Ispitivanje osetljivosti bakterija na

antibiotike i hemioterapeutike

Institut za mikrobiologiju i imunologiju

Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu
 Antibakterijski agensi

Antibiotici Hemioterapeutici
u uže s ilsu

• Prirodni • Sintetski ili polusintetski

• Biološki proizvodi gljiva ili
drugih mikroorganizama
 Šta je a ti iogra ?

Postupak za ispitivanje osetljivosti bakterija

na antibiotike i hemioterapeutike
 Standardizacija antibiograma

Postupak izrade antibiograma nije oduvek bio

uniforman

Svaka laboratorija je imala „svoj rezultat

Standardizacija antibiograma – uvođe je pre iz ih

procedura za izradu i očitava je rezultata
 Kada i zašto se radi antibiogram?

Posle izolacije i identifikacije bakterija

(ponekad uporedo sa identifikacijom)

Da bismo znali na koje antibiotike je izolovana bakterija

osetljiva, a na koje nije, tj. koji antibiotik primeniti
Za koje bakterije se radi antibiogram?

Uzorci iz primarno sterilnih regija (krv, likvor i dr.):

1. za sve bakterije

Uzorci iz kolonizovanih regija:

1. za striktno patogene bakterije
2. za uslovno patogene bakterije za koje se procenjuje da
su ogući uzroč i i i fek ije a os ovu kli ičke slike,
broja bakterija, drugih nalaza)

Ne radi se antibiogram za bakterije koje su deo normalne

flore !
 Na koje antibiotike se testiraju
bakterije za koje se radi antibiogram ?

Izbor antibiotika zavisi od:

1. bakterijske vrste
2. od lokalizacije infektivnog procesa (materijala iz koga
je bakterija izolovana)
3. starosti pacijenta(deca!), alergije na pojedine
antibiotike, trud oće

Na osnovu rezultata antibiograma pravi se izbor antibiotika

za leče je i fek ije shod o kli ičko statusu ko kret og
pacijenta (komorbiditeti, imunski status, druga terapija itd.)
 Metode antibiograma

Fenotipske Genotipske

1. Difuzioni metod detekcija gena koji

kodiraju rezistenciju
2. Dilucioni metod na antibiotike

3. Difuzija antibiotika u gradijentu

koncentracije / E-test
4. Automatizovani sistemi
(identifikacija bakterija i ispitivanje
osetljivosti na antibiotike)
 Izbor metode antibiograma

• Najšire korišće etod - disk difuzioni (DD)

• Jed ostava za izvođe je, jeftin, ali nedovoljno

preciza e ože se odrediti MIK !

• Prema potrebi (kod teških infekcija) rade se

preciznije metode, kojima se određuje MIK
(dilucioni metod, E-test, automatizovani metod)
 Važ i para etri osetljivosti akterija a
antibiotike

MIK: minimalna inhibitorna koncentracija

aj a ja ko e tra ija a ti iotika koja sprečava
rast i raz ožava je akterija

MBK: minimalna baktericidna koncentracija

najmanja koncentracija antibiotika koja izaziva
smrt bakterija, tj. ubija 99,99% populacije
bakterija
 Z ačaj određiva ja minimalne inhibitorne
koncentracije (MIK) antibiotika
• Poznavanje vrednosti MIK određe og antibiotika za dati
bakterijski soj koji je izolovan od pacijenta o ogućava
individualno doziranje antibiotika

• Kod teških pa ije ata i vaziv e akterijske i fek ije

i/ili i sufi ije ija jetre, u rega.... je važ o pre iz o
individualno doziranje leka

• MIK se smatra referentnim kriterijumom za definisanje

osetljivosti mikroorganizama

• MIK se izražava u ug/ml (mg/L)

 Postupak disk difuzionog metoda

https://www.youtube.com/watch?v=uweRheNCj
_c
 Šta se dešava toko i ku a ije?
1. Bakterije formiraju slivene kolonije (konfluentan porast)
2. Antibiotik difunduje kroz podlogu
• koncentracija antibiotika postepeno i radijalno opada sa
udalje ošću od diska
• formira se zona inhibicije rasta

37°C
24 h

Čvrsta hra ljiva podloga Antibiogram Čita je

zasejana čisto akterijsko diskovi rezultata
kulturom
 Očitava je rezultata disk difuzio og
metoda antibiograma

Zona inhibicije rasta: okrugla zona oko diska sa

antibiotikom u kojoj nema vidljivog porasta bakterija

Merenje preč ika zone inhibicije

 Tu ače je rezultata a ti iogra a
3 kategorije osetljivosti:
osetljiv – verovat oća uspeha terapije je visoka
S ako pri e e uo ičaje ih doza a ti iotika, datih
a uo ičaje i ači
intermedijarno (umereno) osetljiv – ogući
I uspeh terapije ako se antibiotik da u maksimalnim
koncentracijama i pareneteralnim putem (iv ili im)
rezistentan - ne primenjuje se u terapiji;
R
bez obzira na dozu, terapija je vrlo verovatno
euspeš a
 Tu ače je rezultata disk difuzio og
metoda Dijametar zone inhibicije rasta

Pri er preporuče ih zo a Dijametar zone inhibicije rasta

Staphylococcus aureus S I R
Amikacin ≥29 ≤28

Uporediti izmerene Imipenem ≥16 14-15 ≤13

≥14 ≤9
preč ike zo a i hi i ije
Meticilin 10-13
Hloramfenikol ≥18 13-17 ≤12
rasta ispitivane bakterije Gentamicin ≥15 13-14 ≤12
Ciprofloksacin ≥21 16-20 ≤15
sa standardnim Trimetoprim+ ≥16 11-15 ≤10
preporuče i zo a a za sulfametoksazol
≥15
određe u akteriju i
Vankomicin / /
Escherichia coli S I R
određe i a ti iotik. Amikacin ≥17 14-16 ≤13
Imipenem ≥16 14-15 ≤13
Meticilin / / /
Hloramfenikol ≥18 13-17 ≤12
Gentamicin ≥15 13-14 ≤12
Ciprofloksacin ≥21 16-20 ≤15
Trimetoprim+ ≥16 11-15 ≤10
sulfametoksazol
Vankomicin / / /
Rezultati disk difuzionog metoda
antibiograma
Bakterija rezistentna na antibiotik Zona inhibicije
rasta
Disk
antibiotika
Rast
bakterija
 Disk difuzioni metod

Prednosti: Ogra iče ja:

• istovremeno se ispituje • e ože se odrediti MIK
osetljivost bakterije na (nedovoljno precizno);
veći roj a ti iotika rezultati se izražavaju u vidu
• jednostavan i jeftin kategorija osetljivosti (S, I, R)
• rezultati za 24 h
postoji opasnost od prevelike
ili marginalno efektivne doze

Kvalitativni metod u rutinskoj upotrebi

 Izbor najboljeg antibiotika u
odgovarajućoj dozi za datog pa ije ta
MIKROBIOLOG
Određiva je MIK antibiotika
za određe i soj bakterije koja je
izolovana od pacijenta
FARMAKOLOG
Poznavanje far akoloških parametara Multidisciplinarni
za taj antibiotik (zadržava je u pristup
organizmu, vreme eliminacije,
penetracija u tkiva...)
KLINIČAR
Postavljanje ispravne dijagnoze i
sagledavanje svih faktora rizika kod
pacijenta
 Moguć osti određiva ja MIK antibiotika

Difuzija antibiotika u
Dilucioni metod
gradijentu
antibiograma
koncentracije (E-test)

Agar Bujon
dilucioni dilucioni
metod metod
 Dilucioni metod antibiograma

• Dilucioni metod: iz dvostrukih raz laže ja

antibiotika u odgovarajućoj hra ljivoj podlozi

U zavisnosti od vrste podloge u kojoj se prave

raz laže ja a ti iotika:

1. bujon dilucioni metod

2. agar dilucioni metod

 Bujon dilucioni metod antibiograma
Bakterijska suspenzija

100 µl

Bujon
+
0,5 0,25 0,125 0,06 0,03 Antibiotik (µg/ml)

37°C 24 h

MIK MIK = 0,25 µg/ml

Tu ače je rezultata ikro ujo
dilucionog metoda
Jedan bakterijski izolat; osam antibiotika (A-H)
Konc. antibiotika µg/ml
0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 - + kontrole
 Agar dilucioni metod
• Jedanaest bakterijskih izolata (žuti krugovi)
• Jeda a ti iotik u 7 različitih ko e tra ija ,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32 µg/ml)
(svaka ploča sa čvrsto podlogo sadrži drugu ko e tra iju istog a ti iotika)

2
1

Koliki je MIK soja broj 1? A soja broj 2?

 Bujon / agar dilucione metode
antibiograma

Prednosti: Ogra iče ja:

• oguć ost • slože a teh ika
određiva ja MIK izvođe ja

• Referentne metode za ispitivanje osetljivosti bakterija

na antibiotike
• Izvode se u referentnim laboratoriama u ilju praće ja
rezistencije bakterija na antibiotike
• Ne rade se u kli ički ikro iološki la oratorija a
Difuzija antibiotika u gradijentu koncentracije
(E-test)
Zas iva se a pri ipu difuzije a ti iotika kroz čvrstu
hranljivu podlogu prethodno zasejanu ispitivanom
bakterijskom kulturom.
Antibiotik je nanet na traku u opadajuće gradijentu
koncentracije.
E E
12 12
8 8
4
3
37°C 4
3
2 2
1.5 1.5
1 1
.75 .75
.50 .50
.35 .35
.25 .25
.10 .10
.05
.02
24 h .05
.02
.01 .01

Plastič a/karto ska traka i preg ira a Zona inhibicije

antibiotikom u gradijentu rasta: oblik elipse
koncentracije
 Očitava je rezultata E-testa

Vrednost MIK:
• očitava se a skali ko e tra ija
na E-test traci
• na mestu gde linija zone
inhibicije rasta preseca ivicu E-test
trake MIK
E-test metod posle 24-časov e i ku a ije
 Interpretacija rezultata E-testa
Ciprofloksacin za Penicilin za S. pneumoniae
Yersinia pestis
R 2 µg/ l R
R > 4 ug/ml

I 1-4 ug/ml
I 0.125-1 µg/ml
I
S < 1 ug/ml

S 0.064 µg/ l S
 E-test vs. disk difuzioni metod

E-test DD metod

Zona inhibicije Zona inhibicije

rasta: rasta:
elipsoidna kružna

Rezultat: Rezultat:
1. MIK 1. Kategorija
2. Kategorija osetljivosti
osetljivosti
 Test difuzije antibiotika u gradijentu
koncentracije (E-test)

Prednosti: Ogra iče ja:

• direkt o očitava je • visoka cena
vrednosti MIK
• istovremeno se
ispituje osetljivost na
veći roj a ti iotika
• jednostavan
• rezultati za 24 h
 Automatizovani sistemi - princip
• Karti a i okulisa a akterijsko suspe zijo se
postavlja u aparat koji kolori etrijski očitava da li je došlo
do porasta bakterija u prisustvu antibiotika
• Svako polje a karti i sadrži a ti iotik različite
koncentracije

• Vrste antibiotika i raspon

raz laže ja defi isa i
dizajnom kartice
 Automatizovani sistemi - brza identifikacija
bakterija i ispitivanje osetljivosti na antibiotike

1. Priprema bakterijske 2. Unos bakterijske suspenzije u karti e

suspenzije

3. Unos panela u aparat (inkubacija)

4. Rezultati se očitavaju posle
nekoliko sati
5. Software interpretira kategorije
osetljivosti na osnovu dobijenih
MIK vrednosti
Genetičko određiva je reziste ije akterija
na antibiotike
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ekstrakcija
bakterijske DNK/RNK
Identifikacija

Amplifikacija gena -
PCR

Elektroforeza

Geni
rezistencije

Korišće je više parova prajmera (multipleks PCR) soj se ože identifikovati uz

dokazivanje prisustva dva gena koji kodiraju rezistenciju na eritromicin (ermC i ermA)

Uzorci 4 i 7 imaju oba gena rezistencije

 Određiva je reziste ije akterija a
antibiotike detekcijom gena

• Metode molekularne biologije

• Rezistencija je genski deteminisana precizna metoda
• Rezultati se dobijaju brzo (par sati)
• Veliki z ačaj kod akterija koje se teško izoluju
(primer: rezistencija kod mikobakterija)

Problemi:
• e ože se odrediti vred ost MIK
• geni nisu uvek eksprimirani
(bakterija ože imati „uspava ge kada ne dolazi do
fenotipske ekspresije rezistencije)
Akronimi značajnih rezistentnih patogena

• MRSA - meticilin rezistentan S. aureus

• VRE - vankomicin rezistentan Enterococcus
• ESBL – b lakta aze prošire og spektra delova ja
(engl. Extended-spectrum b-lactamases)
pojedine bakterije iz familije Enterobacteriaceae
(Klebsiella spp, E. coli, Proteus spp.)
Izolacija i identifikacija multirezistentnih
sojeva korišće je hro oge ih podloga
VRE MRSA
pink kolonije plave kolonije

CHROMagar™ VRE Brilliance MRSA 2 Chromogenic Agar

 Kojim metodama se NE može odrediti
vrednost MIK?

1. Disk difuzionim metodom antibiograma

2. Bujon dilucionom metodom antibiograma

3. Agar dilucionom metodom antibiograma

4. Testom difuzije antibiotika u gradijentu koncentracije

5. Detekcijom gena rezistencije

Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) je:

. aj a ja ko e tra ija a ti iotika koja sprečava rast i

raz ožava je bakterija

2. najmanja koncentracija bakterija koja raste u prisustvu

datog antibiotika

3. najmanja koncentracija antibiotika koja ubija 99,99%

bakterija
I dividual o dozira je a ti iotika je oguće
sprovesti:

1. na osnovu empirijskog poznavanja osetljivosti

veći e sojeva te vrste akterija a dati a ti iotik

2. ukoliko se zna profil rezistencije (kategorije S, I, R)

datog izolata bakterije na antibiotike

3. ukoliko se zna vrednost MIK za dati antibiotik

 Praktični rad

1. Očitava je rezultata disk difuzio og etoda

antiobiograma i popunjavanje laboratorijskog
izveštaja

. Očitava je rezultata ikro ujo dilu io og

metoda antibiograma