Ribozymy

 katalyticky aktivní molekuly RNA (= RNA s enzymovou aktivitou)

 objeveny v 80. letech T. R. Cechem a S. Altmannem – Nobelova cena 1989

• 1982: Tom Cech – samosestřih pre-rRNA u Tetrahymena
- pre-rRNA klonována do plazmidu a transkribována in vitro
- inkubace v přítomnosti Mg2+ (bez přítomnosti proteinů)
- gelová elektroforéza - na gelu patrná i vyštěpená lineární a cirkulární forma intronu
• 1983: Sidney Altman – RNáza P (štěpí pre-tRNA )

Výskyt: od virů po člověka

Příklady:
• „samosestřihové“ introny
• Hammerhead ribozyme - replikace RNA viroidů
• Hairpin ribozyme – replikace rostlinných virů
• rRNA - ribozom - katalyzuje syntézu peptidové vazby
• RNáza P - štěpení cukr-fosfátové kostry RNA
 Ribozymy - RNA enzymy
Katalyzované reakce – substrátem většinou RNA:

1. nejčastěji hydrolýza fosfodiesterových vazeb (endonukleáza)

2. syntéza fosfodiesterových vazeb (ligáza)
3. transesterifikace – editace, sestřih
4. syntéza peptidové vazby

Funkce:
• Syntéza proteinů
• RNA procesing - sestřih
• Replikace virové RNA

RNA s katalytickou funkcí v dnešních buňkách jsou podle hypotézy Světa RNA molekulární fosílie z ranných etap
vývoje života na Zemi.
 Vlastnosti ribozymů umožňující jejich katalytickou funkci

 složitá terciální struktura, která umožňuje vytvoření aktivního místa

- přivedení substrátů blízko k sobě

 vazba kovových iontů

- pro katalýzu nebo pro tlumení negativního náboje, pokud jsou RNA řetězce v terciální struktuře blízko u sebe
- častým kovovým iontem je u ribozymů Mg2+

 báze jsou donory i akceptory protonu

- NH skupiny mohou při katalýze přijmout nebo uvolnit H+

 2´-OH skupina
- může sloužit jako zdroj H+ – např. při katalýze tvorby peptidové vazby na ribozomu
 SELEX
Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment
 Metoda označovaná také jako „evoluce in vitro“ nebo „selekce in vitro“
 „Chybující“ replikací se ve zkumavce vytvoří heterogenní populace molekul DNA nebo RNA a následnou selekcí se
získávají molekuly DNA nebo RNA, které se silně váží na určité ligandy, např. aminokyseliny.
Selektované molekuly jsou opakovaně podrobeny reverzní transkripci/chybové amplifikaci/transkripci in vitro a jsou opět
selektovány pro vazbu na ligand – příprava molekul vážících ligand s vysokou afinitou a specifitou
 Touto metodou jsou připravovány tzv. aptamery, rovněž použita pro přípravu ribozymů

Eduard Kejnovský | 13. 3. 2014 | Vesmír 93, 144, 2014/3

 Evoluce ribozymu in vitro metodou SELEX
Selekce RNA-ligázových ribozymů in vitro

• Randomizovaná doména RNA-ligázy připojena ke krátké RNA, která má v dvouřetězcovém úseku ss zlom
• Pouze úspěšné RNA-ligázy jsou amplifikovatelné RT-PCR (reverzní transkripce a amplifikace PCR)
- jeden z primerů nasedá na sekvenci původně odděleného úseku RNA
• Selektované RNA-ligázy mutovány, znovu připojeny ke krátké RNA se zlomem a proces SELEX je opakován

→ zvýšení účinnosti u několik řádů

→ RNA-ligáza může fungovat i jako RNA-polymeráza (připojuje jednotlivé nukleotidy)
 RNA-based polymeráza se neposouvá po templátu (připojení pouze 14 nt), nutné vysoké koncentrace Mg, které ribozym destabilizují

RNA-ligázová doména

RNA-ligázová doména
RNA-ligázová doména

Reverzní transkripce
Inkubace několik minut a amplifikace
v přítomnosti Mg2+ úspěšných RNA-ligáz
P-P-P 5´ P P
OH 3´

primer
5´ 5´
 Aptamery
Aptamer je oligonukleotid (DNA nebo RNA) nebo peptid schopný specifické a silné vazby na cílové molekuly.

• příklady cílových molekul: aromatické ligandy, oligosacharidy, aminokyseliny, peptidy nebo proteiny

Získávají se selekcí ve zkumavce metodou SELEX.

https://phys.org/news/2013-07-tighter-artificial-dna.html

Analogie s protilátkami – specifita a vysoká afinita vazby na cílovou molekulu

Aptamery mohou být užitečnými nástroji v diagnostice a biotechnologiích.

Potencionálně mohou sloužit jako terapeutika, klinické využití aptamerů za protilátkami zaostává
• mnohdy dlouhá doba přípravy
• aptamery připravovány in vitro – nutnost testování funkce in vivo
 Riboswitch („RNA přepínač“)
Úsek mRNA, který po vazbě specifického ligandu změní svoji strukturu, a tím reguluje expresi genů kódovaných
daným transkriptem.
Tyto malé regiony (~120 nukleotidů) jsou obvykle lokalizovány na 5´UTR transkriptu regulovaného genu (působí na
stejnou molekulu, kterou jsou kódovány, tj. nachází se v poloze cis).

Cis-regulační riboswitch je složený ze dvou segmentů

I) „aptamerová“ doména
– vytváří complexní terciální strukturu a specificky váže malé ligandy

II) „gene expression platform“

Terminator stem
– interaguje s dalšími elementy a moduluje expresi genu Anti-terminator stem loop
loop
https://www.nature.com/scitable/topicpage/riboswitches-a-common-rna-regulatory-element-14262702/#
 Riboswitch („RNA přepínač“)
Rozpoznávají různé regulátory (AK, proteiny, nukleobáze, nenabitou tRNA), mohou snímat signály z prostředí (teplota, dvojmocné ionty).
Typickým ligandem metabolit nebo kovový ion

Výsledkem vazby odpovídajícího ligandu je významná strukturní změna ovlivňující expresi transkriptu.

• Terminace transkripce
(tvorba terminátoru transkripce nezávislém na Rho faktoru)

• inhibice iniciace translace

(interakce s oblastí s S-D sekvencí anebo iniciačním kodonem AUG)

• ovlivnění stability mRNA.

Typické pro bakteriální mRNA - hrají významnou roli v adaptační

strategii bakterie
Nalezeny i u eukaryot (např. riboswitch regulující sestřih 3´-konce) David Staněk - RNA - temná hmota v našich buňkách