Diagnostyka

niedoborów odporności
 sytuacje sugerujące istnienie niedoboru odporności

 osiem lub > zakażeń dróg oddechowych lub uszu w ciągu roku

 dwa lub > zapaleń zatok / rok

 trwająca 2 m-ce lub > antybiotykoterapia bez wyraźnej poprawy

 2 lub > zapalenia płuc / rok

 brak przyrostu masy ciała lub wzrostu u dziecka z nawracającymi zakażeniami

 powtarzające się głębokie ropnie skórne lub ropnie narządowe

 przewlekające się grzybice jamy ustnej lub skóry u dzieci powyżej 1 roku życia

 konieczność długotrwałego stosowania antybiotyków dożylnych dla opanowania

zakażenia

 2 lub > ciężkie zakażenia, jak: posocznica, zapalenie mózgu, kości, skóry

 wywiad rodzinny wskazujący na występowanie pierwotnych niedoborów odporności

 dane z wywiadu i objawy kliniczne sugerujące możliwość zaburzeń
odporności (szczegółowe)

• poronienia, porody przedwczesne, śmierć noworodków w rodzinie

• nieprawidłowy przebieg ciąży, dystrofia wewnątrzmaciczna, wcześniactwo dotyczące

samego pacjenta

• podejrzenie przebytych przez matkę w czasie ciąży chorób, jak: różyczka,

toksoplazmoza, cytomegalia

• nieprawidłowe reakcje poszczepienne

• przewlekłe utrzymujące się na śluzówkach pleśniawki lub afty nie poddające się
leczeniu

• bardzo ciężko przebiegające choroby zakaźne wieku dziecięcego powikłane

zapaleniami płuc czy zapaleniem mózgu i opon m-rdz

• nawracające zakażenia układu oddechowego, skóry, dróg moczowych

• uporczywe robaczyce przewodu pokarmowego źle poddające się leczeniu

• współistnienie infekcji układu oddechowego u pacjentów z przewlekłą biegunką

niebakteryjną, zaburzeniami wchłaniania, niskim wzrostem
• tkanka limfoidalna jamy nosogardłowej w zaniku mimo nawracających zakażeń

• utrzymywanie się podwyższonej ciepłoty ciała bez wyjaśnionej przyczyny

• brak cienia grasicy lub przerost grasicy

• brak izohemaglutynin, brak ASO mimo nawracających infekcji paciorkowcowych lub

gronkowcowych

• obciążony wywiad rodzinny: choroby autoimmunologiczne, niedobór IgA,

limfopenia
Sytuacje sugerujące istnienie niedoboru odporności u osoby dorosłej:

 
cztery lub więcej infekcji (zapalenie płuc, oskrzeli, zatok, uszu) w ciągu roku
wymagających antybiotykoterapii

infekcje lub nawracające infekcje wymagające długotrwałego stosowania

antybiotyków

2 lub więcej ciężkie zakażenia bakteryjne (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych,

zapalenie kości, posocznica, zapalenie skóry)

dwa lub więcej potwierdzonych radiologicznie zapaleń płuc w ciągu 3 lat

zakażenie z nietypową lokalizacją lub spowodowane nietypowym patogenem

wywiad rodzinny wskazujący na istnienie pierwotnych niedoborów odporności

Cechy kliniczne sugerujące istnienie niedoborów odporności

 Infekcje czynnikami o niskiej patogenności (zakażenia oportunistyczne)

 Nawracające zakażenia o ciężkim przebiegu
 Przewlekłe zakażenia niepoddające się leczeniu
 Nawroty zakażeń pomimo leczenia
 Wywiad rodzinny w kierunku PID - niewyjaśnione zgony w okresie noworodkowym,
poronienia, wcześniactwo
 Znane objawy niedoborów odporności (np. tężyczka hypokalcemiczna w 1-2 dobie
życia, małopłytkowość, wygląd dziecka poparzonego, siwienie)
 Nawracające zapalenia zatok
 Przewlekła biegunka
 Niskowzrost
 Zmiany skórne (wyprysk, grzybica śluzówkowo-skórna)
 Hepatosplenomegalia
 Nawracające zapalenie skóry, ropnie, opóźnione gojenie ran
 Opóźnione odpadanie pępowiny
 Cechy autoagresji (zespoły autoimmunologiczne)
2. Objawy stwierdzane w badaniu przedmiotowym ogólnolekarskim:

– zaburzenia rozwoju somatycznego

– zaburzenia kostno-szkieletowe

– brak lub skąpe utkanie tkanki limfatycznej – migdałków, węzłów chłonnych

– zmiany skórne – wybroczyny, teleangiektazje, rash toczniopodobny

– ataksja móżdżkowa

– krwawienia.
Kryteria diagnostyczne niedoborów odporności:

 definitywne
potwierdzony defekt genu, >98% prawdopodobieństwa, że za 20 lat diagnoza będzie taka
sama,

 prawdopodobne
charakterystyczne cechy laboratoryjne i kliniczne bez potwierdzenia defektu genu lub
nieprawidłowości jego produktu, 85% prawdopodobieństwa,

 możliwe
przed bardziej szczegółową diagnostyką.
• w przypadku pierwotnych niedoborów odporności bez wczesnej
diagnostyki i wdrożenia adekwatnego do stwierdzanego defektu
immunologicznego leczenia, wielu pacjentów nie ma szans na
przeżycie

• zespół Di George’a - tężyczka hypokalcemiczna, wady serca

• zespół Wiskott-Aldrich’a - trombocytopenia, azs

• pierwotne niedobory immunoglobulin - nagły początek po 3 - 6 m.ż.

• selektywny niedobór IgA - po 4 r.ż.

• pospolity zmienny niedobór odporności - zwykle w 2-3 dekadzie życia

rodzaj i przebieg zakażeń:

• infekcje wywołane czynnikami o niskiej patogenności - Candida albicans,

Pneumocystis carini

• pacjenci z niedoborem przeciwciał - tendencja do rozwijania infekcji

spowodowanych drobnoustrojami otoczkowymi, jak Haemophilus,
Pneumococcus, Streptococcus; enterowirusy

• pacjenci z niedoborami typu komórkowego - infekcje wywołane przez wirusy,

grzyby, mycobacteria, pierwotniaki
wtórne niedobory odporności

 czynniki infekcyjne (HIV, odry) + leczenie

 choroby metaboliczne:
cukrzyca, mocznica, zespół nerczycowy, niedożywienie,
 niedobór witamin czy minerałów (cynk)
 choroby nowotworowe + leczenie
 choroby autoagresyjne + leczenie
 stres np. pooperacyjny czy pooparzeniowy
 nadmierna immunostymulacja
 leki p-padaczkowe, antybiotyki
 zespół przewlekłego zmęczenia
Zespół przewlekłego zmęczenia (chronic fatigue syndrome - CFS)

złożone zaburzenie charakteryzujące się uczuciem krańcowego wycieńczenia, które

występuje u pacjenta co najmniej od sześciu miesięcy. Jego rozpoznanie, oprócz
nieprzemijającego uczucia wyczerpania, określa się na podstawie 8 kluczowych symptomów,
spośród których pacjent musi spełniać minimum 4, a są to:

1.      Utrata/zaburzenia pamięci lub koncentracji.

2.      Ból gardła/chrypka.
3.      Powiększone węzły chłonne szyi lub pachowe.
4.      Niewyjaśnione bóle mięśni.
5.      Ból, który przemieszcza się z jednego stawu do drugiego bez obrzęku lub
zaczerwienienia.
6.      Ból głowy inny niż zwykle, o innym nasileniu.
7.      Sen nie dający wypoczynku.
8.      Skrajne wyczerpanie trwające dłużej niż 24 godziny po wysiłku fizycznym lub
psychicznym.
badanie fizykalne

• niskowzrost + nawracające zakażenia - niedobór komórek T i/lub B

• brak tkanki limfatycznej (migdałki) - prawdopodobnie agammaglobulinemia

• hepatosplenomegalia + rozsiana limfoadenopatia - ewentualnie infekcja HIV, CVID, zespół

Ommen’a

• postępująca ataksja, teleangiektazje na spojówkach, bocznych powierzchniach nosa, uszach,

okolicy zgięć łokciowych i kolanowych, nieprawidłowe ruchy gałek ocznych - ataksja-
teleangiektazja
• przewlekłe zmiany zapalne skóry - zespół hyper - IgE, zespół Ommen’a, inne SCID

• wyprysk o charakterze azs - zespół Wiskott-Aldrich’a

• zapalenie przyzębia - zaburzenia chemotaksji neutrofili

• siwienie, fotofobia, bladość skóry - zespół Chediak- Higashi

• zapalenie dziąseł, postępująca próchnica - zaburzenia adhezji

leukocytów
Pogłębienie diagnostyki immunologicznej zalecane jest przy występowaniu poniższych
objawów klinicznych:
 
 zwiększona podatność na zakażenia Chorują częściej, dłużej i inaczej
 cięższy przebieg infekcji
 przewlekłe zakażenia, przewlekła biegunka
 zwolnienie tempa wzrostu masy ciała
 zakażenia drobnoustrojami oportunistycznymi lub o małej zjadliwości
 wysypka o niewyjaśnionej etiologii
 nawracające lub przewlekłe zakażenia, nie poddające się antybiotykoterapii gojenie ran
 nawracające zakażenia skóry czy ropnie
 nawracające zapalenie przyzębia
 nawracające zakażenia Neisseria spp.
 choroby autoimmunologiczne
 choroby z pierwotnego niedoboru odporności w rodzinie
 rozpoznanie choroby często współistniejącej z niedoborem odporności
 nieprawidłowości w wynikach badań laboratoryjnych czy obrazie morfologicznym krwi
obwodowej m.in. limfopenia, hipereozynofilia, małopłytkowość, zmniejszone stężenie wapnia
zjonizowanego
Badania laboratoryjne - celowość oceny – wywiad, badanie fizykalne

1. Morfologia krwi pełnej z leuko- i płytkogramem

2. Badania bakteriologiczne
3. Ocena stężenia immunoglobulin IgA, IgG, IgM w surowicy; IgE opcjonalnie
4. Ocena reaktywności skóry – testy punktowe, płatkowe, odczyn tuberkulinowy
5. Ocena miana ASO, miana izohemaglutynin, miana p-ciał p-jądrowych, stężenia p-ciał
poszczepiennych, obecność autoprzeciwciał …
6. Ocena fenotypowa – cytometria przepływowa
7. Badanie szpiku – ocena dojrzewania poszczególnych linii komórkowych
8. Testy czynnościowe – test transformacji blastycznej
9. Ocena składowych i czynności układu odporności nieswoistej – fagocyty, dopełniacz,
białka ostrej fazy …
10. Ocena haplotypu HLA
 morfologia krwi pełnej z oceną leuko- i płytkogramu

ocena wstępna limfocytów B

podklasy immunoglobulin w surowicy
przeciwciała swoiste i izohemaglutyniny

ocena wstępna układu grasiczozależnego

testy skórne oceniające reakcje typu późnego
RTG klatki piersiowej (ocena cienia grasicy)

ocena szczegółowa układu grasiczozależnego

fenotyp komórek T (cytometria przepływowa)
aktywność proliferacyjna limfocytów T (mitogeny i antygeny)

ocena układu fagocytarnego + układu dopełniacza

test NBT, składowe dopełniacza

badanie bakteriologiczne
 ocena wartości leukogramu krwi obwodowej
(wartości odsetkowe i bezwzględne)

limfopenia - w 90% SCID, CVID - 1,5 G/l, u noworodków 2,0 - 4,5 G/l: nawracające zakażenia,
wyniszczenie, choroby autoagresyjne, aplazja szpiku spowodowana rozrostem komórek
hematopoetycznych,

limfocytoza - zespół Omenn’a, zespół hyper - IgE, wrodzona neutropenia

niskie wartości płytek, płytki morfologicznie małe - zespół Wiskott-Aldrich’a,

pancytopenia - dysgenezja siateczki,

niedobory p-ciał i/lub defekty komórek B

Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Haemophilus influenzae
Giardia lamblia
3. niedobory odporności z przewagą zaburzeń syntezy przeciwciał:

 agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X

 niedobór łańcuchów lekkich k

 selektywny niedobór podklas IgG lub IgA

 pospolity zmienny niedobór odporności (CVID)

 izolowany niedobór IgA

 sprzężony z płcią zespół hyper-IgM

 defekt przeciwciał z prawidłowym stężeniem IgG

 przejściowa hipogammaglobulinemia niemowląt

Zakład Immunologii Klinicznej UMB

 ocena układu humoralnego

morfologia krwi pełnej z leukogramem i płytkogramem

stężenie immunoglobulin A, G, M
stężenie immunoglobuliny E
stężenie immunoglobuliny D
stężenie podklas IgG
miano heamaglutynin, anty-A, anty-B
odsetek i wartość bezwzględna komórek B
stężenie p-ciał swoistych po szczepieniu
ocena odsetka komórek CD4 i CD8
ocena zdolności syntezy immunoglobulin in vitro
ocena stężenia immunoglobulin w surowicy krwi
(metoda nefelometryczna)

 zwykle prawidłowe stężenie IgA wyklucza

niedobory przeciwciał i odwrotnie,

 bardzo niskie lub nieoznaczalne stężenie IgA może

być objawem pierwotnego niedoboru przeciwciał,
 niedobory p-ciał

• izolowany niedobór IgA

IgA < 7 mg/dl; = IgG, IgM

• pierwotna hipogammaglobulinemia
IgA < 5 mg/dl; IgG < 300 mg/dl; IgM < 50 mg/dl

• agammaglobulinemia
IgG < 200 mg/dl; nieoznaczalne stężenie IgA i IgM

• zespół hiper-IgM
podwyższone stężenie IgM; nieoznaczalne IgA i IgG
 ocena podklas IgG - konieczna zwłaszcza w przypadku nawracających
zapaleń zatok obocznych nosa i zapaleń płuc
(metoda nefelometryczna)

wartości prawidłowe podklas IgG:

IgG1 - 60-65%, IgG2 - 20-25%, IgG3 - 5-10%, IgG4 - 6%

niedobór IgG1 - różne pierwotne i wtórne zaburzenia odporności

przewlekłe ropne zakażenia górnych i dolnych dróg oddechowych

niedobór IgG2 - selektywny niedobór - niezwykle rzadki,

głównie u dzieci z nawracającymi zakażeniami dróg oddechowych,
w zapaleniach ścian naczyń krwionośnych,
padaczce
często niedobory IgG2+IgG4+IgA = zakażenia dolnych dróg oddechowych,
rozstrzenie oskrzeli, astma oskrzelowa.
niedobór IgG3 - najczęstszy z niedoborów podklas,
nawracające zapalenia górnych dróg oddechowych,
zapalenia płuc, opon mózgowo-rdzeniowych, dróg moczowych,
zwyżki temperatury o niejasnej etiologii,
astma oskrzelowa

niedobór IgG4 - zwykle towarzyszy niedoborowi IgG2 i

izolowanemu niedoborowi IgA,
zapalenia zatok obocznych nosa, nosogardła, uszu, płuc,
rozstrzenie oskrzeli,
biegunki,
SLE,
zespół Down’a.
 ocena miana heamaglutynin, anty-A, anty-B w surowicy

(nie należy ich szukać u pacjentów z grupą krwi AB

* u dzieci > 1. roku życia i u osób dorosłych

izohemaglutyniny powinny występować w mianie
wyższym niż 1 : 10,

* miana niższe lub brak izohemaglutynin - zaburzenia syntezy

p-ciał, np. zespół Wiskott-Aldrich’a,

* wyraźna korelacja pomiędzy mianem izoheaglutynin

i stężeniem IgM w surowicy
 ocena wytwarzania p-ciał swoistych

* stymulacja antygenami proteinowymi -

szczyt wytwarzania p-ciał w 2. tyg. po podaniu
(brak reakcji u chorych z agammaglobulinemią)

* stymulacja szczepionkami polisacharydowymi -

szczyt wzrostu p-ciał swoistych w 3. tyg. po podaniu
(brak reakcji u chorych z selektywnym niedoborem IgG2 i chorych z
agammaglobulinemią, ciężkie reakcje w zespole Wiskott-Aldrich’a)
 podwyższone stężenie IgE
(UDSK - metoda fluorymetryczna UniCAP)

choroby atopowe,
choroby pasożytnicze,
pierwotne niedobory komórek T - zespół Ommen’a, Wiskott- Aldrich’a,
zespół Job’a (zaburzenia fagocytozy),
choroby autoagresyjne,
rozrostowe,
infekcje wirusowe (HIV),
poalkoholowa marskość wątroby

podwyższone stężenie IgE oceniane jako parametr izolowany nie diagnozuje

chorób alergicznych, znacząco niskie je wyklucza
 ocena liczby komórek B

• w puli krążących limfocytów komórki B stanowią 5 - 15%,

• fenotypowanie komórek przeciwciałami monoklonalnymi

ekspresja CD19, CD20, CD22, koekspresja CD40 w analizie cytometrycznej

• odsetek komórek B spada progresywnie do wieku

• obniżony - np. CVID,

• podwyższony - np. ostra faza zapalenia

Klasyfikacja SCID (Severe combined immunodeficiency – ciężki złożony niedobór
odporności) wg fenotypu limfocytów

T-B-NK-
Niedobór ADA, gen ADA, autosomalny recesywny
Niedobór PNP, gen PNP, autosomalny recesywny

T-B-NK+
Niedobór RAG1 lub RAG2, gen RAG1 lub RAG2, autosomalny recesywny

Zespół Omenna, mutacja w RAG1 lub RAG2 prowadząca do częściowej utraty funkcji,
autosomalna recesywna

SCID Atabasków lub Navajo, mutacja w produkcie dla genu Artemis, autosomalna
recesywna

T-B+NK-
Mutacja we wspólnym łańcuchu gamma (c), genie IL2RG, sprzężona z płcią
Mutacja w enzymie JAK3, genie JAK3, autosomalna recesywna

Zakład Immunologii Klinicznej UMB

2. Well-defined syndromes with immunodeficiency.

1.Wiskott–Aldrich syndrome (WAS)

2. DNA repair defects (other than those inTable 1) – defekty naprawy DNA
(a) Ataxia– telangiectasia
(c) Nijmegen breakage syndrome
(d) Bloom syndrome

3.Thymic defects – zaburzenia grasicze

DiGeorge anomaly (chromosome 22q11.2 deletion syndrome)

4. Immune-osseous dysplasias – dysplazje kostno-immunologiczne

(b) Cartilage hair hypoplasia
(c) Schimke syndrome

5. Comel– Netherton syndrome

Zakład Immunologii Klinicznej UMB

niedobory komórkowe - defekty komórek T

Mycobacteria species
Salmonella species
Listeria monocytogenes
Toxoplasma gondii
Pneumocystis carinii
grzyby, wirusy
skojarzone niedobory B i T

Candida albicans
Pneumocystis carinii
Aspergillus species
wirusy (herpes virus)
diagnostyka układu grasiczozależnego

ocena morfologiczna krwi pełnej

ocena nadwrażliwości skórnej typu późnego

badanie RTG/usg klatki piersiowej

ocena odsetka komórek m.in. CD4, CD8, CD3

ocena wykładników aktywacji CD69, CD25, CD71, HLA

ocena cytoplazmatycznych receptorów cytokinowych

ocena stopnia proliferacji

ocena zdolności syntezy cytokin (PBMC, subpopulacje izolowane)

 ocena nadwrażliwości skórnej typu późnego
(badania przesiewowe)

antygeny do prób śródskórnych (0,1 ml):

* tuberkulina - 0,1 ml (2-10 IU PPD, przy próbie ujemnej - 50 IU PPD),

* candida lub monilia - stężenie 1 : 100, przy próbie ujemnej - 1 : 10,

* trichophyton - stężenie 1 : 30,

* antygen wirusa świnki (w krajach gdzie obowiązuje szczepienie) - roztwór

nierozcieńczony

* anatyksyna tężcowa i błonicza - stężenie 1 : 100,

odczyt po 24 i 48 godzinach, największa średnica stwardnienia (bąbel - ujemna)

antygen pojedynczy - próba (+) - 5 mm lub większa, pojedyncza (-) nie

rozpoznajemy anergii

wiele antygenów - próba (+) - 2 mm lub większa

WHO nie zaleca stosowania tzw. multitestów

 diagnostyka in vitro
(ocena liczby limfocytów T)

znakowanie przeciwciałami monoklonalnymi

(ocena cytometryczna)

CD2 - wszystkie limfocyty T + część limfocytów NK

CD3 - immunokompetentne limfocyty T z receptorem TCR
CD4 - limfocyty pomocniczo/indukcyjne,
rozpoznające antygeny HLA II na APC,
CD8 - limfocyty supresorowo/cytotoksyczne,
rozpoznające antygeny HLA I na APC

współczynnik Th/Ts - CD4+/CD8+ - HIV - niski, alergie, na ogół podwyższony

komórki nie T - CD3-CD16+CD56+ - komórki NK - w niedoborach komórek T -

substytucja
 igła
podająca

impuls Coulter 1949

fluorescencji
Kamentsky 1965
Van Dilla 1969
zogniskowana
wiązka laserowa
kształt i wewnętrzna ziarnistość

wielkość
Fluoresceina (FITC)
wzbudzenie emisja
300 nm 400 nm Wavelength
500 nm 600 nm 700 nm

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

ity
s
n
te
In
e
tiv
la
e
R

białko
Phycoerytherin (PE)
wzbudzenie emisja
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

białko
Allophycocyanin (APC)
białko 632.5 nm (HeNe)

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

wzbudzenie emisja
Cytometria przepływowa

materiał:
krew, szpik (limfocyty, monocyty/makrofagi, eozynofile, płytki krwi, agregaty płytka-
makrofag, retikulocyty)
płyny ustrojowe (mózgowo-rdzeniowy, wysiękowe stawowe, opłucnowe, BAL, plwocina,
wysiękowy ucha itd.)
tkanki (tarczyca regiony TPO, guzy jelita grubego, migdałki itd.)
metody:
receptory powierzchniowe (konstytutywne, aktywacja, kostymulacja)
cytoplazmatyczne (glikokortykosteroidowe, cytokinowe)
ploidia DNA
stopień proliferacji
 wartości referencyjne

 rasa (uwarunkowania genetyczne),

 warunki geograficzne,

 warunki socjoekonomiczne,

 zróżnicowanie wiekowe,

 różna technika przygotowania materiału do badań,

 kalendarz szczepień.
 % %
80 40

60 30

CD3
CD19
NK
40 20

20 10

0 0
cord blood <1 yr 1-3 yrs 4-6 yrs 7-20 yrs 21-50 yrs 51-70 yrs >70 yrs
 % CD3HLADR
8
Th/Ts
7 T/B
6

0
cord <1 yr 1-3 4-6 7-20 21-50 51-70 >70
blood yrs yrs yrs yrs yrs yrs