Kwalificatiedossier 

  Analisten  Crebonummer 23030 

1 augustus 2015  dossier 
Kwalificatie  Chemishe-fysisch analist  Crebonummer 93714 
kwalificatie 
Examenkandidaat  Dani Mierop  Studentnummer  503711 
Jasper Nijsters  508880 
Kain Cober  405445 
   
Cohort:  2021-2022  Datum  4-5-2022 
School  Vista college  Tijdsduur schrijven  
onderzoeksverslag 
 
Hierbij verklaar ik dat de Naam vertegenwoordiger Datum   Paraaf  
in dit rapport examenlocatie  
opgenomen         
meetgegevens door
derden mogen worden
ingezien en/of
beoordeeld.  
 Chlooramfenicol in ei met behulp van
hplc
Gemaakt door: Jasper Nijsters, Dani Mierop en Kain Cober

2
Samenvatting:
Met dit verslag wordt er meer duidelijkheid gegeven over ons project bij praktijk chemie. Ons project
houdt in dat we het chlooramfenicol gehalte in een ei van een kip zijn gaan bepalen. Uiteindelijk gaat
het om het gehalte chlooramfenicol dat we met de HPLC hebben bepaald. Ook hebben we nog het
voorschrift dat we moesten volgen aangepast zodat deze makkelijker te begrijpen en te volgen valt.
Er was uit dit project geen fatsoenlijk resultaat uitgekomen. We raden aan voor volgende groepen
om een duidelijker voorschrift te gebruiken en na te gaan of alle benodigdheden in het lab te vinden
zijn.

3
Inhoudsopgave:
Samenvatting blz. 3
Inleiding blz. 5
Theoretische achtergrond blz. 6
Chlooramfenicol blz. 6
HPLC blz. 7
Centrifuge blz. 8
Rotatieverdamper blz. 9
Materiaal en Methode blz. 10
Meetwaarde en resultaten blz. 12
Conclusie blz. 14
Bronvermelding blz. 15
Bijlage blz. 16

4
Inleiding:
We hebben eerst een voorschrift gekregen. Op basis hiervan hebben we een planning gemaakt om zo
efficiënt mogelijk een planning te maken. Het doel is om het chlooramfenicol gehalte in ei te
bepalen. Chlooramfenicol is een bacteriostatisch antibioticum dat de synthese van eiwitten in
bacteriën remt het wordt vooral gebruikt bij levensbedreigende infecties voor meer informatie zie
Theoretische achtergrond Chlooramfenicol.

5
Theoretische achtergronden:
Chlooramfenicol:
[4]
Chlooramfenicol is een bacteriostatisch antibioticum dat de synthese van eiwitten in bacteriën
remt. Het wordt geproduceerd door de bacterie streptomyces venezuelea  maar kan inmiddels
synthetisch worden vervaardigd. Chlooramfenicol is effectief tegen veel micro-organisme, maar
wordt vanwege ernstige bijwerkingen vooral gebruikt bij levensbedreigende infecties. Omdat
chlooramfenicol heel makkelijk langs de bloed-hersenbarrière gaat wordt het gebruikt
voor hersenabcessen te bestrijden.

6
HPLC:
[3]
HPLC bestaat uit twee fase de stationaire fase wat de binnenkant van de kolom is gevuld met een
pakking van kleine bolletjes. Deze pakking is meestal van silica. De grootte van de bolletjes is
afhankelijk van de kolom, maar diameters tussen 3 μm en 5 μm zijn het meest gebruikelijk. Kleinere
deeltjes geven een betere scheiding dan grotere deeltjes, maar ook een hogere druk. De bolletjes zijn
bekleed met een actieve laag die een interactie aangaat met de mobiele fase en de componenten
van het te analyseren monster. De mobile fase bestaat uit een polair of apolair oplosmiddel ook wel
de eluent genoemd in ons geval was dit een polair oplosmiddel. Als het monster er door gaat wordt
dit door de detector gedetecteerd en vervolgens via een gebonden computer zichtbar gemaakt als
een chromatogram en tabel.

7
Centrifuge:
[1]
Een centrifuge wordt gebruikt voor scheiding van suspensies dit proces wordt gedaan door aan
monsters aan een as te hangen en dan te laten ronddraaien. Hier door ontstaat centrifugale kracht
wat de vloeistof van de vaste stof uit de suspensie scheidt.

8
Rotatieverdamper:
[2]
Het toestel bestaat uit een met water/ olie gevuld verwarmingsbad die een draaiende
rondbodemkolf verwarmt. In de kolf bevindt zich een oplossing waaruit het oplosmiddel
verdampt moet worden. Door het draaien wordt de binnenkant van de kolf steeds weer
bevochti gd met een dun laagje oplosmiddel ook wel de fi lm genoemd.
Door middel van een vacuümpomp staat de rotati everdamper onder verlaagde druk,
waardoor het kookpunt van het oplosmiddel verlaagd wordt. Hierdoor verdampt het
oplosmiddel nog gemakkelijker. Het verdampte oplosmiddel wordt weer vloeibaar en
opgevangen in een opvangkolf via een spiraalkoeler

9
Materiaal en methode:
Voor deze meting is gebruikgemaakt van het verslag ‘’verslag 83,4 bepaling van
chlooramfenicol in eieren’’ en voorschrift ‘’HPLC-optimalisatie cafeïne of paracetamol’’

Benodigdheden:

reagentia:
-millipore-water (HPLC-water)
-methanol
-ethylacetaat
-acetonitril
-iso-oktaan
-n-hexaan
-diëthylether
-natriumsulfaat
-natriumchloride
-kaliumchloride
-ammonia
-ammoniumchloride
-kaliumdihydrogeenfosfaat
-dinatriumhydrogeenfosfaat
-chlooramfenicol

apparatuur:
-rotatieverdamper
-centrifuge
-HPLC met UV-detectie
-pH meter
-omni-mixer
-normaal laboratorium glaswerk

10
 HPLC instellingen
kolommen
analytische kolom: lichrosorb 5 RP 18 (4,6 mm ID x 15 cm lengte) 5 μm chromepack art.
28810
voorkolom: bondapack C 18 (3,9 mm ID x 2 cm lengte) 37-50 μm waters art 27248.
Eluens
water (gebufferd)-methanol 75-25 1,5ml/min
Detectie
golflengte: 278 nm
gevoeligheid: 0,005-0,04 aufs
Injectie
injectievolume 50 μl
Werkwijze: zie bijlage 3

11
Meetwaarden en resultaten:

Tabel 1: monster meting als uit bijlage 1 en 2

Piek# Ret. Tijd Oppervlakte Hoogte
(1) (2) (3) (4)
Minuten uV uV
1 0,088 1217 164
2 0,698 42654 1461
3 1,204 4945 734
4 1,373 10789 1610
5 1,490 20970 2880
6 1,814 559373 111573
7 1,917 1278879 116283
8 2,302 83538 17420
9 2,409 4177723 47243
10 2,821 71143 9261
11 3,131 179827 9871
12 3,349 49912 6385
13 3,504 31904 5242
14 3,644 14999 3506
15 3,697 17027 3491
16 3,868 65781 7623
17 4,078 25472 2665
18 4,238 20325 2356
19 4,450 6966 1091
20 4,701 40929 5515
21 4,878 1413 278
Totaal 2945786 356653

12
Grafieken:
Grafiek 1:

13
Conclusie en discussie:
Ondanks het feit dat we geen resultaat hebben kunnen concluderen uit ons practicum,
hebben we wel een conclusie weten te krijgen. Onze conclusie is dat het voorschrift dat ons
is gegeven en wij hebben gevolgd ongeschikt is om uit te voeren. Het voorschrift is
onduidelijk en het materiaal wat nodig is voor het practicum ligt niet allemaal op school
waardoor sommige stappen moeilijk uit te voeren zijn.

14
Bronvermelding:
[1]https://nl.wikipedia.org/wiki/Centrifuge#:~:text=Werking,(buitenwaarts%20gerichte)
%20centrifugale%20kracht.
[2]https://www.vosinstrumenten.nl/laboratorium/apparatuur/rotatieverdampers/
#:~:text=Wat%20is%20een%20rotatieverdamper&text=De%20draaiverdamper
%20bevordert%20de%20verdamping,de%20binnenzijde%20van%20een%20rondbodemkolf.
[3]https://nl.wikipedia.org/wiki/High-
performance_liquid_chromatography#Scheidingsmethoden
[4]https://nl.wikipedia.org/wiki/Chlooramfenicol

15
Bijlagen
Bijlagen 1: monster meting deel 1

16
Bijlagen 2: monster meting deel 2

17
Bijlage 3: werkwijze

1 Bereiding chemicaliën:

1.1 natriumchloride oplossing 4%

Los 40g natriumchloride op in millipore-water. Vul aan tot 1000ml en meng.

1.2 verzadigd kaliumchloride oplossing

Los 34g kaliumchloride op in 100ml millipore-water.

1.3 waterige buffer pH=10,4

los 54g ammoniumchloride op in ca. 300ml millipore-water en voeg 350ml ammonia toe.
Controleer de ph met een pH meter. (pH=10,4) vul aan tot 1000ml en meng
1.4 Eluens vloeistofchromatografie water (gebufferd)-methanol 75-25
los 0,68g kaliumdihydrogeenfosfaat en 0,89g dinatriumhydrogeenfosfaat. 2 hydraat op in
750ml millipore-water. voeg hierna 250ml methanol toe meng en filtreer het mengsel door
een millipore filter.

1.5 chlooramfenicol standaardoplossing

-voeg ca. 50mg chlooramfenicol nauwkeurig op 1mg af in een maatkolf van 100ml. Los op in
methanol en meng.
-pipiteer 10ml om naar een maatkolf van 100ml vul aan met millipore-water en meng.
(Oplossing B)
-pipiteer 10ml van oplossing B naar een maatkolf van 100ml vul aan met millipore-water en
meng. (Oplossing C)
-pipiteer 10ml van oplossing C naar een maatkolf van 100ml vul aan met millipore-water en
meng. (Oplossing D = 500ng/ml)

2 extractie
-Breng in een 800ml bekerglas het eiwit en eigeel van een ei en bepaal het gewicht. Meng
het eiwit en eigeel goed.
-Voeg hierna 150g natriumsulfaat toe en homogeniseer het mengsel met behulp van een
glasstaaf.
-breng 300ml ethylacetaat in het bekerglas en meng met behulp van de omni-mixer voor 5
minuten.
-centrifugeer gedurende 5 minuten bij 6000 rpm.
-breng 150 ml van het supernatant in een 250 ml indampkolf en damp het supernatant in
met behulp van de rotatieverdamper, tot er een olieachtig residu overblijft.
3 zuivering
-neem het residu op in ca. 10ml acetonnitril en breng het met behulp van 25 ml iso-oktaan in
een 100ml schietrechter.
-schud de afgesloten schietrechter gedurende 1 minuut en laat de fasen scheiden.
- laat de onderstaande acetonnitrilfase af in een 100ml indampkolf en spoel na met 2ml
acetonnitril.

18
-schud de iso-oktaanfase nogmaals gedurende 1 minuut met 10ml acetonnitril.
- laat de fasen scheiden en laat de onderstaande acetonitrilfase af in de indampkolf en spoel
na met 2ml acetonitril.
-damp de verzamelden acetonnitrilfase op in een rotatieverdamper tot er een droog residu
overblijft.
-los het residu op in 1ml methanol en voeg 10ml natriumchloride oplossing 4% toe.
-breng het mengsel met 15 ml hexaan kwantitatief over naar een 100ml schietrechter.
- schud de afgesloten schietrechter gedurende 1 minuut en laat de fasen scheiden.
-laat de onderstaande waterig fase af in een indampkolf van 100ml en spoel na met 1ml
millipore-water en voeg 2ml millipore-water toe aan de hexaan fase. Schud gedurende 10s
en spoel na met 1ml millipore-water.

-laat de waterige fase af in de indampkolf en verwerp de hexaan fase. Verzamel de waterige

zoutoplossing in de 100ml schietrechter met 15ml hexaan. Schud de schietrechter nogmaals
gedurend 1 minuut en handel als bovenstaand
-voeg hierna aan de waterige fase 2ml kaliumchloride oplossing en 3ml buffer toe en breng
het geheel kwantitatief met 30ml diëthylether over in de 100ml schietrechter.
-schud de fase gedurend 1 minuut en laat ze schieden.
-laat de onderstaande waterge fase af in de reeds gebruikte 100ml indampkolf.
-filtreer de bovenstaande etherfase welke chlooramphenicol bevat in een indampkolf van
100ml waarop zich een trechter met glaswol en droog natriumsulfaat bevindt. Spoel the
schietrechter af met 2ml diëthylether.
- breng de waterige fase opnieuw in de schietrechter m.b.v. van 30ml diëthylether en schud
gedurend 1 minuut en handel dan nogmalls als bovenstaand.
-spoel, nadat beide ether-fracties zijn verzameld in de indampkolf, de natriumsulfaat met 3
maal 5ml diëthylether.
-verdamp de ether op de rotatieverdamper tot droog.
-los het residu p in 1ml millipore-water, filtreer het residu over een filter (Gelman acrodisc
0,45 μm).
-injekteer van het filtraat 50 μl in het HPLC-systeem
4 uitvoering
breng 50 μl van de verkrege monsteroplosing in het HPLC systeem en vergelijk de
chlooramphenicol piek met die van een standaard oplossing. Bereken het gehalte in μg/kg
aan chlooramphenicol in het monster.

19