Alternative testiranju na

životinjama u biomedicini i
farmaciji

Kolegij: Animalni modeli bolesti dr.sc.Paola Kučan Brlić

https://speakingofresearch.com/facts/the-animal-model/
ETIČNOST
 TROŠAK
(i trajanje)

In 2020, NIH budgeted nearly $42 billion for

research and development (PETA)...
At least 115 million animals are thought to be
used for scientific purposes every year, worldwide

Meigs L, Smirnova L, Rovida C, Leist M, Hartung T. Animal testing and its alternatives - the most important omics is economics.
ALTEX. 2018;35(3):275-305. doi: 10.14573/altex.1807041. PMID: 30008008.
Johns Hopkins University
Center for Alternatives to Animal Testing (est. 1981)
 ZAVARAVAJUĆI
REZULTATI (engl.
missleading)

Richard Klausner, director of the National Cancer Institute, for the Los Angeles Times in 1998.
„The history of cancer research has been a history of curing
cancer in the mouse. We have cured mice of cancer for
decades- and it simply didn’t work in humans.”

Judah Folkman (1933-2008)

In 2004, the first angiogenesis
inhibitor, bevacizumab (Avasti
n), was approved by the FDA
https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(08)00121-
9#relatedArticles
2003, zaustavljena faza II kliničkog ispitivanja cjepiva cause liver tumor in rats, discovered after drug
za Alzheimer jer je uzrokovalo oticanje mozga (što se has been on the market for years

nije pokazalo ni kod miševa ni kod primata)

liver toxicity in 5 species

 3R in vitro

in silico in chemico ex vivo

3R
3R

other R’s
• -prvo “poboljšanje”: upotreba anestetika
• -1846. eter upotrijebljen na ljudskom pacijentu
• -ubrzo nakon toga – upotreba na životinjama u eksperimentima
• -od 1876. – u Velikoj Britaniji je obavezna upotreba anestetika za
eksperimente u kojima životinje osjećaju bol (Zakon o okrutnosti
prema životinjama, Cruelty to Animals Act)
 ex vivo
• izvan organizma

in vitro • u ili na stanicama ili tkivima

• „u staklu”, izvan živog organizma izvađenim iz organizma, u
• sredinom 20.stoljeća, jedine (humane) vanjskom okruženju s minimalnim
stanice koje su se mogle uzgojiti in vitro izmjenama prirodnih uvjeta
bile su tumorske stanice koje ne
predstavljaju pravu sliku organizma
in chemico
• danas, • korištenjem metoda abiotičke
• imamo matične stanice koje možemo kemijske reaktivnosti
usmjeriti da se razviju u određene ili sve
druge tipove stanica
• mogućnost „reverzije” već diferenciranih
stanica u matične
• 3D printanje humanih tkiva i organa
• kemija, neživo in silico
• uzgoj humanih tkiva u laboratoriju • korištenjem računala ili
• organe na čipu računalnih/informatičkih simulacija
• dostupnost humanih tkiva (donora)
• itd...
! ALI- uzgoj stanica u kulturi zahtjeva FBS
(fetalni bovine serum) i procjena je da je 1M
fetalnih krava žrtvuje da bi se to dobilo
 In silico
• In silico koristi virtualne alate
radi predikcije „ponašanja”
(interakcije i djelovanja)
različitih molekula/komponenti
• Treba: velike baze podataka
(database)- 3D strukture,
prethodna istraživanja (na
životinjama) o toksičnosti tvari,
alate (software) za analize
Put do alternative...
• Za dobivanje odobrenja relevantnih organizacija za regulatorna testiranja:
• svaka alternativna metoda mora proći provjeru (validaciju) prije no što može
zamijeniti postojeću metodu
• validacija – proces kojim se dokazuje da je metoda testiranja prihvatljiva za ono
čemu je namijenjena
• uvođenje alternativnih metoda u područja primijenjenih istraživanja zahtijeva
odobrenje od različitih nacionalnih regulatornih agencija (npr. Food and Drug
Administration) ili međunarodnih organizacija (npr. Svjetske
zdravstvene organizacije ili OECD – Organization for Economic Coordination and
Development)

•Osnovni koraci za zamjenu postojećeg regulatornog testa

novom metodom su:
•Razvoj testa (kojemu su vjerojatno prethodila bazična istraživanja)
•Predvalidacija
•Validacija
•Recenzija (neovisna procjena)
•Regulatorno prihvaćanje​
Fotografija Ova fotografija autora Nepoznat autor ima licencu CC BY-NC-ND.
Primjeri uspješnih in vitro alternativa

1. Test trudnoće na kuniću

Razvijen 1931. od strane Maurice Friedman i Maxwell Edward Lapham na
Sveučilištu Pensilvanija, korišten sve do ranih 1960-ih.
Test je koristio ubrizgavanje ženskog urina u jajnike malenih životinja. Naime,
human chorionic gonadotropin (hCG) uzrokuje deformacije jajnika (povećanje
folikula) u nekih životinja otvaranjem takvih životinja i promatranjem njihovih
jajnika znanstvenici su mogli reći je li žena čiji su urin ubrizgali trudna.
'the rabbit died' = test je pozitivan
ALTERNATIVA br.1
• LAL test (Limulus Amoebocyte Lysate) - hemolimfa praklještara
Limulus polyphemus (horseshoe crab, potkovičasti rak, rak bodljaš)
• Otkriven 1956., u upotrebi od 1970-tih, 1983 odobren od FDA kao test
za endotoxin
• Princip: hemolimfa se pomiješa s testnim uzorkom-ako su bakterijski
pirogeni prisutni u uzorku – zgrušavanje
• Biologija testa: amebociti (vrsta stanica u hemolimfi) kada dođu u
kontakt s endotoksinom, otpuštaju granule sa koagulantom-->
zgrušavanje

+ veća osjetljivost od testa na kunićima

ALI
- oko 30.000 jedinki godišnje ugiba kao posljedica uzimanja hemolimfe
- ponekad daje lažno negativne rezultate
- ponekad precijenjuje sadržaj pirogena
- ne detektira pirogene koji nisu bakterijski endotoksini (npr. Gram-
pozitivne egzotoksine, viruse, gljivice)​
ALTERNATIVA br.2
Test pirogene aktivnosti na ljudskoj krvi (WBT,
whole blood test ili MAT, monocyte activation test)

• potpuno zamijenjuje upotrebu životinja

• razrijeđenoj ljudskoj krvi se dodaje tvar koja
se testira – prisutnost pirogena će potaknuti
otpuštanje citokina (npr. IL-1β) iz monocita u
krvi
• razina proizvedenih citokina se kvantitativno
određuje pomoću enzimskog imunotesta
(ELISA)

• jeftiniji i osjetljiviji od testa na kunićima, može

detektirati čitav niz različitih pirogena (za
razliku od LAL testa)
• 2005. je test internacionalno validiran od
strane ECVAM-a (European Centre for the
Validation of Alternative Methods) a od 2010.
MAT (Monocyte-Activation Test) je službeni
test European Pharmacopoeia (EP Chapter
2.6.30).
 3. Proizvodnja monoklonskih protutijela

Hibridoma stanice se ubrizgavaju i.p.

u miša gdje se one dijele i izlučuju u
ASCITES visoke količine protutijela

Od 2000.: The Prohibition of Routine Ascites Production

of Monoclonal Antibodies in the United States
 PHAGE DISPLAY
- Metoda se zasniva na genetskoj manipulaciji
bakteriofaga
- „Strana” DNA se može ubaciti u gen bakteriofaga koji
će je onda ispoljavati kao površinski protein
(=protutijelo)- koji se onda testira ako prepoznaje/veže
drugi protein (=antigen)
npr. izolacijom B limfocita iz čovjeka  njihovi varijabilni
geni se nasumično kombiniraju i kombinacije ukloniraju u
bakteriofag koji ih onda ispoljava kao scFv
 4. Draize test
Razvijen 1944. od znanstvenika FDA, korišten do ?
• Alternative prihvaćene u nekim zemljama za tzv. Bottom-Up
pristup (testiranje započinje metodama kojima se identificiraju
tvari koje NISU iritirajuće)
ex vivo organotipski očni modeli (Ex vivo ocular organotypic models )
Metoda ispitivanja zamućenja i propusnosti goveđe rožnice Metoda testiranja na izoliranim očima pilića
BCOP (bovine cornea opacity and permebility) test ICE (Isolated chicken eye test)

https://www.youtube.com/watch?v=gx1TNEv5tgo
Nema procjene sustavnog učinka
 ex vivo organotipski modeli
• test kokošjeg jajeta na korioalantoičnoj membrani (CAM)
oplođenih kokošjih jaja (HET-CAM (hen’s egg test-chorioallantoic
membrane))
• nije globalno regulatorno prihvaćena

Jaje pile
 In chemico test
• korištenje metoda abiotičke kemijske reaktivnosti kao zamjene za testove (in vivo) na životinjama

• Test denaturacije hemoglobina

Interferencija
boje
ispitivane
tvari sa
absorbancom
/rezultatima

0.5

Hayashi T, Itagaki H, Fukuda T, Tamura U, Kato S. Quantitative evaluation for

the prediction of eye irritation using hemoglobin. AATEX. 1993;2:25–31.
• Ocular Irritection® test
- mješavina proteina, glikoproteina, ugljikohidrata, lipida itd..
koja oponaša strukturu rožnice
- test se bazira na očitavanju denaturacije i disagregacije
proteina mjerenjem OD te usporedbom sa poznatim
korozivima/iritantima
- Odobren od OECD (Organisation for EconomicCo-operation
and Development) 2019
In vitro testovi
Test propusnosti fluoresceina (Fluorescein leakage test)

Madin-Darby stanice bubrega pasa

(Madin-Derby canine kidney (MDCK)
cells )
 Alternative
• jednostavne za implementaciju u bilo
koji laboratorij
• jeftin(ij)e
• učinkovite (pogotovo za određivanje
visoke razine toksičnosti/teških
oštećenja)

• Organotipski modeli i stanične linije nisu humanog porijekla i razlike

između vrsta mogu uzrokovati krivu procjenu štetnosti
• Stanice u kulturi uzgajane kao „monolayer” ne predstavljaju
kompleksnu 3D organizaciju u stvarnim tkivima
3D modeli
primjer epi alveolar
Odakle humane stanice?

• matične stanice
• kirurški „ostatak”
• ne-transplantabilna tkiva
• kadaver
• zdravi donori (npr. krv)
• tkiva u kulturi
• 3D (printani) organi
• organi na chipu
 Ex-vivo organotipska kultura tkiva
(Ex vivo organotypic culture system)

- Očuvana vitalnost stanica, struktura i razvoj tkiva paralelno onom viđenom in vivo

- Tkivo kultivirano u međufazi tekućina-zrak, kako bi se pravilno regulirala izmjena plinova kroz rezove

- Praćenje patofizioloških promjena i detaljnu analizu lokalnih urođenih imunoloških stanica u realnom vremenu
Fetal brain tissue Cut in Ex-vivo Ex-vivo
gw 17 vibratome culturing infection

Tissue
ACSF

medium with 7 GF
 2014
2006

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8465948/
Organi na čipu (Organs-on-chips (OoCs))
• uređaj koji se bazira na mikrofluidici
• sastavljen je od mreže mikrokanalića kroz koju se može regulirati protok
tekućine a u kojem se uzgaja i održava tkivo (ili tkiva!)
• Glavni nedostaci testiranja na životinjama
• Načelo 3R
• Razlika: in vitro, ex vivo, in silico, in chemico
• Primjer jedne uspješne in vitro/ex vivo alternative
• U kojem smjeru ide budućnost alternativa testiranja na životinjama