que els bacteris aprofiten els nutrients que hi
ha present als budells segons la disponibilitat que hi hagi, per tant, es generaran diferents nínxols
en funció d’aquesta disponibilitat. A més segons la teoria, les diferents espècies de bacteris tenen
preferència per un nutrient o substrat en concret, per la qual cosa, podran haver-hi tants nínxols
com substrats hi hagi i permetrà que hi puguin coexistir nombroses espècies de bacteris i el seu
creixement vindrà determinat per la disponibilitat que hi hagi d’aquell nutrient.

Quin tipus de substrats necessiten la majoria dels bacteris intestinals? Quina procedència tenen?

Es necessiten carbohidrats fermentables que provenen dels aliments que s’estan digerint, de les
secrecions produïdes pels humans i dels mucus que recobreixen l’intestí. Hi ha d’altres que
provenen dels teixits musculars.

Quina composició té el mucus que recobreix l'intestí i quins sucres s'hi poden trobar?

Està fet de glicoproteïnes o glicolípids com glucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina,

galactosa, fucosa, àcid siàlic, glucuronat i galacturonat.

El gen eda codifica la KDPG aldolasa, un dels enzims clau de la via d'Entner-Doudoroff. Swenney i
col.laboradors van portar a terme un experiment en el s'inactivaba el gen eda mitjançant una
inserció. Quines conseqüències tenia aquesta inactivació respecte a la utilització de substrats? I
respecte a la capacitat de créixer en el mucus?

La inactivació provocava que la E.coli no pogués créixer amb medis amb substrats com el
gluconat, glucuronat i galacturonat. El tenir el gen eda inactivat feia que el mutant no tingués la
capacitat per colonitzar l’intestí gros del ratolí i per tant, no podia créixer en el mucus.

ARTICLE 2

Com a "expression profiling" entenem la realització d'un estudi per determinar quin és el perfil
d'expressió gènica d'un organisme determinat. El perfil d'expressió gènica (entès com el conjunt
de gens que s'estan expressant en cada moment) variarà depenent de les condicions a les que el
microorganisme estigui exposat (temperatura, salinitat, pH, tipus de font de carboni, etc). En
aquest article s'estudia el perfil d'expressió gènica d' Escherichia coli quan creix en mucus que és
el substrat en el que suposadament creix quan està en l'intestí. La metodologia per analitzat perfils
d'expressió gènica utilitzant xips de DNA la pots trobar descrita de forma relativament senzilla en
un article de Duggan et al. publicat l'any 1999 a Nature Genetics i del qual t'adjunto el link.
http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/ng/journal/v21/n1s/abs/ng0199supp_10.html
Per tal de veure quins gens s'indueixen quan E. coli creix utilitzant els nutrients intestinals, els
autors intenten simular les condicions nutricionals de l'intestí gruixut realitzant dos tipus
d'experiments, els que anomenen "low mucus" amb una concentració de 5 mg/ml de mucus, els
que anomenen "PH1" amb 10 mg/ml de mucus, analitzats a l'inici de la fase de creixement
exponencial (Fase 1), i els que anomenen "PH2", crescuts també amb 10 mg/mL de mucus però
analitzats al final de la fase de creixement exponencial (Fase 2).

QÜESTIONS

En quina forma es troben la major part dels carbohidrats que hi ha en el colon?

En forma polimèrica

Amb quina tècnica s'ha pogut determinar que Escherichia coli creix en el mucus que recobreix
l'epiteli intestinal?

La hibridació per fluorescència in situ i in vitro de talls intestinals fins (FISH)

Quin és el temps de generació d'Escherichia coli quan creix a l'interior de l'intestí?

40-80 minuts

Quins gens s'indueixen de forma significativa en els experiments "low mucus"?

Els gens que estan relacionats amb les vies del catabolisme dels amino sucres. També es van
expressar gens del cicle de l’àcid tricarboxílic, la gluconeogènesi i la respiració anaeròbica.

En els experiments realitzats amb concentracions de mucus elevades, quines diferencies

d'inducció s'observen entre l'inici (Fase 1) i el final (Fase 2) de la fase de creixement exponencial?

A la fase 1 es va induir l’expressió de gens que tenien a veure amb el catabolisme del
gluconat, glucuronat, l’àcid siàlic, l’N-acetilglucosamina, maltosa, ribosa i manosa, mentre
que a la fase 2 es va induir l’expressió de gens relacionats amb la degradació de
l’etanolamina, la fucosa, la respiració anaeròbica i el cicle del l’àcid tricarboxílic.
Amb la informació obtinguda, els autors preparen diferents mutants cada un d'ells defectiu en un
dels gens dels quals s'havia observat la inducció. De cada un dels mutants s'analitza la capacitat
d'iniciar i mantenir la colonització de la mucosa intestinal. Quines conclusions en treuen els autors
d'aquests experiments realitzats amb mutants?

Van observar que el mutant amb un defecte en la via de Entner-Doudoroff va crèixer més
lent durant la iniciació i per tant també es va veure reduida la seva massa la femta durant el
manteniment de la colonització. El que tenia un defecte en el transport de NAG i
glucosamina tenia una defecte en la iniciació però no en el manteniment. El que tenia un
defecte en el catabolisme de l’àcid siàlic tenia un defecte tant a la iniciació com en el
manteniment. Els que tenien defectes en el catabolisme de la fucosa tenien una bona
iniciació però no un bon manteniment, i el mateix passa als que tenien un defecte en el
catabolisme de la manosa. Amb aquests resultats van poder arribar a la conclusió de que
els mutants que tenien un defecte en el catabolisme del glucuronat presenten més defectes
pel que fa al manteniment i a la iniciació, degut a que els que presentaven defecte en el
catabolisme del galacturonat es va veure que no afectava a la capacitat de colonització.

Segons els experiments realitzats en el laboratori amb combinacions de fonts de carboni, -quin és
l'ordre de preferència amb el que E. coli utilitza els diferents substrats que li són presentats?

1. Gluconat, 2. NAG, 3. Àcid siàlic i àcid glucurònic, 4. Manosa, 5. Fucosa, 6. Ribosa

Quina és la principal font de carboni que E. coli utilitza durant la colonització de la mucosa
intestinal?

Els sucres que deriven del mucus, com el gluconat

ARTICLE 3

Per determinar com funciona el metabolisme d'un bacteri podem seguir diferents aproximacions:
1- Podem fer una anàlisi electroforètica de quins enzims claus del metabolisme hi ha presents
(per exemple podem detectar la presencia dels enzims de la via d'Embden Meyerhoff)
2- Podem analitzar els mRNAs per veure quins gens metabòlics s'estan expressant (podríem
detectar la presencia de RNA missatger que codifiqui enzims de la via d'Embden
Meyerhoff)
3- Podem mesurar la concentració d'intermediaris metabòlics a l'interior de la cèl.lula (per
exemple Fructosa 1,6 bisP que és un dels intermediaris clau de la via d'Embden Meyerhoff)

Totes aquestes aproximacions ens permeten detectar l'existència d'una determinada via
metabòlica en l'organisme que estem estudiant però no ens diuen res sobre l'activitat d'aquesta via
metabòlica. Però no ens permeten determinar la intensitat amb que aquesta via o una altre
d'alternativa estan processant els metabolits.
L'anàlisi de fluxe metabòlic és la metodologia que ens permet quantificar la intensitat dels fluxos
de carboni a través de les diferents vies que formen la xarxa metabòlica de la cèl.lula.
En aquest article es fa una anàlisi de fluxe de les vies centrals del catabolisme de la glucosa en
diferents microorganismes que pertanyen a diversos grups filogenètics i que tenen perfils
metabòlics variats.
Pot ser que una part de l'article sigui una mica difícil de seguir perquè segurament no estàs
familiaritzat amb els mètodes experimentals i d'anàlisi de les dades, necessaris per poder realitzar
una anàlisi de fluxe metabòlic. Això no ha de ser cap impediment per poder entendre la part
principal dels resultats que està resumida en les figures 2 i 6.
Et recomano que miris amb detall els següents elements de l'article:
- Abstract
- Introduction
- Figures 2 i 6
- Discussion

QÜESTIONS

En quins microorganismes es va realitzar l'estudi?

En Agrobacterium tumefaciens, dues Pseudomones, Sinorhizobium meliloti, Rhodobacter

sphaeroides, Zymomonas mobilis i Paracoccus versutus

A quins grans grups filogenètics pertanyen?

Firmicutes, proteobacteris gamma i proteobacteris alfa

Dos dels microorganismes (Escherichia coli i Bacillus subtilis) són organismes model que han
estat utilitzats durant molts anys en estudis de laboratori. Aquest estudi indica l'existència de
diferencies importants entre la resta dels organismes estudiats i aquests microorganismes model.
Que els hi suggereixen aquestes diferencies als autors del treball?

Els hi suggereixen que la via ED es la principal per al catabolisme de la glucosa, mentre que
la via EMP era quasi absent i la via PP només tenia funció biosintètica en els
microorganismes estudiats. Per tant, els va fer pensar que el fet de recolzar la idea de que
la principal via de la degradació de la glucosa era la via EMP, es un concepte erroni, degut a
que s’han estudiat originalment amb E.coli i B. subtilis els quals presenten fluxes glicolítics
molts alts i que per tant no representen a la majoria dels microorganismes.

Quina és la via predominant de degradació de glucosa en la majoria dels microorganismes

estudiats?

La d’Entner-Doudoroff
Quina és la funció de la via de les pentoses fosfat (PP) en aquests microorganismes?

La biosíntesi de precursors de biomassa

En aquest estudi, Escherichia coli, Bacillus subtilis i Paracoccus versutus es fan créixer
aeròbicament en presència d'oxigen. Creus que els diagrames de fluxe metabòlic d'aquests tres
microorganismes que hi ha a la Figura 6 són els que caldria esperar d'un creixement aeròbic?
Explica-ho.

En el cas de E.coli i B.subtilis sí que es va obtenir un creixement esperat, encara que el flux
del cicle del TCA va ser baix, la qual cosa suggeria que podia realitzar una fermentació
aeròbica. Pel que fa a P. versutus, no era esperat que tingués una taxa catabòlica tan alta,
més alta inclús, que els microorganismes model; això es degut a adaptacions per part dels
microorganismes per crèixer al laboratori i a condicions industrials.