14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023].

See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
European J. Biochem. 9 (1969) 189-198

Comparaison de la composition chimique d’une fraction lipopolysaccharidique

et d’une fraction polysaccharidique isol6es de BruceZZa melitensis
et J. ASSELINEAU
C. LACAVE
Laboretoire de Chimie Biologique, FacultA dea Scienm, Univemit.4.de Toulouae

A. SERREet J. Roux
Laboratoire de Microbiologie, Facult4 de MBdecine, Univereit4 de Montpellier
( R e p le 16 octobre 1968/22 janvier 1969)

Westphal’s procedure was found the most suitable for the isolation of lipopolysaccharide
fractions from Brucella melitensis cells; only the fraction obtained in the aqueous layer (LPS)
is studied in this paper. Beside LPS, an extracellular polysaccharide fraction (PS) was extracted
from the culture medium of the bacteria, and the chemical composition of both fractions, LPS
and PS, has been compared.
I n both cases, nucleic acid contaminants were eliminated either by alcohol precipitation or
by use of cetavlon. These treatments also removed an acidic polysaccharide containing mainly
galactosaminuronic acid, which might be Vi antigen.
The main difference between LPS and PS ia the presence of a small amount of lipid A in LPS
(ca. 1 As in the case of lipid A isolated from LPS of Enterobacteria, Brucella lipid A contains
glucosamine and fatty acids, but B-hydroxymyristic acid could not be detected.
The behaviour of LPS and PS fractions on DEAE-cellulose columns is very similar, end the
small differences that could be observed may be explained by solubility changes due to the lipid
moiety present in LPS.
Both fractions contain 2-keto-3-hydroxy-octulosonic acid, a mixture of D- and L-glycero-
D-mannoheptoses,a high amount of glucose, galactose, a 3,6-dideoxyhexose (cofitme or abequose),
and a methylated sugar behaving as a methylated derivative of dideoxyhexose. Small amounts
of rhamnose in PS and of arabinose in LPS seem to be due to contaminants.

En raison du rale jou6 par la pmoi cellulaire des
Brucella dans certains phbnomhnes biologiques (anti-
gBnicit6, toxicit&,pouvoir protecteur . . .) [i]il nous
a paru intkressant d’ktudier la composition chimique
de cette paroi. D’une manihre gkndrale, la composition
chimique de la paroi de certaines bactdries B gram
nkgatif a BtB bien btudihe, surtout chez les EnMro-
bactCriacBes, et a fait, l’objet de revues d6taillBes [2] ;
cependant, peu d’informations sont actuellement
disponibles dans le caa des parois de B r w U a . Ant&
rieurement, nous avions m i s en Bvidence dans les
Abrhiatiom nun w e l l e s . Dam la suite de l’expod, nous
utilberons les abrbviations suivantes: LPS et Ps pour les
prbparations de lipopolysaccharidea et polysaccharides
respectivement, telles qu’elles eont dbfiniee dans le texte;
LPSc et PSc pour lea mernes prbparationa ap& traitement
par le catavlon; LPS.t et PSd pour lea pr6psrationa ob-
tenues apSs traitement par 1’6thanol; KDO: acide c6to-2
d6eoxy-3 D-manno-octuloeonique;R,lC = RF raffortb au Rp
du glucose.
Ce memoire comtitue une partie de la these de Doctorat-
&-Sciences Natureues qui wra eoutenue par c. h a v e , en
1969, devant la Faculte dea Sciencea de Toulouse, enregist&
au C.N.R.S. EOUS le No A.O. 2983.
parois de Br. abortus et Br. melitmie un peptido-
glycane de composition semblable it celle des peptido-
glycanes dkjit isolks d‘autres bactkries [3]; il a B t B
Btudih ulthrieurement par Mardarowicz dans Brucella
abortus S-19 [a]. Chez les Brucella, le peptidoglycane
ne reprbsente qu’une treB faible proportion des con-
stituants de la paroi.
Un groupe de substances, localisees dans les parois
de bactkries $, gram nkgatif, a fait l’objet de nombreux
travaux, en raison des propriBt6s biologiques varides
qu’elles manifestent : ce sont les lipopolysaccharides
et polysaccharides [11 responsables de l’antigBnicit0
et de la spBcificit6 de nombreuses bactbries [2,5].
Dans les Brucella, des travaux anciens dbcrivent des
polysaccharides antigkniques, mais de nature chimi-
que obscure [6]. Plus rbcemment, Westphal[7] a
Lo16 un lipopolpccharide biologiquement inactif
sans donner d‘information sur sa composition;
Dubrovskaya et al. [8] ont compare les propriktes
serologiques et la composition en sucres des lipopoly-
aaccharides de souches R et 5. Enfin, Redfearn[9]
d’une part, Parnaa ef al. [lo] d‘autre part, ont BtudiB

190 Lipopolysaccharide de Brucella melitensis
ces composes essentiellement au point de vue biolo-
gique. On relhve de nombreuses contradictions entre
ces divers auteurs en ce qui concerne la nature des
constituants : tandis que Dubrovskaya mentionne des
Werenoes entre lea formes R et S, Parnas n’en trouvc
pas, et attribue les proprietds biologiques aux pro-
teines plut6t qu’aux polysaccharides.
Dens ce travail, nous avons cherche it identifier
lea principaux constituants d’une fraction lipopoly-
saccharidique de Brucelb melitensis, designee dans ce
qui suit par LPS, et it Btablir un parallkle entre LPS
et une fraction polysaccharidique extra-cellulaire,
designee par PS. I1 faut faire certaines restrictions
cependant, it cause des fluctuations relevees au cours
de l’experimentation: certaines fractions n’apparais-
sent pas de fapon constante, de trhs 16gAres modifica-
tions des conditions de culture (pH, temperature,
dude) ou du processus d’extraction se repercutent
sur les resultats obtenus. Ce fait n’est pas exceptionnel
et a BtB souligne par Nowotny et al. [ill. Lea resultats
ci-aprh ne tiennent compte que des donnees con-
stantes et reproductibles.
MAaRIEL ET MgTHODES
BactkPies
Elles proviennent de la souche Brucella melitensis
M 15 isolee dans le Laboratoire de Microbiologie de
la Facult6 de MBdecine de Montpellier 06 les premiers
lots de bacteries ont Btt5 cultives. D’autres lots de la
m6me souche bacterienne ont 6th cultivds it 1’Institut
Merieux de Lyon. Le milieu de culture et les conditions
de la recolte sont decrits dans une prhcedente publi-
cation[12]. Les batteries en provenance de Mont-
pellier Btaient repues en suspension dans un melange
alcool-ether (l:l, v/v) et celles fournies par l’In-
stitut Mdrieux sont en suspension dans un melange
tampon phosphate de pH 7,24thanol (1 :1, v/v).
L’intervalle de temps separant le moment de la
recolte de celui oh le materiel est trait6 eat inferieur
it 48 heures.
Extraction
Lipplysaccharide. Les methodes de Boivin [13]
et de Ribi [14] n’ont pas 6th retenues, la premiere
donnant un melange trop complexe et la seconde
ayant un tree faible rendement. Nous avons utilise
Le mbthode de Westphal[15] : aprhs trois extractions
successives 8. 65”par un melange phenol-eau (1:1,
v/v), la phase aqueuse est dialyde pour 6liminer les
traces de phenol ; le lipopolysaccharide en solution
est prdcipit6 par l’ethanol en presence de MgC1, (on
ajoute une solution de MgC1, 8. 20°/, dans l’6thanol
jusqu’8 concentration de 0,2 A titre indicatif, les
rendements moyens obtenus par rapport aux cellules
entihres, ont 6th les suivants: (a) fraction isolee de la
phase aqueuse (LPS): S o l 0 ; (b) phase intermediaire
entre l’eau et le ph6nol: 180/,; (c) fraction soluble
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
European J. Biochem.
dans le phenol (obtenue par precipitation par 1’Qther):
2601,; (d) fraction insoluble dans le phenol: 470/0
(pour ses propri&t6s,voir [12]).
Polysacchuride extra-cellukzire. Les bacteries pro-
venant de 1’Institut MBrieux sont centrifugees 1 4”,
B l’aide d’une centrifugeuse Sorvall (15000x g), puis
lades avant extraction par le phenol. Le surnageant
est concentre sous pression reduite (elimination de
l’alc001et reduction du volume), puis dialyse (3 jours
contre eau courante et 2 jours contre eau distillke).
On precipite le materiel en solution par 1’8thanol et
on centrifuge pour recueillir le precipite (PS).
PrCcipitation par un sel d’ammonium quatermire
(bromure de cay1 trimkthyl ammonium ou cetavlon).
Aux PS ou LPS en solution it 0,5O/, dans le sulfate
de sodium 20 mM, on ajoute une solution de cetavlon
it 1,5O l 0 dans l’eau ; par centrifugation, on recuphre le
surnageant qui contient lea polysaccharides neutres
d6barrassBsdes acides nuclkiques. Les polysaccharides
acides qui ont precipite avec le cetavlon peuvent 6tre
dissocids avec une solution de NaCl 4 M [16,17].
Hydrolyses
Les lipides sont liberes par hydrolyse par chauRage
A, reflux dans l’acide acetique 0,l N ou HC1 0,Ol N
8. 100” pendant 1 h ; les sucres simples, par HC12 N
ou H,SO, 2 N pendant 2 h A 110” en tube scell6; les
desoxysucres par HC1 0,Ol N pendant 15 min it 100”
en tube scellt5 ; les sucres amines, par HC14 N pendant
4 h 1 110” en tube scelle; enfin, lea acides amines,
par HC1 6 N pendant 18 h it 110” en tube scelle et
lea acides aminohexuroniques par HCl concentre
pendant 2 h 8. 110” en tube scelle. Apres hydrolyse,
on ajoute de l’eau distillee et on concentre sous
pression reduite, en ajoutant plusieurs fois de l’eau
pour chasser HCl; on laisse ensuite les hydrolysats
au dessiccateur sous vide en presence de P,O, et de
KOH. H,SO, est &mine sous forme de sel de baryum
apres centrifugation.
Chromatographies
Sur papier. Nous avons employe du papier What-
man no 1 pour les chromatographies ordinaires et
no 3 pour les chromatographies preparatives. On
utilise la chromatographie descendante avec les
sysMmes de solvants suivants : (A) butanol-1-acide
acetique-eau (4: 1 :1, v/v/v); (B) acetate d’ethyle-
acide acktique-eau (3: 1:3, v/v/v); (C) acetate
d’ethyle-pyridine-eau (12:5:4, v/v/v); (D)buta-
nol-1-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v); (E)butanol-1-
pyridine-HC10,l N (5:3:2, v/v/v); (F)butanol-1-
ethanol-eau (12:5:4et 5:1:4,v/v/v); (G) pyridine-
pentanol-1-eau (7:7:6),v/v/v).
Les reactifs utilises pour la revelation des diffe-
rents composes sont les suivants: la p-anisidine (301,
dans l’acetone), le phtalate acide d’aniline [18] et le
nitrate d’argent [19] pour les sucres; le reactif
 14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
Vol.9, No.2,1969 C. LACAVE. A. SERREet J. Ronx
J. ASSELINEAW, 191

$Elson-Morgan [20] et la ninhydrine 0’1O/, dans par la m6thode de Westphal et par la papaine ont BM
l’acetone pour les sucres amines, la ninhydrine pour comparees et les resultatis feront l’objet d’une publica-
les acides amines; l’o-phhylkne-diamine (chlorhy- tion ulMrieure [33]. Les extraits obtenus 3 l’aide du
drate) est caracteristique des acides cBt0-2 d6soxy-3 phenol induisent des titres en anticorps agglutinants
oniques (colorations Bvoluant du jaune au violet en plus eleves que les extraits traiMs par les enzymes;
passant par le vert-jaune et le rouge [21]). Pour les d’autre part, ces derniers contiennent un contaminant
dBsoxysucres, nous avons utilisB les m6thodes d6crites protbique decelable par immunodiffusion [33]. Enfin
par Edward et Waldron [22] et la mkthode d’Ander- la methode au phenol a l’avantage d’gtre applicable
son [23] qui est l’application sur papier de la reaction aux formes R et S alors que les autres ne sont utili-
de Waravdekar et Saslaw [24]. sables qu’avec les formes S; c’est pour ces raisons
Sur plaques. Nous avons utilisd des couches que nous l’avons halement retenue. Seul, le lipopoly-
minces de cellulose 300 NM (Macherey, Nagel et Co); saccharide extrait de la phase aqueuse (LPS) est
les solvants et rdactifs de rBv6lation sont lee memes Btudie dans ce qui suit, comparativement au poly-
que sur papier. saccharide extra-cellulaire (PS). La composition et
Sur colonnes. a) Fractionnement des LPS et PS les propriBt6s des autres fractions de l’extrait ph6no-
sur colonnes de DEAE-cellulose (Touzart & Matig- lique seront d6crites ultxirieurement.
non-CAP 0,87): aprks lavage de 1’Bchangeur par la
soude N, on fait passer de l’eau jusqu’3 neutralit6 et PURIFICATION DES EXTRAITS
on Bquilibre avec le tampon servant au debut de
1’6lution (tampon Tris/HCl 0’05 M de pH 8,2). Braun et al. [34] ont decrit l’extraction d’un DNA
L’Blution se fait avec trois tampons de molaritds par le phhol dans les Brucella; il n’est donc pas
croissantes : 0’05 M, 0,02 M et 0,2 M. Concentration btonnant que les extraits obtenus selon Westphal
des produits 3 analyser : 50 mg dans 4 ml d’eau ; les contiennent des acides nucl6iques. Les solutions
fractions recueillies sont de 5 ml. aqueuses 3 la concentration de presentent une
b) Fractionnement d’hydrolysats de PS et LPS forte absorption Q 260mp; les solutions de PS
sur colonnes de DEAE-cellulose selon la technique montrent aussi une absorption Q cette longueur
decrite par Osborn [25]. d’onde, mais plus faible. Nous avons utilid, pour
l’klimination des acides nucl6iques’ deux procBdBs
Bgalement efficaces:
MCthodes andytiques a) la precipitation par l’alcool : un volume d’6tha-
Les monosaccharides sont examines par la mB- no1 ajoutB 3 un volume d’une solution aqueuse (1
thode de Dische [26] et les spectres d’absorption sont de PS ou LPS suffit 3 Bliminer la totalit6 des acides
mesurks au spectrophotomktre Zeiss PMQ 11. Les nucleiques ;
hexoses sont doses par la methode 3 l’anthrone b) l’emploi d’un sel d’ammonium quaternaire:
(modifi6e par Montreuil et Spik [27]); les pentoses aprks action du cetavlon, il n’y a plus d’absorption
sont recherches par la mkthode 3 l’orcinol[27]; les dans le surnageant Q 260 mp.
heptoses par la mbthode de Dische modifiee par Os- Outre les acides nuclbiques, les preparations
born [25]; les acides uroniques par la methode au peuvent &re souill6es de proteines entrainees lors
carbazole [27] ; les 3,6-did6soxysucrespar la methode de l’extraction. L’examen des courbes d’absorption
de Ashwell [28]; les cBto-2 d6soxy-3 sucres par la en ultra-violet ne montre pas d‘absorption de 275 B
methode de Waravdekar et Saslaw modifiee [28]. Les 280 mp, il n’y a donc pas de quantiMs importantes
sucres amin& sont recherchee par la methode de de prot6ines; ce resultat est confirm6 par un dosage
Rondle et Morgan [29] et identifies aprks degradation des acides amin& lib&& par hydrolyse (Tableau 1).
en pentoses par la ninhydrine [30] ; les acides aminks
sont doses B l’aide de l’Autoanalyseur Technicon.
Tableau 1. A d y s e d‘un hydrdysat de LP& b l’autoadyseur
L’oxydation periodique selon Bagdian et al. [31] a Bt6 Technicon
utilisee pour l’identification des heptoses.
Acide amin6 Concentrations
moles/lOO mg w/100mg
Rl%ULTATS ET DISCUSSION Acide aspartique 0,45 60
EXTRaCTION ThrBonine 0,30 35
SBrine 0,50 52
Nous avons compare les mbthodes d’extraction Acide glutamique 1.05 173
des antigkneslipopolysaccharidiquesles plus utilis6es : Proline 0960 79
celles de Boivin et al. [13], de Westphal et al. [15], et Alanine 1’05 93
Glucosamine 0’60 101
de Ribi et al. [14]. Nous avons en outre essay6 une Isoleucine 0,20 26
mBthode d’extraction prbconide par Scott [32] pour Leucine 0’25 33
les polysaccharides, employant la papaine activh. Lysine 0’50 145
Les propri6tds biologiques des pdpitrations obtenues Tymsine, phenylalanine, histidine tram -

192 Lipopolysaccharide de Bnteelb melitem&
Le total des acides correspond B un taux de prothines
infdrieur B l o l o ; les composes les plus abondants
sont la lysine, l’acide glutamique, l’alanine et la
glucosamine.
HI~TJ~ROOJ~NI~IT~ DES EXTRAITS
(dhbarrass6s des acides nucldiques)
Nowotny et al. [ill ont beaucoup insist6 sur
l’h6t6rogenhitk des prkparations d‘endotoxine de Xer-
ratia mrcescens quelle que soit la methode d’obten-
tion utilisee. Les resultats que nous avons obtenus
avec Brucellu melitensis confirment ces observations :
a) fractionnement par l’alcool: en utilisant des
quantites croissantes d‘bthanol, on pr6cipite diverses
fractions de la phase aqueuse (solutions de PS ou
LPS) de compositions Werentes et correspondant
vraisemblablement it des composds de poids mold-
culaires diffbrents;
b) fractionnement par le cetavlon: la chromato-
graphie sur papier d’un hydrolysat de PS ou LPS
montre l’existence d‘acides uroniques ou amino-
uroniques, dont le comportement est le meme. Or,
aprhs pr6cipitation des acides nucleiques par le
cetavlon, ces deriv6s uroniques ont disparu de la
fraction surnageante : il y avait donc un (ou plusieurs)
polysaccharide(s)acide(s) dans la. pdparation initiale.
I1 est donc tres probable que PS comme LPS
soient des melanges. Ceci confirmerait les r6sultats
de Hinsdill et Berman [35]qui trouvent 9 antighes
(par immunoelectrophorhse) en extrayant Brucella
abortus par le phenol et les observations de Nowotny
[ll]: &ant donne le grand nombre de reactions
biologiques dont les endotoxines sont responsables,
il est plausible de supposer que plusieurs types de
substances interviennent .
Polysaccharide acide
Sa recherche est plus facile avec la prbparation
de PS, car les complexes precipit6s par le sel d’am-
monium quaternaire contiennent beaucoup moins
d’acidesnuclkiques;mais ces rdsultats restent valables
pour LPS,.
On rdcupere le polysaccharide acide B partir du
precipit6 en le dissolvant dans une solution de
NaCl4 M. Aprh hydrolyse hergique (HC1 concentr6
pendant 2 h B 1 lo”), on trouve un compose qui reagit
comme les acides uroniques, mais qui se colore aussi
par la ninhydrine (en jaune, puis vire au violet aprbs
24 ou 48 h). En utilisant le solvant G prkconisd par
Heyns [36] pour &parer les acides hexosaminuroni-
gues, et en comparant avec un t6moin d‘acide glu-
cosaminuronique, on constate qu’on est en presence
d’un acide migrant moins rapidement et dont le RF
correspond ti celui de l’acide galactosaminuronique.
En recherchant les sucres neutres, on ne trouve que
le glucose (en faible quantie). Brownlee [37]a decrit
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
European J. Biochem.
un rtntighne Vi dans diverses batteries dont Brucella
melitensis, qu’elle obtient aprBs extraction par le
phenol selon Westphal, et precipitation de la solution
aqueuse par 2 volumes d’kthanol, ou par le cetavlon.
Elle a identifib l’acide galactosamkuronique et il est
connu que tous les antigenes de ce type sont de hauts
polymhres d’acides hexosaminuroniques [38]. I1 est
donc probable que le polysaccharide acide que nous
obtenons est l’antigkne Vi; il est connu que cet
antigbne prkcipite avec lee acides nucl6iques lors du
fractionnement par l’ethanol.
COMPARAISON DES FRACTIONS
POLY SACCHARIDIQUES(PS)
ET LIPOPOLYSACCRARIDIQUES (LPS)
Les deux preparations sont solubles dens l’eau.
On les compare apr&sBlimination des acides nucl6i-
ques: PS, et LPS, ou PS,t et LPSet.
Analyses de N et P
Les t e n e m trouvdes sont semblables it celles
signalkes dans la litgratwe dans le cas d‘autres
genres bacteriens.
Teneurs en O l 0
N P
PSC 0 0’9-1’06
LPS, 0’29-0’33 1,M-1’18
Heymann et d.[39] trouvent par exemple 0,86 ti
1’1 Ol0 de phosphore.
Teneurs en sucres rdducteurs
Exprimbesen glucose,aprBs dosage par l’anthrone.
Elles pr6sentent de l6gBres variations d’un extrait B
l’autre. Un glucosane extrait par l’eau froide et bio-
logiquement inactif a 6tB signal6 dans les Brucella [40]
et il est possible gue ce constituant soit entrain6 au
cows de nos extractions, en proportions variables.
En moyenne, on obtient 50 B 60°/, de glucose dans
LPSc et 40 h, 50°/, dans PSc.
Sucres neutres
Les chromatogrammes sur papier des hydrolysats
de PS, et PSet d’une part, LPS, et LPSet d‘autre
part, presentent de grandes analogies. On peut faire
les remarques suivantes (les valeum de R G Btant ~ ~
relatives au solvant D) :
a) le compose de R ~ l c1,15 (arabinose) n’existe
que dans LPS, ou LPSet; il est beaucoup plus visible
apres une hydrolyse sulfurique ;
b) le constituant de RalC 1,70--1’80 (rhamnose)
est toujours present dans PSc ou PSet, mais plus net
aprhs une hydrolyse plus Bnergique. Dans LPS, ou et ,
sa pr6sence n’est pas constante selon les prkparations;
 14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
vo1.9, No.2, I989 J. ASSELINEAU,
C. LACAVE, A. SERREet J. Ronx 193

c) le constituant de R G 2,l
~ (did6soxysucre)
~ n’est par hydrolyse plus Bnergique; ce sont, soit des com-
pas toujours visible; poses peu stables dBtruits par un acide plus concentre,
d) le compost5 le plus rapide (RclC= 2,8 B 2,9) soit des oligosaccharides qui se scindent ensuite en
se colore imm6diatement en jaune avec la panisidhe monosaccharides. E n revanche, une hydrolyse plus
(avant chauffage) et la coloration s’atthue apr&sun forte fait apparaitre de nouveaux composbs decelables
chauffage trop long ou avec le temps. par la ninhydrine: les sucres amines. En conclusion,
PSc ou PSet et LPSc ou LPSet ont un comportement
Cinktique d’hydrolyse similaire, sauf dans les hydrolyses mknagdes. Ceci
pourrait s’expliquer, soit par la liberation d’oligo-
La comparaison des chromatogrammes correspon- saccharides difFt5rents si les enchainements des unites
dant ti dit€&entes conditions d’hydrolyse con6rme la ne sont pas identiques dans les composes initiaux,
similitude de composition entre PSc ou PS,t e t LPS, soit parce que la partie lipidique de LPS g h e la
ou LPSet, ainsi qu’il ressort de la Fig.l (voir aussi libt5ration de certains sucres.
Tableau 2).
Une hydrolyse mdnagke fait apparaitre sur les
chromatogrammes une serie de constituents migrant Fractionnement des prkparations PS, ou PS,t et
moins vite que le glucose, mais plusieurs disparaissent LPS, ou LPS,t: phipitation par des concentrations
croissantes d’Lthano1
Conditions
016 d’hydrolyse LPS et PS se comportent assez diE6remment en
iv6s0.08 036053075 1 135 1.75 RGIC ce qui concerne leur precipitation par l’alcool, une
faible proportion d’alcool prbcipite une fraction plus
PS 0 0 0 0 HCI 4 N - 4 h
importante de LPS que de PS (voir Tableau2), ce
LPS 0 0 0 0 0 0
qui pourrait 6tre dfi B la modification de solubiliti:
introduite par la partie lipidique. Nous avons observi:
PS 0 00 0 0 0 HCLGN-2h une repartition difF6rente des fractions obtenues selon
LPS 0 0 700 0 0 gue les bacteries traitkes venaient de Montpellier
I (LPS,) ou de 1’Institut Mdrieux (LPS,). I1 s’agit de
PS 0 0 ; 0 0 0 0 0 HC12N-2h la meme souche M 15 de Brucella melitensis: lea
LPS y p p
I l l
j pop
I 1 I
I 0 ? conditions de culture et peut-btre les traitements
I
I
I
I
I
prkliminaires subis par les bacilles sont responsables
I HCL 0.05N-30min de ces divergences. La plupart des rhsultats concer-
I
I nant ces polysaccharides ont Bti: obtenus ti partir de
I , LPS,.
a 0 2 0.32 0.63 0.88 13 175’ 21 ’ 28 RG*(solvant D)
0.11 a45 1 La composition en oses des diverses fractions est
rdsumee dans le Tableau 3 ; on observe :
Fig. 1. Repbentation s&matique dea princiypaux conetituants
apparaiasant au c a r s des hydrolysea d a m Pi3 et LPS. Les a) une complexite croissante des fractions quand
acidea nuclbiques et lee polysaccharidea acides ont Btk la concentration en Bthanol augmente dans le cas de
prbalablement BliminBs. 0 , constituents dont la presence LPS: une seule tache est r8vi:li:e dans la premiere
n’est pas constants sur lea chromatogrammea (Role= 0,16 fraction, mais nous verrons ultbrieurement qu’elle
et 0,76). Les valeurs de &lc dans le solvant D representent:
0,02,0,08, et O,ll=oligosaccharides ( ?); 0,32=KDO; 0,45= correspond au glucose et aux heptoses dont les mi-
disaccharide ( ? lactose); 0,53 = glucosamine; 0.63 = di- grations sont identiques avec la plupart des solvants ;
saccharide ( ? maltose); 0,88 = galectose; 1 = glucose +
heptoses; 1.15 = arabinose; 1,75 = rhamnose; 2,l = 3,6-
did6soxghexose; 2,8 = sucre 4 rapide Tableau 3. Composition des diffhentes fractions obtenuea
(z parfir de LPS,et P8 par prbipitation par l’#hml

Tableau 2. Rendemenb en de la prbipitation par l’ethml

LPS, = extrait d‘un lot de bacillea cultivh B Montpellier.
LPS, = extrait d‘un lot de bacillea cultivb B 1’Institut
MBrieux

Concentration Rendement Hexoses

en6th8nOl ps LPS, ~ps, d8nB LPS. vol
1 ++ ++
+++
vol ‘1. ‘I. ‘1. ‘I. 2

++ ++ ++ ++ &
1 0 80 40 4.2 LPS, 5

3-5
2 9
78
495
8
16 66 10 +
5-10
5
3 3
40 66
PS
let2
3-5 et
+ + + +
10 0,5 4 4 66 5-10 + + + + +

Lipopolysaccharide de Br~cellamelitemis
t b i O , 4 b b j o b
Nurnko des fractions
Fig. 2. Elution d’une wlonne de DEAE-cellulose. Dosage t i
l’anthrone. (-), Elution d’une solution de PS, pic8 I-V;
(- -), Bution d’une solution de LPS, pics I’-V’
I”
400 450 500
Longueur d’onde (mp)
Fig.3. 8pectre d’absorption aprka rkaction de Disch des fractions dudes BUT DEAE-cellulose. (A), Fractions I, 11, 111, V, aprb
3 min de rbaction; (B), fraction IV: IV(31, apr&s3 min de rhaction, IV(lo), aprhs 10 min de reaction
b) peu de difF6rences qualitatives dans les diverses
fractions de PS.
Nous n’avons pas effectue d’hydrolyses m6nagees
libbrant les desoxysucres.
Chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose.
On chromatographie directement les solutions aqueu-
ses des deux prbparations :PScetLPSc sans hydrolyse
prbalable. La Fig. 2 montre l’aspect trks semblable
des courbes d’blution. Les dosages sur des fractions
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
European J. Biochem.
aliquotes it la sortie de la colonne sont faits par la
methode B l’anthrone (absorbances A 585 et 620 mp).
On obtient cinq fractions dans chaque cas; seules les
teneurs respectives en sucres varient entre LPS et
PS (le Eger decalage de la premikre fraction Bluee
peut s’expliquer par la tr&sforte concentration des
sucres dans PS, produisant un Btalement du pic).
Lea fractions correspondant A un pic sont groupees
et analysees colorimetriquement par la mbthode de
Dische. Les spectres d‘absorption respectifs des dif-
ferentes fractions obtenues avec PS ou LPS sont trBs
semblables, ce qui laisse supposer que leur composi-
tion est voisine. L’examen de la Fig.3 retrapant les
courbes d’absorption des diffbrentes fractions aprBs
reaction de Dische, et des resultats a p p o d s par la
chromatographie sur papier et sur couche mince des
hydrolysats, permet de localiser : les d6soxysucres
dans les fractions I et I1 (max. A 390 mp) (Fig.SA),
les hexoses dans la fraction 111 (max. B 412-414mp),
les heptoses dans les fractions I1 et surtout IV
(Fig.3B)’ le sucre rapide edin dans la fraction V
exclusivement (Fig.3A). LeTableau 4 rbsume les con-
clusions.
I1 faut remarquer l’absence de glucosamine dans
LPS comme dans PS, ainsi que de l’arabinose et du
400 450 500
Longueur d’onde(mp)
rhamnose. Cette observation serait en faveur de la
presence de ces deux derniers sucres comme conta-
minants des PS et LPS. De cet ensemble d’expkrien-
ces, il ressort qu’il y a de grandes analogies au point
de vue chimique entre les preparations PS et LPS:
ce resultat est en accord avec leur identit6 immunolo-
gique Btablie par la technique d‘immunodifFusion [33].
L’existence de PS extra-cellulaire chez les bac-
tbries A gram nkgatif n’est pas exceptionnelle e t a

Vol.9. No.2, 1960 J. ASSELINEAU,
C. LACAVE,
Tableau 4. Composition en osea des fraetiona d l u h d’une
wlonne de DEAE-cellulose
Les fractions sont celles des Fig.3A et 3B
II)
e
-
W
a
souvent B t k dbcrite : Homma et Suzuki [41] trouvent
deux composbs dans le milieu de culture de Pseudo-
monm aer uginosa ayant meme composition e t memes
propriktks que l’antighne de Boivin. Dans Escherichia
coli, Marsh et Crutchley [42] parlent m6me d’une
((endotosine)) dans le surnageant des cultures, tandis
que Corpe et Salton [43] decrivent des PS dont la
coniposition en monosaccharides est identique a
celle des LPS de la paroi. Dans Serratia marcescens
enfin, Adams et Young [44] isolent trois polysaccha-
rides du milieu de culture ayant des propriktks
d‘endotoxine.
IDENTIFICATION DE QUELQUES CONSTITWANTS
DE PS ET LPS
Fraction lipidique
Seul le produit is016 par la methode au phenol
cont,ient une partie lipidique, liberable par hydrolyse
du LPS,t par l’acide acetique 0,l N (voir ahydro-
lyses))).La teneur en est trhs faible (environ l o / , par
rapport B LPS,t) cornparbe & celle des LPS d’autres
bacteries a gram nbgatif qui contiennent souvent de
30 a 50 de lipicles : le LPS de Salmonella minnesota
par exemple en contient 500/, [45]; cependant Kasai
et ul. [46]mentionnent 9 8, 170/, de lipide A dans les
LPS Qtudieset 0,020/, dans Pseudomonm fluorescem.
Nous avons cependant adopt4 le terme de lipopoly-
saccharide d’abord par analogie avec les autres poly-
meres extraits par cette mkthode des parois des bac-
tCries a gram nbgatif, ensuite par opposition au PS
rigoureusement depourvu de lipide.
Cette fraction qui correspond au lipide A, se
presente sous forme d’un compose insoluble dans
Yether, mais soluble dans le chloroforme. Son chro-
matogramme sur couche mince de silicagel G a le
meme aspect que celui du lipide A de Kaaai[47]
(blution par un melange chloroforme-methanol-
eau (65 :25 :4, v/v/v). Aprks hydrolyse chlorhydrique
du lipide A, on &pare une fraction soluble dans
l’bther, constitube d’un melange d’acides gras qui
sont methyl& par le diazomkthane. La chromato-
graphie en phase gazeuse (sur colonne 8, loo/, SE 30
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
A. SERREet J. Ronx 195
sur chromosorb W) du melange des esters mbthyliques
deckle trois constituants essentiels : les acides palmi-
tique, n-heptaditcanoique e t stharique. Les acides en
C,, e t C,, sont en quantites Bquivalentes et represen-
tent chacun 115 environ de l’acide palmitique. Cette
composition diffkre de celles decrites dans la littkra-
ture par l’absence d’acide B-hydroxy-myristique, que
nous n’avons pu dBceler dans nos prhparations.
Dans la fraction hydrosoluble du lipide A, nous
avons m i s en evidence la glucosamine:
a) en chromatographie sur papier e t sur couche
mince de cellulose avec les solvants A, B et F et en
revblant par la p-anisidine, la ninhydrine et le rbactif
d’Elson-Morgan, on obtient un sucre amini: de m6me
comportement que la glucosamine tkmoin. En co-
chromatographiant avec un Bchantillon de glucos-
amine pure, on ne rBvkle qu’une seule tache;
b) aprks chromatographie preparative sur papier,
on Clue la bande correspondant au Gmoin de glu-
cosamine. L’Bluat est trait6 par la ninhydrine et
chromatographie B nouveau sur papier avec les
solvants A et D : il fournit une tache d’arabinose [30];
c) aprhs hydrolyse prolongbe de la fraction hydro-
soluble e t examen de l’hydrolysat l’aide de l’auto-
analyseur Technicon, on trouve la glucosamine, A
c8t4 de trks faibles quantitks d‘acide glutamique,
d’alanine et de lysine.
La glucosamine n’a pu 6tre mise en evidence dans
le PS extracellulaire, ce qui montre que ce sucre
n’existe que dans la part,ie lipidique de 1’ant.igitne.La
prbsence du lipide A est la difkence essentielle que
nous avons observee entre PS e t LPS.
Les sucres
Acide cCto-2 dhsoxy-3 octulosonique. Au cows des
dernibres annbes, divers dBrives acides (cbto-2
dbsoxy-3) de sucres ont 6th decouverts dans les
batteries; un des plus repandus est l’acide cbto-2
dbsoxy-3 D-manno-octulosonique ou KDO [48].
Les faits experimentaux suivants permettent
d’ktablir la presence de KDO dans PS et LPS de
Brucella melitensis :
a ) aprks hydrolyse mknagke, on chromatographie
sur papier avec les solvants A, D e t E e t rbvitle par
la methode #Anderson [23]. On peut. ainsi repher un
acide &to-2 desoxy-3 aldonique ( R ~ l = c 0,32 dans
le solvant D, voir Fig. 1) ;
b) aprks chromatographie prkparative sur papier
e t elution des bandes appropriees, des reactions po-
sitives sont obtenues avec la rkaction de Dische [26],
la reaction d’Edward e t Waldron [22] (sp6cifique des
d6soxysucres) e t la reaction de Weissbach e t Hur-
witz [21] modi66e par Osborn [25] e t Ashwell [28];
c) les hydrolysats ont 6th compares avec un hy-
drolysat de LPS de E . coli prepare par nos soins
(methode de Westphal) et avec une fraction isolee
de Serratia marcescens par l’acide trichloracetique

198 Lipopolysaccharide de Brutella melitemis
(aimablement fournie par le Docteur Nowotny). Ces
deux preparations contiennent du KDO, qui montre,
en chromatographie sur papier, le meme RF et les
m6mes colorations que le constituant de Brucella;
d) nous avons pu comparer directement notre
acide avec un temoin de KDO obtenu par saponifica-
tion du penta-acbtyl &to-2 d6soxy-3 octulosonate de
mbthyle [49]; la chromatographie sur papier e t sur
couche mince de cellulose avec le solvant E montre
I’identitk de ces deux acides.
Dans une note prdiminaire, Ellwood [60]a signale
recemment l’existence de KDO dans les Pasteurelh
et plus generalement dans toutes les Brucellacees.
Pentoses. Un seul pentose, l’arabinose, a BtB
identifie par chromatographie sur papier avec d.86-
rents systhmes de solvants (D et F) e t divers modes
de rbvblation, ainsi que par co-chromatographie avec
un temoin.
Ce pentose (Fig. 1) existe seulement dans la frac-
tion polysaccharidique de LPS : nous ne l’observons
pas dans le PS extra-cellulaire. Rappelons qu’on ne
le trouve plus dans les Bluats de la chromatographie
de LPS sur DEAE-cellulose. Dubrovskaya [S] men-
tionne le xylose comme pentose dans les souches R
de Brucella melitensis exclusivement.
Hexoses. 11s constituent une fraction quantitative-
ment importante des preparations, mais peuvent
provenir en partie de fractions non antigdniques
telles que le glucosane d6jB mentionne. Glucose e t
galactose ont 6th identS6s par co-chromatographie
avec les temoins dans les solvants A, D e t F. I1 faut
noter que le glucose est d6jB libere (partiellement au
moins) aprks 15min d’hydrolyse avec HC1 0,05N.
Le galactose ( R ~ l c= 0,87) est en quantitk relative-
ment peu importante. Nous n’avons pu mettre en
6vidence le mannose signale par Dubrovskaya [S]
dans le LPS de Brucella melitensis.
Heptoses. Davies [51] a dhcrit les heptoses trouves
dans les bacthries B gram negatif. Plus recemment,
Bagdian et al. [31] ont identifie le L-glycbro D-manno-
heptose chez Salmonella minnesota. S. ruiru, et Pro-
teus mirabilis, ce dernier contenant en plus leD-glychro
D-mannoheptose. Une publication rbcente [52] signale
l’existence simultanee de ces deux stbrboisombres
(D- et L-glycero D-mannoheptoses) dans toutes les
batteries B gram nbgatif Btudihes, avec prbponderance
en g6nera1, du L-glycbro D-mannoheptose. Dubrovs-
kaya [8] et Parnas [lo] ont mentionnb l’existence
d’heptoses d a m les LPS de B. abortus et B. melitensis
sans les identifier.
Au moins deux heptoses existent dans les extraits
de Brucella melitensis; il est difficile d‘obtenir une
bonne separation par chromatographie sur papier B
cause des mobilit& semblables des aldoheptoses e t
des aldohexoses et de la predominance quantitative
des hexoses dans les polysaccharides bactbriens. La
chromatographie sur papier (solvant D) et la reaction
de Dische effectuhe sur les Bluets [26] (voir Fig.4)
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
European J. Blochem.
mettent en evidence la presence des memes heptoses
dans PSc et PSet, LPS, et LPSet de Brucella melitensis.
Par oxydation periodique, nous n’avons pu identifier
avec certitude le mannose forme [31], le glucose &ant
en teneur trop importante dans nos extraits. Nous
avons comparb nos hydrolysats avec ceux du LPS
de Proteus mirabilis ; en eluant les bandes correspon-
dant aux deux heptoses e t en chromatographiant 8,
nouveau avec l’acbtone L 95 o/o (chromatographie
ascendante), on peut &parer les constituants. I1 y a
deux heptoses dans leu extraits de Brucella melitensis.
dont le comportement est le meme que celui des L- et
D-glyckro n-mannoheptoses qui existent dans les
hydrolysats de Proteus. E n outre, un temoin de
D-glyc6ro L-mannoheptose ne donne qu’une seule
tache, en chromatographiant sur papier avec le
L-glyc6ro D-mannoheptose (qui eSt son enantiomhe).
Longueur d’onde(rnp)
Fig.4. Spectre d’absorptim des heptosea dans la rkaction de
Dische. (I),avant c y s t h e (maximum a 390 mp); (11), aprbs
cystkine (to);(111), aprhs c y s t h e (4,). I1 et I11 ont un
maximum A 605 mF
C m p h <( rapides b)
Le rhamnose. I1 n’est pas toujours present dans
les hydrolysats de LPS, ou LPSet alors que c’est un
constituant important du PS extra-cellulaire ; il
devient davantage visible aprbs une hydrolyse plus
energique (HC12 N pendant 6 h ou 4 N pendant 4 h,
voir la Fig.l). Son identification B btb rbalisee par
chromatographie SIX papier avec divers solvants et
co-chromatographie avec le rhamnose. L‘Bluat d’un
chromatogramme preparatif trait6 par la cystkine
donne la rbaction caractbristique des mt?thyl-pentoses
(Dische). Comme pour le pentose trouve dans LPS,
il est possible que le rhamnose appartienne B une
impuret4 polysaccharidique de notre prBparation de
PS. E n effet, lorsqu’on precipite par l’ethanol le PS
extra-cellulaire, les solutions alcooliques surnageantes
s’enrichissent en rhamnose.
Le composd de R ~ l c= 2,l (solvant 0).I1 est
difficile A identifier car sa coloration est fugace avec
la p-anisidine, les teneurs sont faibles et il n’est pas

Vol. 9. No.2, I909 C. LACAVE, A. SERRE
J. ASSELINEAU,
toujours decelable sur les chromatogrammes. Sa
prBsence est plus constante dans LPS que dans PS,
peut-%re parce qu’il y est plus abondant. Sa migra-
tion trbs rapide fait penser & un did6soxysucre.
La ritaction de Edward et Waldron [22] indiquant un
6-d6soxysucre est positive ainsi que la reaction de
Ashwell [28], specifique des 3,6-did6soxysucres (oxy-
dation periodique B 65” et acide thiobarbiturique).
La comparaison avec des hydrolysats de poly-
saccharides de Merentes Salmonella contenant le
paratose, l’abbquose et le tyvelose montre qu’il peut
s’agir de l’abbquose (3,6-did&soxyD-galactose) ou de
son Bnantiomke, le colitose. E n fait, nous ne pouvons
lever l’indetermination entre abequose e t colitose, les
rotations specifiques sont respectivement de -4 e t
+4”, et nous disposons de trop faibles quantites de
materiel pour faire des mesures de rotation de notre
compos6. Ces didesoxysucres sont des constituants
immunodominants de beaucoup d’antigbnes poly-
saccharidiques des EntbrobactbriacBes, dans lesquels
ils occupent une position terminale, ce qui est en
accord avec leur facile liberation par hydrolyse.
Le compost! le plus ra@ ( R ~ l = c 2’8). Son com-
portement en chromatographie (solvant F), d a m la
reaction de Dische et aprbs reaction avec BCl, [53]
font supposer qu’il s’agit d’un deriv6 methyle. Son
RF superieur it celui du tetrambthyl 2,3,4,6-glucose
e t sa &action positive avec le rhactif de Edward e t
Waldron incitent B penser qu’il possbde m e (ou
plusieurs) fonction(s) dbsoxy. Par demethylation par
BCb, il fournit un d6riv6 qui se comporte en chro-
matographie sur papier comme l’abbquose (ou le
colitose) : il s’agirait alors d’un monombthylbther de
l’abhquose (OU du colitose).
Ce sucre se colore immediatement en jaune avec
la p-anisidine, mais disparait au COWS du c h a a a g e ;
il est relativement fragile car avec des conditions
d’hydrolyse permettant de deceler encore les hexoses,
il disparait.
CONCLUSIONS
Parmi les constituants macromol6culaires de
Brucella m,elitensis,nous avons pu mettre en evidence,
& c6tB d’un polysaccharide de caractere acide con-
tenant de l’acide galactosaminuronique e t probable-
ment assimilable & l’antighe Vi, une faction lipopoly-
saccharidique et une fraction polysaccharidique
extra-cellulaire. Nos resultats montrent que ces
preparations ne sont pas homogbnes.
La partie polysaccharidique des fractions LPS
e t PS extra-cellulaire presentent de grandes analogies
de composition qualitative, en particulier en ce qui
concerne leur teneur en substances aussi specifiques
que KDO, heptoses e t dhsoxysucre. De petites diver-
gences apparaissent mais on ne peut affirmer qu’elles
concernent les polymhes eux-m6mes : ainsi dans la
fiaction LPS extraite par la technique de Westphal,
on deckle de l’arabinose qui n’existe pas dans le PS
14 European J. Biochem.. Vol.0
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
et J. Roox 197
extra-cellulaire dans lequel en revanche, se trouve le
rhamnose. Ces sucres peuvent appartenir & des
contaminants du type arabinoglucane (ou galactane),
de m6me qu’une partie du glucose peut appartenir &
des glucanes, dans la fraction LPS par exemple.
La difference essentielle entre les deux polymbres
est la presence d’un lipide, trks faiblement representit
dans LPS alors que PS en est totalement ditpourvu.
La partie lipidique du LPS posskde le type de
constituants habituellement rencontres dans le
lipide A : glucosamine, acide phosphorique et acides
g a s . I1 faut cependant noter l’absence d’acide p-hy-
droxy-myristique (et de tout acide p-hydroxylB), ce
qui repritsente une U b r e n c e essentielle par rapport
aux lipides A de E . coli [54] ou de Salmonella [47] par
exemple.
I1 a 6th envisage que des substances chimiquement
difTitrentes soient responsables des multiples aspects
de l’activith biologique des endotoxines des bactitries
B gram negatif [II]. Suivant la mhthode utilisbe pour
leur extraction et leur fractionnement, on obtient
des preparations ayant des propribtes difftrentes
notamment au point de vue toxicite. Les prbparations
de LPS de BTUM~ZU melitensis qui font l’objet de ce
travail, prbsentent effectivement une faible toxiciti:
[65,33].
E n conclusion, malgre des aspects specifiques
particuliers de la pathologie de la brucellose [56], la
nature des constituants 616mentaires des lipopoly-
saccharide e t polysaccharide extra-cellulaire de
Brucella melitensis ne M b r e pas fondamentalement
de celle des constituants correspondants trouves
dans les autres bacMries L gram nbgatif, leur arrange-
ment pourrait 6tre M e r e n t de celui trouvh dans les
lipopolysaccharides des Entkrobactitries, puisque
leurs propri8Ms biologiques bien Btudibes par Parnas
[lo] e t Redfearn [9] paraissent trbs bloignees de celles
attribu6es dux endotoxines classiques.
Nous remercions vivement lee laboratoires Mbrieux
(Institut MBrieux 69-Marcy I’fitoile)et plas particulikrement
le Dr. L. Valette pour les envois de bacthries. Nous remer-
cions Bgalement le Dr. K. Heyns (Universith de Hanibourg)
pour I’Bchantillon d’acide glucomminuronique, le Dr.
E. Heath (John Hopkins University, Baltimore, Etats Unis)
pour un Bchantillon d’ester mbthylique du KDO penta-
acktyl.6, le Dr. A. Nowotny (Temple University, Phila-
delphie, Etata Unis) pour I’kchantillon de LPS de Serrutiu
murcesoem, Madame Polonsky (Institut de Chimie des Sub-
stances Naturelles, Gif-sur-Yvette) pour tin kchantillon d’as-
carylose, Ie Dr.A. M. Staub (Institut Pasteur, Paris) pour
les discussions concernant ce travail et des Bchantillons
de polyosides de Salmonella, les Dw. 0. Luderitz et 0. West-
pha1 (Max Planck-Institut fiir Immunbiologie-Freiburg)
pour des Bchantillons d’heptoses et Ie LPS de Profeus
mirabilis. Enfin, nous remercions le service de microanalyses
de Gif-sur-Yvette pour les analyses de N et P.
BIBLIOGRAPHIE
1. Markenson, J., Sulitzeanu, D., et Olitzki, A. C., A’ulure,
183 (1969) 1693.
2. Westphal, O., Ann. Inst. Pwteur, 98 (1960)789.

198 J.ASSELINEAV,A. SERREet J. Roux: Lipopolyaaccharide de Brucella melitensis
C. LACAVE,
2a. Westphal, O., et J a m , K., Methods Carbohydrate Chem.
5 (1965) 83.
2b. King, H. K., Sci. Progr. (London), 69 (1961) 299.
2c. Salton, M. R. J., The Bacterial Cell Walls, Elsevier,
Amsterdam 1964, p. 133 e t 170.
2d. Liideritz, O., Staub, A. M., et Westphal, O., Bacteriol.
Revs. 30 (1966) 192.
3. Lacave, C., et Roux, J., C m p t . Rend. 260 (1965) 1614.
4. Mardarowicz, C., 2. Naturforsch. 21b (1966) 1006.
5. Staub, A. M., In Bacteriul Endotoxins, Ed. Landy and
Braun, p. 38. Rutgers 1964.
5a. Osborn, M. J. et Rosen, S. M., Rothfield, L., Zeleznick,
L. D., and Horecker, B. L., Science, 145 (1964) 783.
6. Miles. A. A., et Pirie, N. W., Brit. J. Exptl. Pathol. 20
(1939) 83; 109 et 278.
6a. Peterson, J. S., Pirie, N. W., e t Stableforth. A. W.,
Brit. J . Exptl. Pathol. 28 (1947) 223.
6b. Pennel, R. B., The Chemktry of Brucella Organisme,
1950. ,,Brucellosis“ - Washington, p. 37.
7. WestDhal. 0. d’aDr8s Urbrtschek.. B... 2. Immunitdits-
jorich. 120 (1966) 279.
8. Dubrovskava. I. I.. Biokhimiua, 29 (1964) 846.
8a. Dubrovskaya, I. I., et Dranovikaya, E. A., Biokhimiya,
32 (1967) 31.
9. Redfearn, M. S. Ph. D. Thesis, The University of Wis-
consin, 1960.
10. Parnas, J.. et Fijalka,BL, Arch. Xyg. B a k e d . 150
(1966) 375.
10a. Parnas, J., Pleszczyneka, E., Mardarowicz, C., et Po-
plawski, S., 2. fur Immunitiitsforsch. Allergie klin.
Immunol. 133 (1967) 302.
lob. Parnas, W., e t Winiarska, U., Bull. A d . Polon. 8ci.
15 (1967) 205.
11. Nowotny, A., Cundy, K. R., Neale, N. L., Nowotny,
A. &I., Radvany, R., Thomas, S. P.. et Tripodi, D. J.,
Ann. N. Y . A d . Sci. 133 (1966) 586.
12. Roux, J., Asselineau, J., Serrk, A.,’ e t Lacave, C., Ann.
Inat. Pasteur 113 (1967) 411.
13. Boivin, A., et Mesrobeanu,L., Rev. Immunol. 1 (1935)563.
14. Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M., e t Milner, K. C.,
J. Ezptl. Ned. 114 (1961) 647.
16. Westphal, O., Luderitz, O., et Bister, F., 2. Naturforsch.
7 b (1952) 148.
16. Scott, J. E., Methods Biochem. Anuly. 8 (1959) 154.
17. Linde, K., et BruMemaM, H., Arch. Byg. Bakterbl.
151 (1967) 100.
18. Partridge, S. M., Nature, 164 (1949) 443.
19. Trevelyan, W. E., Procter, D. P., e t Harrison, J. S.,
A’ature, 166 (1950) 444.
20. Elson, L. A., et Morgan, W. T. J., Biochem. J. 27 (1933)
1824; reactif modif% par Partridge, S. M., Biochem. J .
42 (1948) 238.
21. Weissbach, A., et Hurwitz, J., J . Biol. Chem. 234 (1959)
705.
22. Edward, J. T., et Waldron, D. M., J. Chem. SOC.(1952)
3631.
23. Anderson, P. J., J . Chromatog. 21 (1966) 163.
24. Waravdekar, V. S., et Saslaw, L. D., J. Biol. Chem. 234
(1959) 1945.
25. Osborn, M. J., Proc. Natl. A d . Sci. U.8. 50 (1963)
499.
26. Dische, Z.. H e t W Biochem. Analy. 2 (1955) 313.
27. Montreuil, J., et Spik, G., Nicrodosage dee Glucides
totaux, Faculte des Sciences de Lille, 1963, p. 15.
14321033, 1969, 2, Downloaded from https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00594.x by Algeria Hinari NPL, Wiley Online Library on [02/03/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License
European J. Biochem.
28. Ashwell, G., Methods Enzymol. 8 (1966) 89.
29. Rondle, C. J. M., e t Morgan, W. T. J., Biochem. J . 61
(1955) 586.
30. Stoffyn, P. J., et Jeanloz, R. W., Arch. Biochem. Bio-
phys. 52 (1954) 373.
31. Bagdian, G., Droge, W., Kotelko, K., Luderitz, O., et
Westphal, O., Biochem. 2. 344 (1966) 197.
32. Scott, E., Methods of Carbohydrate Chem. 5 (1965) 38.
33. Roux, J., Asselineau, J., Serre, A. et Lacave, C., non
publib.
34. Braun, W., BUITOUE, J. W., et Philipps, J. H., Nature,
180 (1957) 1356.
35. Hinsdill, R. D., e t Berman, D. T., J . Bacterial. 93 (1967)
544.
36. Heyns, K.. Kiessling, G., Lindenberg, W., Paulsen, H.,
et Webster, M. E.. Chem. Ber. 92 (1959) 2435.
37. Brownlee, S. T., Ph. D. Thesis, Duke University, 1964.
38. Heyns, K., et Kiessling, G., carbohydrate Res. 3 (1967)
340.
39. Heymann, H., Maniello, I. &.I.et , Barkulis, S. S., Bio-
chent. Biophys. Ree. Ccnnmun. 26 (1967) 486.
40. Hershey, A. D., Huddleson, I. F., et Pennell, R. B., J .
Infect. Dis. 57 (1935) 183.
41. Homma, J. Y., et Suzuki, N., Ann. N. Y. A d . Sci. 133
(1966) 508.
42. Marsh, D. G., e t Crutchley, &.J.,
I. J. Uen. Microbiol. 47
(1967) 405.
42a. Marsh, D. G., et Walker, P. D., J. Uen. Microbiol. 52
(1968) 125.
43. Corpe, W. A., et Salton, M. R. J., Bwchim. Biophys.
Ada, 124 (1966) 125.
44. Adams, G. A., e t Young, R., Ann. N. Y . Acud. Sci. 133
(1966) 527.
45. Nikaido, H., Biochemisty, 4 (1965) 1550.
46. Kasai, N., Aoki, Y., Watanabe, T., Odaka, T., et Yama-
moto, T., Jap. J . Nicrobiol. 5 (1961) 347.
47. Kasai, N., Ann. N . Y . A d . Sci. 133 (1966) 486.
48. Hemhbereer. C. L.. et Brinklev. S. B.. Federation Proc.
“ I
26 (196u7)Abst. 141.
48a. Perrv. M. B., e t Adams. G. A.. Bioc7rent. Bimhus. Res.
L “
CGmun. 26 (1967) 417.
49. Ghalambor, M. A., Levine, E.M., et Heath, E.C., J . Biol.
Ghem. 241 (1966) 3207.
50. Ellwood, D. C., Biochem. J. 106 (1968) 47 P.
61. Davies, D. A. L., Advan. Carbohydrate Chem. 15 (1960)
271; J. Bacteriol. 93 (1967) 11.
52. Adams, G. A., Quadling, C., et Perry, 111. B., Can. J.
Nicrobiol. 13 (1967) 1605.
53. McLennan, A. P., Biochem. J. 82 (1961) 394.
64. Hurwitz, J., et Weissbach, A., J. Biol. Chem.234 (1959)
710.
55. Nowotny, A., communication personnelle.
56. Roux, J., Rev. Immunol. 26 (1961) 32.
C. Lacave et J. Asselineau
Laboratoire de Chimie Biologique de la Facult4 des Sciences
84 Grende Rue Saint Michel, F-31 Toulouse, France
A. Serre et J. Roux
Laboratoire de Microbiologie de la Faculte de Medecine
Institut de Biologie
Boulevard Henri IV, F-34 Montpellier, France