‫שיטות מחקר‪-‬שיעור ‪1.11.

16 -1‬‬

‫דוגמא‪ :‬אנו רואים משמאל ‪northern blot‬‬

‫‪analysis of microRNA expression‬‬
‫בתנאים שונים‪.‬‬
‫ככל שה‪ band-‬חזק יותר‪ -‬כך הביטוי של‬
‫ה‪ microRNA-‬חזק יותר‪.‬‬
‫שאלות שניתן לשאול‪:‬‬
‫איזה ‪ control‬חסר? מה המסקנה מה‪-‬‬
‫‪ figure‬הזה? והאם ‪ miR-16‬מבוטא יותר‬
‫בתאים בהשוואה ל‪?miR-29b-‬‬
‫חסר כאן ‪ .loading control‬אם יש ‪ ,differential expression‬צריך לראות שהטעינו כמות זהה‬
‫של ‪ RNA‬בג'ל בכל בארית‪ .‬רק כך נדע שההבדל שרואים הוא בגלל התנאים השונים‪ ,‬ולא כי‬
‫הטעינות כמות שונה של ‪.RNA‬‬
‫הבנדים של ה‪ control -‬לא אמורים להשתנות‪ ,‬אלא להישאר אותו דבר‪ .‬בגלל שחסר ה‪loading -‬‬
‫‪ ,control‬לא ניתן להסיק ש‪ miR-16-‬מבוטא יותר בהשוואה ל‪.miR-29b-‬‬

‫דוגמא נוספת‪ :‬אנו רואים למעלה חתכים של עור‪ ,‬שנצבעו עבור חלבונים שונים‪ .‬למשל כאשר ‪p53‬‬
‫מבוטא‪ -‬מופיעים עיגולים ורודים‪ .‬לא רואים עיגולים אלה לפני חשיפה ‪ ,UV‬אבל כן אחרי‪.‬‬
‫נלמד בהמשך מה זה ‪ immunostaining‬של ‪ tissue samples‬ואיך מכינים בכלל ‪.tissue samples‬‬
‫אם שואלים מהי המסקנה כאן‪ ,‬אז צריך לדעת שאם זו רקמה שנצבעה ב‪,immunostaining -‬‬
‫אז חיפשו כאן ביטוי של חלבונים ולא של ‪.RNA‬‬
‫נלמד איך לגשת לשאלות מדעיות ואילו שיטות מתאימות‪ ,‬כדי לענות על השאלות הללו‪.‬‬

‫נדבר למשל על ‪.microRNA‬‬

‫‪ microRNAs‬אלה גנים שמתבטאים מה‪ ,DNA-‬בדיוק‬
‫כמו גנים אחרים‪ ,‬כ‪ ,RNA-‬ואז הם עוברים חיתוך ויש‬
‫‪ biogenesis processes‬של חתיכות ה‪ RNA-‬האלה‪,‬‬
‫ובסוף יש חתיכה קצרה של ‪ RNA‬באורך של ‪22‬‬
‫נוקלאוטידים‪ .‬הם לא מתורגמים לחלבונים‪ .‬הם‬
‫מתפקדים בתור ‪ ,single strands RNAs‬והם מוצאים‬
‫מקטעי ‪ RNA‬עם רצפים קומפלמנטריים‪ ,‬שמהווים כ‪ traget-‬עבורם‪ .‬הם נקשרים אליהם‪ ,‬ומונעים‬

‫© מורן פן‬
‫מה‪ RNAs-‬הללו לעבור תרגום‪ microRNAs .‬דומים מאוד ל‪ ,siRNA-‬בכך שהמטרות שלהם עוברים‬
‫‪.down regulation‬‬

‫כאשר רוצים לחקור גן מסוים‪ ,‬או ‪ microRNA‬מסוים‪ -‬יש שאלות רבות שצריך לשאול ברבדים‬
‫שונים‪:‬‬
‫‪ .1‬שאלות על ה‪ transcriptional regulation-‬של הגן‪ ,‬למשל‪ -‬מתי הגן עובר ‪ ?transcription‬מהו‬
‫ה‪ transcription factor-‬שעובד? אלה שאלות שלא קשורות ל‪ function-‬של הגן‪.‬‬
‫‪ .2‬שאלות על ה‪ .post-transcriptional regulation-‬ברגע שהגן כבר עבר שעתוק ל‪ RNA-‬בגרעין‪,‬‬
‫האם הוא יעבור חיתוכים? האם הוא יישאר בגרעין או יעבור לציטופלזמה? האם הוא יתורגם?‬
‫האם ה‪ RNA-‬יעבור מודיפיקציות שימנעו ממנו לעבור תרגום?‬
‫‪ .Gene regulated by microRNA .3‬שאלות על ה‪ function-‬של החלבון‪.‬‬
‫‪ .Cellular effect .4‬אילו גירויים חיצוניים גורמים לכל ה‪ cascades-‬של האירועים הנ"ל‪ .‬למשל‬
‫משהו חיצוני כמו ‪ ,UV‬שיכול לאקטב את הביטוי של הגן‪.‬‬

‫‪ transcriptional and post-transcriptional regulation‬זה המפתח לפיתוח תרופות‪ .‬אם‬

‫המטרה היא לפתח משהו שיהיה מתורגם לתרופה‪ ,‬ברגע שמבינים את המכניזם ואת השלבים של‬
‫הרגולציות השונות של הגן‪ -‬זה המפתח להבנה‬
‫ולפיתוח תרופות‪.‬‬

‫‪Transcriptional Regulation‬‬
‫ישנן שאלות רבות שניתן לשאול כאשר רוצים‬
‫ללמוד על ה‪ ,transcriptional regulation-‬ואנו‬
‫נלמד על השיטות שבאמצעותן אפשר ענות על‬
‫השאלות הללו (ניתן לראות הכל משמאל)‪:‬‬
‫‪ -‬מתי מתרחש השעתוק?‬
‫‪ -‬שאלות על ה‪ .enhancer-‬לשם כך צריך לבצע ‪.HiC‬‬
‫‪ -‬מהו ה‪?transcription factor-‬‬
‫‪Epigenetic modifications -‬‬
‫‪ -‬כיצד נראה הרצף של הגן?‬
‫‪ - genomic location -‬האם הוא קרוב לצנטרומר למשל‪ .‬אילו גנים נמצאים ליד? צריך להשתמש‬
‫לשם כך ב‪.bioinformatic tools-‬‬

‫© מורן פן‬
‫‪ -Domain location -‬הכרומטין לא מסודר רק באמצעות נוקלאוזומים‪ ,‬אלא כל המבנה הזה‪ ,‬יחד‬
‫עם הנוקלאוזומים‪ ,‬מקופל ויוצר מבנה שנקרא ‪ .domain‬אלה פיסות גדולות של כרומטין‪ .‬זה כמו‬
‫כיס‪ ,‬שנמצא בו הכל‪ .‬אז באיזה ‪ domain‬הגן נמצא? ב‪ domain-‬גדול או קטן? אקטיבי או סגור?‬
‫‪ -Transcription factor interaction -‬אילו פקטורים מעורבים? לשם כך צריך לבצע ‪chromatin‬‬
‫‪.IP‬‬
‫‪ -‬אילו ‪ Co-factors/co-repressors‬מעורבים ברגולציה על השעתוק‪.‬‬
‫‪ -Promoter accessibility -‬האם הוא פתוח או סגור? האם יש גישה ל‪transcription factors-‬‬
‫ול‪?epigenetic modifiers-‬‬
‫‪ -‬האם יש ‪ enhancer ?enhancer regulation‬יכול להיות רחוק מהגן‪ ,‬אז אם אכן הוא רחוק‪-‬‬
‫האם יש ‪ secondary shape‬ל‪?DNA-‬‬
‫‪ -Nucleosome position -‬קשור ל‪ accessibility-‬של הגן‪.‬‬
‫‪ .pol2 machinery -‬זה המכניזם שמשעתק את הגנים‪ .‬אחרי שכל ה‪transcription factors-‬‬
‫נמצאים‪ ,‬ה‪ pol2 machinry-‬מגיע ורץ על ה‪ DNA-‬ומשעתק גנים‪ .‬האם הקשירה לפרומוטור היא‬
‫מהירה או איטית? לשם כך צריך לעשות ‪.chromatin IP‬‬
‫‪ -Transcription rate -‬איטי או מהיר? אם זה איטי‪ ,‬האם יש לכך משמעות? האם כאשר זה איטי‬
‫או מהיר‪-‬מקבלים כמות שונה של ‪ RNA‬או צורה שונה שלו? אם זה איטי‪ ,‬אז אולי יש ל‪ RNA-‬זמן‬
‫ליצור ‪?secondary shape‬‬
‫‪post-transcriptional regulation‬‬
‫שאלות שניתן לשאול כשרוצים‬
‫לחקור ‪post-transcriptional‬‬
‫‪ ,regulation‬והשיטות‬
‫שבאמצעותן ניתן לענות על שאלות‬
‫אלה‪:‬‬
‫‪ .1‬אם למשל חוקרים ‪ ,miRNA‬אז‬
‫כיצד הוא קשור לריבוזום?‬
‫‪ .2‬היכן הוא נמצא אחרי השעתוק?‬
‫האם הוא עובר לציטופלזמה‪ ,‬או‬
‫שמא הוא נשאר בגרעין‪ ,‬או אולי‬
‫הוא נכנס לוזיקולות בתא? לשם כך צריך לבצע ‪ ,nuclear and cytoplasm extraction‬ובודקים‬
‫היכן החלבון או ה‪.miRNA-‬‬
‫‪ .3‬אילו איזופורמים יש ל‪ miRNA-‬הנחקר?‬
‫‪ .4‬כיצד רק ‪ strand‬אחד נשאר אקטיבי ולמה?‬
‫‪ .5‬אילו ‪ co-factors‬מבצעים את ה‪?post transcriptional regulation-‬‬

‫© מורן פן‬
 ‫‪ .6‬שאלות לגבי ה‪.stability-‬‬
‫‪ .7‬שאלות על ‪ ,dicer activity‬האם יש ‪?co-factors‬‬
‫‪ .8‬האם הוא עובר ‪ splicing‬ע"י ‪?DROSHA‬‬
‫‪ .9‬האם ה‪ microRNA -‬נמצא ב‪ intron-‬של גן או בתוך ‪ exon‬של גן? אם הוא באמצע גן‪ ,‬אז מה‬
‫מקבלים כאשר יש שעתוק‪ -‬את ה‪ microRNA-‬או את הגן?‬
‫‪ .avoiding degradation .10‬כיצד ה‪ miRNA-‬לא מתפרק ע"י ‪ RNases‬שנמצאים בתא? האם יש‬
‫מודיפיקציות כלשהן שמגינות עליו?‬

‫‪Gene regulation by microRNA‬‬

‫שאלות שניתן לשאול על ה‪ function -‬של‬
‫ה‪ microRNA-‬או על ה‪ function-‬של הגן‬
‫אותו אנו חוקרים‪ ,‬והשיטות בהתאם‪:‬‬
‫‪ .1‬מה קורה לתא‪ ,‬כאשר עושים ‪ KO‬לגן או‬
‫ל‪ ?microRNA-‬כנ"ל לגבי ‪over-‬‬
‫‪.expression‬‬
‫‪ .2‬אם חוקרים ‪ ,microRNA‬אילו מטרות יש‬
‫לו?‬
‫‪ -cell localization .3‬היכן ה‪ microRNA -‬נמצא? האם ישר אחרי שהוא נוצר‪ -‬הוא עושה ‪ KD‬ל‪-‬‬
‫‪ ?mRNA‬או שמא הוא מחכה קצת‪ ,‬ורק יותר מאוחר?‬
‫אם הוא בממברנה‪ ,‬אולי הוא עוזר לעשות ‪ transportation‬של דברים? אם בגרעין‪ -‬אולי הוא‬
‫‪?DNA modifier‬‬
‫‪ :DICER/RISC loading .4‬כיצד ה‪ microRNA-‬נקשר ל‪?RISC complex-‬‬
‫‪.target mRNA availability .5‬‬
‫‪.ribosome activity .6‬‬
‫‪ .3'UTR miRNA site availability .7‬כאשר ‪ miRNA‬פועלים על ‪ ,mRNA‬הם נקשרים ל‪,3'UTR-‬‬
‫וכך מונעים מאותו ‪ mRNA‬להיות מתורגם‪ .‬אז אם חושבים שהגן הנחקר מעוכב ע"י ‪,microRNA‬‬
‫צריך לחקור את ה‪.3'UTR-‬‬

‫‪Cellular effect‬‬
‫אילו ‪ external stimuli‬משפיעים על הפעילות או השעתוק של ה‪?microRNA-‬‬
‫‪ -proliferation/apoptosis/differentiation/migration/shape‬כל השינויים הפנוטיפים הללו‬

‫© מורן פן‬
‫משפיעים ישירות על ביטוי גנים שונים‪ ,‬כולל ביטוי של ‪ ,microRNAs‬ועל ה‪post transcription -‬‬
‫‪ regulation‬של הגנים‪ ,‬ועל הפעילות‪.‬‬

‫© מורן פן‬