Laboratoris de Microbiologia

ambiental
 Estudis mediambientals
SIGNIFICAT DELS MO A L’AMBIENT
• El paper dels MO a l’ambient és doble:
(1º) subministren els compostos inorgànics amb una
valència adequada per a que les plantes superiors
puguin utilitzar-los (cicles del nitrògen i del sofre)
(2º) contribueixen a la continua descomposició i
mineralització de la matèria orgànica en putrefacció.
•L’activitat dels MO descomponedors
és fonamental per a permetre el
reciclatge de matèria orgànica fixada
en les plantes superiors: els herbívors
consumeixen una part molt limitada
d’aquesta matèria orgànica perquè la
relació C:N de la matèria orgànica (al
voltant de 200:1) es molt més gran que
la que és convenient pels animals
(20:1).
 Estratègia de mostratge
• - Nombre i tipus de mostra
• localització (atzar, transectes, punts
crítics, etc)

• Dependrà de molts factors que inclouen

els objectius de l’anàlisi, recursos i
característiques del que cal mostrejar
– En general és car i no es poden fer grans
quantitats com es fa amb paràmetres químics
 Equipament

• Cambres de gran
volum per a guardar
les mostres
• Congeladors per a
guardar els
microorganismes
control
• Màquines de mesura:
 Equipament

• Factors físics (pH, terbolesa, temperatura, salinitat)

• Factors químics (ions, àcids, bases, O2, matèria orgànica, ..)

Protocols de detecció de microorganismes: (protozous, algues, paràsits, fongs,

bacteris, virus).

Sistemes de filtració i concentració dels

microorganismes que poden estar diluïts al
medi ambient.

Incubadors a les temperatures adequades.

Equipament per a biologia molecular

Personal especialitzat
 Tipus d’ organismes
Organismes patògens
• No s’ espera gran quantitat d’ organismes patògens actius
(comparat amb un laboratori clínic). Però pot donar-se el cas de que
es necessiti aïllar-los, per la qual cosa es recomana tenir zones
adients per a treballar amb ells.

Organismes manipulats
• Tot i que de vegades es poden utilitzar, no es solen aplicar les
restriccions de OMG
• La probabilitat de que un organisme manipulat resisteixi al medi
ambient es mínima.

Viabilitat dels microorganismes

• Els microorganismes en el medi ambient estan “estressats”.
Necessitarem sistemes per a activar-los si es volen cultivar.
Enriquiments i medis poc selectius previs al cultiu.
 Control de qualitat
“El trabajo ha de realizarse bien y eso ha de demostrarse. No sirve tener experiencia, el
error siempre puede ocurrir por diversas causas no controladas”
Mètodes estandarditzats
• Protocols establerts i reconeguts internacionalment per a cada anàlisi que es fa.
• Existeixen organismes encarregats d’ estandaritzar els mètodes i d’ elaborar normes de
correcte funcionament. (ISO, International standard organization), AENOR (asociación
española de normalización).
• Si en un laboratori es volen obtenir resultats coherents, és imprescindible seguir al peu
de la lletra mètodes que estiguin estandarditzats.
Mètodes estandarditzats procuren
• Especificar tots i cadascun dels detalls del mètode donant tota la informació necessària
per a que es puguin realitzar en qualsevol laboratori.
Mètodes estandarditzats inclouen:
• Protocols d’ anàlisis (materials, microorganismes i metodologia).
• Controls del material.
• Controls de microorganismes
• Controls de cada procés (material de referència)
• Norma d’ús de la maquinària
• Control del bon estat de la maquinària
 Material de referència
• Material controlat que pot ser usat com a control en un
determinat procés. Al analitzar un material de referència,
ja que se sap quin resultat ha de sortir, s’assegura que
el protocol s’ ha fet bé.
• La no-coincidència del resultat del material de referència
amb el que ha de sortir, indica que el procés no s’ha
realitzat bé o que s’ ha produït algun problema.

xex. Enumeració d’ Escherichia coli. Es prepararà un cultiu d’aquest

bacteri que contingui 109 cèl·lules/ml. Aquest cultiu es diluirà en un
tampó fins a obtenir 100 cèl·lules/ml. Aquest cultiu es reparteix en
tubes d’ 1 ml. Cada tub té 100 cèl·lules. Es preparen 250 tubs i es
guarden congelats.
Cada cop que s’analitzi E. coli d’una mostra, s’afegirà una placa
 Cartas de control
Es fam molts vials de referència (xex anàlisis de Escherichia coli).
s’agafen 20 per començar i es van afegint cada cop que es fa una
anàlisi

Gráfico de control: OX174

47

38

29

OX174

20 LCS = 43,6022

Promedio = 28,8800

11 LCI = 14,1578
1 7 13 19 25 31 37 43 49
4 10 16 22 28 34 40 46

Nivel sigma: 2
 Laboratoris acreditats

acreditació: Procés pel qual un organisme

acreditador independent garanteix que un
laboratori treballa segons una norma o
procediment prèviament establert, i comprovat
que es el més adequat per a el treball que es
realitza en aquest laboratori.
™Que els procediments són adequats.
™Que els equips i materials són adequats i estan
en correcte ús.
™Que el personal té la titulació, coneixements i
experiència necessària.
 Procés:

1.- El laboratori sol·licita a ENAC (entidad nacional de

acreditación) que vol ser acreditat. Envia:
¾ Manual d’assegurament de la qualitat
¾ abast de l’acreditació
¾ procediments analítics
2.- ENAC contacte amb els auditors i si són acceptats pel
laboratori s’ estudia la documentació
3.- Primer informe tècnic. Positiu o negatiu. Resposta del
laboratori
4.- Auditoria. Segon informe tècnic: observacions y/o
conformitats
5.- Al·legacions i respostes per part del laboratori
6.- La comissió d’ ENAC decideix la concessió o no de
l’acreditació
 Laboratoris de Microbiologia ambiental

¿Quin tipus de mostra

analitzarem?
• Aigües: beguda, mar,
rius, depuradores, ...
• Sòls: Contaminats,
agrícoles, naturals...
• Aire: Sistemes d’ aire
condicionat, aire estèril
(quiròfans).
Recollida de mostres
9 Es imprescindible un bon sistema de
recollida i transport de les mostres. El
personal que pren la mostra ha de ser
conscient de la importància de retolar les
mostres amb el màxim d’ informació
possible i si cal prendre notes de lloc i
moment del mostreig (pH, Ta, salinitat..).

9 En un laboratori de Microbiologia
ambiental, les mostres han de recollir-se
i processar-se l’abans possible,
preferiblement dins les 24 hores des de
la seva recollida, i sempre conservar-se
a 4oC fins el seu processament.

9 Si l’anàlisi ha de servir per inculpar a

algú, ha d’haver presència de l’autoritat
competent que certifiqui que la recollida
de mostres s’ha fet de forma legal i
correcta
 tipus de contenidors
• contenidors estèrils
• Que tanquin bé
• que permetin retolació
• De diferents volums

• Nevera per conservar les

mostres en fred
• conservadors de fred
• Emmagatzematge a 4ºC
Gran diversitat

• Aigües beguda
• Aigües residuals
• Aigües rius
• Aigua de mar
• Aigües subterrànies
• Aigües minerals
• Aigües manantials
• Aigües sulfuroses
• Aigües hospitalàries
• Aigües amb gas
• Bacteris
– Filtració per membrana de 0.2 o 0.45 μm
– Volum variable 100 ml per E. coli i 1L per
Legionella
– Problemes de colmatació dels filtres
 Aire

Mètode passiu mètode per impacte

• Captació per filtració

activa
 Fomites
Superfícies on es poden acumular MO

Objectes d’ús personal del malalt o

portador, que poden estar contaminats i
transmetre agents infecciosos

Especialment important en ambientes

hospitalaris, lavabos públics, etc.

Important via de transmissió fecal-oral

Important a indústria alimentària, per epidemiologia, avaluació de desinfectants...

 Examen de superfícies i fomites

Mètodes per detectar MO

present en superfícies
contaminades.

• Neutralitzar agent
desinfectant.

• El mètode més clàssic és

l’hisop

• Altres mètodes són el

contacte amb placa, la
xeringa d’ agar, o cintes
adhesives
Plaques de contacte RODAC pel mostreig de superfícies
 Sòls i sediments
• Sòls: Matriu composta de matèria mineral, matèria
orgànica, aigua i aire en la que es troben gran quantitat
de MO

• Sediments: són els productes de la degradació causada

pels agents d’erosió:
- fragments de roca, quars insoluble, feldespat, minerals argilosos,
minerals precipitats a partir de materials en solució aquosa.

• Llods de depuradora : sòlid, semisòlid o líquid de

desfeta generat per una planta de tractament d'aigües
residuals. La seva generació és inherent al seu
funcionament. Al ser materials orgànics riscos
s’anomenen biosòlids
 Sòls i sediments. Presa de mostra
Les mostres de sòls s’agafen amb
l’equipament apropiat que permeti una
mostra representativa.
 Processament de la mostra

Bacteris o fongs

• Processar la mostra l’abans possible

• Resuspendre la mostra en aigua o en el tampó apropiat (bacteris o
fongs)
• Pre-enriquir amb medis selectius per eliminar la flora acompanyant
• inocular en medi sòlid adequat

Virus
Es necessari prèviament desadsorbir els virus de les partícules del sòl abans
de procedir al seu estudi.
Normalment es fa servir un tampó d’ elevat pH, que produeix un canvi iònic en
la carrega del virus, la qual cosa li permet alliberar-se. Després es procedeix al
seu anàlisi.
 Característica del sòl. Espores
Resuspendre la mostra en tampó apropiat
Realitzar dilucions i inocular sobre el medi adequat
Realitzar xoc tèrmic de la mostra (80ºC) durant 5’ i inocular sobre el medi
adequat (espores).
Observació de les colònies y gram, tinció d’espores.