1

МЕДИЦИНСКИ УНИВЕРСИТЕТ – ПЛЕВЕН

ФАКУЛТЕТ „МЕДИЦИНА ”

ЦЕНТЪР ЗА ДИСТАНЦИОННО ОБУЧЕНИЕ

КАТЕДРА „ХИМИЯ И БИОХИМИЯ”

ЛЕКЦИЯ №4

ЗА ДИСТАНЦИОННА САМОПОДГОТОВКА ПО УЧЕБНА ДИСЦИПЛИНА

„БИОХИМИЯ”

ЗА СТУДЕНТИ ОТ СПЕЦИАЛНОСТ „МЕДИЦИНА”

ТЕМА: Кинетика на ензимните реакции. Скорост на ензимните реакции,

влияние на концентрацията на субстрата и ензима. Влияние на
инхибиторите върху кинетиката на ензимните реакции - примери за
лекарствени вещества.

РАЗРАБОТИЛ: проф.Регина Комса-Пенкова д.б.н.

Гр. Плевен
2020 год
 2

4 .Кинетика на ензимните реакции. Скорост на ензимните реакции, влияние на

концентрацията на субстрата и ензима. Влияние на инхибиторите върху
кинетиката на ензимните реакции - примери за лекарствени вещества.

Същественото свойство на ензимите като биокатализатори е значителното ускоряване на

катализираната от тях реакция. Как се измерва скоростта на една химична реакция.
1. Скоростта на химичната реакция се определя чрез увеличаване концентрацията на продукта за
единица време или чрез намаляване концентрацията на субстрата за единица време. Т. е за да
проследим хода на ензимно катализираната реакция във времето, трябва да измерваме периодично
концентрацията на субстрата или продукта. Например при разграждане на уреята от ензима уреаза, ще
мерим количествотовото амоняк. При разграждане на белтъци от трипсин - ще мерим количеството на
свободни амино групи и т.н.
Графичното представяне на промяна в концентрацията на S или P във времето се нарича кинетична
крива. От кинетичните криви се определя скоростта на
реакцията чрез построяване на допирателната: ds/dt, ∆P
dp/dt (промяна в концентрацията за единица време). mmol/L S2
Скоростта зависи от много фактори, концентрацията на S,
концентрацията на Е, t, рН и др. Последователно ще .
разгледаме как скоростта V зависи от тези фактори.
От кинетичната крива се вижда, че скоростта на ензимно
. S1
катализираната реакция намалява с времето. Какви са
причините? . . .
1.1. Намаляване концентрацията на субстрата, .
1.2. Изтегляне на реакцията в обратна посока, поради
натрупване на продукта 1 2 3 4 5 t min
1.3. Частично инактивиране- стареене на ензима.
Затова се определя само началната скорост Vo, която не зависи от времето и изброените фактори.
2. Зависимост на скоростта на реакцията от концентрацията на субстрата. Ако измерим
скоростта на реакцията при няколко различни концентрации на субстрата, ще видим че началната
скорост се увеличава с нарастване на субстратната концентрация. А при много високи субстратни
концентрации скоростта практически не се променя. Това означава че е постигната максималната
скорост -Vmax, Концентрацията на субстрата, при която се постига полумаксималната скорост е равна
на Km.
Vmax и Km са основните параметри, характеризиращи ензима: по максималната скорост определяме
ензимната активност, а Кm ни подсказва условията за това определяне.
Да разгледаме малко по-подробно тези характеристики:
Ензимната кинетика е създадена от Leonor Michaelis и Mod Menten през 1913г. Те са предложили модела
на ензимния катализ чрез създаване на ES комплекс: E + S k1↔Error! Bookmark not defined.k-1 ES k2→E + P
Ензимът се свързва със субстрата и се образува ES комплекс. Скоростната константа на образуване на
този комплекс е k1. Eнзим-субстратният комплекс може да се дисоциира до изходните вещества - E и S
при скоростната константа k-1, или да образува продукт Р, със скоростна константа k2. Предполага се,
че продукта не се превръща в S. Това условие важи докато концентрацията на продукта е малка.
Другият момент от Михаелис-Ментеновата теория е, че скоростта на ензимно катализираната реакция
се определя от най-бавното стъпало - образуване на продукта:Vo= k2 [ES].
Съотношението между трите константи се означава с Km= (k-1 + k2)/k1, в условията, когато цялото
количество ензим се свърже в ES комплекс, скоростта ще бъде максимална
Vmax = k2. [E]. Ако с матeматически преобразувания изразим [ES] получаваме уравнението на
Михаелис-Ментен:
 3
Същата кинетична зависимост
Vo
k 2. [E]. [S] е характерна и за други
mmol/L. min
V= процеси: транспорта през
[S] + Km мембраните, свързване на
Vmax
V max. [S] хормони или други лиганди с
V= рецепторите, и кинетика на
Km + [S] Vmax лекарствени средства.
2 Km и Vmax са двете основни
Михаелис -Ментеновата характеристики на всеки
зависимост има ензим и неговия субстрат.
хиперболичен вид. Km S
mmol/L

При внимателно разглеждане на Михаелис-Ментеновата зависимост, можем да разграничим три

различни участъка
2.1 когато [S]<< [Km], V = [S].Vmax/Km=[S].const, т.е. скоростта е пропорционална на субстратната
концентрация. Това можем да използваме за определяне на метаболити (урея, глюкоза) с ензимни
методи.
V max
2.2 когато [S]=[Km], тогава V =
2
2.3 когато [S]>> [Km], V = Vmax; Скоростта не зависи от субстратната концентрация, а се определя от
ензимната концентрация. Това е условието за измерване на ензимната активност, измервайки скоростта
съдим за количеството ензим.
2.4 Km е мярка за афинитета между субстрата и ензима, колкото по-малка е стойността на Km,
толкова по-малка концентрация на субстрат е необходима за достигане на полумаксималната скорост
Когато k-1>>k2, Km=Kd- дисоциационната константа на ES комплекс, тогава Km е мярка за афинитета.
Когато k-1<<k2, тогава Km е скоростна константа.
1
Vo 1
Vo
S+ I
1 2
V02
1 1 S
V01
1
V max
1
V max

1 1 1
α
S1 S2 S
1
Km 1 1 0 1
1 Km 1 1 1 1 KmS Km
= + x= ; y= S
Vo V max S V max S+ I
S Vo
a = tg α = Km ; b = 1
y= ax+ b В обратни/реципрочни координати Михаелис-
V max V max

Ментеновата зависимост е права, която пресича

ординатната ос в точка 1/Vmax, а абсцисата в -1/Km. По този начин значително по-лесно се изчисляват
и Vmax и Km. Тази зависимост е изведена от Lineweaver и Burk
3. Зависимост на скоростта на реакцията от концентрацията на ензима. В условията на
насищане, т.е. когато концентрацията на субстрата е много
Vo висока, ([S]>Km), скоростта се определя от ензимната
концентрация Vmax=k2.[E]. Това е условието за измерване на
ензимната активност. С увеличаване количеството на Е,
пропорционално ще нараства ензимната активност (скоростта)
Единици на ензимна активност (ЕА):
1 IU (МЕ) -международна единица, представлява ензимната
активност, при която 1 µМ субстрат се превръща в продукт за 1
min при оптимално рН и t0. Ако определим V = 10 µМ/min,
означава, че ЕА= 10 IU (МЕ).
Е Катал е друга единица, която се използва за измерване на
mmol/L .min ензимната ативност - катализира превръщането на 1 М субстрат
в продукт за 1 секунда.
 4
Специфичната ензимна активност е преизчислена ензимната активност спрямо количеството ензим,
поставено в реакционната смес. Серумните ензимни активности се дават в МЕ/литър
4. Влияние на инхибиторите върху кинетиката на ензимните реакции. Инхибирането,
подтискане на ензимната активност с
различни вещества се изследва защото: ФАД ФАД.Н2
CH CH COOH
1) Инхибиторите могат да се използват като 2 COOH
лекарствени средства. CH2 COOH сукцинатдехидрогеназа HOOC CH
2) Инхибиращо действие имат различни сукцинат - фумарат
токсични вещества, натурални - и създадени
от човека. COOH
Инхибирането на ензимната активност може CH2
да бъде конкурентно и неконкурентно - по
механизъм, и обратимо или необратимо, COOH
малонова киселина
взависимост от стабилността на връзката
между ензима и инхибитора.
4.1 Конкурентно инхибиране е инхибирането на ензима от аналог на субстрата.
Инхибиторът и субстратът са много близки по строеж молекули. Конкурентното инхибиране
обикновено е обратимо. Конкурентният инхибитор увеличава Km, но не повлиява Vmax Vmax се постига
при по-високи концентрация на субстрата.

Vo 1
mmol/L. min Vo S+I

Vmax S
S
S+ I
Vmax
1 S - субстрат
Vmax I - конкурентен инхибитор
2

S 1 1 0
Km Km S+ I 1
S mmol/L KmS Km
S+I S

Например, ако вземем сукцинатдехидрогеназната

(СДХ) реакция от Цикъла на Кребс в която
Сукцинат се превръща във Фумарат, Малоната е
конкурентен инхибитор на СДХ.
Aлопуринол е също пример на конкурентен инхибитор на ксантин оксидаза, ензим метаболизиращ
пурини, който е лекатрствен препарат за лечение на подагра.
Oseltamivir/Tamiflu - Активният му метаболит e конкурентен инхибитор на невраминидазите на
грипните вируси А и B. Вирусните невраминидази са необходими за освобождаване на
новообразуваните вирусни частици от инфектираните клетки и дисеминиране на инфекцията.
4.2 Неконкурентното инхибиране се осъществява от вещества, които се свързват с ензимната
молекула (в активния център или извън него) и не позволяват да се образува ES комплекс, или след
свързването им с ензимсубстратния комплекс го правят неефективен.
 5
Инхибитора и субстрата - са много близки по строеж молекули. Конкурентното инхибиране
обикновено е обратимо. Например, ако вземем сукцинатдехидрогеназната (СДХ) реакция от Цикъла на
Кребс в която Сукцинат се превръща във Фумарат, Малоната е конкурентен инхибитор на СДХ
Конкурентният инхибитор увеличава Km, но не повлиява Vmax.
Vmax се постига при по-високи концентрация на
субстрата.
4.2 Неконкурентното инхибиране се осъществява от
вещества, които се свързват с ензимната молекула (в
активния център или извън него) и не позволяват да се
образува ES комплекс, или след свързването им с
ензимсубстратния комплекс го правят неефективен.

Примери: Сериновият тип протеази в активния си център

съдържат серинов остатък, към който се свързва
субстрата. Те се инхибират необратимо с
диизопропилфлуорфосфат.
Ензимът, който е необходим за предаване на нервен
импулс (ацетил-холинестераза) се инхибира от бойните
отровни вещества: зарин, зоман и отрова на кобрата -
Naja-naja.
Ензимите съдържащи, сулфхидрилна група в активния център се инхибират от живачни йони. Това са
глицералдехид-фосфатдехидрогеназата и компонентите на дихателната верига. Същият ефект има
йодацетамида. Оловото при синтеза на порфирини инхибира ДАЛК синтазата.
Неконкурентните инхибитори намаляват Vmax и не повлияват Km.

1 S+I
Vo
Vo
mmol/L. min

S 1
Vmax S Vmax S
S+I

Vmax S - субстрат
S+ I 1 I - неконкурентен инхибитор
Vmax S S+ I Vmax
2
Vmax S+ I
2

1 = 1 0
0 Km Km S 1
S= S+ I KmS KmS + I
mmol/L S