‫عبد الرحمن‬ )2449( ،119-111 :)2(04 – ‫مجمة العموم الزراعية العراقية‬

‫فصل وتنقية وتوصيف جزئي لاليسوزايم من زىرة القرنابيط‬

‫سوسن مصطفى عبد الرحمن‬

‫قسم الصناعات الغذائية – كمية الزراعة – جامعة بغداد‬
‫المستخمص‬
‫جرى في ىذه الدراسة فصل انزيم الاليسوزايم من زىرة القرنابيط بواسطة محاليل استخالص مختمفة وبعد اجراء التجارب االولية ظير محمول فوسفات‬
‫ كافضل محمول استخالص لكونو اعطى مستخمصا انزيميا باعمى فعالية نوعية بمغت‬6.5 ‫ موالر واس ىيدروجيني‬0.2 ‫الصوديوم الدارئ بتركيز‬
. %60 ‫ تمت تنقية اولية لالنزيم بتركيز المستخمص الخام باستخدام ممح كبريتات االمونيوم بنسبة تشبع‬. ‫ممغم مقارنة مع المحاليل االخرى‬/‫وحدة‬10.9
‫ اعقب ذلك التنقية باستخدام كروموتوغرافي‬. ‫اجريت عممية التنافذ الغشائي لمراسب االنزيمي الخام مقابل محمول فوسفات الصوديوم الدارئ ال زالة االمالح‬
‫ بعدد مرات‬%58.2 ‫اشارت نتائج لتنقية االيسوزايم الجزئية الى ان الحصيمة االنزيمية بمغت‬. Duolite C-464 ‫التبادل االيوني عمى عمود المبادل الموجب‬
‫ الى ان‬8-3.5pH ‫ اظيرت نتائج التوصيف الجزئي لتحديدأفضل أس ىيدروجيني لفعاليةانزيم الاليسوزايم بمدى‬. ‫ممغم‬/‫ وحدة‬43.3‫ وفعالية نوعية‬7.7 ‫تنقية‬
‫ اي انو يكون ثابتا في‬6-5.5 pH ‫ في حين تراوح المدى االمثل لثباتو بين قيمتي‬، ‫ يمثل افضل قيم االس الييدروجيني المدروسة‬6 ‫األس الييدروجيني‬
‫ ْم ابدى االنزيم‬80 ‫الى‬30 ‫ وعند تحديد درجة الحرارة المثمى العمى فعالية النزيم الاليسوزايم بدرجات حرارية مختمفةوعمى مدىتراوح من‬. ‫االوساط الحامضية‬
‫ بينما اشارت نتيجة دراسة الثبات الحراري إلى ان االنزيم احتفظ تقريباً بكامل فعاليتو عند حضنو بدرجات حرارة مابين‬. ‫ ْم‬60 ‫اقصى فعالية عند درجة حرارة‬
.‫ ْم‬70 ‫ من فعاليتو االصمية عند درجة حرارة‬%92 ‫ وبحوالي‬6‫ دقيقة عند االس الييدروجيني‬15 ‫( ْم لمدة‬65-50)
The Iraqi Journal of Agricultural Sciences 40 (2) : 111-1190 (2009) Abdul– Rahman

SEPARATION ,PURIFICATION AND PARTIAL

CHARACTERIZATION OF LYSOZYME FROM
CAULIFLOWER
S.M. Abdul – Rahman
Dept. of Food Tech. College of Agric/ Univ.
of Baghdad
ABSTRACT
This study was aimed to separate cauliflower lysozyme by using different extraction solutions, after primry
experiences it was found that 0.2 M phosphate buffer pH (6.5) is the best one for extraction because the specific
activity for the enzyme reached 10.9 unit/mg comparison with other extraction solutions. primary purification of
the enzyme was done by concentrating the crude extract using ammonium sulphate at 60% saturation, then
dialyzed aginst phosphate buffer to remove the salts . followed by appling the dilayzed concentrate on ion exchange
chromatography on the cation exchange column Duolite C-464 .The results of partial purification pointed out that
the enzyme yield and purification folds and specific activity were 58.2% and 7.7 times and 43.3 unit/mg
respectively. The results of enzyme partial characterization showed that the optimum pH for the enzyme activity
was 6, and the enzyme was most stable at pH values ranged between 5.5 - 6 . At optimization the optimum
temperature for activity the enzyme exhibited the maximum activity at 60 oC at temperature degrees ranged
between 30 to 80 oC while the study of heat stability pointed out that the enzyme retained almost its entire activity
over 15 min incubation at 50-65 oC at pH 6 and 92% from its original activity at 70 oC .

111
 ‫عبد الرحمن‬
‫رشح خالل ‪ 3‬طبقات من الشاش ‪ ،‬ولمتخمص من الرواسب‬
‫اجري الطرد المركزي عمى سرعة مقدارىا ‪ 4000‬دورة ‪ /‬دقيقة‬
‫لمدة ‪ 10‬دقائق وبعد جمع الراشح قدرت فعالية االنزيم وتركيز‬
‫البروتين في المستخمص الخام وخالل خطوات التنقية ‪.‬‬
‫فعالية االنزيم‬
‫قدرت فعالية الاليسوزايم حسب طريقة العكارة التي‬
‫اوردىا ‪ Li-chan‬واخرون )‪ (13‬حيث حضر عالق خاليا‬
‫بكتريا ‪ Micrococcus Iysodeikticus‬في محمول دارئ‬
‫الفوسفات بتركيز ‪ 0.006‬موالر واس ىيدروجيني ‪6.24‬‬
‫وبدرجة ح اررة الغرفة وعمى امتصاصية مقدارىا ‪0.7 – 0.6‬‬
‫عمى طول موجي قدره ‪ 450‬نانومتر ‪ .‬اضيف ‪ 0.1‬مل من‬
‫محمول االنزيم لـ ‪ 2.5‬مل من عالق الخاليا في وقت الصفر‬
‫ومزج جيداً مع العالق وسجل االنخفاض في قيم االمتصاص‬
‫عمى طول موجي ‪ 450‬نانومتر كل ‪ 30‬ثانية لمدة دقيقتين‬
‫باستعمال جياز الطيف الضوئي ‪.‬‬
‫عرفت وحدة فعالية انزيم الاليسوزايم بانيا كمية االنزيم التي‬
‫تسبب انخفاضاً في االمتصاص الضوئي مقداره ‪ 0.001‬في‬
‫الدقيقة الواحدة عمى طول موجي قدره ‪ 450‬نانومتر باستعمال‬
‫عالق خاليا بكتريا ‪ M. Iysodeikticus‬كمادة اساس وتحت‬
‫ظروف التجربة ‪.‬‬
‫قدر تركيز البروتين حسب طريقة ‪ Lowry‬واخرون )‪. (15‬‬
‫تنقية االنزيم الجزئية‬
‫تمت الخطوة األولى من تنقية انزيم الاليسوزايم وذلك‬
‫بتركيز المحتوى البروتيني لممستخمص الخام باضافة كبريتات‬
‫االمونيوم الصمبة بنسبة اشباع ‪ %60‬مع التحريك لحين‬
‫االذابة ‪ ،‬ثم ترك المحمول لمدة ‪ 3‬ساعات بدرجة ‪ْ 4‬م جرى‬
‫بعدىا عممية الطرد المركزي بسرعة ‪ 8000‬د ‪ /‬د لمدة ‪15‬‬
‫دقيقة ثم جمع الراسب وذوب في ‪ 7‬مل من دارئ االستخالص‬
‫‪ ،‬واجريت عممية النضح الغشائي لممحمول مقابل محمول‬
‫واس‬ ‫بتركيز‪0.2‬موالر‬ ‫الدارئ‬ ‫الصوديوم‬
‫ىيدروجيني‪ 6.5‬بثالث تبديالت لمدة ‪ 24‬ساعة ثم قدرت‬
‫الفعالية االنزيمية وتركيز البروتين ‪.‬‬
‫بعد ذلك اتبعت تقنية التبادل االيوني عمى عمود ‪Duolite‬‬
‫‪C-464‬بابعاد‬
‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬
‫المقدمة‬
‫الاليسوزايم ىو االسم المتداول النزيم ينتمي إلى‬
‫المجموعة الثالثة لالنزيمات المحممة ‪ . Hydrolases‬ويوصف‬
‫عمميا بانو ‪ N-acetylhexosaminodase‬ويصنف كـ‬
‫‪ Muramidase‬ويحمل التصنيف الرقمي )‪(EC.3.2.1.17‬‬
‫)‪. (11‬‬
‫تنتشرانزيمات الاليسوزايم بشكل واسع في الطبيعة وبخاصة في‬
‫بياض البيض واالف ارزات الجسمية كالدموع والمعاب والحميب‬
‫والخاليا البيضاء ‪ Leucocytes‬كما يوجد في االحياء المجيرية‬
‫والفايروسات والعاثيات والحشرات والنباتات(‪ ،)14‬وبسبب خواص‬
‫ىذه االنزيمات التثبيطية تجاه بعض االنواع من االحياء المجيرية‬
‫فقد استعممت كمادة حافظة طبيعية في صناعة االغذية )‪(17 ، 6‬‬
‫وقد درس الاليسوزايم المستخمص من الحيوانات بشكل واسع من‬
‫حيث وجوده ووظيفتو وتركيبو وخواصو المختمفة اال ان القميل من‬
‫الدراسات تمت عمى الاليسوزايم من مصادر نباتيو وقد تعاممت‬
‫بشكل اساسي مع الاليسوزايم الموجود في العصارات النباتية مثل‬
‫عصارة نبات البابايا )‪ )12،12‬والتين )‪ (9‬وعصارة شجرة المطاط‬
‫‪ )21،4) Hevea brasiliensis‬وعصارة نبات ‪Asclepias‬‬
‫‪ (16) syriaca‬وعصارة نبات الديباج ‪(1) Calotropis‬‬
‫‪.procera‬‬
‫ولقد اجري ىذا البحث بيدف فصل انزيم الاليسوزايم من زىرة‬
‫القرنابيط حيث يزرع ىذا النبات في العراق ويعتبر من المحاصيل‬
‫الميمة ‪ ،‬وتنقيتو جزئيا ومحاولة التعرف عمى بعض خواصو اذ‬
‫تساعد مثل ىذه المعمومات في التعرف عمى محتوى مختمف‬
‫الخضروات والفواكو الخام من الاليسوزايم ‪.‬‬
‫المواد وطرائق العمل‬
‫استخالص االنزيم‬
‫تم الحصول عمى نبات القرنابيط من السوق المحمية‬
‫وبعد ان شذبت رؤوس القرنابيط ‪ ،‬اجريت عمميات‬
‫فوسفات‬ ‫االستخالص بنسبة ‪ 1:1‬من عناقيد االزىار مع محاليل‬
‫استخالص مختمفة شممت الماء المقطر و محمول فوسفات‬
‫الصوديوم الدارئ بتركيز ‪ 0.2‬موالر ورقم ىيدروجيني ‪، 6.5‬‬
‫والدارئ نفسو الحاوي عمى ‪ %2‬ممح كموريد الصوديوم ‪.‬‬
‫مزجت في الخالط لمدة ‪ 3-1‬دقائق الستخالص العصير ثم‬
‫‪111‬‬
 ‫عبد الرحمن‬
‫النتائج والمناقشة‬
‫استخالص االنزيم‬
‫قدرت الفعالية النوعية النزيم االيسوزايم المستخمص‬
‫من ازىار نبات القرنابيط باستخدام محاليل استخالص مختمفة‬
‫تمثمت بالماء المقطر ومحمول فوسفات الصوديوم الدارئ‬
‫بتركيز ‪ 0.2‬موالر واس ىيدروجيني ‪ 6.5‬والدارئ نفسو الحاوي‬
‫عمى ‪ %2‬كموريد الصوديوم ‪ ،‬اذ حقق االستخالص بمحمول‬
‫دارئ الفوسفات بتركيز ‪ 0.2‬موالر واس ىيدروجيني ‪ 6.5‬اعمى‬
‫فعالية نوعية بمغت ‪ 10.9‬وحدة ‪ /‬ممغم مقارنة بالمحاليل‬
‫االخرى (محمول الفوسفات الدارئ الحاوي عمى كموريد‬
‫الصوديوم بنسبة ‪ %2‬والماء المقطر) فكانت الفعالية النوعية‬
‫ليما ‪ 9.9‬و ‪ 9.7‬وحدة‪/‬ممغم عمى التوالي ‪.‬‬
‫من مالحظة الشكل ‪ 1‬نجد ان الفعالية النوعية لالنزيم‬
‫المستخمص بالماء المقطر كانت منخفضة مقارنة بالمحاليل‬
‫الدارئو المستخدمة مما يدل عمى ان الماء المقطر اقل مالئمة‬
‫لالستخالص ‪ ،‬اضافة إلى زيادة نسبة البروتين المستخمص‬
‫بمحمول الفوسفات الدارئ بسبب ارتفاع القوة االيونية لو مقارنة‬
‫بالماء المقطر وبالتالي ساىم في فك ارتباط االنزيم من انسجة‬
‫النبات ‪ ،‬وىذا يتوافق مع ماذكره ‪ (18) Parkin‬من ان كفاءة‬
‫أي محمول الستخالص البروتينات بشكل عام يعتمد عمى عدة‬
‫عوامل منيا االس الييدروجيني لمحمول االستخالص والقوة‬
‫االيونية لو وكذلك الطبيعة الكيمياوية لممحمول ‪ .‬والستخالص‬
‫االنزيمات يجب استخدام محاليل دارئو تحافظ عمى االس‬
‫الييدروجيني في المدى الذي يكون فيو االنزيم ثابت ‪.‬‬
‫‪111‬‬
‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬
‫)‪ (1.5 × 10.5‬سم والذي سبق موازنتو بمحمول فوسفات‬
‫الصوديوم الدارئ بتركيز ‪ 0.05‬موالر واس ىيدروجيني ‪، 7.5‬‬
‫بعد اضافة النموذج غسل المبادل بمحمول دارئ الموازنة‬
‫بسرعة جريان ‪ 30‬مل ‪ /‬ساعة وبواقع ‪ 5‬مل ‪ /‬انبوب ‪ .‬أسترد‬
‫االنزيم باستخدام محمول فوسفات الصوديوم بتركيز ‪ 0.5‬موالر‬
‫واس ىيدروجيني ‪ . 8‬قيس امتصاص الضوء عمى طول‬
‫موجي ‪ 280‬نانومتر لتعيين تركيز البروتين وقدرت فعالية‬
‫االنزيم لألجزاء المستردة ثم جمعت األجزاء المحتوية عمى‬
‫الفعالية ‪ ،‬قيس الحجم وتركيز البروتين والفعالية االنزيمية ‪.‬‬
‫توصيف االنزيم‬
‫شمل اجراء االختبارات التالية ‪ :‬ـ‬
‫‪ . 1‬تعيين االس الييدروجيني االمثل لفعالية االنزيم ‪ .‬استخدم‬
‫لمتفاعل محموالن دارئان ىما محمول خالت الصوديوم الدارئ‬
‫بقيم مختمفة من األس الييدروجيني ‪5.5 , 5 , 4.5 , 4 , 3.5‬‬
‫ومحمول فوسفات الصوديوم الدارئ وبقيم اس ىيدروجيني ‪,‬‬
‫‪.8 . 7.5 , 7 6.5 , 6‬‬
‫‪ . 1‬تعيين االس الييدروجيني االمثل لثبات االنزيم حيث‬
‫حضن االنزيم مع المحاليل المنظمة ذات قيم االس‬
‫الييدروجيني المختمفة تراوحت بين‪3.5‬ـ‪ 8‬لمدة نصف ساعة‬
‫جرى بعدىا تقدير الفعالية المتبقية لالنزيم‪.‬‬
‫‪ . 1‬تعيين درجة الح اررة المثمى لفعالية االنزيم ‪ :‬عمى درجات‬
‫ح اررية مختمفة بنقمو ‪ 5‬درجات بين درجة واخرىمن ‪ْ 12‬م لغاية‬
‫‪ْ 82‬م عند أس ىيدروجيني ‪ 6‬لمحمول التفاعل ‪.‬‬
‫‪ .4‬د ارســة الثبــات الح ـراري لالن ـزيم فــي درجــات ح ارريــة مختمفــة‪:‬‬
‫دقيقــة وباســتخدام اس‬ ‫تراوحــت مـ ـن‪ْ 80-30‬م ولمــدة ‪15‬‬
‫ىيدروجيني ‪ 6‬لمحمول التفاعل ‪.‬‬
 ‫عبد الرحمن‬ ‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬

‫‪12‬‬

‫‪10‬‬

‫‪8‬‬
‫الفعالية النوعية‬
‫‪6‬‬
‫( وحدة ‪ /‬ملغم )‬
‫‪4‬‬

‫‪2‬‬

‫‪0‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬
‫دارئ الفوسفات الحاوي عمى ‪%2‬‬
‫ماء مقطر‬ ‫دارئ الفوسفات‬
‫كموريد الصوديوم‬
‫شكل(‪ )1‬كفاءة استخالص انزيم اليسوزايم القرنابيط بمحاليل استخالص‬
‫مختلفة‬

‫النوعية ‪ 16.5‬وحدة ‪ /‬مل و ‪ 18.3‬وحدة ‪ /‬ممغم عمى التوالي‬ ‫تركيز االنزيم وتنقيتو الجزئية‬
‫‪ ،‬اما عدد مرات تنقيتة في ىذه المرحمة فكانت ‪ 3.3‬وبحصيمة‬ ‫تم تركيز االنزيم لممستخمص الخام باستخدام كبريتات‬
‫انزيمية مقدارىا ‪(.%69‬جدول ‪. )1‬‬ ‫االمونيوم بنسبة اشباع ‪ %60‬فكانت فعالية االنزيم وفعاليتة‬

‫جدول ‪ 1‬خطوات تنقية انزيم الاليسوزايم من القرنابيط‬

‫الفعالية‬ ‫الفعالية‬ ‫تركيز‬

‫الحصيمة‬ ‫عدد مرات‬ ‫الفعالية‬ ‫الحجم‬
‫الكمية‬ ‫النوعية‬ ‫البروتين‬ ‫خطوات التنقية‬
‫(‪)%‬‬ ‫التنقية‬ ‫(وحدة ‪ /‬مل)‬ ‫(مل)‬
‫(وحدة)‬ ‫(وحدة‪/‬ممغم)‬ ‫(ممغم‪/‬مل)‬

‫‪100‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪335‬‬ ‫‪5.5‬‬ ‫‪1.2‬‬ ‫‪6.7‬‬ ‫‪50‬‬ ‫المستخمص الخام‬

‫الترسيب بكبريتات‬
‫‪69‬‬ ‫‪3.3‬‬ ‫‪231‬‬ ‫‪18.3‬‬ ‫‪0.9‬‬ ‫‪16.5‬‬ ‫‪14‬‬
‫االمونيوم‬

‫التبادل االيوني‬
‫‪58.2‬‬ ‫‪7.7‬‬ ‫‪195‬‬ ‫‪43.3‬‬ ‫‪0.15‬‬ ‫‪6.5‬‬ ‫‪30‬‬ ‫بعمود ‪Duolile‬‬
‫‪C-464‬‬

‫‪114‬‬
 ‫عبد الرحمن‬ ‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬

‫اكممت التنقية الجزئية لالنزيم باستعمال المبادل االيوني‬
‫‪ Duolite – C464‬وذلك لكفاءتو المميزة في الفصل ‪،‬‬
‫استرداد االنزيم بنقاوة عالية مع امكانية استخدامو عدة مرات‬
‫دون الحاجة لخطوة اعادة فعالية ‪. (13) Regeneration‬‬
‫ويعد ظيور الفعالية االنزيمية في جزء االسترداد من عمود‬
‫ان شحنو االنزيم موجبة مما‬
‫جعمتو يرتبط بالمبادل (شكل ‪ )2‬بمغت الحصيمة االنزيمية‬
‫‪.‬‬ ‫‪7.‬‬ ‫تنقية‪7‬‬
‫من المعموم ان كبريتات االمونيوم من اكثر االمالح استعماالً‬
‫في تركيز البروتينات نظ اًر لقمة كمفتيا ولذائبيتيا العالية وكذلك‬
‫النعدام تأثيرىا في االس الييدروجيني ومن ثم التؤثر في ثبات‬
‫االنزيم ‪ .‬وان مبدأ التركيز بكبريتات االمونيوم يعتمد عمى‬
‫معادلة الشحنات الموجودة عمى سطح البروتين واالخالل‬
‫المبادل االيوني دليالً عمى‬ ‫بطبقة الماء المحيطة بو مما يؤدي إلى ترسيبو بتأثير ما يعرف‬
‫‪. (7) Salting out‬‬
‫مرات‬ ‫وبعدد‬ ‫‪%58.2‬‬

‫‪1.6‬‬ ‫‪9‬‬
‫الغسل‬ ‫االسترداد‬ ‫‪8‬‬
‫‪1.4‬‬
‫االمتصاص الضوئي ‪ 280‬نانومتر‬

‫‪7‬‬

‫الفعالية ( وحدة ‪ /‬مل )‬

‫‪1.2‬‬
‫‪6‬‬
‫‪1‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0.8‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪3‬‬
‫‪0.4‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪0.2‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73‬‬

‫رقم الجزء‬

‫شكل ‪ 2‬كروموتوغرافي التبادل االيوني لتنقية اليسوزايم القرنابيط باستخدام عمود المبادل االيوني ‪ Duolite – C464‬تمت موازنتو‬
‫بمحمول ‪ 0.05‬موالر فوسفات الصوديوم الدارئ واس ىيدروجيني ‪ . 7.5‬وتم االسترداد بمحمول ‪ 0.5‬موالر فوسفات الصوديوم‬
‫الدارئ واس ىيدروجيني ‪ . 8‬سرعة الجريان ‪ 30‬مل ‪ /‬ساعة بواقع ‪ 5‬مل لمجزء الواحد ‪.‬‬

‫ووصمت الحصيمة االنزيمية ‪ %35‬لالنزيم ‪ %13 , I‬لالنزيم‬
‫‪II‬‬
‫توصيف األنزيم‬
‫األس الييدروجيني األمثل لفعالية االنزيم‬
‫يالحظ من الشكل ‪ 3‬الذي يمثل االس الييدروجيني‬
‫االمثل لفعالية االنزيم ان الفعالية االنزيمية زادت بزيادة االس‬
‫الييدروجيني ووصمت حدىا االقصى عند قيمة ‪ 6‬مما يعني‬
‫انو االس الييدروجيني االمثل لمفعالية ويمكن مالحظة‬
‫لقداستخدمت طرائق عدة لتنقية انزيم الاليسوزايم من مصادره‬
‫‪ Hara‬و ‪ (10) Matsushima‬عند‬ ‫المختمفة فقد حصل‬
‫تنقية انزيم الاليسوزايم من نبات المفت ‪Brassica rapa‬‬
‫وفصمو عمى المبادل االيوني الموجب ‪ CMC‬بعد اجراء‬
‫الترسيب الممحي بكبريتات االمونيوم عمى انزيمي ‪II , I‬‬
‫بحصيمة ‪ %42‬و ‪ %16‬عمى الترتيب ‪ .‬اكممت التنقية‬
‫بواسطة الترشيح اليالمي عمى عمود ‪Sephadex G-75‬‬

‫‪115‬‬
 ‫عبد الرحمن‬ ‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬

‫حالة ايونية السيما الحوامض االمينية الموجودة في الموقع‬ ‫االنخفاض التدريجي عمى جانبي االس االمثل ‪ ،‬ومع االرقام‬
‫الفعال من االنزيم )‪ . (22‬وعمى الرغم من اختالف مصدر‬ ‫الييدروجينية ‪ 1.5‬و ‪ 8‬كان الحد االدنى من الفعالية ‪ .‬وىذا‬
‫االنزيم النباتي وتباين طريقة تقدير فعاليتو فقد جاءت نتيجة‬ ‫االنخفاض نتيجة تأثير االس الييدروجيني لوسط التفاعل عمى‬
‫ىذه الدراسة مشابية لما وجده ‪ Audy‬واخرون )‪ (2‬من ان‬ ‫الحالة االيونية لممجاميع الحفزية )‪(Catalytic groups‬‬
‫اقصى فعالية اليسوزايم جنين الحنطة كان عند االس‬ ‫الموجودة في الموقع الفعال لالنزيم او نتيجة التغير في الحالة‬
‫الييدروجيني ‪ ، 6‬ومتفقة لما حصل عميو ‪ Ereifej‬و )‪(8‬‬ ‫االيونية لمعقد االنزيم ‪ -‬المادة االساس )‪ (ES‬ومعقد االنزيم –‬
‫‪.‬‬ ‫‪Markakis‬‬ ‫الناتج )‪ . (EP‬أي ان االس الييدروجيني االمثل لمفعالية ُيمثل‬
‫تمك القيمة التي تكون عندىا جميع مكونات التفاعل في افضل‬

‫‪14‬‬

‫‪12‬‬
‫الفعالية ( وحدة ‪ /‬مل )‬

‫‪10‬‬

‫‪8‬‬

‫‪6‬‬

‫‪4‬‬

‫‪2‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪10‬‬
‫االس الهيدروجيني ( ‪) pH‬‬

‫شكل ‪ 3‬األس الهيدروجيني االمثل لفعالية اليسوزايم القرنابيط‬

‫والقاعدية ‪ .‬ويعود ىذا االنخفاض في ثبات االنزيم إلى تأثير‬
‫االس الييدروجيني في جزئية االنزيم وحده من خالل تغيير‬ ‫األس الييدروجيني األمثل لثبات األنزيم‬
‫تعد دراسة االس الييدروجيني االمثل لثبات االنزيم‬
‫شكمو الفراغي بتغييره لمتركيب الثالثي والثانوي أي يحدث تغير‬
‫جزءاً أساسياً لخواص أي انزيم اذا ان معرفة ىذه الخاصية‬
‫بالحالة الطبيعية لالنزيم وبالتالي االقالل من فعالية االنزيم‬
‫تساعد في تحديد ظروف خزن االنزيم وظروف تنقيتو ‪.‬‬
‫وصوالً إلى الحد الذي يفقد فيو االنزيم فعاليتو تماماً )‪(19 ، 5‬‬
‫يبين الشكل ‪ 4‬ان المدى االمثل لثبات االنزيم يكون عند قيم‬
‫‪.‬‬
‫االس الييدروجيني ‪ 5.5‬و ‪ 6‬أي انو يكون ثابتاً في االوساط‬
‫الحامضية ويبدي انخفاضاً في االوساط الحامضية المتطرفة‬

‫‪116‬‬
 ‫عبد الرحمن‬ ‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬

‫‪120‬‬

‫‪100‬‬
‫الفعالية المتبقية ( ‪) %‬‬

‫‪80‬‬

‫‪60‬‬

‫‪40‬‬

‫‪20‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪) pH‬‬ ‫االس الهيدروجيني (‬
‫شكل ‪ 4‬ثبات أنزيم اليسوزاي م القرنابيط بقيم أس هيدروج يني مختلفة‬
‫حضن االنزيم في المحاليل الدرئة بقيم أس هيدروج يني مختلفة لمدة‬
‫نصف ساعة ثم قدرت الفعالية‬

‫اما انخفاض فعالية االنزيم في درجات الح اررة العالية فيحدث‬
‫نتيجة كسر لمعديد من االواصر الييدروجينية الضعيفة وبالتالي‬
‫تغير التركيب الثالثي لالنزيم فيفقد قوتو الحفزية وقد يحدث‬
‫مسخ لو ويفقد فعاليتو بالكامل )‪ . (18‬وتتشابو نتيجة ىذه‬
‫الدراسة مع ما ذكره ‪ Audy‬وجماعتو )‪ (2‬من ان اعمى فعالية‬
‫النزيم الاليسوزايم المعزول من جنين الحنطة كانت عند درجة‬
‫ح اررة ‪ْ 60‬م وعند دراستو َعمى مدى درجات من ‪ 5‬إلى ‪ْ 90‬م‬
‫‪ .‬وقد ذكرت البحوث ان من السمات المشتركة النزيمات‬
‫الاليسوزايم النباتية تتمثل في انيا غالباً ما تكون فعالة بدرجات‬
‫نسبيا‪(3).‬‬ ‫عالية‬
‫درجة الحرارة المثمى لفعالية االنزيم‬
‫تشير نتائج دراسة درجة الح اررة المثمى (شكل ‪ )5‬إلى‬
‫زيادة فعالية االنزيم عند زيادة درجة الح اررة لتصل اقصاىا عند‬
‫درجة ح اررة ‪ْ 60‬م حيث سجمت اعمى قيمة ليا ‪ ،‬ثم انخفضت‬
‫بعدىا ‪ .‬ويشترك عامالن في ىذه الظاىرة احدىما زيادة الطاقة‬
‫الحركية الذاتية لكل من االنزيم ومادة التفاعل واالخر زيادة‬
‫فرصة التصادم بين االنزيم ومادة التفاعل كنتيجة لزيادة معدل‬
‫حركتيم بفعل الح اررة )‪. (18‬‬
‫ح اررية‬

‫‪117‬‬
 ‫عبد الرحمن‬ ‫مجمة العموم الزراعية العراقية – ‪)2449( ،119-111 :)2(04‬‬

‫‪16‬‬
‫‪14‬‬
‫‪12‬‬
‫الفعالية ( وحدة‪ /‬مل )‬

‫‪10‬‬
‫‪8‬‬
‫‪6‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪100‬‬

‫درجة الحرارة (مئوية)‬

‫شكل‪ 5‬درجة الحرارة المثلى لفعالية انزيم اليسوزايم القرنابيط‬

‫‪ْ 65 – 50‬م وبحوالي ‪ %92‬من فعاليتو االصمية عند درجة‬ ‫الثبات الحراري لالنزيم‬
‫ح اررة ‪ْ 70‬م لكنو لم يحتفظ اال بحدود ‪ %75‬من فعاليتو بدرجة‬ ‫تم تعيين الثبات الحراري النزيم اليسوزايم القرنابيط‬
‫‪ْ 80‬م ‪ ،‬وىذه النتيجة تدل عمى ان لالنزيم ثباتيو ح اررية ‪،‬‬ ‫بوصفو من العوامل الميمة في توصيف االنزيم من خالل‬
‫وغالباً ما تتميز االنزيمات التي ليا درجات ح اررية مثمى عالية‬ ‫تحديد درجات الح اررة التي يحتفظ فييا االنزيم بفعاليتو وتمك‬
‫بثباتيا الحراري العالي ‪.‬‬ ‫التي تؤثر عميو بشكل سمبي ‪ .‬فيالحظ من الشكل ‪ 6‬ان االنزيم‬
‫احتفظ تقريباً بكامل فعاليتو عند معاممتو بدرجات ح اررية من‬

‫‪120‬‬

‫‪100‬‬
‫الفعالية المتبقية ( ‪) %‬‬

‫‪80‬‬

‫‪60‬‬

‫‪40‬‬

‫‪20‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪100‬‬
‫درجة الحرارة ( مئوية )‬

‫شكل‪ 6‬الثبات ال حراري ال نزيم اليسوزايم ال قرنابيط‬

‫حضن االنزيم بدرجات حرارية مختلفة لمدة ‪ 15‬دقيقة ثم قدرت ال فعالية‬

‫‪118‬‬
 ‫عبد الرحمن‬
characterization of multiple forms of papaya
latex lysozyme. Prikladngya. Biokhimiya
Mikrobologiya. 31(2):247-254.
13 - Li – Chan, E.,S. Nakai,J. Sim,D.B.
Bragg, and K.V. Lo. 1986. Lysozyme
separation from egg white by cation exchange
column chromatography. J. Food Sci.
51(4):1032-1036.
14 - Losso, J.N.,S. Nakai, and E.A. Charter.
2000. Lysozyme In A.S. Naidu(ed.).Natural
Food Antimicrobial Systems. CRC Press, LLC.
p.185-210.
15-Lowry,O.H.,N.J. Rosebrough, A.L.Farr,
and R.J. Randall. 1951. Protein measurment
with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem.
193:265-275.
16 - Lynn, K.R. (1989). Four lysozyme
from latex of Asclepias syriaca.
Phytochemistry. 28:1345-1348.
17-Masschalck,B.and
C.W.Michiels.2003.Antimicrobial
properties of lysozyme in relation to
foodborn vegetative bacteria. Crit
Rev.Microbiol.29:191-214.
18-Parkin,K.L.1993.Environmental
effects on enzyme activity. In
T.Nagodawithana and G.Reed (ed.).
Enzymes in Food Processing.Academic
Press , Inc.New York,USA, pp.273.
19- Segal, I.H. (1976). Biochemical
Calculation. 2nd – edition, John Wiley &
Sons, Inc, New York,USA, pp.273.
20-Subroto,T.,S.Sufiati, and
J.J.Beintema.1999.Papaya(Carica papay)
lysozyme is a member of the family 19
(Basic class II) chitinases.J.Mol.Evol.
49:819-821.
21- Tata, S.J.,J.J. Beintema, and S.
Balabaskaran. 1983. The Lysozyme of
Hevea brasiliensis Latex: Isolation,
purification, enzyme kinetics and partial
amino acid sequence. J. Rubb. Res. Inst.
Malaysia. 31 (1):35-48.
22-Whitaker,J.R. 1972. Principles of
Enzymology for Food Science.Merecel
Dekke , Inc,New York, USA, p.65-119.
119
)2449( ،119-111 :)2(04 – ‫مجمة العموم الزراعية العراقية‬
‫المصادر‬
1- Al-Samaraie, S.M.A.R.2003. Separation,
purification and characterization of lysozyme
from Calotropis procera .Ph.D.Thesis.Dept.Food
Sci.,Coll.of Agric.,Univ.of Baghdad.pp.93.
2 - Audy, P.,J, Trudel, and A.Asselin. 1988.
Purification and characterization of a lysozyme
from wheat germ. Plant Sci. 58:43-50.
3-Beintema,J.J.and A.C.Terwisscha Van
Scheltinga.1996. Plant lysozyme. In P.Jolles
(ed.).Lysozymes:Model Enzymes in Biochemistry
and Biology. p.75-86.
4-
Bokma,E.,M.Spiering.,K.S.Chow.,P.P.M.F.A.Mulde
r.,J. Subroto., and J.J.Beintema.2001.Determination
of cDNA and Genomic DNA sequence of hevamine,
a chitinase from the rubber tree Hevea brasiliesis
.Plant Physiol . Biochem.39:367-376.
5-Crabb,W.D, and J.K.Shetty.1999.Commodity
scale production of sugars from starches.Current
Option in Microbiology.2:252-256 .
6-Datta,S.2005. Purification of lysozyme from
shell liquor of eastern oysters (Crassostrea
virginica) and its use in antimicrobial films to
preserve smoked fish. M.Sc.Thesis,Dept.of Food
Sci., Coll. of Agriculture and Mechanics.,Univ. of
Louisiana. pp.58.
7 - England, S. and S. Seifter. 1990.
Precipitation Techniques. Methods in
Enzymology . 182:425-441.
8 - Ereifej, k. I and P. Markakis. 1980.
Cauliflower lysozyme. J. Food Sci. 45:1781-
1782.
9-Glazer, A.N.,A.O,Barel., J.B.Howard,
and D.M. Brown, 1969. Isolation and
characterization of fig lysozyme. J.Biol.
Chem. 244:3583-3589.
10 - Hara, S. and Y. Matsushima. 1972.
Studies on the substrate apecificity of egg white
lysozymes. IV. A comparative study of the
substrate specificities of lysozyme from
different sources. J. Biochem. 72:993-1000.
11 - Kato, A.,H.R. Ibrahim,S. Nakamura,
and K. Kabayashi, 1994. In J.S Sim and S
Nakai (ed.). Egg Uses and Processing
Technologies. Wallingford (UK) : CAB
International. p. 250-268.
12 - Lakhtin, V.M.,E.A. Kostanova, and
N.P. Arbstskij. 1995. Isolation and