CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I

Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

MP03 TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR

UF2. PRÀCTICA 1 EXTRACCIÓ D'ADN DE SANG PERIFÈRICA I AMPLIFICACIÓ DE
FRAGMENTS PER PCR

L’objectiu de la pràctica és obtenir una solució d’ADN a partir d'una mostra de sang
perifèrica, utilitzant un kit comercial d’extracció i purificació basat en columnes
(membranes de silica)(QIAmp® DNA Mini Kit de Qiagen). Amb aquesta mostra d’ADN es
farà una PCR multiplex basada en el protocol Biomed i es visualitzarà el resultat en un
gel d'agrosa.

I PART DIA 1: PROTOCOL D’EXTRACCIÓ DNA

1. Afegir a un tub eppendorf 200 μl de sang anticoagulada, 20 μl de proteïnasa K i

200 μl de Solució AL.
2. Vòrtex 15’’
3. Incubar 10 min a 56ºC. Vòrtex 10’’ durant la incubació.
4. Afegir 200 µl d'etanol 96-100 %.
5. Vòrtex 15’’
6. Transferir aquesta barreja a una columna
7. Centrifugar 1 min a 6000 g (rcf) o 8000 rpm (velocitat màxima)
8. Descartar el líquid del tub de recollida i tornar-lo a col·locar sota la columna
9. Afegir a la columna 500 µl del AW1 buffer (ethanol added)
10. Centrifugar 1 min a 8000 g (rcf)
11. Descartar el tub inferior d'un sol us i reemplaçar-lo per un nou
12. Afegir a la columna 500 µl del AW2 buffer (ethanol added)
13. Centrifugar 3 min a 12000 g (rcf) o 14000rpm (velocitat màxima)
14. Descartar el tub inferior d'un sol us i reemplaçar-lo per un tub eppendorf nou
15. Afegir a la columna 50 µl del AE buffer
16. Incubar 1 min a temperatura ambient
17. Centrifugar 1min a 6000 g (rcf) o 8000 rpm
18. L’eluït en l’eppendorf conté l’ADN i cal etiquetar i guardar (4ºC o -20ºC)

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 1 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

II PART DIA 1: QUANTIFICACIÓ DNA PER ESPECTROFOTOMETRIA

La ratio A260/A280 permet determinar la puresa de la mostra en relació a la presència de
proteïnes. Si l’ADN està lliure de proteïnes aquesta ratio es situa entre 1.7-2.
La ratio A260/ A230 permet determinar la puresa de la mostra en relació a la presència de sals,
carbohidrats, etc. Si l’ADN està lliure de contaminants aquesta ratio es situa entre 1.5-2.2.
L'absorbància a 260nm permet calcular la concentració d’ADN de doble cadena (DNAds)
sabent que el factor de conversió és 50 µg/mL

[ ]= A260 * factor de dilució * factor de conversió

PROTOCOL Quantificació ADN

• Diluir 5µl (12,5µl) la mostra d’ADN en 195µl (500µl) d'aigua o TE

• Mesurar l'absorbància a 260 i 280 nm
• Calcular la concentració de la mostra en μgr/ml.

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 2 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

FONAMENT PCR BIOMED

Reacció en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, 1984). Objectiu PCR

Multiplex: Amplificació de múltiples loci en una única reacció, utilitzant múltiples
parells de primers.
Biomed: To control for the quality and amplifiability of DNA from paraffin-embedded
material, a special multiplex control gene PCR was developed, resulting in a ladder of
five fragments (100, 200, 300, 400, and 600 bp). JJM van Dongen et al. Design and
standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin
and T-cell receptor genere combinations in suspect Lymphoproliferations. Leukemia
(2003) 17, 2257–2317

Primers utilitzats en el protocol Biomed

100F 5´GCCCGACATTCTGCAAGTCC3´
100R 5´GGTGTTGCCGGGAAGGGTT3´
200F 5´TGTTGACTCGATCCACCCCA5´
200R 5´TGAGCTGCAAGTTTGGCTGAA3´
300F 5´TGCGATGTGGTCATCATGGTG3´
300R 5´CGTGTCATTGTCGTCTGAGGC3´
400F 5´CCGCAGCAAGCAACGAACC3´
400R 5´GCTTTCCTCTGGCGGCTCC3´
600F 5´GGAGCAGCATTCCATCCAGC3´
600R 5´CATCCATGGGCCGGACATAA3´

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 3 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

III PART DIA 1: PROTOCOL PCR MULTIPLEX:

Mix x1 mostra x _____ mostres Programa PCR (2,5hores):

Tp 10X withMgCl2 2,5 µl • 10’ a 95ºC
dNTPs 2mM 2,5 µl • 40 cicles:
Primer Mix 0,5 µl o 45’’ a 95ºC
H2O 17,375 µl o 45’’ a 60ºC
TaqGold 0,125 µl o 1’30’’ a 72ºC
DNA 2 µl --------- • 10’ a 72ºC

Total 25 µl --------- • Mantenir a 4ºC

Preparació de la Primer Mix (100 µl):

2,5 µl de 100F i 2,5 del 100R
2,5 µl de 200Fi 2,5 del 200R
2,5 µl de 300Fi 2,5 del 300R
2,5 µl de 400Fi 2,5 del 400R
5 µl de 600Fi 5 del 600R
70 µl aigua

Calcula com es preparen 150 µl de dNTPs a 2mM:

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 4 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

FONAMENT DEL GEL D’AGAROSA

L’electroforesi en gel d’agarosa es una tècnica molt utilitzada per a la separació d’ADN.
L’agarosa és un polisacàrid de galactosa i 3,6-anhidrogalactosa. Les cases comercials la
solen vendre en forma de pols. Per a preparar-la cal diluir-la en aigua, però tan sols es
dilueix a temperatures superiors a 60º. Per aquesta raó s’escalfa la mescla en
microones. Gràcies als residus 3,6-OHgal i gal SO4 i depenent de la quantitat d’agarosa
dissolta, un cop solidificada es formarà una estructura porosa que serà la que
determinarà la separació de les molècules, segons la seva mida.
Una de les aplicacions més comuns del gel d’agarosa és la separació del producte
obtingut en la PCR, una tècnica que amplifica un fragment d’ADN específic. Una altra
aplicació important és l’estudi de la qualitat de l’ARN.

IV PART DIA 2: PROTOCOLO GEL AGAROSA:

Preparació del gel d’agarosa al 1,5%

1.- Agafar la bandeja del mini gel y cobrir els extrems amb cinta adhesiva.
2.- En un erlenmeyer afegir
- 50ml de TAE 1X
- 1,5% d’agarosa
3.- Escalfar al microones fins que bulli.
4.- Deixar refredar una mica i afegir SYBR Save (cal diluir 1:10000).
5.- Abocar la mescla en el portagels preparat i col·locar la pinta.
6.- Deixar que solidifiqui durant 20 min.

Preparació de la mostra, càrrega i electroforesi

7.- Barrejar en un eppendorf 20µl de mostra del producte de la PCR y 4 µl de TM 6X.
8.- Afegir a la cubeta d’electroforesi el buffer 1X fins que cobreixi tot el gel.
9.- Carregar les mostres preparades en el pous del gel. En un dels pous cal carregar un
estàndard de pes molecular.
10.- Connectar la font a 120 V durant 20-30 min. Finalment, observar el gel amb el
transil·luminador d’UV.

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 5 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

MP3UF2 - TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR

MP_UF_RA
RA 1, RA2 i RA3
TÍTOL DE LA PRÀCTICA 1. EXTRACCIÓ D'ADN DE SANG PERIFÈRICA I
PRÀCTICA AMPLIFICACIÓ DE FRAGMENTS PER PCR
NOM I COGNOMS

DATA

QÜESTIONARI : (Representa informe de pràctica i activitat de desdoblament)

1. Quina és la concentració d'ADN de la teva mostra? quina qualitat té?

2. Mix i programa de PCR utilitzat?
3. Resultats de la PCR. Suma la imatge i la descripció de cada carril.
4. Ha funcionat la PCR?, Perquè?
5. Si no fos així, que creus que podria haver passat?
6. Dona una explicació lògica i raonada a les següents situacions
a. No apareix cap banda a cap pou
b. Al control positiu no apareix banda (a la resta de mostres sí)
c. Apareix una banda no esperada a totes les mostres, inclús al control
negatiu

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 6 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

MP03 TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR

UF2. PRÀCTICA. CLONACIÓ DEL PLASMIDI PUC19 EN E. coli

OBJECTIU DE LA PRÀCTICA:
Conèixer algunes de les tècniques emprades en la clonació del DNA en sistemes
cel·lulars. La pràctica consta de quatre parts diferenciades que es fan en quatre dies
diferents:
Part I: Transformació de la soca d’E. coli DH5α amb el plasmidi pUC19 i obtenció de
colònies.
Part II: Amplificació dels bacteris portadors del plasmidi a partir de les colònies
formades.
Part III: Obtenció del DNA plasmídic utilitzant el kit “QIAprep” spin miniprep kit de
Qiagen i fragmentació amb enzims de restricció.
Part IV: Electroforesi en gel d’agarosa del DNA plasmídic i dels fragments obtinguts.

DIA 1: TRANSFORMACIÓ DE LA SOCA D’E. coli DH5α AMB EL PLASMIDI pUC19 I

OBTENCIÓ DE COLÒNIES.

FONAMENT:
La transformació bacteriana és el procés mitjançant el qual una soca de bacteris és
capaç de captar el DNA que hi ha en el medi. Es diu que els bacteris són COMPETENTS
quan són capaços de dur a terme aquesta transformació.

La soca d’E.coli DH5α és una soca que s’ha fet competent al laboratori de manera que
pot captar un DNA extern. L’eficiència de transformació d’aquesta soca és de 1 x 106
transformants / µg DNA.

Com a DNA extern utilitzarem el plasmidi pUC19 que té l’origen de replicació d’E.Coli,
un gen de resistència a l’ampicil·lina i el gen lacZ que codifica per l’enzim beta-
galactosidasa quan l’IPTG és present en el medi. Aquest enzim degradarà un anàleg de
la lactosa (X-gal) i podrem veure les colònies que hagin incorporat el plasmidi perquè
seran de color blau.

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 7 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

Materials i reactius necessaris:

Eppendorfs estèrils
Puntes estèrils
Plaques de medi LB-agar amb ampicil·lina (100 µg/ml)
IPTG 100 mM
X-gal 20 mg/ml
Medi LB

Procediment
Tot el procediment de manipulació es farà a la poiata. Excepte quan es digui el contrari
tot el procés caldrà fer-ho en fred.

Per grup:
1.- Descongelar en fred el tub de cèl·lules DH5α.
2.- Agafar 50 µl dels bacteris i posar-los en un eppendorf estèril.
3.- Afegir-hi 2,5µl de la solució de plasmidi pUC19. NO BARREJAR PIPETEJANT AMUNT
I AVALL. NOMÉS SACSEJAR EL TUB.
4.- Incubar en gel durant 30 minuts.
5.- Produir un shock tèrmic posant el tub durant 25 segons a 42ºC.
6.- Col·locar els tubs en gel durant 2 minuts.
7.- Afegir-hi 950 µl de medi LB atemperat a 37ºC.
8.- Incubar els tubs a 37ºC en agitació durant 1 hora.

Durant aquest temps cal afegir l’X-Gal i l’IPTG a dues de les plaques de LB-agar i
deixar-lo en incubació durant 30 minuts. Es posen 20µl de la solució d’X-gal i 40µl de
la solució d’IPTG en dues plaques de LB-agar i s’escampa tot amb la nansa de
digralsky perquè l’agar s’impregni dels dos compostos. Es deixa reposar 30 minuts a
temperatura ambient.

9.-En acabar el període d’incubació procedirem a la sembra de dos volums de bacteris

en plaques amb X-gal i IPTG i plaques sense X-gal i IPTG. Sembrarem 100 µl amb la
nansa de digralsky en unes plaques i 200µl en unes altres i ho incubarem a 37ºC tota la
nit (estufa).

*Cada grup tindrà dues plaques amb X-gal i IPTG (100 µl en una i 200 µl en una altra) i
dues plaques sense X-gal i IPTG (100µl en una i 200µl en una altra).

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 8 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

Mapa del pUC19

DIA 2 (Pati): Visualització de les colònies transformades del dia anterior.

Avui escollirem una colònia de les plaques, la picarem amb una nansa o bé una punta
groga estèril i la posarem en un tub estèril amb 4ml de medi LB amb ampicil·lina (100
µg/ml). Ho incubarem a 37ºC tota la nit en agitació (bany termostatitzat).

DIA 3: AÏLLAMENT DEL DNA PLASMÍDIC I FRAGMENTACIÓ PER ENZIMS DE

RESTRICCIÓ.

Part I: Aïllament del DNA plasmídic

Per aïllar el DNA plasmídic utilitzarem un kit de la casa Qiagen que es diu “Qiaprep Spin
Miniprep kit”. Està dissenyat per purificar aproximadament 20 µg de DNA plasmídic a
partir d’un cultiu “overnight” d’E.Coli (1-5 ml) amb medi Luria-Bertani (medi LB).

Material i reactius necessaris:

Eppendorfs estèrils
Puntes estèrils
Els reactius del kit (tampó P1, tampó P2, tampó N3, tampó PE i Tampó EB).

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 9 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

Procediment
1. Centrifugació dels tubs dels bacteris (velocitat màxima de la centrífuga durant 5
minuts).
2. S’elimina el sobrenedant i ens quedem amb el pellet on hi ha els bacteris.
3. Resuspendre el pellet de bacteris amb 250µl de tampó P1 (en aquest tampó s’hi
ha afegit RNAsaA per degradar l’RNA) i transferir tot el volum a un eppendorf
estèril. No han de quedar grumolls de bacteris sinó que el líquid ha de ser
homogeni.
4. S’afegeixen 250 µl de tampó P2 i es barreja molt bé invertint el tub entre 8 i 10
vegades. No passar pel vòrtex ja que fragmentaríem el DNA genòmic. Cal invertir
el tub fins que la solució es vegi viscosa i lleugerament clara (com a màxim 5
minuts abans de continuar).
5. Afegir 350µl de tampó N3 i barrejar ràpidament i minuciosa invertint el tub el
temps necessari fins que la solució es torni tèrbola però homogènia.
6. Centrifugar en la microcentrífuga durant 7 minuts (aprox. 13000 rpm). S’ha de
formar un botó blanc (pellet) i compacte.
7. S’agafa el sobrenedant obtingut i es transfereix a una de les columnes QIAprep del
kit.
8. Es centrifuga durant 1 minut. El líquid haurà passat a la part inferior del tub i és
descartat.
9. Es renta la columna afegint-hi 750µl de tampó PE i centrifugant durant 1 minut.
10. Es descarta el líquid de la part de sota i es torna a centrifugar durant 1 minut per
eliminar les restes de líquid que hagin pogut quedar adherides a la columna.
11. Es col·loca la columna amb un eppendorf net i estèril. S’elueix el DNA plasmídic
que haurà quedat unit a la membrana afegint-hi 50µl de tampó EB (10mM Tris
HCl, pH 8,5) al centre de la columna. Ens esperem 1 minut i centrifuguem durant 1
minut més.

Ja disposem de 50µl de DNA plasmídic purificat.

Part II: Digestió amb enzims de restricció

Digerirem el DNA procedent del pUC19 amb dos enzims de restricció: EcoRI i ScaI.
Farem la digestió amb cada enzim per separat i una digestió conjunta.

Per a cadascuna de les digestions individuals seguirem el següent protocol:

1. Agafarem 5µl de DNA plasmídic i els posarem en un eppendorf estèril.

2. Hi afegirem 12µl d’aigua estèril ultrapura. Atenció! Per la digestió amb els dos
enzims reduïm a 11µl la quantitat d’aigua estèril ultrapura que afegim i posem
1µl de cadascun dels dos enzims.
3. Hi afegirem 1µl d’enzim.
4. Hi afegirem 2µl de tampó 10x que ve amb l’enzim.
5. Ho incubarem durant 1 hora a 37ºC i ja ho tindrem preparat per carregar-ho al
gel d’electroforesi.
Versió: Aquest document pot quedar
Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 10 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

DIA 4: ELECTROFORESI EN GEL D’AGAROSA PER OBSERVAR EL DNA

Material i reactius necessaris:

Motllo pel gel d’agarosa
Cinta adhesiva
Pinta per fer els pouets dins del gel
Cubetes i font d’electroforesi de DNA
Transil·luminador
Agarosa 1.5%
Tampó TAE1x
Solució de SybrGreen (cal diluir 1:10000 la solució que arriba comercial; partim d’una
dilució prèvia 1:10 de la solució comercial).

Fonament
L’electroforesi en gel d’agarosa és una tècnica molt utilitzada per a la separació d’àcids
nucleics. L’agarosa és un polisacàrid de galactosa i 3.6-anhidrogalactosa. Es ven en
pols. Per preparar-la cal diluir-la en aigua, però només es dilueix a temperatures
superiors als 60ºC de manera que cal escalfar la barreja al microones. Gràcies als
residus 3,6-OHgal i gal SO4- i depenent de la quantitat d’agarosa dissolta, un cop
solidificada, es formarà una estructura porosa que serà la que determinarà la
separació de les molècules segons el seu tamany.

TÈCNICA
Preparació del gel d’agarosa al 1%

1. Agafar el motllo del mini gel i cobrir els extrems amb cinta adhesiva segons
l’esquema. També preparar la pinta.
FIG.1 Motllo de
gels Cinta
autoclau

Pinta: farem
servir la de 6

2. En un erlenmeyer posar-hi
- 50ml de TAE 1x
- 0.5g d’agarosa

3. Posar-ho al microones perquè es dissolgui. Quan comenci a fer bombolletes ja

es pot treure.

4. Deixar que es refredi una mica i afegir-hi 50l de la solució de SybrGreen.

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 11 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

5. Abocar-ho tot al motllo i posar-hi la pinta.

6. Deixar que solidifiqui durant uns 20 min.

Preparació de les mostres

7. Posarem en eppendorfs 15µl de cadascun dels productes de les digestions i del

DNA sense digerir i a cada tub hi afegirem 3µl del tampó de càrrega 6X. El
tampó de càrrega porta blau de bromofenol que ens permetrà seguir
l’avançament de les mostres en el gel i glicerol que els dona pes i fa que no
surtin del pouet. Carregarem també marcadors de bases de DNA. El DNA ladder
que farem servir s’afegeix directament al pouet (10µl).

Càrrega del gel i electroforesi

8. Cal afegir a la cubeta tampó TBE 1X fins que cobreixi el gel d’agarosa.

9. Carregar les mostres als pouets i afegir en un pou l’estàndard de pes molecular.
10. Connectar la font a 120 V durant 20-30 min.

11. Observar el gel amb el transil·luminador d’UV.

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 12 de 13
 CGFS LABORATORI CLÍNIC I BIOMÈDIC PRÀCTICA I
Curs 2022-23
ACTIVITAT PARAL·LELA

MP_UF_RA MP3UF2 - TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR RA4

TÍTOL DE LA
PRÀCTICA 2. CLONACIÓ DEL PLASMIDI PUC19 EN E. coli
PRÀCTICA
NOM I COGNOMS

DATA

QÜESTIONARI : (Representa informe de pràctica i activitat de desdoblament)

1. Què és la transformació bacteriana?

2. Què vol dir que un bacteri és competent?
3. Què és un vector de clonació?
4. Quines són les parts del pUC19 que el converteixen en un vector de clonació?
5. Resultats de la clonació. Suma la imatge del gel d’agarosa i la descripció de cada
carril. Quantes bandes has obtingut en cadascun dels carrils del gel? Quantes
n’hauries d’haver obtingut? Per què?
6. En cas que no hagis obtingut bandes en un carril, raona què pot haver passat en
el procediment que expliqui el resultat que has obtingut.

7. Respon breument Després de la transformació dels bacteris DH5alfa amb el

plasmidi pUC19 els sembrem en dos tipus de plaques, les unes amb X-gal i IPTG
i les altres sense X-gal i IPTG. Tots dos tipus de plaques tenen ampicil·lina.
a) Per què hem posat ampicil·lina a les plaques de LB-agar?
b) Quin color tenen les colònies obtingudes a les plaques amb X-gal i IPTG i per
què?
c) Quin color tenen les colònies obtingudes a les plaques sense X-gal i IPTG?
d) Totes les colònies obtingudes en aquestes plaques és d’esperar que hagin
incorporat el plàsmid? Per què?
8. Digereixo el pUC 19 amb l’enzim Ssp I, quants fragments se’m generaran i de
quina mida?
9. On estan dins del pUc19 les dianes de restricció pels enzims EcoRI i ScaI
utilitzats per a la digestió del DNA plasmídic de la pràctica?

Versió: Aquest document pot quedar

Elaborat: obsolet una vegada imprés
Data d’entrada en vigor:
Arxiu: Pàgina 13 de 13