Professional Documents
Culture Documents
Chuẩn bị, phân tích cấu trúc và prebiotic tiềm năng của arabinoxylo-oligosacarit
Chuẩn bị, phân tích cấu trúc và prebiotic tiềm năng của arabinoxylo-oligosacarit
com
Xem siêu dữ liệu, trích dẫn và các bài báo tương tự tạilõi.ac.uk mang đến cho bạn CỐT LÕI
Helena Pastell
Được trình bày, với sự cho phép của Khoa Nông Lâm nghiệp của
Đại học Helsinki, cho những lời chỉ trích công khai trong giảng đường B3, Viikki,
vào ngày 29 tháng 1quần què2010, lúc 12 giờ trưa.
Helsinki 2010
Tùy chỉnh: Giáo sư Vieno Piironen
Khoa Hóa học Ứng dụng và Vi sinh Đại học
Helsinki
Helsinki, Phần Lan
TRỪU TƯỢNG
Arabinoxylo-oligosacarit (AXOS) có thể được điều chế bằng enzym từ arabinoxylans (AX) và AXOS được
biết là có tiềm năng tiền sinh học. Ở đây các đặc điểm cấu trúc của 10 loại ngũ cốc AX đã được kiểm tra.
AX bị thủy phân bởi Shearzyme®để chuẩn bị AXOS và cấu trúc của chúng đã được phân tích đầy đủ. Tiềm
năng tiền sinh học của AXOS tinh khiết đã được nghiên cứu trong các thí nghiệm lên men với vi khuẩn
bifidobacteria và hệ vi sinh vật trong phân.
Trong AX được chiết xuất từ bột và cám, một lượng lớn --L-Arafcác đơn vị được gắn vào --
D-XylPchuỗi chính, trong khi mức độ thay thế vừa phải hoặc thấp được tìm thấy từ trấu, lõi
ngô và rơm. Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy bột mì và cám AX chứa
lượng --L-Ara caofcác đơn vị liên kết với O-3 của --D-Xylp dư lượng và được thay thế gấp đôi
các đơn vị --D-Xylp bằng --L-Arafnhóm thế ở O-2 và O-3. Vỏ lúa mạch và lõi ngô AX chứa một
lượng lớn --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên, cũng có thể được tìm thấy trong AX từ bột
yến mạch và vỏ trấu, và với số lượng ít hơn trong AX lúa mì.
Lúa mạch đen và bột mì AX và yến mạch đánh vần là AX đã được thủy phân bởi Shearzyme®
(vớiAspergillus aculeatusGH10kết thúc-1,4---D-xylanase làm enzym chính) để sản xuất AXOS
trên thang miligam. AXOS đã được tinh chế và cấu trúc của chúng được phân tích đầy đủ, sử
dụng phép đo khối phổ (MS) và quang phổ 1D và 2D NMR. Xylobiose và xylotriose được thế
đơn với --L-Arafđược gắn vào O-3 hoặc O-2 của đầu không khử --D-XylPđơn vị và AXOS bị loại
bỏ với hai --L-Arafđơn vị ở đầu không khử --D-XylPđơn vị xylobiose hoặc xylotriose được sản
xuất. Xylobiose với --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên cũng đã được tinh chế. Các AXOS này
được sử dụng làm tiêu chuẩn để xác định và định lượng thêm AXOS tương ứng từ các sản
phẩm thủy phân trong sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao với phân tích phát hiện ampe kế
xung (HPAEC-PAD).
Tiềm năng tiền sinh học của AXOS đã được thử nghiệm trongtrong ống nghiệmthí nghiệm lên
men. Bifidobacterium vị thành niênATCC 15703 vàB. longumATCC 15707 đã sử dụng AXOS từ các
sản phẩm thủy phân AX. Cả hai loài đều giải phóng L-arabinose từ AXOS, nhưngB. vị thành niên
tiêu thụ XOS hình thành, trong khiB. longumlên men L-arabinose được giải phóng. Loài thứ ba
được thử nghiệm,B. breveATCC 15700, phát triển kém trên các chất nền này. Khi được nuôi cấy
trên AXOS tinh khiết, hỗn hợp bifidobacteria sử dụng gần như hoàn toàn AXOS thay thế đơn
thuần, nhưng không phát hiện thấy sự phát triển nào với AXOS tinh khiết thay thế kép làm cơ
chất. Tuy nhiên, AXOS thay thế kép được sử dụng từ hỗn hợp xyloza, XOS và AXOS. Hệ vi sinh vật
trong phân sử dụng cả AXOS đơn thuần và thay thế kép. Do đó, một hỗn hợp AXOS thay thế đơn
lẻ và kép có thể hoạt động như một chất tiền sinh học lên men chậm, phù hợp.
Luận án này góp phần cung cấp thông tin về cấu trúc của AX ngũ cốc và điều chế AXOS đơn
và thay thế kép từ AX. Hiểu các chiến lược sử dụng là cơ bản trong việc đánh giá tiềm năng
tiền sinh học của AXOS. Vẫn cần nghiên cứu thêm trước khi AXOS có thể được sử dụng trong
các ứng dụng cho con người.
Sự nhìn nhận
Nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Hóa học Ứng dụng và Vi sinh, Bộ môn
Hóa học và Hóa sinh, trường Đại học Helsinki trong những năm 2003-2009. Một
phần của nghiên cứu được thực hiện trong chuyến nghiên cứu tại trường Đại học
Kỹ thuật Đan Mạch (DTU ). Công trình được hỗ trợ tài chính bởi Quỹ Nghiên cứu
Raisio, Quỹ Danisco, Học viện Phần Lan và Quỹ Văn hóa Phần Lan, những tổ chức
này rất biết ơn. Hành động COST 928 và Mạng NordForsk; Food and Bioresource
Enzyme Technology được ghi nhận đã tài trợ cho chuyến tham quan nghiên cứu
tại DTU.
Tôi vô cùng biết ơn những người hướng dẫn của tôi, Giáo sư Maija Tenkanen và Docent Päivi Tuomainen đã
giúp tôi hoàn thành luận văn này. Bạn đã khiến tôi quan tâm đến công việc nghiên cứu, và bạn đã cho tôi rất
nhiều lời khuyên bổ ích, những lời phê bình mang tính xây dựng và sự kiên nhẫn. Cảm ơn bạn đã hỗ trợ tôi
trong suốt công việc với sự hướng dẫn đầy cảm hứng của bạn. Tôi xin cảm ơn Giáo sư Vieno Piironen vì những
nhận xét quý báu liên quan đến luận án này và những lời động viên khích lệ trong quá trình làm việc. Tôi xin
chân thành cảm ơn Tiến sĩ Liisa Virkki vì sự giúp đỡ của bạn trong việc chuẩn bị các bản thảo và luận án này
cũng như sự quan tâm liên tục của bạn đối với công việc của tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn Giáo sư Anne Mayer và Phó Giáo sư Peter Westermann đã cung cấp cơ
sở vật chất làm việc tuyệt vời tại DTU và đã giới thiệu tôi vào thế giới nghiên cứu của vi sinh học và
sinh học phân tử. Tôi đặc biệt cảm ơn Louise Vigsnæs, Gitte Hinz-Berg và nhiều người khác đã
hướng dẫn tôi trong phòng thí nghiệm tại DTU và khiến kỳ nghỉ của tôi ở Đan Mạch trở nên khó
quên.
Tôi muốn cảm ơn các đồng tác giả của tôi, Phó Giáo sư Henk Schols và Tiến sĩ Mirjam Kabel vì sự giúp đỡ
của bạn đối với các thí nghiệm MALDI-TOF-MS và những nhận xét mang tính xây dựng trong quá trình
chuẩn bị bản thảo.
Tôi cảm ơn tất cả các đồng nghiệp hiện tại và trước đây của tôi trong tòa nhà Viikki D đã tạo ra bầu
không khí làm việc hỗ trợ và vì những khoảnh khắc đẹp mà chúng tôi đã chia sẻ. Xin gửi lời cảm ơn đặc
biệt đến nhóm nghiên cứu hemicellulose: Leena Pitkänen, Ndegwa Maina, Sanna Koutaniemi, Sun-Li
Chong, Susanna Heikkinen, Kirsi Mikkonen, Mari Heikkilä, Kirsti Parikka, Henna Pynnönen, Liisa
Johansson, Paula Koivisto, Riku Talja, Saara Hamarila và Annemai Soovre. Cảm ơn tất cả các bạn đã nhận
xét công việc của tôi, trình bày ý tưởng của bạn và chia sẻ những khoảnh khắc tuyệt vời cũng như lắng
nghe và giúp đỡ trong những thời điểm khó khăn. Tôi rất biết ơn Essi Harju và Jaakko Arpiainen vì sự
giúp đỡ trong phòng thí nghiệm.
Giáo sư Alphons GJ Voragen và Docent Tarja Tamminen được cảm ơn vì đã xem xét cẩn thận
trước luận án này, những nhận xét và đề xuất của họ để cải thiện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến bố mẹ tôi là Hanna và Tapio Rantanen và em gái Riitta
của tôi. Bạn đã luôn tin tưởng ở tôi, giúp đỡ và hỗ trợ tôi bằng mọi cách có thể. Tôi cũng muốn
cảm ơn những người thân và bạn bè của tôi vì sự quan tâm mà bạn đã thể hiện đối với công việc
của tôi, vì những khoảnh khắc hạnh phúc và sự thoải mái khi cần thiết. Cảm ơn bạn vì tình bạn lâu
dài trong suốt ngần ấy năm và đã giúp tôi đôi khi hoàn toàn quên đi khoa học...
Cuối cùng, lời cảm ơn yêu thương của tôi xin gửi đến Matti, chồng tôi và con trai Aleksanteri của chúng
tôi. Cảm ơn Matti vì đã yêu con người thật của con, tin tưởng và ủng hộ con. Bạn đã làm cho cuộc sống
của tôi hoàn thành. Aleksanteri, bạn luôn có thể khiến mẹ cười với những trò đùa “keksijä-Kyösti” của
bạn và hạnh phúc với một nụ hôn ướt át. Tôi đánh giá cao niềm vui sống tinh tế của bạn – thế giới là một
nơi đầy nắng với bạn!
Helena Pastell
nội dung
TRỪU TƯỢNG 5
SỰ NHÌN NHẬN 6
DANH MỤC CÁC XUẤT BẢN GỐC 10
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 12
1. GIỚI THIỆU 15
2.4 Các phương pháp phân tách và phát hiện trong phân tích AXOS 33
2.4.1 Lưu giữ monosacarit 34
2.4.2 Lưu giữ oligosacarit 35
2.4.3 Phát hiện ampe kế xung 35
5. KẾT QUẢ 61
5.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu (I-IV) 61
5.2. Cấu trúc của AXOS được điều chế bằng enzym (I-III) 61
5.3 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX (I-III) 66
5.4 Hoạt động của Shearzyme (I-III) 68
5.5 Hành vi của AXOS trong sắc ký (I-III) 68
5.5.1 Tách AXOS trên TLC 68
5.5.2 Thứ tự rửa giải của AXOS và phản ứng của chúng trong HPAEC-PAD 69
5.6 Thí nghiệm lên men (IV) 71
5.6.1 Thành phần cacbohydrat của sản phẩm thủy phân XOS và AX 71
5.6.2. Sự phát triển của các nền văn hóa bifidobacteria tinh khiết 72
5.6.3 Lên men với hệ vi sinh vật trong phân 74
6. THẢO LUẬN 77
6.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu 77
6.2 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX 78
6.3 Sản xuất AXOS ở quy mô chuẩn bị 82
6.4 Những thách thức trong việc xác định và định lượng AXOS 84
6.5 Hoạt động của AXOS trong hệ thống HPAEC-PAD 85
6.5.1 Thứ tự rửa giải của AXOS 85
6.5.2 Phản hồi của AXOS trong PAD 86
6.6 Thí nghiệm lên men 87
6.6.1 Sử dụng chất nền 87
6.6.2 Chiến lược sử dụng cơ chất của bifidobacteria thuần khiết 90
6.6.3 Các tính năng cụ thể trong việc sử dụng AXOS tinh khiết 92
7. KẾT LUẬN 95
Luận án này dựa trên các ấn phẩm gốc sau đây, được gọi trong văn bản bằng chữ
số La Mã:
TÔI Rantanen, H., Virkki, L., Tuomainen, P., Kabel, M., Schols, H., Tenkanen, M. 2007.
Điều chế arabinoxylobiose từ xylan lúa mạch đen sử dụng họ 10Aspergillus
aculeatusendo-1,4---D-xylanase.Polyme cacbohydrat, 68, 350-359.
II Pastell, H., Tuomainen, P., Virkki, L., Tenkanen, M. 2008. Chuẩn bị enzyme
theo từng bước và mô tả đặc điểm cấu trúc của arabinoxylo-oligosacarit thay
thế đơn và kép với các nhánh cuối không khử. Nghiên cứu carbohydrate, 343,
3049-3057.
III Pastell, H., Virkki, L., Harju, E., Tuomainen, P., Tenkanen, M. 2009. Sự hiện diện của 2-
Ô---D-xylopyranosyl---L-arabinofuranosyl chuỗi bên trong arabinoxylan ngũ cốc.
Nghiên cứu carbohydrate, 344, 2480-2488.
IV. Pastell, H., Westermann, P., Meyer, AS, Tuomainen, P., Tenkanen, M. 2009.Trong ống
nghiệmquá trình lên men carbohydrate có nguồn gốc arabinoxylan bởi bifidobacteria và hệ
vi sinh vật phân hỗn hợp.Tạp chí hóa học nông nghiệp và thực phẩm, 57, 8598- 8606.
Các giấy tờ được sao chép với sự cho phép của người giữ bản quyền: Elsevier (TÔI, II,
III) và Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ (IV.).
Đóng góp của tác giả cho các bài báo từ I đến IV:
TÔI Helena Pastell (nhũ danh Rantanen) đã lên kế hoạch nghiên cứu cùng với Giáo sư
M. Tenkanen và Docent P. Tuomainen. Docent L. Virkki đã lên kế hoạch cho các
phân tích NMR, giải thích kết quả và viết phần NMR trong bản thảo. Phó giáo sư
H. Schols và Ph.DM Kabel đã giúp lập kế hoạch và thực hiện phân tích MALDI-
TOF-MS. Các công việc thí nghiệm khác, ngoại trừ phép đo hoạt tính enzyme và
phân tích metanol bằng axit, được thực hiện bởi Helena Pastell. Cô ấy đã viết bản
thảo được cùng biên tập với các tác giả khác. Helena Pastell đóng vai trò là tác giả
tương ứng của bài báo.
II Helena Pastell đã lên kế hoạch cho nghiên cứu cùng với Giáo sư M. Tenkanen và Tiến
sĩ P. Tuomainen, người cũng đã thực hiện các phép đo MALDI-TOF-MS. Docent L. Virkki
đã lên kế hoạch cho các phân tích NMR, giải thích kết quả và viết phần NMR trong bản
thảo. Helena Pastell chịu trách nhiệm về công việc thử nghiệm khác. Cô ấy đã viết bản
thảo được cùng biên tập với các tác giả khác, và cô ấy đóng vai trò là tác giả tương
ứng của bài báo.
III Helena Pastell đã lên kế hoạch cho nghiên cứu cùng với Giáo sư M. Tenkanen và Tiến
sĩ P. Tuomainen. Docent L. Virkki đã lên kế hoạch cho các phân tích NMR, giải thích kết
quả và viết phần NMR trong bản thảo. B.Sc E. Harju đã phân lập được arabinoxylan và
oligosacarit. Công việc thử nghiệm khác, ngoại trừ các phân tích trước đó và ESI-MS,
được thực hiện bởi Helena Pastell. Cô ấy đã viết bản thảo đã được các tác giả khác
nhận xét, và cô ấy đóng vai trò là tác giả tương ứng của bài báo.
IV. Helena Pastell đã lên kế hoạch cho nghiên cứu cùng với Giáo sư M. Tenkanen, PGS.
Giáo sư P. Westermann và Giáo sư AS Meyer. Helena Pastell chịu trách nhiệm về công
việc thử nghiệm, ngoại trừ phân tích t-RFLP. Cô ấy đã viết bản thảo được cùng biên
tập với các tác giả khác. Helena Pastell đóng vai trò là tác giả tương ứng của bài báo.
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
- - L-Araf alpha-L-arabinofuranosyl
CÂY RÌU arabinoxylan(s)
MỘTzX MỘT; --L-Araf+ --D-XylP,z; vị trí liên kết giữa --L-Araf và --D-
XylP,X; (-)-D-Xyl(P)
AXH-d3 - - L-arabinofuranosidase (chỉ có thể giải phóng liên kết (1-3) -- L-
Arafcác đơn vị từ bị loại bỏ --D-XylPdư lượng)
AXH-m - - L-arabinofuranosidase (tác động trên (1-2)- và (1-3)-liên kết
- - L-Arafđơn vị trên monosubstituting --D-XylPdư lượng)
AXOS arabinoxylo-oligosacarit (s)
- - D-XylP beta-D-xylopyranosyl
BHAX vỏ lúa mạch arabinoxylan
CCAX lõi ngô arabinoxylan
ĐP Mức độ trùng hợp Mức
ĐS độ thay thế
DQF-COSY quang phổ tương quan được lọc lượng tử kép
Đ.2,3X
- - D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl phổ
ESI-MS khối ion hóa phun điện hóa
FOS thực phẩm fructo-oligosacarit
FOSHU dùng cho sức khỏe được chỉ
GC định sắc ký khí
GH glycosid thủy phân
GOS sắc ký thẩm thấu gel galacto-
GPC oligosacarit sắc ký tương quan đa
HMQC lượng tử dị nhân kết nối đa liên kết dị
HMBC nhân
HPAEC-PAD sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao với phát hiện ampe kế
xung
HSQC sắc ký lỏng tương quan đơn lượng tử hạt
LC/MSD nhân/phát hiện chọn lọc khối lượng
LDL lipoprotein mật độ thấp
MALDI-TOF-MS quang phổ khối thời gian bay/giải hấp thụ laser có hỗ trợ
ma trận
mw khối lượng mol trung bình trọng lượng cộng
NMR 1D hưởng từ hạt nhân một chiều cộng hưởng từ
2DNMR hạt nhân hai chiều cám yến mạch
OBAX arabinoxylan
OSAX yến mạch đánh vần arabinoxylan
1. Giới thiệu
Trong hầu hết các chế độ ăn uống của con người, carbohydrate là nguồn năng lượng chính.
Carbohydrate có thể được chia thành hai loại: 1) carbohydrate được tiêu hóa và hấp thụ
trong ruột người và 2) chất xơ là carbohydrate không tiêu hóa được đi đến ruột già. Do đó,
chất xơ có thể được định nghĩa là “các bộ phận thực vật ăn được hoặc carbohydrate tương
tự có khả năng chống tiêu hóa và hấp thụ trong ruột non của con người với quá trình lên
men hoàn toàn hoặc một phần trong ruột già” (Hiệp hội các nhà hóa học ngũ cốc Hoa Kỳ
(AACC), 2001). Theo định nghĩa mới nhất của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA),
chất xơ đơn giản là “carbohydrat không tiêu hóa được cộng với lignin”. Thành phần chính
của chất xơ là các polysacarit không tinh bột (ví dụ: cellulose,
Nhiều loại oligosacarit không thể tiêu hóa khác nhau, được phân loại là chất xơ ăn kiêng,
hoặc oligosacarit thu được từ polysacarit được phân loại là chất xơ ăn kiêng, được đưa vào
trong các thành phần thực phẩm mới và có thể được sử dụng trong thực phẩm chức năng.
Oligosacarit có nhiều đặc tính sinh lý có lợi, chẳng hạn như thúc đẩy sự phát triển của vi
khuẩn đường ruột có lợi (BifidobacteriumVàLactobacillus) (= hiệu ứng tiền sinh học) (Gibson
và Roberfroid, 1995; Crittenden và Playne, 1996; Voragen, 1998) và bảo vệ chống ung thư
ruột kết bằng cách sản xuất axit béo chuỗi ngắn (SCFA) trong ruột già trong quá trình lên
men (Voragen, 1998; Scharlau và cộng sự, 2009). Mối quan tâm đến oligosacarit như thành
phần phụ trong thực phẩm tăng cường sức khỏe đã tăng lên ở Châu Âu, nhưng hiện chỉ có
inulin, FOS và GOS được phép sử dụng cho người trong thực phẩm chức năng (van Loo et
al., 1999; Pascal, 2008). Tại Nhật Bản, thực phẩm dành cho mục đích sử dụng lành mạnh
được chỉ định (FOSHU) đã được luật hóa vào năm 1991. Các sản phẩm của FOSHU bao gồm
lactosucrose. Yêu cầu sức khỏe chính đối với các sản phẩm này là chúng là “thực phẩm được
FOS, GOS, xylo-oligosaccharides (XOS) và lactulose đặc biệt kích thích sự phát triển của
Bifidobacterium(Imaizumi và cộng sự, 1991; Crittenden và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, oligosacarit
tuyến tính có thể bị lên men quá nhanh bởi vi khuẩn bifidobacteria và mục tiêu hiện tại là tìm ra
oligosacarit lên men chậm trong ruột già. Quá trình lên men chậm tạo ra nhiều SCFA, trong đó
đặc biệt là axit butyric và propionic dường như đóng vai trò chính trong việc ngăn ngừa ung thư
ruột kết (Scharlau et al., 2009). Các oligosacarit có khả năng lên men chậm bao gồm arabinoxylo-
oligosacarit (AXOS), được tạo ra bằng cách phân hủy arabinoxylan cao phân tử (AX). AXOS phân
nhánh là các oligosacarit không tiêu hóa được, nhưng được lên men trong ruột già bởi hệ vi sinh
vật đường ruột (Gibson và Roberfroid, 1995; van Laere và cộng sự, 2000). AXOS được lên men bởi
một số vi khuẩn bifidobacteria có lợi cho sức khỏe và bởi vi khuẩn đường ruột chiếm ưu thế,vi
khuẩnspp., nhưng có hại Clostridiumspp. cho thấy việc sử dụng AXOS phân nhánh thấp (van Laere
Để có được những tác dụng đối với sức khỏe thông qua vi khuẩn có lợi cho sức khỏe, một chiến lược là
bổ sung bifidobacteria vào thực phẩm. Tuy nhiên, bifidobacteria dùng đường uống có thể không tồn tại
trong ruột và ngay sau khi ngừng ăn, hệ vi khuẩn đường ruột sẽ trở lại trạng thái trước đó (Suwa et al.,
1999). Một chiến lược khác là củng cố thực phẩm bằng SCFA, nhưng không chắc rằng SCFA được thêm
trực tiếp vào thực phẩm sẽ đến được ruột già. Do đó, chất xơ hoặc oligosacarit có thể lên men được sử
dụng bằng đường uống sẽ đến được ruột non có thể thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria
và mang lại tác dụng tích cực của SCFA (Campbell và cộng sự, 1997b; Suwa và cộng sự, 1999).
Để chuẩn bị các oligosacarit không thể tiêu hóa, có sẵn một số nguồn thực vật giàu
carbohydrate. Trong thành tế bào, lignin, cellulose và hemiaellulose liên kết chặt chẽ
với nhau và có thể được gọi là vật liệu lignocellulose (Aspinall, 1980; Puls, 1993). Chất
thải hoặc sản phẩm phụ của lâm nghiệp, nông nghiệp và công nghiệp có chứa một
lượng đáng kể vật liệu lignocellulose. Xử lý sinh khối còn lại làm nguyên liệu thô mang
lại lợi ích kinh tế và sinh thái do khả năng tái tạo sinh học và sự phong phú của nó
(Alonso et al., 2003). Xylan là thành phần chính của hemiaellulose và do đó, sau
cellulose, là nguồn thực vật tái tạo phong phú thứ hai với tiềm năng sử dụng cao như
các sản phẩm hữu ích (Kulkarni et al., 1999). Xylan chiếm khoảng
17
20-30% trọng lượng khô của phụ phẩm nông nghiệp, chẳng hạn như rơm ngũ cốc và vỏ hạt
(Aspinall, 1970).
Luận án này xem xét các tài liệu về sự xuất hiện và cấu trúc của arabinoxylan trong ngũ cốc, quá
trình sản xuất AXOS bằng enzym, cũng như tiềm năng tiền sinh học của chúng. Phần thực nghiệm
của luận án là tổng hợp các số liệu đã công bố trong các bài báo đính kèmI-IV, trong đó mô hình
thay thế của một số AX cao phân tử được nghiên cứu, quá trình sản xuất, tinh chế và phân tích
cấu trúc của AXOS được đặc trưng và tiềm năng tiền sinh học của AXOS được đánh giá trongtrong
ống nghiệmhọc. Các kết quả thu được được đánh giá trong phần Thảo luận.
18
Hạt ngũ cốc thường bao gồm cám, mầm và nội nhũ tinh bột. Ngoài ra, một số loại
ngũ cốc thông thường còn mang vỏ trấu (hulls); lúa mì (Triticum aestivumL.) và lúa
mạch đen (serealeL.) được tách vỏ trong khi thu hoạch, trong khi lúa mạch (
Hodeum thô tụcL.) và yến mạch (Avena sativaL.) thì không, nhưng vỏ trấu được
loại bỏ theo cách truyền thống trước khi sử dụng trong chế độ ăn uống của con
người. Cám được sản xuất từ các loại ngũ cốc, sử dụng các phương pháp phù
hợp với các loại ngũ cốc có cấu trúc khác nhau, dẫn đến cám chứa các lớp hạt đa
dạng. Cám lúa mì khá sạch các lớp khác, cám lúa mạch chứa một số tàn tích vỏ
trấu và cám yến mạch thường chứa một lượng đáng kể nội nhũ tinh bột (Fulcher
và Duke, 2002). Thành tế bào thực vật ngũ cốc bao gồm chủ yếu là polysaccharid,
lignin và protein (Puls, 1993; Aspinall, 1980). Các polyme chính trong thành tế bào
là cellulose (25-35%), hemiaellulose (40-50%) và lignin (7-10%) (Ishii, 1997). Cả
cellulose và hemiaellulose đều có chức năng như vật liệu hỗ trợ cấu trúc trong
thành tế bào; cellulose có độ bền kéo cao và tạo độ cứng cho tường,
Xylan xuất hiện dưới dạng hemiaellulose phổ biến nhất và sau cellulose, chúng là
polysacarit phổ biến thứ hai trong giới thực vật. Xylan có thể được chia thành ba nhóm:
1) (glucuron-)arabinoxylan, hiện diện trong gỗ mềm, mô gỗ của cỏ và cây hàng năm, 2)
arabinoxylan trung tính trong hạt ngũ cốc và 3) glucuronoxylan có trong gỗ cứng
(Aspinall, 1959, 1970) ; Sjöström, 1981; Ebringerová và Heinze, 2000). Ngũ cốc nguyên
hạt chứa AX từ 1,2% trọng lượng (trong gạo (Oryza sativa
L.)) đến 8,5% trọng lượng (trong lúa mạch đen), trong khi xylan trong các mô ngũ cốc
(lá, rơm, trấu) chiếm 25-35% sinh khối khô (Aspinall, 1970; Henry, 1985; Härkönen et al.,
1997; Moure và cộng sự, 2006). Mặc dù tỷ trọng AX khá nhỏ trong tổng thể
19
ngũ cốc, tỷ lệ tương đối là đáng kể trong thành tế bào nội nhũ ngũ cốc, trong đó AX chiếm
từ 20% (w/w; trong lúa mạch) đến 72% (w/w; trong lúa mì) (Fincher, 1975; Bacic và Stone,
1980). Do đó, AX là thành phần chính của thành tế bào của một số loại ngũ cốc (Hoffmann et
al., 1992). Tuy nhiên, thành tế bào nội nhũ chỉ đóng góp 0,5-5% trọng lượng khô của ngũ cốc
nguyên hạt và chúng cũng tạo thành các polyme không tinh bột khác với AX, ví dụ như
2002). Trung bình 2,1% trọng lượng AX trong bột mì (chủ yếu là nội nhũ) đã được báo cáo
(Andersson và Åman, 2001). Về mặt định lượng, hầu hết AX nằm trong các lớp cám, đóng
góp khoảng 25% trọng lượng khô của hạt (Fulcher và Duke, 2002).
Arabinoxylans có thể được chia thành AX chiết xuất được trong nước và không thể chiết xuất được
bằng nước. Khả năng không chiết xuất được của nước là do sự kết hợp của các tương tác không
cộng hóa trị và liên kết cộng hóa trị với các thành phần khác của thành tế bào, chẳng hạn như
protein, cellulose và lignin (McNeil et al., 1975; Markwalder và Neukom, 1976; Andrewartha et al.
1979; Jeffries, 1990). Nhiều liên kết trong số này không bền với kiềm và do đó một số AX có thể
được giải phóng và chiết xuất bằng cách xử lý kiềm (Ishii, 1997; Courtin và Delcour, 2001).
Gruppen et al. (1991) đã chỉ ra rằng với bari hydroxit (Ba(OH)2) phần chính của AX được chiết xuất
có chọn lọc từ các mẫu ngũ cốc khác nhau. Các kiềm khác, chẳng hạn như natri hydroxit (NaOH)
và kali hydroxit (KOH), cũng đã được sử dụng để chiết xuất AX. KOH được ưa chuộng hơn NaOH vì
mannan ít nhiều không hòa tan trong KOH (Puls và Schuseil, 1993). TRONG
bổ sung (1-3, 1-4)---glucan được chiết xuất cùng với KOH và NaOH, và do đó chúng không chọn lọc
như Ba(OH)2(Gruppen và cộng sự, 1991). Nhóm xylan bao gồm cả các polysacarit chiết xuất được
trong nước và kiềm (Aspinall, 1970) nhưng bất kể phương pháp chiết xuất nào, AX đều có độ hòa
tan khác nhau trong nước, vì khả năng hòa tan trong nước phụ thuộc vào cấu trúc của polyme.
Các xylan không được thay thế gần như không tan trong nước, nhưng khi tăng lượng nhóm bên
arabinose, các polyme trở nên dễ tan trong nước hơn (Sternemalm et al., 2008; Pitkänen et al.,
2009). Số lượng và sự sắp xếp cấu trúc của các chuỗi bên của AX khác nhau giữa các loài ngũ cốc
và thậm chí giữa các bộ phận khác nhau của cùng một loại cây.
20
Chuỗi chính tuyến tính của arabinoxylan bao gồm (1-4) --D-xylopyranosyl được liên kết với nhau
(--D-XylP) dư lượng. Xylan ngũ cốc chủ yếu được thay thế bằng (1-2)- và/hoặc (1-3)-
al., 1992; Izydorczyk và Biliaderis, 1993). Monosubstituting --D-XylPđơn vị có (1-2)- liên kết -L-
Arafnhóm thường được tìm thấy trong bột lúa mạch chiết xuất kiềm AX (22%) nhưng chúng
đã được tìm thấy với một lượng nhỏ trong tất cả các loại ngũ cốc AX. Cám lúa mì có thể chiết
xuất bằng nước AX sở hữu lượng cao nhất của (1-2)- và (1-3)-được thay thế --D-XylPđơn vị
(40% số đơn vị được thay thế) (Viëtor và cộng sự, 1992; Shiiba và cộng sự, 1993; Izydorczyk
và Biliaderis, 1995). Ngoài --L-Arafdư lượng, chuỗi chính --D-XylPđơn vị cũng có thể
- - L-Arafđơn vị (Saulnier et al., 1995b; Ishii, 1997). Nhóm axetyl, ferulic vàP-axit coumaric dễ
dàng được giải phóng trong quá trình chiết xuất bằng kiềm (Puls và Schuseil, 1993). Các đơn
vị cấu trúc chính của AX được trình bày trong Hình 1 và cấu trúc giả định của AX trong Hình
2.
h COOH
h CH CH COOH COOH
h Ô Ô h Ô CH CH
h Ồ OH H Ồ h Ồ
Ồ h Ồ h
HỒ HOH2C h3khí CO
HỒ HỒ
h Ồ h Ồ h Ồ OCH3
Một số xylan ngũ cốc cũng có thể mang chuỗi bên chứa nhiều hơn một đơn vị đường
(Aspinall, 1970). Trong các chuỗi bên mở rộng hơn này, --L-Arafphần còn lại gắn vào chuỗi chính
xylan mang các nhóm thế bổ sung, chẳng hạn như các đơn vị galactose hoặc xylose (Aspinall,
1980). Các chuỗi bên đa dạng này đã được phân lập từ các mô được xếp hạng cao hơn của cây
Đisaccarit 2-Ô---D-XylP-L-Arafchuỗi bên, được gắn vào O-3 của chuỗi xylan chính, lần đầu tiên
được báo cáo trong lõi ngô AX và vỏ lúa mạch AX (Whistler và McGilvray, 1955; Aspinall và Ferrier,
1958; Kusakabe và cộng sự, 1983; Ebringerová và cộng sự, 1992). Sau đó, cấu trúc chuỗi bên này
cũng được xác định ở ngô (Zea maysL.) vỏ trấu và cám ngô AX (Hromádková và Ebringerová, 1995;
Saulnier et al., 1995a). Sự tồn tại của chuỗi bên disaccharidic này trong vỏ lúa mạch chiết xuất
bằng kiềm AX gần đây đã được Höije et al. (2006). Wende và Fry (1997) đã báo cáo rằng disacarit,
thường được este hóa bởi axit ferulic ở vị trí O-5 của Ara.fđơn vị, là một thành phần phổ biến của
các bức tường tế bào cỏ. Các mẫu nhóm thế chính khác nhau trong các bộ phận thực vật dựa trên
Bảng 1.Các nhóm thế chính của các AX khác nhau từ cây ngũ cốc.
thay thế
nguồn AX - - L-Araf - - L-Araf - - L-Araf (4-Ô-Tôi-)--D-GlcA 2-Ô---D-XylP---L-Araf Thẩm quyền giải quyết
Các nhóm thế không phải lúc nào cũng được phân phối thường xuyên trên đường
trục AX. Riêng đối với AX có lượng nhóm thế cao, người ta đã đề xuất sự luân
phiên giữa các vùng phân nhánh cao và ít phân nhánh (Ewald và Perlin, 1959;
Gruppen et al., 1993). Nói chung, thành tế bào nội nhũ ngũ cốc chứa arabinoxylan
phân nhánh cao, trong khi các mô phân nhánh cao hơn, chẳng hạn như cỏ, rơm,
vỏ trấu và lõi ngô, thường chứa AX ít phân nhánh hơn và bổ sung (4-Ô-methyl)
nhóm bên axit glucuronic (Aspinall, 1980). Cám lúa mạch đen, lúa mì, gạo và yến
mạch chứa AX phân nhánh cao tương tự như AX nội nhũ từ lúa mì, gạo và lúa
mạch đen. AX với mức độ phân nhánh thấp đã được báo cáo trước đó từ vỏ trấu,
rơm lúa mì và yến mạch (Hromádková et al., 1987; Schooneveld-Bergmans et al.,
1999; Puls et al., 2006). Tỷ lệ arabinose-to-xylose (Ara/Xyl) dao động từ 0,5 đến 0,8
trong nội nhũ ngũ cốc và từ 0,4 đến 1,2 trong cám thường xảy ra, nhưng người ta
cũng tìm thấy các biến thể tự nhiên rộng rãi. Tỷ lệ Ara/Xyl trong nội nhũ, lớp
aleurone, màng ngoài quả, vỏ quả và màng ngoài quả rất đa dạng, và màng ngoài
quả có thể có tỷ lệ Ara/Xyl cao nhất trong một số loại ngũ cốc (Izydorczyk và
Biliaderis, 1995; Glitsø và Bach Knudsen, 1999 ; Ordaz-Ortiz và cộng sự, 2005).
Thành tế bào của nội nhũ lúa mì và lúa mạch đen rất giàu AX. Tỷ lệ Ara/Xyl là khoảng 0,5
trong bột lúa mì và lúa mạch đen hòa tan trong nước AX từ Megazyme International Ireland
Ltd. (Bray, Ireland), nhưng cấu trúc liên quan đến loại -L-Arafthay thế khác nhau đáng kể.
Trong bột mì AX có khoảng 1/3 -L-Arafđược liên kết (1-3) với monosubstituting --D-XylPdư
lượng và hai phần ba là (1-2)- và (1-3)-được liên kết với thay thế kép --D-XylP(Sorensen và
cộng sự, 2006; Pitkänen và cộng sự, 2009). Bột lúa mạch đen AX đã thay thế đơn lẻ nhiều
hơn đáng kể --D-XylPdư lượng, kể từ hai phần ba của -L-Arafđược liên kết (1-3) thành mono-
và một phần ba thành thay thế kép --D-XylP, tương ứng (Höije và cộng sự, 2008; Pitkänen và
cộng sự, 2009). Cấu trúc AX của nội nhũ lúa mì được chiết xuất bằng kiềm tương ứng với cấu
trúc của nội nhũ lúa mì được chiết xuất bằng nước, mặc dù các biến thể nhỏ trong tỷ lệ Ara/
Xyl và trọng lượng phân tử đã được báo cáo (Gruppen et al., 1993). Tỷ lệ Ara/Xyl của các AX
khác nhau được chiết xuất từ các nguyên liệu ngũ cốc khác nhau được thể hiện trong Bảng
2.
24
Ban 2.Tỷ lệ arabinose so với xyloza của các loại AX dựa trên ngũ cốc khác nhau được chiết xuất bằng các phương pháp
khác nhau. Dung môi được sử dụng để chiết xuất được sử dụng sau nhiều lần tiền xử lý khác nhau.
mạch nha lúa mạch Nước 0,64 Dervilly và cộng sự, 2002 Kabel
Nhà máy bia ś ngũ cốc đã qua sử dụng kiềm (KOH) 0,48 và cộng sự, 2002a Kabel và
Nhà máy bia ś ngũ cốc đã qua sử dụng Nước 0,88 cộng sự, 2002a Ebringerová và
Lõi ngô kiềm (NaOH) 0,07 cộng sự, 1992 Kabel và cộng sự,
Lõi bắp kiềm (NaOH) 0,06 Ramírez và cộng sự, 2008 Kabel và cộng
Lõi bắp Nước 0,72 sự, 2002a Ebringerová và Hromádková,
vỏ ngô kiềm (NaOH) 0,63 1997 MacArthur và D. Áppolonia, 1980
Cám yến mạch kiềm (NaOH) 1,07 Gruppen và cộng sự, 1991
đánh vần yến mạch kiềm (Ba(OH)2) 0,12
nội nhũ lúa kiềm (KOH) 0,84 Shibuya và cộng sự, 1985 Shibuya và cộng
Cám gạo kiềm (KOH) 0,97 sự, 1983 Ebringerová và cộng sự, 1994
cám lúa mạch đen kiềm (NaOH) 0,14 Hromádková và cộng sự, 1987 Hromádková
cám lúa mạch đen kiềm (NaOH) 0,18 và Ebringerová, 1987 Cyran và cộng sự, 2004
cám lúa mạch đen kiềm (NaOH) 0,87
bột lúa mạch đen kiềm (Ba(OH)2) 0,75
bột lúa mạch đen Nước 0,67 Cyran và cộng sự, 2003
cám lúa mì kiềm (NaOH) 1.17 Brillouet và cộng sự, 1982 Gruppen và
cám lúa mì kiềm (Ba(OH)2) 0,73 cộng sự, 1991 Bataillon và cộng sự, 1998
cám lúa mì kiềm (NaOH) 0,39 Schoonveld-Bergmans và cộng sự, 1999
cám lúa mì kiềm (Ba(OH)2) 0,71 Nandini và Salimath, 2001 Maes và
cám lúa mì kiềm (Ba(OH)2) 0,81 Delcour, 2002
cám lúa mì kiềm (NaOH) 0,82
cám lúa mì kiềm (KOH) 0,40 Kabel và cộng sự, 2002a Maes
cám lúa mì Nước 0,56 và Delcour, 2002 Kabel và
cám lúa mì Nước 0,63 cộng sự, 2002a
cám lúa mì Nước 1,25 Hollmann và Lindhauer, 2005
Bột mì kiềm (Ba(OH)2) 0,52 Gruppen và cộng sự, 1991
Bột mì Nước 0,80 MacArthur và D. Áppolonia, 1980.
Bột mì Nước 0,52 Cleemput và cộng sự, 1997
Bột mì Nước 0,55 Dervilly-Pinel và cộng sự, 2001
Đối với một số phân đoạn AX được chiết xuất được báo cáo trong ấn phẩm gốc, tỷ lệ Ara/Xyl trung bình được
tính toán tại đây.
25
Xương sống arabinoxylan bị phân hủy bởi glycoside hydrolase (GH) có khả năng thủy phân
liên kết glycosid giữa (1-4) --D-Xyl được liên kếtPcác đơn vị. Các enzym như vậy được sản
xuất ví dụ như bởi các loại vi khuẩn và nấm khác nhau. Xương sống AX của thực vật được
thủy phân ngẫu nhiên, sử dụngkết thúc-1,4---D-xylanase (EC 3.2.1.8), tạo ra hỗn hợp các
oligosacarit khác nhau. Các xylanase hiện được phân loại dựa trên sự tương đồng về cấu
trúc và trình tự trong các họ GH 5, 7, 8, 10, 11 và 43, nhưng nghiên cứu chủ yếu tập trung
vào họ GH10 và GH11 (CAZy - Carbohydrate Active enZymes; Collins et al., 2005).
Các xylanase GH10 và GH11 có các đặc tính xúc tác riêng biệt. Pell et al. (2004) và
Fujimoto et al. (2004) đã quan sát thấy rằng họ GH10 chứa các enzym có vị trí xúc tác
hơi đa dạng so với enzym GH11, dẫn đến sự khác biệt nhỏ trong các sản phẩm cuối
thủy phân của chúng. Các xylo-oligosacarit tạo ra từ hoạt động của GH10 xylanase
ngắn hơn so với các xylo-oligosacarit được tạo ra bởi GH11 xylanase. GH11 xylanase bị
cản trở bởi sự hiện diện của các nhóm phụ, trong khi GH10 xylanase có thể hoạt động
gần nhóm thế, tạo thành oligosacarit mang nhóm thế ở đầu cuối không khử
của --D-XylPdư lượng (Biely và cộng sự, 1997; Vardakou và cộng sự, 2003; Beaugrand và cộng sự, 2004;
Maslen và cộng sự, 2007) (Hình 2). AXOS ngắn nhất được sản xuất là --L-Araf-(1-3)---D-
XylP-(1-4)-D-XylP(MỘT3X) và --D-XylP-(1-4)[--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-4)-D-XylP(XA3X).
Các nhóm thế feruloyl không cản trở hoạt động của xylanase, vì feruloyl
arabinoxylobiose là oligosacarit lên men ngắn nhất được giải phóng bởi GH10
xylanase (Vardakou et al., 2003). Hệ thống đặt tên cho oligosacarit được áp dụng
từ Fauré et al. (2009).
như (1-2)-liên kết 4-Ô---D-MeGlcA, ở đầu không khử của chuỗi xyloza ngăn cản
hoạt động của enzym (Poutanen et al., 1990). Hơn nữa, áp chót (1-3)-liên kết
- - L-Arafdư lượng ngăn chặnexo-1,4---D-xylosidase từTrichoderma reeseitừ
thủy phân liên kết --1,4-glycosid trước đơn vị xyloza được thay thế (Tenkanen et al., 1996).
Ngoài ra, các exo-oligoxylanase giải phóng xyloza ở đầu khử (EC 3.2.1.156) có thể thủy phân
(A)XOS hơn nữa thành các oligosacarit thậm chí còn ngắn hơn (Tenkanen và cộng sự, 2003).
Enzyme được đề cập cuối cùng không thể thủy phân xylobiose, trong
tương phản vớiexo-1,4---D-xylosidaza. Vị trí hoạt động của các enzyme thủy phân chuỗi
chính xylan được trình bày trong Hình 2.
--L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) là các enzym phân cắt đầu cuối Arafdư lượng -từL-
các polysacarit và oligosacarit khác nhau. Các arabinofuranosidase tác động lên - L-
polyme AX (arabinoxylan arabinofuranohydrolases, AXH) được phân chia thêm tùy theo
đặc tính cơ chất của chúng, vì một số tác động lên (1-2)- và (1-3)-L-Ara được liên kếtf
đơn vị trên monosubstituting --D-XylPdư lượng (AXH-
m), trong khi những người khác chỉ phát hành (1-3)-liên kết -L-Arafcác đơn vị từ bị loại bỏ --
D-XylPdư lượng (AXH-d3) (van Laere et al., 1997) (Hình 2). Hầu hết -Larabinofuranosidase
được phân lập, chẳng hạn như từnấm mốc Aspergillus(Kormelink và cộng sự, 1993c),
Pseudomonas huỳnh quang(Kellett, 1990) và lúa mì (Beldman et al., 1996), chỉ hoạt động
trên --L-Arafdư lượng trên thay thế đơn lẻ --D-XylPdư lượng (AXH-m).
Laere và cộng sự, 1997, 1999) vàmiếng lót Humicola(Sørensen và cộng sự, 2006).
-arabinofuranosidase được báo cáo đầu tiên, có thể giải phóng --L-Araftừ cả đơn lẻ và đôi
thay thế --D-XylP, được phân lập từ mạch nha lúa mạch (Ferré et al., 2000). Cái này --
arabinofuranosidase có thể hoạt động trên các liên kết ở đầu cuối không khử --D-XylPvới
một hoặc hai --L-Arafnhóm thế, nhưng không cho thấy hoạt động đối với thay thế kép
nội bộ --D-XylP. AXH-m và AXH-d3 có tính đặc hiệu cao, hoạt động trên các polyme và oligome, là
những công cụ tuyệt vời để sử dụng trong việc sửa đổi tỷ lệ phân nhánh của AX và AXOS.
27
Xylan --1,2-glucuronidase (EC 3.2.1.131) thủy phân liên kết giữa (4-Ô-
methyl)---nhóm thế D-glucopyranosyl và --D-XylPđơn vị. --1,2-Glucuronidase hoạt động được
tìm thấy trong vi khuẩn và nấm (Pul et al., 1987). Một số glucuronidase có thể hoạt động
trên xylan cao phân tử và một số trên oligosacarit (Khandke et al., 1989; Tenkanen và Siika-
aho, 2000). Các nhóm axetyl được loại bỏ bởi các este axetyl xylan (EC 3.1.1.72), tách các
nhóm axetyl khỏi các vị trí O-2 và O-3 của --D-XylPđơn vị (Biely, 1985; Kormelink và Voragen,
1993). Enzyme quan trọng hơn trong việc biến đổi AX có thể chiết xuất bằng nước, vì trong
quá trình chiết xuất AX bằng kiềm, hầu hết các nhóm acetyl đều bị loại bỏ. Hơn nữa, các este
Ồ Ồ
HOH2C HOH2C
Ồ Ồ
a, b, ca Một đ Một
28
Ồ Ồ
HỒ Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ô Ô
Một.kết thúc-1,4---D-xylanase GH10 (EC 3.2.1.8) HỒ
Ồ
Ô Ô HỒ
Ô Ồ
b.kết thúc-1,4---D-xylanase GH11 (EC 3.2.1.8) Ô đ
Ồ
HOH2C
c.exo-1,4---D-xylosidase (EC 3.2.1.37)
Ồ
d. --L-arabinofuranosidase AXH-m (EC 3.2.1.55)
đ. --L-arabinofuranosidase AXH-d3 (EC 3.2.1.55) c g
f. --glucuronidaza (EC 3.2.1.131)
g. khử exo-oligoxylanase giải phóng xyloza cuối (EC 3.2.1.156)
Nhân vật2.Cấu trúc arabinoxylan dựa trên ngũ cốc giả thuyết và các glycanaza thủy phân xương sống xylan (ac) và các glycanaza giải
phóng các nhóm thế được trình bày (df). Chức năng khử exo-oligoxylanase (g) giải phóng xyloza cuối được hiển thị trên AXOS.
29
Enzyme tinh khiết cho phép điều chỉnh thành công các sản phẩm cuối cùng của
quá trình thủy phân, trong khi hỗn hợp enzyme thương mại thường chứa sự kết
hợp của các enzyme khác nhau có thể ảnh hưởng đến kiểu thủy phân. DP và mức
độ thay thế (DS) có thể được giảm hiệu quả bằng các enzym khác nhau. Sản phẩm
thủy phân chủ yếu là xylose, XOS và AXOS mạch thẳng không thế. Tuy nhiên, nếu
xương sống xyloza được thay thế nhiều, thì không có vị trí nào trên xương sống
mà các enzym có thể tiếp cận được. Để phân tích cấu trúc, AXOS phải được phân
lập khỏi các sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác. Sắc ký thẩm thấu
gel (GPC) và sắc ký trao đổi anion (AEC) là các phương pháp được sử dụng rộng rãi
trong việc phân tách chuẩn bị monosacarit và các oligosacarit khác nhau, dựa trên
sự khác biệt về kích thước và điện tích của chúng (Kormelink et al., 1993b; Kabel et
al., 2002c) . AXOS,
AXOS, với DP từ 3-11, đã được điều chế và xác định trong các nghiên cứu được trình bày
trong Bảng 3. Các nghiên cứu toàn diện nhất về phân lập và mô tả cấu trúc của AXOS được
thực hiện sau quá trình thủy phân nội nhũ lúa mì AX vớinấm mốc Aspergillus xylanase I và
III, không may là không được gán vào họ GH nhưng hầu hết có lẽ là thành viên của GH10 và
GH11 tương ứng (Gruppen et al., 1992; Kormelink et al., 1993a; Viëtor et al., 1994).
1,4---D-xylanase Tôi đã chuyển đổi 72% AX của bột mì thành mono-, di- và oligosacarit
với DP 3-10, trong khi xylanase III thủy phân 50% AX thành oligosacarit với DP 5-10.nội
soi-1,4---D-xylanase Tôi có thể tạo ra AXOS thay thế đơn lẻ và kép bằng các nhánh đầu
cuối không khử. AXOS với ít nhất một đơn vị xyloza không được thay thế trong thiết bị
đầu cuối không khử trước khi dư lượng xyloza phân nhánh được tạo ra bởikết thúc
-1,4---D-xylanaza III. Tương tự, các AXOS ngắn hơn cũng được hình thành
bởi GH10 kháckết thúc-1,4---D-xylanase so với GH11 được trình bày trong Bảng 3.
Số lượng AXOS được tạo ra hiếm khi được xác định. Vietor et al. (1994) đã báo cáo năng suất
24% trọng lượng đối với tất cả các mono- và oligosacarit được định lượng từ lúa mạch AX
sau khi xử lý bằng xylanase. Trong nghiên cứu của Ordaz-Ortiz et al. (2004), 8% trọng lượng
AXOS với DP 4-9 đã được xác định và định lượng sau khi xử lý AX xylanase bột mì. AXOS
chính (XA3XX) với hiệu suất cao nhất bao gồm 3% (77 mg) của tất cả các AXOS được định
lượng.
Một chuỗi bên disaccharidic khá hiếm gặp trong ngũ cốc, cụ thể là 2-Ô---D-XylP---L-Araf
, đã được báo cáo trong AXOS thu được bởi gia đình GH 11kết thúc-1,4---D-xylanase
thủy phân vỏ lúa mạch AX. Hexasacarit này (--D-XylP-(1-4)-[--D-XylP-(1-2)---L-Araf-
Chuẩn bị thương mại Ultraflo (Novo-Nordisk A/S, Bagsvaerd, Đan Mạch) cũng đã được sử
dụng để điều chế AXOS. Ultraflo là một chế phẩm --glucanase được sản xuất bởimiếng lót
Humicolavà nó chứa các hoạt động phụ như cellulase, xylanase, arabinase và feruloyl
esterase (Faulds et al., 2002). Broberg và cộng sự. (2000) đã xử lý mạch nha lúa mạch chiết
xuất AX bằng Ultraflo và xác định sáu loại AXOS khác nhau (A2XX, MỘT2+3XX, XA2+3XX, MỘT2
XXX, MỘT2+3XXX). Lượng AXOS trong các phân số thu được là 3-18 g (4-26nmol).
31
Bàn số 3.Arabinoxylo-oligosacarit thu được trong quá trình thủy phân các AX khác nhau được chiết xuất từ các
nguyên liệu làm từ ngũ cốc. Các AXOS chính được sản xuất được gạch dưới.
Enzim họ GH Chất nền (AX)
AXOS Thẩm quyền giải quyết
(Sinh vật sản xuất) nguồn gốc
MỘT2+3XX 1993
MỘT2+3MỘT3X
XA3MỘT3X
XA2+3XX
MỘT3MỘT2+3XX
MỘT2+3MỘT2+3XX
XA3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT2+3XX
XA2+3XA2+3XX
XA3MỘT3XX 1993
XXA2+3XX
XA3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT2+3XX
XA2+3MỘT3XX
XXA3MỘT3XX
XXA3MỘT2+3XX
XA3MỘT2+3XXX
XA3XA3XX
XA2+3XA2+3XX
XA3XXA3XX
XXA3XA3XX
nội soi-1,4---D-xylanaza I vách tế bào lúa mạch MỘT3X Vietor và cộng sự,
XA3MỘT3X
MỘT2MỘT3X
MỘT2+3MỘT3X
32
nội soi-1,4---D-xylanaza I Nhà máy bia ś dành MỘT3X Kabel và cộng sự,
XA2+3XX 2002b
GH11 2006
(Trichoderma longibrachiatum)
Ngoài việc điều chế AXOS từ AX chiết xuất, AXOS cũng có thể được sản xuất trực tiếp từ
vật liệu lignocellulose. Trong nghiên cứu của Swennen et al. (2006), AXOS được sản
xuất trên quy mô lớn từ cám lúa mì (500 kg). Cám lúa mì lần đầu tiên được khử bằng
enzyme và khử protein và sau đó được xử lý bằngBacillus subtilisGH11kết thúc-1,4---D-
xylanaza. AXOS thu được được phân đoạn bằng kết tủa etanol được phân loại, trong đó
nồng độ etanol được tăng dần cho đến khi đạt được nồng độ cuối cùng là 90% (v/v).
AXOS được tạo ra có DP trung bình là 15 và tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27. Sản lượng của AXOS là
6% trọng lượng với độ tinh khiết là 72%. --D-XylPcác đơn vị nói chung là
thế đơn với --L-ArafDư lượng O-3, nhưng AXOS thu được với 40-70%
kết tủa ethanol chứa gần như nhiều --L-Arafthay thế kép --D-XylP các đơn vị. Trong
nghiên cứu của Maes et al. (2004), cám lúa mì đã tách tinh bột và khử protein (1000 g)
Bagsvaerd, Đan Mạch).nội soi-1,4---D-xylanaza từB. subtilisđã có thể thủy phân 41% khối
lượng AX không chiết xuất được trong nước thành AXOS với DP trung bình là 15, trong khi
A. aculeatus endo-1,4---D-xylanase chỉ thủy phân 18% khối lượng (DP trung bình là 8). Giống nhau
nghiên cứu cho thấy rằng,A. aculeatus endo-1,4---D-xylanase chủ yếu phân hủy AX có thể chiết
2.4 Các phương pháp phân tách và phát hiện trong phân tích AXOS
Carbohydrate hầu như không hấp thụ tia cực tím (UV), do không có liên kết - và do đó,
phương pháp phát hiện chỉ số khúc xạ (RI) hoặc điện hóa (EC) được sử dụng trong
phân tích của chúng. Phát hiện EC đã trở thành phương pháp phân tích ưa thích, đặc
biệt là trong phân tích dấu vết, do giới hạn phát hiện thấp (mức picomolar) (Johnson và
LaCourse, 1990; Lee, 1990; Johnson và cộng sự, 1993). Sắc ký trao đổi anion hiệu năng
cao kết hợp với phát hiện ampe kế xung (HPAEC-PAD) hiện được sử dụng thường
xuyên để phân tách và phân tích oligosacarit. HPAEC-PAD có khả năng phân giải đặc
biệt các đồng phân oligosacarit trung tính và tích điện (Lee, 1990, 1996; Kabel et al.,
2002c). Hơn nữa, khả năng tái sản xuất của HPAEC-PAD là thuận lợi (Thayer et al.,
34
1998). Một trong những ưu điểm lớn nhất của HPAEC-PAD là khả năng phân tách các
oligosacarit kém hoạt động (Lee, 1990).
Cacbohiđrat là axit yếu có pKMột> 12, và trong cột trao đổi anion, quá trình phân tách
đạt được ở độ pH cao, sử dụng dung dịch kiềm mạnh (NaOH 0,1 M) (Lee, 1990; Johnson
et al., 1993). Sự phân ly của các proton từ các nhóm hydroxyl ở độ pH cao tạo ra các
oxyanion được cột HPAEC giữ lại (Thayer et al., 1998). Thời gian lưu (tr) tương quan
nghịch với pKMộtgiá trị và tăng lên khi tăng khối lượng phân tử của carbohydrate. Thời
gian lưu có thể giảm đáng kể bằng cách bổ sung các ion axetat (OAc-) (Johnson và cộng
sự, 1993).
Dự đoán thứ tự rửa giải của monosacarit là phức tạp, do trạng thái cân bằng phức tạp của
chúng giữa pyranoses và furanoses, và -- và --anomers. Một số quy tắc rửa giải chính có thể
được nêu dựa trên hóa học lập thể carbohydrate và các nhóm chức năng. Nhóm hydroxyl dị
thường của carbohydrate có tính axit cao hơn các nhóm khác và ảnh hưởng nhiều nhất. Thứ
tự rửa giải phần lớn tương ứng với pKMộtgiá trị của carbohydrate và trong số các pentose
12.43) rửa giải trước xyloza (pKMột12.29). Hơn nữa, các đồng phân 1-OH theo trục là
dự kiến sẽ là axit mạnh hơn so với --anome xích đạo 1-OH, và lượng -- anome dự kiến sẽ
cao hơn nhiều trong mannose so với glucose, điều này có thể giải thích cho việc rửa giải
glucose sớm hơn. Về hexose và pentose đồng hình, pentose dường như rửa giải sớm hơn
(L-arabinose < D-galactose). Tuy nhiên, xyloza thiếu 5-CH2OH (Hình 3) nhưng mặt khác
tương tự như glucose, rửa giải muộn hơn glucose có tính axit hơn (pKMột12.35) (Lee, 1990).
Ồ Ồ Ồ h
h
Ô HỒ Ô h Ô h Ô h Ô
OH H Ồ h Ồ h Ồ h Ồ h Ồ
Ồ h Ồ Ồ Ồ h Ồ h
HOH2C h HỒ hÔ HỒ
h Ồ h Ồ h h h Ồ h Ồ
Với các oligosacarit, vị trí của các liên kết glycosid và cấu trúc hình dạng tổng thể trở
thành các yếu tố quan trọng và các yếu tố khác ngoài tính axit của các nhóm 1-OH có
ảnh hưởng nhiều hơn đến thứ tự rửa giải. Trong nghiên cứu của Roberts et al. (1971),
pK khác nhauMộtcác giá trị đã được tìm thấy cho mỗi nhóm hydroxyl. Họ đã báo cáo
tính axit của các nhóm hydroxyl trong metyl -- hoặc --D-glucopyranoside là 2-OH > 6-
OH > 3-OH > 4-OH. Do đó, việc che phủ hoặc biến đổi một số nhóm hydroxyl ảnh
hưởng đến thứ tự rửa giải của oligosacarit. Nói chung, khối lượng lưu giữ tăng khi DP
tăng. Vị trí liên kết ảnh hưởng đến quá trình rửa giải theo thứ tự sau đối với glucose
oligosacarit: --1,3 > --1,3 > --1,4 > --1,4 > --1,6 > --1,2 > --1,6 (Koizumi et al., 1991) và do
đó thứ tự rửa giải là khác nhau đối với các disacarit D-glucose khác nhau. Vì thời gian
lưu của oligosacarit từ chuỗi Xyl-(1,4) là
ngắn hơn so với sê-ri Glc-(1,4) và sự khác biệt duy nhất giữa sê-ri là không có -CH2
OH từ xyloza, người ta đã kết luận rằng 6-OH có thể tiếp cận được bằng bề mặt
nhựa. Mặt khác, ngay cả với các nhóm 6-OH tự do, chuỗi Man-(1,4) (Hình 3) rửa
giải ngay cả trước chuỗi xyloza tương ứng, và do đó có ý kiến cho rằng sự hiện
diện của 2-OH dọc trục bằng cách nào đó cản trở sự tương tác giữa oligosacarit và
nhựa (Lee, 1990).
Thông tin về việc lưu giữ oligosacarit phân nhánh còn hạn chế. Tuy nhiên, hai yếu tố có
tác dụng trong việc xác định thứ tự rửa giải: 1) độ axit tương đối của các nhóm
hydroxyl và 2) khả năng tiếp cận của các oxyanion oligosacarit đối với các nhóm chức
của pha tĩnh. Hardy và Townsend (1988) đã nghiên cứu việc tách các oligosacarit trung
tính khỏi glycoprotein, nhưng kết quả không thể áp dụng trực tiếp cho AXOS.
Trong phát hiện ampe kế xung, cacbohydrat bị oxy hóa ở điện cực vàng (Au)
(Johnson và LaCourse, 1990). PAD, với điện cực làm việc Au, được phát triển để cho
phép đổi mới thường xuyên bề mặt điện cực làm việc. Độ nhạy cao để phát hiện
anot của cacbohydrat ở điện cực Au yêu cầu pH 12 (Johnson et al.,
36
1993). Chức năng của điện cực có thể được chia thành ba bước. Trong bước đầu tiên,
cacbohydrat bị oxy hóa ở điện cực Au, dẫn đến dòng oxy hóa cụ thể và trong bước này,
tín hiệu được thu thập. Tiếp theo là một điện thế dương lớn để đạt được sự hình thành
anốt của các oxit bề mặt để làm sạch điện cực. Giai đoạn cuối cùng là bước kích hoạt
lại, vì bề mặt điện cực bị oxy hóa bị khử trở lại bề mặt Au phản ứng. Quá trình oxy hóa
glucose ở dạng mạch hở trên PAD trong bước đầu tiên được mô tả như sau: xảy ra quá
trình oxy hóa hai electron đầu tiên rất nhanh của aldehyd thành axit cacboxylic tương
ứng, tiếp theo là các bước tương đối nhanh dẫn đến sự phân cắt liên kết C1-C2 sản
xuất CHO2H, sau đó C2 và C6 được chuyển thành cacboxylat tương ứng. Sự phân cắt
anot tuần tự tiếp theo của các cacbon cuối cùng còn lại xảy ra chậm và các electron
được giải phóng trong quá trình oxy hóa được phát hiện (Johnson và LaCourse, 1990).
PAD không cung cấp phản ứng đồng nhất đối với carbohydrate bao gồm các đơn vị monosacarit giống nhau nhưng với sự sắp xếp cấu trúc khác nhau của
dư lượng. Do đó, kỹ thuật này yêu cầu một tiêu chuẩn định lượng cho từng oligosacarit được xác định (Lee, 1990). Đây là một nhược điểm nghiêm trọng, vì
các hợp chất tham chiếu cho các oligosacarit phức tạp không có sẵn và do đó phải tự điều chế. Thông tin trước đây về các phản ứng đối với oligosacarit, bao
gồm cả AXOS, bị hạn chế. Khi phân tích định lượng được thực hiện, sự lựa chọn giữa đo diện tích hoặc chiều cao là sự thỏa hiệp giữa một số yếu tố. Khi tích
phân các pic, chiều cao pic hoặc diện tích pic có thể được sử dụng khi đạt được độ phân giải và hình dạng pic tốt. Đôi khi chiều cao cực đại chính xác hơn
diện tích khi đo đại lượng, mặc dù diện tích được sử dụng rộng rãi hơn trong sắc ký (Dyson, 1998). Snyder (1972) chỉ ra rằng chiều cao ít bị ảnh hưởng bởi sự
chồng lấp hơn so với diện tích có các đỉnh đối xứng, trong khi Meyer (1995) chứng minh rằng chiều cao là lựa chọn an toàn hơn trong việc đo các đỉnh chồng
lấn nhỏ. Hơn nữa, sai số tích phân đối với các phép đo chiều cao trong hầu hết mọi tình huống đều nhỏ hơn so với các phép đo diện tích tương ứng. Một
thiếu sót của việc sử dụng chiều cao pic là chiều cao là một hàm của độ rộng pic, làm cho điều này phụ thuộc vào hiệu suất của cột chứ không phải số lượng
của phân tử được đo. Tuy nhiên, để tích hợp, chiều cao cực đại có thể được khuyến nghị trong một số trường hợp (Bicking, 2006). trong khi Meyer (1995)
chứng minh rằng độ cao là lựa chọn an toàn hơn trong việc đo các đỉnh nhỏ chồng lên nhau. Hơn nữa, sai số tích phân đối với các phép đo chiều cao trong
hầu hết mọi tình huống đều nhỏ hơn so với các phép đo diện tích tương ứng. Một thiếu sót của việc sử dụng chiều cao pic là chiều cao là một hàm của độ
rộng pic, làm cho điều này phụ thuộc vào hiệu suất của cột chứ không phải số lượng của phân tử được đo. Tuy nhiên, để tích hợp, chiều cao cực đại có thể
được khuyến nghị trong một số trường hợp (Bicking, 2006). trong khi Meyer (1995) chứng minh rằng độ cao là lựa chọn an toàn hơn trong việc đo các đỉnh
nhỏ chồng lên nhau. Hơn nữa, sai số tích phân đối với các phép đo chiều cao trong hầu hết mọi tình huống đều nhỏ hơn so với các phép đo diện tích tương
ứng. Một thiếu sót của việc sử dụng chiều cao pic là chiều cao là một hàm của độ rộng pic, làm cho điều này phụ thuộc vào hiệu suất của cột chứ không phải
số lượng của phân tử được đo. Tuy nhiên, để tích hợp, chiều cao cực đại có thể được khuyến nghị trong một số trường hợp (Bicking, 2006).
37
Nghiên cứu về các hợp chất tiền sinh học và vi khuẩn sinh học đã hoạt động trong hơn một thập
kỷ. Probiotic là “một thành phần thực phẩm vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe” (Salminen et al.,
1998). Các ảnh hưởng sức khỏe liên quan đến việc sử dụng men vi sinh bao gồm: làm giảm các
triệu chứng kém hấp thu đường sữa, cải thiện sức đề kháng tự nhiên đối với các bệnh truyền
nhiễm ở đường tiêu hóa, ức chế ung thư, giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, cải thiện
tiêu hóa và kích thích miễn dịch đường tiêu hóa (Collins và Gibson, 1999 ).
Các hợp chất prebiotic được nhắm mục tiêu để kích thích sự phát triển của
bifidobacteria và lactobacilli được công nhận là men vi sinh tăng cường sức khỏe
(Gibson và Roberfroid, 1995). Gibson và cộng sự. (2004) đã đưa ra định nghĩa mới
nhất về hợp chất prebiotic: "Prebiotic là một thành phần lên men có chọn lọc cho
phép những thay đổi cụ thể, cả về thành phần và/hoặc hoạt động trong hệ vi sinh
vật đường tiêu hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và sức khỏe của vật chủ." Do đó,
để đánh giá các đặc tính tiền sinh học của các hợp chất khác nhau, ba tiêu chí đã
được thiết lập bởi Gibson et al. (2004): 1) Một hợp chất prebiotic nên chống lại axit
dạ dày,
Đường tiêu hóa của con người (GIT) là một hệ vi mô trong đó vi khuẩn có lợi, có khả năng gây
bệnh và có hại cùng tồn tại. Các chức năng sinh lý bình thường được kích hoạt, trừ khi vi khuẩn có
hại và có khả năng gây bệnh chiếm ưu thế. Do đó, việc duy trì trạng thái cân bằng hợp lý của hệ vi
sinh vật là rất quan trọng và có thể được hỗ trợ bằng cách sử dụng men vi sinh, prebiotic hoặc sự
kết hợp của chúng, synbiotic, trong chế độ ăn uống (Bielecta và cộng sự, 2002).
38
Fructo-oligosacarit, galacto-oligosacarit và lactulose được lên men có chọn lọc bởi men vi
sinh và do đó có thể được gọi là prebiotic (Gibson et al., 2004). Ngoài ra, tiềm năng tiền sinh
học của một số oligosacarit khác đã được thử nghiệm. Ví dụ, xylo-oligosacarit tuyến tính đã
cho thấy kết quả đầy hứa hẹn trongtrong ống nghiệmVàtrong cơ thể sốngnghiên cứu
(Okazaki và cộng sự, 1990; Crittenden và Playne, 1996; Vázquez và cộng sự, 2000). XOS được
báo cáo là ổn định trong một loạt các giá trị pH (2,5-8,0) và khó tiêu hóa trong đường tiêu
hóa (Vázquez et al., 2000). Tuy nhiên, oligosacarit tuyến tính có thể được lên men nhanh
chóng trong ruột kết và do đó oligosacarit có cấu trúc carbohydrate phức tạp hơn hiện đang
được nghiên cứu để tìm ra prebiotic lên men chậm hơn (Voragen, 1998; Kabel et al., 2002b).
Hơn nữa, chưa có bằng chứng nào cho thấy XOS kích thích chọn lọc sự phát triển của vi
Grootaert và cộng sự. (2009) đã đánh giá tác dụng prebiotic của chế phẩm AXOS với DP trung bình là 15
và tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27. Một mô hình về hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột của con người đã được sử dụng
và sự thay đổi một phần của quá trình lên men đường đối với phần xa của đại tràng đã được quan sát
thấy khi bổ sung AXOS. AXOS cũng có tác dụng kích thích propionate mạnh
39
tác dụng. Ngoài ra, AX được xử lý trước bằng xylanase (không đặc trưng) đã kích thích vi khuẩn bifidobacteria ở
ruột kết trong mô hình đường ruột của con người (Vardakou et al., 2007).
Chỉ có một vàitrong cơ thể sốngnghiên cứu lên men trên AXOS có thể được tìm thấy trong
tài liệu. Van Crayeveld và cộng sự. (2008) đã đánh giá tiềm năng tiền sinh học của AXOS có
nguồn gốc từ cám lúa mì liên quan đến cấu trúc của chúng ở chuột. AXOS và XOS với DP 3
dẫn đến tăng nồng độ axetat và butyric trong đại tràng và tăng lượng vi khuẩn
bifidobacteria. Mặt khác, AXOS với DP trung bình là 61 đã ức chế hiệu quả nồng độ axit béo
chuỗi ngắn phân nhánh, do đó làm thay đổi sự cân bằng khỏi quá trình lên men protein,
nhưng AXOS chuỗi dài không làm tăng nồng độ butyrate hoặc kích thích sự phát triển của vi
khuẩn bifidobacteria trong phân. AXOS với DP là 12, tỷ lệ Ara/Xyl là 0,69 và AXOS với DP là
15, tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27 cũng bị ảnh hưởng tương tự, cho thấy ảnh hưởng của DP rõ rệt hơn.
Hiệu quả sức khỏe đường ruột tốt nhất thu được với AXOS của DP 5 và tỷ lệ Ara/Xyl là 0,27.
Cloetens et al. (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm AXOS được sản xuất từ lúa
mì đối với quá trình chuyển hóa ruột kết ở người tình nguyện. Kết quả từ nghiên cứu cho
thấy rằng liều tối thiểu 2,2 g AXOS (DP 15, tỷ lệ Ara/Xyl 0,26) điều chỉnh thuận lợi quá trình
chuyển hóa ruột kết ở người khỏe mạnh. Tuy nhiên, các nghiên cứu dài hạn vẫn được yêu
2.5.3 Sản xuất SCFA trong quá trình lên men prebiotic
Quá trình lên men của các oligosacarit ngắn (prebiotic) trong ruột già bởi vi khuẩn đại tràng,
ngoài sự phát triển của vi sinh vật, còn dẫn đến việc sản xuất CO22, H2, SCFA và lactate. SCFA
và lactate có thể được chuyển hóa hơn nữa để cung cấp năng lượng cho vật chủ. Ngoài ra,
nhiều tác dụng đối với sức khỏe đã được báo cáo đối với SCFA, chẳng hạn như cải thiện chức
năng ruột, hấp thụ canxi, chuyển hóa lipid và giảm nguy cơ ung thư ruột kết (Scheppach et
al., 2001; Scharlau et al., 2009). Việc sản xuất SCFA không phân nhánh (acetate, propionate
và butyrate) là mong muốn, vì chúng có thể làm giảm độ pH trong ruột và ức chế sự phát
triển của vi khuẩn có hại (Campbell et al., 1997a; Wong et al., 2006) . Butyrate đặc biệt có khả
năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô ruột kết trongtrong ống nghiệmVà
trong cơ thể sốngthí nghiệm. Sự hình thành axit butyric trong quá trình lên men ở ruột kết
dường như cũng tương quan với đặc tính ức chế ung thư của chất xơ (Scheppach et al.,
1995; Wollowski et al., 2001). Một số tác giả cho rằng butyrate
40
cũng có thể được sản xuất từ lactate bởi một số vi khuẩn đường ruột (Duncan et al., 2004).
Ngược lại, nồng độ của SCFA phân nhánh (isobutyrate, isovalerate) nên được giảm xuống, vì
chúng được hình thành trong quá trình dị hóa protein thành các chất dị hóa có khả năng gây độc
liên quan đến ung thư ruột (Visek, 1978; Van Craeyveld và cộng sự, 2008). Probiotic trong một số
trường hợp có thể ngăn chặn quá trình lên men protein trong ruột kết (De Preter et al., 2004).
Hệ vi sinh vật đường ruột đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe và phòng
ngừa bệnh tật, điều này đã được công nhận rõ ràng (Holzapfel và Schillinger, 2002). Trong
đường tiêu hóa có hơn 400 loài vi khuẩn, trong đó vi khuẩn axit lactic chiếm khoảng 10%. kỵ
khí gram dươngvi khuẩn,Vi khuẩn, Và Bifidobacteriumloài chiếm ưu thế trong ruột già,
nhưng cũng có những nhóm quan trọng khác như clostridia và lactobacilli (Kontula et al.,
2000; Holzapfel và Schillinger, 2002). Sự hiện diện của bifidobacteria trong đường tiêu hóa
có liên quan đến những ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe (Modler, 1994). Sự phát triển của
những vi khuẩn này có liên quan đến khả năng sản xuất protein của chúng, chẳng hạn như
các enzym thủy phân ngoại bào và nội bào, cũng như các chất vận chuyển mono và
oligosacarit tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrate không tiêu hóa được (van den
Trình tự bộ gen củaB. longumNCC 2705 vàB. vị thành niênATCC 15703 đã tiết lộ hàm
lượng protein cao liên quan đến việc sử dụng các polysacarit và oligosacarit không tiêu
hóa, bao gồm cả --D-xylosidase và -L-arabinofuranosidase giả định để phân hủy AXOS
(Schell et al., 2002; van den Broek et al., 2008 ). Cho đến nay, bifidobacteria không được
biết đến ở mức độ protein để sản xuấtkết thúc-1,4---D-xylanase, nhưng một gen mã
hóa xylanase giả định (họ GH 8) đã được phân lập (van den Broek et al., 2005). Do đó,
các vi sinh vật khác trong đường tiêu hóa là cần thiết cho quá trình thủy phân AX
polyme không tiêu hóa thành oligosacarit. Các enzyme chính để sử dụng AXOS là
- - L-arabinofuranosidase.Bifidobacterium vị thành niênATCC 15703 chứa các gen cho
hai hoạt động xylan cao phân tử ngoại bào -L-arabinofuranosidase: AXH-m (họ GH
41
51) và AXH-d3 (GH family 43), có khả năng phát hành -L-Araftừ mono- và thay thế kép --
D-XylPtương ứng (van Laere và cộng sự, 1999; van den Broek và cộng sự, 2005, 2008).
Đáng ngạc nhiên, cácB. longumCác gen NCC 2705 được chú thích trong các họ GH43 và
GH51 đã không tiết lộ sự tương đồng đáng kể với -L-arabinofuranosidase ngoại bào
hiện được biết đến (van den Broek et al., 2008), mặc dù một sốB. longumcác chủng có
thể phát triển trên arabinoxylan lúa mạch đen, có lẽ bằng cách giải phóng và chuyển
hóa -L-Arafnhóm thế (Crittenden et al., 2002). Thật vậy, nhiều người khácB. longumcác
chủng rõ ràng có họ GH 51 -L-arabinofuranosidase (Gueimonde et al., 2007). Trình tự
bộ gen củaClostridiumVàLactobacilluscác chủng cho đến nay không tiết lộ enzyme nào
trong họ GH 43 và 51 có chứa -L-arabinofuranosidase và
- - xylosidase (van den Broek et al., 2008), điều này tiếp tục chỉ ra tiềm năng sử dụng AXOS
làm oligosacarit tiền sinh học với tính chọn lọc của vi khuẩn bifido.
Mặc dù có một số nghiên cứu cho thấy rằng AXOS và đặc biệt là các sản phẩm thủy phân AX khác
nhau là các prebiotic tiềm năng (Grootaert và cộng sự, 2007; Vardakou và cộng sự, 2008), vẫn còn
thiếu thông tin về ảnh hưởng của cấu trúc phân tử của AXOS tiền sinh học giả định. về sự phát
triển của lợi khuẩn bifidobacteria. Bảng 4 tóm tắt sự phát triển của một số chủng vi khuẩn
bifidobacteria trên các chất nền L-arabinose, D-xylose, XOS, AXOS và (arabino)xylan. Thông
thường, sự tăng trưởng được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD) và phát hiện quá
trình sản xuất SCFA trong các mẫu lên men. HPAEC-PAD cũng được sử dụng trong một số nghiên
cứu để xác định việc sử dụng carbohydrate (Crittenden và cộng sự, 2002; van Laere và cộng sự,
Bảng 4.Sự phát triển của các chủng vi khuẩn bifido khác nhau trên L-arabinose, D-xylose, xylo-oligosaccharides (XOS), arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) và
(arabino)xylan. + = tăng trưởng, - = không tăng trưởng, nôm na = không phân tích.
Cơ chất
sinh vật Thẩm quyền giải quyết
L-arabinose D-xylose XOS AXOS (tiếng Ả Rập)xylan
B. vị thành niênMã ATCC 15703 - - na na na Roy và Ward, 1990 van Laere
B. bifidumF-35b - - na + na
B. breveATCC 15700 - - na na na Roy và Ward, 1990 van Laere
Cơ chất
sinh vật Thẩm quyền giải quyết
L-arabinose D-xylose XOS AXOS (tiếng Ả Rập)xylan
B. galicumATCC 49850 na + + na + Palframan và cộng sự, 2003
Mục đích tổng thể của luận án này là điều chế và tinh chế các arabinoxylooligosacarit chuỗi ngắn
khác nhau (AXOS) từ arabinoxylans ngũ cốc (AX) và làm sáng tỏ các cấu trúc cũng như nghiên cứu
tiềm năng tiền sinh học của AXOS được sản xuất. Hoạt động của enzyme trên AX đã được nghiên
cứu thông qua AXOS được tạo ra trong quá trình thủy phân và các nghiên cứu cũng được thực
hiện để thu thập thông tin về hoạt động của các AXOS khác nhau về cấu trúc trong sắc ký.
- Để điều chế AXOS chuỗi ngắn bằng enzym và tách chúng ra khỏi các sản phẩm thủy phân
- Để phân tích đầy đủ các cấu trúc của AXOS tinh khiết (TÔI-III)
- Đánh giá chức năng của Shearzyme sử dụng trong quá trình thủy phân bằng enzym (TÔI-III)
- Để chỉ định thứ tự rửa giải của AXOS và xác định phản hồi của các AXOS khác nhau trên hệ
- Xác định cấu trúc của một số AX ngũ cốc khác nhau (I-III) và sự xuất hiện của --
D-XylP-(1-2)---L-Araf-(1-3) chuỗi bên trong chúng (III)
- Nghiên cứu tiềm năng tiền sinh học của AXOS trongtrong ống nghiệmnghiên cứu, và đặc biệt là
để kiểm tra ảnh hưởng của --L-Ara cụ thểfthay thế trên sự phát triển của bifidobacteria (IV.)
45
Phần này tổng hợp các tài liệu và phương pháp được trình bày chi tiết hơn trong các
bài gốcI-IV.
4.1.1 Cacbohydrat
Các arabinoxylan được sử dụng trong nghiên cứuI-IVđược liệt kê trong Bảng 5. Một số AX được
sử dụng đã được mua và một số ít được làm quà tặng. AX còn lại được chiết xuất từ các mẫu
ngũ cốc khác nhau. AX được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để điều chế AXOS (I-IV) và trong
trong ống nghiệmNghiên cứu quá trình lên men (IV.) để sản xuất chất nền.
(TLC) và phân tích HPAEC-PAD (I-IV). Các monosacarit trước đây cũng được sử dụng làm chất
chuẩn trong phân tích sắc ký khí (GC) (I-III). XOS từ Wako Pure Chemical Industries (Osaka,
Nhật Bản), FOS từ BioCare (Birmingham, Vương quốc Anh) và monosacarit (arabinose và
xyloza) đã được sử dụng trong các nghiên cứu lên men (V).
4.1.2 Enzym
endo-1,4---D-xylanase là enzyme chính (49 100 nkat/ml), được sử dụng để điều chế AXOS
chuỗi ngắn từ AX (I-IV). Shearzyme 500 L được lấy từ Novozymes A/S. Các enzym tinh chế
được sử dụng để tạo ra các AXOS khác nhau từ AX và để đánh giá cấu trúc của các AXOS
được tạo thành bằng các phương pháp có sự hỗ trợ của enzym (I-IV). Các enzyme tinh khiết
Bảng 6.Enzyme tinh khiết được sử dụng trong các nghiên cứuI-III.
tinh khiết EC GH Hoạt động
sinh vật Nguồn Học
enzym Con số Gia đình (nkat/ml)
AXH-m
Aspergillus niger 3.2.1.55 54* 6970 Megazyme TÔI
(E-AFASE)
AXH-d3 Bifidobacterium
3.2.1.55 43 3340 Megazyme II
(E-AFAM2) vị thành niên
XH-m không xác định 3.2.1.55 14590 Novozyme II,III
- - xylosidaza Trichoderma reesei 3.2.1.37 3 2340 VTT TÔI
endoxylanaza Aspergillus oryzae 3.2.1.8 10* 1850 VTT TÔI
endoxylanaza Aspergillus aculeatus 3.2.1.8 10 121530 Novozyme TÔI
exoxylanaza Trichoderma reesei 3.2.1.156 5 9,7† VTT II
* Thuộc về một số gia đình GH, dựa trên hành động của họ;†= mg đạm/ml
AXH-m và AHX-d3 là --L-arabinofuranosidase (Bảng 6); AXH-m hoạt động trên cả hai
Ara liên kết (1-2)- và (1-3)fđơn vị trên monosubstituting --D-XylPdư lượng, trong khi AXH-
d3 chỉ có thể phát hành liên kết (1-3) -- L-Arafcác đơn vị từ bị loại bỏ --D-XylP
dư lượng. --Xylosidaza (exo-1,4---D-xylosidase) thủy phân chuỗi xyloza từ
đầu không khử, và xylanase (kết thúc-1,4---D-xylanase) hoạt động ở giữa chuỗi
xyloza. Họ GH 5 xylanase là một exoenzyme giải phóng các đơn vị xyloza từ đầu
khử của chuỗi xyloza.
47
Các chủng vi khuẩn thuần sử dụng trong nghiên cứuIV.đã từngB. vị thành niênATCC 15703
(DSM 20083),B. breveATCC 15700 (DSM 20213) vàB. longumATCC 15707 (DSM 20219) được
mua từ DSMZ (Braunsweig, Đức). Đối với các nghiên cứu về quá trình lên men của hệ vi sinh
vật trong phân, các mẫu phân người được lấy từ một người hiến tặng khỏe mạnh trong bốn
lần. Các mẫu phân được trộn trong dung dịch đệm PBS 0,1 M kỵ khí đã khử trùng (nước
muối đệm phốt phát). Tất cả các vi khuẩn (các chủng bifidobacteria thuần túy và vi khuẩn từ
hệ vi sinh vật trong phân) được nuôi cấy kỵ khí trong môi trường BA nghèo dinh dưỡng
được mô tả bởi Angelidaki et al. (1990) với sự sửa đổi rằng chiết xuất nấm men (1 g/l; Merck)
đã được thêm vào môi trường. Dung dịch vitamin được chuẩn bị theo Wolin et al. (1963) và
Các arabinoxylan được mua hoặc thu được ở dạng tinh khiết hoặc được chiết xuất từ các nguyên
liệu ngũ cốc khác nhau trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (Bảng 5). Rìu (III) được chiết xuất từ
lúa mạch đen, lúa mì và cám yến mạch và trấu với Ba(OH) bão hòa2sau khi tiền xử lý bằng enzyme
bằng phương pháp được Virkki et al. (2005). Vỏ lúa mạch AX trước đây đã được chiết xuất bởi
Để đánh giá thành phần monosacarit và tính tỷ lệ Ara/Xyl của AX cao phân tử được phân lập,
hai phương pháp khác nhau đã được sử dụng để phân giải AX thành monosacarit: 1) axit
sunfuric (H2VÌ THẾ4) thủy phân (TÔI) và 2) metanol hóa bằng axit (III). Điều kiện thủy phân
để phân hủy AX bằng H2VÌ THẾ4đã được chọn trong các bài kiểm tra sơ bộ (kết quả không
Bột lúa mạch đen AX được thủy phân bằng 1 MH2VÌ THẾ4trong 30 phút ở 120oC (TÔI). các H2VÌ THẾ4
phương pháp đã được sửa đổi từ phương pháp được sử dụng bởi Lebet et al. (1997). Quá
trình thủy phân được thực hiện song song với bốn mẫu. Sau khi thủy phân, pH được điều
chỉnh đến 7-9 bằng NaOH 10 M. Các chất chuẩn (25 mg/ml) D-xylose, L-arabinose và D-
glucose, được xử lý giống như các mẫu AX. Độ pha loãng cho các mẫu đường chuẩn được
tạo ra từ các dung dịch monosacarit này. Phương pháp HPAEC-PAD để phân tích
Cám lúa mì, lúa mạch đen và yến mạch AX, trấu gạo và lúa mạch AX, yến mạch đánh vần AX và
rơm lúa mì AX được phân hủy thành monosacarit bằng phương pháp metanol hóa axit (III) như
được mô tả bởi Sundberg et al. (1996). AXOS cũng bị phân hủy thành monosacarit, sử dụng
phương pháp metanol hóa axit (III). Các monosacarit silyl hóa được phân tích với GC (phần
4.2.6.3). Các tiêu chuẩn monosacarit cũng được xử lý bằng phương pháp metanol hóa axit.
AXOS được sản xuất theo phương pháp enzym từ AX được chiết xuất ở quy mô chuẩn bị.
Enzyme thương mại Shearzyme được sử dụng để thủy phân chuỗi chính AX tuyến tính (I-III).
AX (5 g/l; 1,5 g bột lúa mạch đen AX (TÔI) hoặc 1,5 g bột mì AX (II) hoặc 5 g yến mạch đánh
vần AX (III)) trong dung dịch đệm natri axetat (NaOAc) 20 mM, pH 5,0, được ủ với
Shearzyme (10 000 nkat/g AX (tôi, tôi) và 50 000 nkat/g AX (III)) ở tuổi 40oC trong 48 giờ. Các
enzyme được sử dụng từng bước để sản xuất AXOS (II). Mẫu thay thế của AX lần đầu tiên
được sửa đổi bằng cách sử dụng --arabinofuranosidase AXH-m (5000 nkat/g AX ở 40oC trong
24 giờ, pH 5), sau đó xử lý bằng Shearzyme. Một số L-Arafnhóm thế tiếp tục được loại bỏ
bằng xử lý AXH-d3 (1000 nkat/g AX ở 40oC trong 24 giờ, pH 6,5). Tất cả quá trình thủy phân
được chấm dứt bằng cách giữ các mẫu trong bể nước sôi trong 10 phút. Sau khi xử lý bằng
enzyme, các sản phẩm thủy phân được tách ra (TÔI-III) theo Hình 4.
49
CÂY RÌU
monosacarit
XOS
AXOS
MeGlcA- và GlcA-XOS
tách bằng
sắc ký trao đổi anion - MeGlcA- và GlcA-XOS
Cột Dowex 1 x 2
tách bằng
sắc ký thẩm thấu gel
Cột biogel P-2
Để chuẩn bị phân tách AXOS và các phân tử tích điện (MeGlcA- hoặc GlcA-XOS), yến
mạch đánh vần là AX (III) (5 g/l) được xử lý bằng Shearzyme. Các phân tử tích điện
được tách ra khỏi AXOS trung tính bằng sắc ký trao đổi anion (AEC) với cột Dowex 1x2
(2,8 x 12 cm; Fluka Chemicals, Buchs, Thụy Sĩ) sử dụng milli-Q-water (2,5 ml/phút)
(Millipore Corp. , Billerica, MA, USA) làm chất rửa giải cho các phân tử trung tính và
NaOAc 0,5 và 2 M (pH 7,8) làm chất rửa giải cho các anion. Mẫu (835 ml, chia thành hai
mẻ) được đưa vào cột AEC và rửa giải bằng nước cho đến khi kết thúc quá trình rửa giải
của đường trung tính, được kiểm tra trên các bản TLC mỏng. Sau khi rửa giải các loại
đường trung tính, các phân tử tích điện được rửa giải khỏi cột, sử dụng NaOAc.
50
Để chuẩn bị phân lập AXOS, bột lúa mạch đen AX (TÔI), bột mì AX (II) và oat đánh vần
là AX (III) (5 g/l) được xử lý bằng Shearzyme. AEC đã được sử dụng cho mẫu thủy phân
AX đánh vần bằng yến mạch (III) để tách MeGlA- và GlCA-XOS khỏi cacbohydrat trung
tính trước khi thực hiện sắc ký thẩm thấu gel (GPC). Đối với GPC, mỗi mẫu thủy phân
được cô đến thể tích 40-50 ml bằng hơi quay. AXOS được phân tách bằng cột Biogel P2
(8,9 x 135 cm, BioRad, Hercules, CA, USA) rửa giải bằng milli-Q-water với tốc độ 10 ml/
phút và các phần 27 ml được thu thập (TÔI,II). Một vài phần 5 ml được thu thập sau khi
tách AXOS bằng cột Biogel P2 nhỏ hơn (5 x 95 cm; Bio-Rad), sử dụng milli-Q-water (2
ml/phút) làm chất rửa giải (III). Mono- và oligosacarit được phát hiện từ các phân số với
TLC và HPAEC-PAD (I-III).
Các AXOS đã phân lập được thủy phân thành monosacarit với --L-arabinofuranosidase
(AXH-m; 5000 nkat/g chất nền) và --xylosidase (1000 nkat/g chất nền) trong 24 giờ ở 40
oC trong dung dịch đệm NaOAc 20 mM, pH 5,0 (TÔI). Hỗn hợp enzym (II) đã được sử dụng
để thủy phân hoàn toàn AXOS thành monosacarit, như được mô tả bởi Virkki et al. (2008).
Hỗn hợp enzym được sử dụng được định lượng theo hoạt tính -L-arabinofuranosidase (1000
nkat/g AX), được coi là hoạt tính enzym giới hạn trong hỗn hợp. Phương pháp metanol hóa
bằng axit đã được sử dụng (III) để giảm cấp AXOS, như được mô tả ở trên đối với giảm cấp
AX. Sau khi xử lý phân hủy AXOS tinh khiết, trước tiên, các mẫu được phân tích bằng phương
pháp HPAEC-PAD đối với oligosacarit để kiểm tra tính hoàn chỉnh của quá trình thủy phân.
Sau đó, các monosacarit được phân tích bằng phương pháp HPAEC-PAD đối với monosacarit
Tỷ lệ Ara/Xyl được xác định từ kết quả phân tích HPAEC-PAD hoặc GC. Nồng độ của
AXOS đã được tính toán, dựa trên sản lượng monosacarit và cấu trúc AXOS đã biết.
Sau khi định lượng mẫu AXOS, pha loãng cho các mẫu đường cong chuẩn được
thực hiện từ mẫu đã định lượng. Các đường cong chuẩn AXOS đã được sử dụng
muộn để định lượng AXOS tương ứng từ các mẫu khác.
51
TLC, HPAEC-PAD và GC được sử dụng để phân tách các mono-, di- và oligosacarit khác
nhau. Hơn nữa, sau khi phân tích cấu trúc hoàn chỉnh trên phép đo phổ khối phổ (MS)
và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), các phương pháp sắc ký đã được sử dụng để xác
định các hợp chất khác nhau dựa trên thời gian lưu của chúng trong HPAEC-PAD hoặc
hệ số lưu (Rf) trên TLC.
4.2.6.1 TLC
TLC được thực hiện (I-III), sử dụng silica gel 60 tấm (Merck). Hỗn hợp 1-butanol/etanol/
nước (3:2:2 v/v) được sử dụng làm chất rửa giải. Các carbohydrate được phát hiện bằng
cách phun 2% (w/v) orsinol hòa tan trong dung dịch ethanol/H2VÌ THẾ4/H2O (80:10:10
vol%), sau đó các tấm được làm nóng ở 105 ° C trong 10 phút.
4.2.6.2 HPAEC-PAD
HPAEC-PAD được sử dụng để phân tích mono- và oligosacarit sau quá trình thủy phân AX
bằng enzym hoặc axit (I-IV), để xác định và định lượng AXOS tinh khiết (I-III), và để so sánh
carbohydrate trước và sau thí nghiệm lên men (IV.). Đối với monosacarit HPAEC-PAD chỉ
được sử dụng trongTÔI,vì trong các nghiên cứu sau này, các monosacarit được phân tích
bằng GC. Đối với oligosacarit, phương pháp HPAEC-PAD là vô giá và đã được sử dụng trong
Hệ thống HPAEC-PAD được trang bị bộ cân bằng xung SSI (Scientific Systems, Inc.,
model LP 21; State College, PA, USA), hai máy bơm HPLC Waters 515, mô-đun điều
khiển máy bơm PC Waters và bộ lấy mẫu tự động Waters 717 làm mát bằng cách sử
dụng thiên niên kỷ32phần mềm (Waters Corporation, Milford, MA, USA) để điều khiển
thiết bị và xử lý dữ liệu. Máy phân tích CarboPac PA-1 (TÔI) và CarboPac PA-100 (I-IV)
cột (250 x 4 mm, id) và cột bảo vệ PA-1 (TÔI) và PA-100 (I-IV), tương ứng, (25 x 3 mm,
id) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) được duy trì ở 30oC. Tất cả các mẫu được lọc, sử dụng
bộ lọc ống tiêm Acrodisc® 0,45 m với màng nylon (Pall Corporation, Ann
Arbor, MI, USA) và thể tích tiêm thường là 10 l trong các phép đo.
52
Các pha động được lọc bằng màng lọc Polypro 0,45 m GH (Pall Corporation) và khử khí
bằng helium. Dung dịch rửa giải để phân tích gradient của oligosacarit (I-IV) là A: 1 M
NaOAc trong 100 mM NaOH và B: 100 mM NaOH và tổng thời gian phân tích là 50
phút. Đối với các monosacarit, dung dịch rửa giải được sử dụng để phân tích gradient (
TÔI) là A: H2O và B: 50 mM NaOH và tổng thời gian phân tích là 45 phút. Phương pháp
monosacarit đã được sửa đổi từ phương pháp của Johansson et al. (2006). Độ dốc và
tốc độ dòng chảy của các phương pháp được mô tả trong Bảng 7. Trong cả hai phương
pháp oligo và monosacarit, máy dò Decade với điện cực vàng (Antec Leyden,
Zoeterwoude, Hà Lan) được sử dụng ở chế độ xung ở 30oC. Điện thế xung và thời
lượng là: E1= 0,15 V, t1= 400 ms, E2= 0,75 V, t2= 120 ms, E3= -0,8 V, t3= 130 mili giây, tS=
20 ms.
Bảng 7.Các dải chuyển màu được sử dụng trong các phương pháp HPAEC-PAD để phân tích oligo- và
monosacarit.
Phương pháp HPAEC-PAD cho oligosacarit
Lưu lượng dòng chảy %MỘT %B
Thời gian
(ml/phút) 1 M NaOAc trong 100 mM NaOH 100 mM NaOH
0 1.0 0 100
15 1.0 0 100
35 1.0 12 88
40 1.0 12 88
45 1.0 0 100
50 1.0 0 100
Phương pháp HPAEC-PAD cho monosacarit
Lưu lượng dòng chảy %MỘT %B
h2Ô
Thời gian
(ml/phút) 50 mM NaOH
0 0,7 97 3
21 0,7 97 3
22 1.1 97 3
24 1.1 0 100
30 1.1 0 100
32 1.1 97 3
33 0,7 97 3
45 0,7 97 3
Phương pháp ngoại chuẩn được sử dụng trong phân tích oligosacarit (I-IV). Hỗn hợp xyloza,
xylobiose, xylotriose và xylotetraose được sử dụng làm chất ngoại chuẩn. Tất cả các hợp
chất trong hỗn hợp chuẩn có nồng độ 25 g/ml. Raffinose (50 g/ml) cũng được bổ sung vào
hỗn hợp chuẩn bên ngoài (TÔI)và được sử dụng làm chất chuẩn nội để cho phép định lượng
chính xác bằng cách thêm vào các mẫu trước khi phân tích HPAEC-PAD (TÔI). Đối với
glucose, xyloza (50 g/ml), và fructose và mannose (100 g/ml) đã được sử dụng; một tiêu chuẩn nội
bộ đã không được sử dụng trong phân tích monosacarit (TÔI). Các tiêu chuẩn bên ngoài được
đưa vào sau mỗi ba mẫu trong cả hai phương pháp để theo dõi thời gian lưu và phản ứng phát
hiện.
Để xác định và định lượng các sacarit tương ứng trong các sản phẩm thủy phân (I-
IV) và các mẫu sau khi lên men (IV.), các monosacarit thương mại X2, X3và X4
đã được sử dụng. Xác định và định lượng AXOS (I-IV) đã được thực hiện, sử dụng A thuần
túy3X (I-IV), MỘT2X, MỘT2XX, MỘT2+3X, MỘT2+3XX (II-IV), Đ2,3X (III) (cấu trúc hóa học của
AXOS được trình bày trong phần 5.2, Hình 6). Các đường chuẩn được tạo để định lượng từ
mỗi hợp chất chuẩn với các mẫu trùng lặp hoặc ba lần ở các mức nồng độ 4-6, như được mô
tả trong phần 4.2.4. Chiều cao cực đại (mV) được sử dụng để định lượng carbohydrate. XA3X
và U4m2XX đã được sử dụng làm tiêu chuẩn để nhận dạng (III), và XA3XX để xác định thứ tự
rửa giải của AXOS trong HPAEC-PAD. XA tinh khiết3X và XA3XX thu được từ bột lúa mạch đen
AX được thủy phân bằng GH11T. reesei endo- 1,4---D-xylanaza và U4m2XX từ xylan bạch
Các phương pháp GC đã được sử dụng để phân tích thành phần monosacarit của AX sau quá trình
metanol hóa axit, theo phương pháp của Sundberg et al. (1996) (TÔI,III), và sau khi thủy phân
hoàn toàn AX bằng enzym, sử dụng phương pháp của Virkki et al. (2008) (IV.) (Bảng 8). Các
phương pháp GC cũng được sử dụng để phân tích các monosacarit sau khi phân hủy AXOS (II, III).
Các monosacarit thu được bằng quá trình metanol hóa bằng axit được silyl hóa và sorbitol được
sử dụng làm chất nội chuẩn. Các monosacarit thu được từ quá trình thủy phân bằng enzym đã bị
khử và acetyl hóa, và myoinositol được sử dụng làm chất nội chuẩn. Các dẫn xuất monosacarit
sau đó được phân tích với GC, sử dụng một trong ba phương pháp được trình bày trong Bảng 8.
Định lượng được thực hiện, sử dụng sáu mức nồng độ của từng loại đường (arabinose, xyloza và
glucose) và tất cả các mẫu và chất chuẩn được phân tích hai lần hoặc ba lần .
54
Bảng 8.Tóm tắt các phương pháp GC được sử dụng trong phân tích thành phần
monosacarit của AX và AXOS (I-III).
TÔI II III
phân hủy mẫu metanol hóa axit thủy phân enzyme metanol hóa axit
phương pháp (Sundberg và cộng sự, (Virkki và cộng sự, 2008) (Sundberg và cộng sự,
1996) 1996)
Đường đơn silyl hóa Acetyl hóa silyl hóa
tiền xử lý
dụng cụ GC hewlett Packard hewlett Packard nhanh nhẹn 6890N
hệ thống hệ thống
(Hewlett Packard)
Cột HP-5 (30 m, id HP-5 (30 m, id 0,32 DB-1 (30 m, id
0,32 mm, độ dày mm, độ dày màng 0,25 mm, độ dày
màng 0,25 m; 0,25 m; Agilent màng 0,25 m;
nhanh nhẹn công nghệ) nhanh nhẹn
Axit béo dễ bay hơi (VFA) được phân tích với GC (IV.). Trước khi định lượng VFA, các
mẫu được axit hóa đến pH < 2 bằng axit photphoric 17% (H3PO4) và sau đó được phân
tích bằng GC (Hewlett Packard 5890 sê-ri II; Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA) với
đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) và cột mao quản (Hewlett Packard FFAP 30 m,
55
đường kính trong 0,53 mm, phim 1 m). Nhiệt độ của kim phun và máy dò là 175oC
và 200oC, tương ứng. Độ dốc nhiệt độ như sau: nhiệt độ ban đầu là 110oC, tăng
dần ở 5oC/phút đến 140oC, duy trì ở 140oC trong 6 phút, tăng tốc ở 45oC/phút đến
200oC và duy trì ở 200oC trong 3 phút. Thể tích tiêm của mẫu là 10 l. VFA đã định
lượng được phân tích dưới dạng axit: axit axetic, propionic, isobutyric, butyric,
isovaleric và valeric. Các tiêu chuẩn được sử dụng trong phân tích VFA là các axit
giống như đã đề cập ở trên với nồng độ 1-40 m . Sau đó, các hợp chất này được
gọi là VFA mặc dù chúng xuất hiện dưới dạng các anion axit (acetate, propionate,
isobutyrate, butyrate, isovalerate và valerate) ở pH sinh lý.
Các phương pháp sắc ký cung cấp thông tin sơ bộ về kích thước AXOS và thành phần
monosacarit, và do đó là một phần của việc làm sáng tỏ cấu trúc. Các phương pháp hỗ trợ
enzyme cũng được sử dụng để làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS. Sử dụng quá trình thủy phân
một phần bằng enzym, đã thu được thêm thông tin về cấu trúc của AXOS tinh khiết. Các --
Arafcác nhóm phụ đã bị loại bỏ, sử dụng --arabinofuranosidase, cho biết độ dài của
chuỗi chính xyloza trong phân tích TLC hoặc HPAEC-PAD sau đây (III). AXOS được thủy
phân hoàn toàn thành monosacarit, sử dụng kết hợp --xylosidase và --
arabinofuranosidase, và tỷ lệ Ara/Xyl được xác định bằng phân tích GC hoặc HPAEC-
PAD (TÔI,II). Quang phổ MS và NMR đã được sử dụng để phân tích cấu trúc hoàn chỉnh
của AXOS. Các bước phân tích được thực hiện để mô tả đầy đủ cấu trúc của AXOS được
trình bày trong Hình 5.
56
phân tích GC
MS đã được sử dụng trong phân tích cấu trúc của AXOS tinh khiết (I-III). Phân tích phép đo
phổ khối thời gian bay/thời gian ion hóa bằng laser được hỗ trợ bởi ma trận (MALDI-TOF-
MS) (tôi, tôi) đã được thực hiện, sử dụng thiết bị Ultraflex (Bruker Daltonics, Wormer, Hà
Lan) được trang bị laser nitơ ở bước sóng 337nm. Máy quang phổ khối được chọn cho các
ion dương, được gia tốc tới động năng 12 000 V sau thời gian chiết chậm 200 ns. Sau đây,
các ion được phát hiện bằng chế độ phản xạ. Công suất laser thấp nhất cần thiết để thu
được quang phổ tốt đã được sử dụng và ít nhất 100 quang phổ đã được thu thập. Máy
quang phổ khối được hiệu chuẩn bằng hỗn hợp các chất chuẩn maltodextrin (dải khối lượng
365-2309).
Dung dịch ma trận được điều chế bằng cách hòa tan 10 mg axit 2,5-dihydroxybenzoic trong 1 ml
Dung dịch acetonitril-nước 30% (v/v). Các mẫu (1 l) và ma trận (1 l) được hút vào
một tấm MALDI-TOF (Bruker Daltonics) và các hỗn hợp này được để khô dưới
luồng không khí ấm liên tục.
Translated from English to Vietnamese - www.onlinedoctranslator.com
57
Phân tích khối phổ ion hóa Electrospray (ESI-MS) (III) đã được thực hiện, sử dụng
thiết bị sắc ký lỏng/máy dò chọn lọc khối lượng (LC/MSD-Trap-XCT Plus; Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA) ở chế độ ion dương. Mẫu tinh khiết trong axit
formic 0,1% (HCOOH) và rượu isopropyl (IPA), theo tỷ lệ 1:1 (v/v), được bơm trực
tiếp vào máy quang phổ khối, sử dụng bộ lấy mẫu tự động LC và thiết bị được vận
hành mà không cần cột. Khí phun sương là N2và điện áp mao dẫn 3500 V ở 350oC.
Phổ được ghi với dải quét từ 50 đến 1000m/z.
Trước các thí nghiệm NMR, các mẫu được trao đổi ba hoặc bốn lần với đơteri oxit (D2O)
(99,8% D, Merck), được lọc bằng 0,45-m và/hoặc 0,10-m Acrodisc®bộ lọc ống tiêm bằng
màng GHP (Pall Corporation) và cuối cùng được hòa tan trong 40 l (TÔI) hoặc 0,5 ml (II,
III) của D2O. Phổ NMR thu được trên máy quang phổ Varian Unity 500 (Hệ thống Varian
NMR, Palo Alto, CA, USA) hoạt động ở tần số 500 MHz cho
1H. Các phép đo được thực hiện bằng đầu dò gHX nano-NMR (TÔI), hoặc đầu dò gradient
trường xung cộng hưởng ba lần (PFG) 5 mm hoặc tủ đông lạnh 5 mm (TÔI,II). Các phép đo
cho các mẫu polysacarit được thực hiện ở 50 ºC (III) và đối với oligosacarit ở 23 ºC hoặc 25oC
(I-III). Sự dịch chuyển hóa học được báo cáo liên quan đến tiêu chuẩn acetone nội bộ ở mức
2,225 ppm đối với1H (II,III) và 31,55 ppm đối với13C (I-III). Các
1Sự dịch chuyển hóa học H được tham chiếu đến tín hiệu HDO ở mức 4,78 ppm (TÔI).
Một chiều (1D)1Phổ H được tích lũy với độ rộng phổ là 6000 hoặc 8000 Hz và với
thời gian thu được là 2-4 giây. Khi ghi lại quang phổ, một sửa đổi của trình tự biến
đổi Fourier loại bỏ nước (WEFT) đã được sử dụng. Hai chiều (2D)1H-1Tay13C-1Các thí
nghiệm tương quan H là DQF-COSY (quang phổ tương quan được lọc lượng tử
kép), HSQC (tương quan đơn lượng tử hạt nhân), HMQC (tương quan đa lượng tử
hạt nhân) và HMBC (kết nối đa liên kết hạt nhân).
58
Các đặc tính tiền sinh học của AXOS được chuẩn bị trong các nghiên cứu trước đó (TÔI,II) đã được
kiểm chứng (IV.). Các thí nghiệm lên men đã được thực hiện, sử dụng ba chủng vi khuẩn
bifidobacteria tinh khiết khác nhau hoặc hệ vi sinh vật phân hỗn hợp trongtrong ống nghiệmủ với
các loại carbohydrate khác nhau làm chất nền. Carbohydrate được thử nghiệm là: L-arabinose, D-
xylose, XOS, FOS (cơ chất tham chiếu), các chất thủy phân RAX và WAX được điều chế bởi
Shearzyme và A tinh khiết2XX và MỘT2+3XX. RAX và WAX cũng được sử dụng làm chất nền cho quá
trình lên men phân. Các điều kiện của thí nghiệm lên men và các chỉ số sinh trưởng đo được được
Bảng 9.Trong ống nghiệmcác thí nghiệm lên men của AXOS tiền sinh học tiềm năng bằng vi khuẩn
bifidobacteria tinh khiết và hệ vi sinh vật phân hỗn hợp.
Cuộc thí nghiệm Lên men nuôi cấy thuần túy Quá trình lên men của hệ vi sinh vật trong phân
Chủng vi khuẩn Bifidobacterium Teenis B. Các chủng hỗn hợp từ hệ vi sinh vật
breve đường ruột
B. longum
Môi trường tăng trưởng trung bình trung bình
+ Chiết xuất nấm men 1 g/l + Chiết xuất nấm men 1 g/l
+ dung dịch vitamin + dung dịch vitamin
pH ban đầu 7 7
Khối lượng thử nghiệm 3ml 2ml
chất khử - Na2S
ủ 140 giờ (~ 6 ngày) 48 giờ
37oC trong bóng tối, pH không 37oC trong bóng tối, pH không
Tăng trưởng đo được lắc lắc
chỉ số VFA VFA
Tiêu thụ carbohydrate Tiêu thụ carbohydrate
OD H2
Ô nhiễm (kính hiển vi) Áp lực
Khi bắt đầu thời gian ủ và sau 48 giờ, các mẫu 1 ml được lấy từ các mẫu phân (thể
tích thí nghiệm 2 ml) để chiết xuất DNA. Đồng thời, các mẫu 4 ml được lấy từ quá
trình lên men tham chiếu (thể tích thí nghiệm 10 ml; mẫu đối chứng không có
nguồn carbon bổ sung). Các mẫu được ly tâm trong 2 phút ở 10 000 G ở 4oC, sau
đó phần nổi phía trên được loại bỏ và viên lơ lửng trong 1 ml dung dịch đệm PBS
0,01-M, và quá trình xử lý này được lặp lại ba lần. Sau lần thứ ba
59
ly tâm, viên được treo trong dung dịch đệm ASL 1,5 ml (đệm ly giải phân; Qiagen
GmbH, Hilden, Đức) và đập hạt (hạt zirconia/silica 0,1 mm) trong 3 phút, sau đó ly
tâm ở 16 000 G ở 4oC trong 3 phút. Quá trình tinh chế DNA tiếp theo được thực
hiện, theo hướng dẫn của bộ Qiagen về "tinh chế DNA từ các mẫu phân" (Qiagen,
Valencia, CA, USA).
Các gen RNA ribosome 16S (rRNA) của vi khuẩn bifidobacteria được khuếch đại bằng phản ứng
chuỗi polymerase (PCR) bằng cách sử dụng bộ mồi đặc hiệu cho vi khuẩn bifidobacteria. Tổng thể
tích của hỗn hợp PCR là 50 l và chứa nước milli-Q, dung dịch đệm phản ứng, Mg2+(25 mM),
deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) (2 mM), mồi chuyển tiếp (25 pmol/l; TET-
Bifido 144f NF, MWG-Biotech AG, Ebersberg, Đức, 5 -́
CCGGAATAGCTCCTGGAAAC-3 ,́ dựa trên mồi Pbi F1 do Roy mô tả và Sirois (2000),
mồi đảo ngược (25 pmol/l; rP2, MWG-Biotech-AG, 5 -́
ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3´ (Weisburg et al., 1991), albumin huyết thanh bò
(BSA; 2%), polymerase và PCR (iCycler Thermal Cycler; Bio-Rad) được bắt đầu với
bước biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút, sau đó là 30 chu kỳ bao gồm biến tính
ở 94oC trong 30 giây, ủ ở 59oC trong 30 giây, độ giãn dài ở 72oC trong 90 giây và
gia hạn cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Gel agarose (1%) được nạp sản phẩm PCR
và chạy điện di trên gel trong 30 phút ở 80 V (nguồn điện Bio-Rad/PowerPac 300)
và các dải trên gel được hiển thị bằng cách sử dụng Bio-Rad Gel Doc™ Hệ thống tài
liệu năm 2000 (tủ phòng tối, đèn chiếu sáng UV, máy ảnh và phần mềm). Dải chứa
sản phẩm PCR quan tâm đã được tinh chế, sử dụng chiết xuất gel theo quy trình
Gel-Out (Công nghệ sinh học A&A, Gdynia, Ba Lan).
Sau phản ứng PCR, các sản phẩm của gen 16S rRNA được đánh dấu huỳnh quang cuối cùng.
Sản phẩm PCR này (10 l) được phân hủy với 1 l enzyme MboI (10 U/l; Fermentas
International Inc., Burlington, Ontario, Canada) trong 6 giờ ở 37oC, sau đó enzyme bị vô hoạt
ở 65oC trong 20 phút. Các đoạn được dán nhãn được phân tích bằng điện di trong trình sắp
xếp trình tự DNA ABI PRISM 373 ở chế độ Quét gen và kích thước của các đoạn được xác
định, sử dụng các tiêu chuẩn của đoạn DNA (GS-500 ROX và GS-1000 ROX; PE Biosystems,
Foster City, CA, USA ). Các phân tích đa hình chiều dài đoạn giới hạn đầu cuối (t-RFLP) đã
bộ mồi để chứng minh sự thay đổi mật độ trong các mẫu phân do bổ sung
carbohydrate có nguồn gốc từ xylan.
61
5. KẾT QUẢ
5.1 Thành phần cacbohydrat của nguyên liệu ban đầu (I-IV)
Thành phần của monosacarit trung tính của AX được sử dụng đã được xác định (I-IV).
Tỷ lệ Ara/Xyl cao nhất được tìm thấy trong WBAX (0,60) và thấp nhất trong OSAX (0,09)
(Bảng 10). Trong tất cả AX được nghiên cứu chiết xuất từ cám (WBAX, RBAX và OBAX)
và trong hầu hết AX từ bột (RAX, WAX-hv và WAX-mv), tỷ lệ Ara/Xyl tương đối cao, cho
thấy cấu trúc AX có tính thay thế cao. Ngược lại, trong OSAX, RiHAX và WStAX, mức độ
thay thế arabinose thấp đã được phát hiện (tỷ lệ Ara/Xyl 0,09-0,19).
Bảng 10.Thành phần monosacarit trung tính của AX được chiết xuất từ các nguyên liệu ngũ cốc khác
nhau.
Ara Xyl glc
nguồn AX Ara/Xyl Phương pháp Học
(% trọng lượng) (% trọng lượng) (% trọng lượng)
5.2. Cấu trúc của AXOS được điều chế bằng enzyme (I-III)
Sáu AXOS khác nhau đã được điều chế và phân lập (I-III).Các phương pháp tương tự đã được sử
dụng với một số sửa đổi nhỏ trong sản xuất các AXOS khác nhau. Kết quả làm sáng tỏ cấu trúc
của AXOS được thể hiện trong Bảng 11. A3X, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2XX và D2,3X
62
xuất hiện khá thuần khiết, nhưng A2X không được tinh chế hoàn toàn và nó xảy ra
cùng với A2XX. Hỗn hợp A2X và A2XX được điều trị thêm bằngT. reeseiGH5 xylanase giải
phóng một dư lượng xyloza từ đầu khử của A2XX, tạo thành A2X.A2X không bị tách ra
nữa và do đó phân tích để xác định tỷ lệ Ara/Xyl của A2X đã không được thực hiện.
Bảng 11.Làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS tinh khiết được điều chế từ xylan ngũ cốc.
tr mw
Học AXOS Ara/Xyl Rìu chất liệu enzym
(phút)- (Na bổ sung)
TÔI MỘT3X 31,0 437 0,49 RAX Shearzyme
II MỘT2+3X
33,4 569 0,93 WAX-mv AXH-m +
MỘT2+3XX 34,4 701 0,73 Shearzyme
Đ.2,3X
III 30.2 569 0,24 OSAX Shearzyme
-
=trtừ phân tích HPAEC-PAD khác nhau một chút giữa các nghiên cứuI-IIInhưng những báo cáo ở đây được
thông qua từ Hình 9.
†=được phân tích từ hỗn hợp hai AXOS na =
không được phân tích
AXOS được phân tích bằng HPAEC-PAD, từ đó chúng được rửa giải với thời gian lưu khác nhau (tr).
Khối lượng phân tử (Mw) thu được bằng phân tích MS và chúng được trình bày dưới dạng sản
phẩm cộng Na (437 = sản phẩm cộng natri của pentotriose, 569 = sản phẩm cộng natri của
pentotetraose, 701 = sản phẩm cộng natri của pentopentaose). Tỷ lệ Ara/Xyl được xác định, sử
dụng phương pháp thủy phân toàn phần bằng enzym hoặc phương pháp metanol hóa bằng axit
để phân hủy AXOS thành monosacarit được định lượng bằng phương pháp GC. AXOS được
nghiên cứu bao gồm một hoặc hai đơn vị arabinose và hai hoặc ba gốc xyloza. Cuối cùng, cấu trúc
chi tiết của AXOS đã được nghiên cứu, sử dụng quang phổ NMR. Kết quả NMR chi tiết (độ dịch
chuyển hóa học và quang phổ) có thể được tìm thấy trong các nghiên cứuI-III. Cấu trúc của AXOS
được hiển thị trong Hình 6. Ngoài sáu AXOS đã được phân tích đầy đủ, cấu trúc của XA3XX và XA3X
đã được làm sáng tỏ, sử dụng phương pháp hỗ trợ MS và enzyme, nhưng cấu trúc của chúng
Ô
HỒ Ồ
Ồ
Một Ồ đ Ô
CH2OH
HỒ
CH 2O h MỘT3X HỒ Đ.2,3X
Ô Ô Ô
Ô
Ồ
Ô HỒ
Ồ
Ô HỒ
HỒ Ô HỒ Ô Ồ
Ồ Ô
Ồ
Ồ Ô
- - L-Araf-(1-3)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl - - D-XylP-(1-2)---L-Araf-(1-3)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl
b Ồ e Ồ
CH2OH MỘT2+3X CH 2O
h MỘT2+3XX
HỒ HỒ
Ô Ô Ô Ô
Ồ Ồ
Ô HỒ Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ồ
HỒ Ô Ô Ồ
Ô Ô HỒ
Ô Ô Ồ
Ô Ô
Ồ Ồ
HOH2C HOH2C
Ồ Ồ
- - L-Araf-(1-2)-[--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-4)-D-Xyl - - L-Araf-(1-2)-[--L-Araf-(1-3)]---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl
c f
Ồ Ồ
Ô HỒ Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ồ
HỒ Ô Ô Ồ
HỒ
Ô HỒ
Ô HỒ
Ô Ô Ồ
Ô Ô
Ồ MỘT2X Ồ MỘT2XX
HOH2C HOH2C
Ồ Ồ
- - L-Araf-(1-2)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl - - L-Araf-(1-2)---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl
Quá trình tinh chế AXOS được thực hiện ở quy mô chuẩn bị trong đó 1,5 g (TÔI,II) hoặc
5 g (III) của nguyên liệu ban đầu được thủy phân và phân đoạn. Các phần tinh khiết
nhất và cô đặc nhất, được sử dụng để phân tích cấu trúc, đã được định lượng. Nồng độ
của các mẫu AXOS tốt nhất là: A3X 132 g/ml (0,32 mol/ml), A2+3X
215 g/ml (0,39 mol/ml), A2+3XX 461 g/ml (0,68 mol/ml), A2XX 433 g/ml (0,79
mol/ml) và D2,3X 443 g/ml (0,81 mol/ml). Nội dung của A.2X không được xác định.
Độ pha loãng cho các mẫu đường chuẩn được tạo ra từ các phân số này. Các tiêu
chuẩn được sử dụng để xác định và định lượng các mẫu khác có chứa AXOS tương
ứng.
Tổng cộng 1,5 g mẫu RAX với độ tinh khiết 87% trọng lượng (chứa 1,3 g AX nguyên chất), đã
được thủy phân (TÔI). Các sản phẩm định lượng chiếm 28% của AX và năng suất của A3X là
12% sản phẩm định lượng (3% của AX). Tương tự, 1,5 g mẫu WAX có độ tinh khiết 84% khối
lượng (chứa 1,26 g AX nguyên chất) đã được thủy phân, và quá trình thủy phân
64
sản phẩm MỘT2+3X và A2+3XX bao gồm tất cả 17% của AX (II). Ở một phương pháp thủy phân
khác từ cùng một nguyên liệu ban đầu thu được 11,7% A2Đã thu được XX của AX (II). Sản
lượng AXOS được tính toán từ các phân số bị cô lập (TÔI,II). Sản phẩm thủy phân (III) tương
ứng với 23% OSAX và được định lượng từ dịch thủy phân thay vì các phân đoạn bị cô lập,
như trongTÔIVàII. Hiệu suất của AXOS là 12% từ các sản phẩm được định lượng và 4% là D
2,3x.
Làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS đơn thế từ bột mì AX được trình bày trong Hình 7
làm ví dụ. WAX-mv được thủy phân từng bước với các enzym thành mono-, diand
oligosacarit (Hình 7a). Sau khi phân tách AXOS bằng phương pháp thủy phân và
sắc ký (GPC), TLC được sử dụng để sàng lọc AXOS lần đầu tiên (Hình 7b). Các mẫu
hứa hẹn nhất (phân số 141-150) đã được chọn để phân tích HPAEC-PAD, trong đó
mẫu tiêu biểu nhất (phân số 143) để làm sáng tỏ cấu trúc đã được chọn (Hình 7c).
Họwcủa AXOS được thay thế đơn vì chất phụ gia Na là 569 (Hình 7d), cho thấy cấu
trúc bao gồm bốn đơn vị pentose. AXOS sau đó bị phân hủy hoàn toàn thành
monosacarit và sắc ký đồ HPAEC-PAD trong Hình 7e cho thấy không có oligosacarit
nào không bị phân hủy. Tỷ lệ Ara/Xyl được xác định với GC là 0,36, điều này cho
thấy rằng AXOS bao gồm một gốc arabinose và ba đơn vị xyloza. Lượng AXOS sau
đó được tính toán, dựa trên nồng độ monosacarit. Sử dụng enzyme AXH-m để loại
bỏ --L-Arafđơn vị từ
monosubstituting --D-XylPđơn vị, chúng tôi đã xác nhận rằng độ dài của chuỗi xyloza
bao gồm ba phần dư (Hình 7f). Với quang phổ NMR (Hình 7g), cấu trúc AXOS được chỉ
định để có một liên kết (1-2) --L-Arafcặn (A2) ở trạng thái không khử --
D-XylPđơn vị (X3) xylotriose (Hình 7h). Do đó, cấu trúc hoàn chỉnh là --L-Araf-
(1-2)---D-XylP-(1-4)---D-XylP-(1-4)-D-Xyl (A2XX).
65
Một
mV 1000
MỘT WAX-hv được thủy phân từng bước với AXH-m, Shearzyme và AXH-d3
800
600
X2 AXOS
400 X
200 X3
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
X
1
X X2
X2 X3
66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99 102 105 108 111 X4
X3
X4 114 117 120 123 126 129 132 135 138 141 144 147 150 153 156 159 162 165 168 171 174 177 180 183 186 189 192 195 198 201 204 207
mV 1000
đ AXOS bị cô lập (fr. 143) c
800 569 = P4+ Nà
600 393
400
200 300 400 500 600 700 800
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
mV 1000
Monosaccharid sau khi thủy phân hoàn toàn bằng enzym
e
800
MỘTX
600
400
200
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
mV 1000
Làm sáng tỏ cấu trúc có sự hỗ trợ của
f
800
enzyme AXOS + AXH-m
600
MỘT
400
200 X3
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
tối thiểu
g h
Ồ
Ô HỒ Ô
HỒ Ô Ô Ồ
HỒ
Ô HỒ
Ô Ồ
Ô
Ồ
HOH2C
Ồ
ppm
Hình 7.Tinh chế AXOS từ dịch thủy phân WAX-hv và làm sáng tỏ cấu trúc của AXOS
chính. Sắc ký đồ HPAEC-PAD của dịch thủy phân (a), phân tích TLC của các phân
đoạn thu được bằng phương pháp tách sắc ký (GPC) của dịch thủy phân (b) và sắc
ký đồ HPAEC-PAD của AXOS tinh khiết (c). Phổ khối của sắc ký đồ AXOS (d), HPAEC-
PAD của AXOS tinh khiết được thủy phân hoàn toàn thành monosacarit (e) và làm
sáng tỏ thêm cấu trúc của AXOS thu được sau khi loại bỏ arabinose bằng enzym
(f). Vùng dị thường của 1D1Phổ H NMR của oligosacarit (g) và cấu trúc hoàn chỉnh
của AXOS (h).
66
5.3 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX (I-III)
Cấu trúc của tám arabinoxylan ngũ cốc đã được nghiên cứu, sử dụng phân tích quang phổ NMR
cho các polyme (III) và bằng cách điều tra các sản phẩm thủy phân Shearzyme của AX (I-III). Dữ
liệu NMR của hai AX bổ sung đã được thông qua từ nghiên cứu của Pitkänen et al. (2009), bởi vì
các sản phẩm thủy phân của chúng cũng đã được kiểm tra. Sử dụng phương pháp quang phổ
NMR, người ta đã tìm thấy các gốc đường khác nhau dưới dạng các nhóm thế gắn vào chuỗi chính
xylan. Trong tất cả các loại ngũ cốc AX được kiểm tra, --L-Araf(1-3)-monosubstituting và --L-Araf
(1-2 và 1-3)-dư lượng xyloza đã được thay thế đã được tìm thấy (Bảng 12). Phân tích NMR cho thấy
rằng đơn vị bên chiếm ưu thế nhất trong tất cả các mẫu là --L-
Araf(1-3)đơn sắc. --L-Araf(1-2 và 1-3)-đã thay thế --D-XylPdư lượng phổ biến trong WBAX
và RBAX, nhưng trong WBAX, nhiều đơn vị bị thay thế hơn đã được tìm thấy (III: Hình
1a). Một đỉnh đáng kể đại diện cho --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên được tìm thấy
trong phổ NMR từ BHAX, OSAX và CCAX, và với số lượng ít hơn trong RiHAX và WStAX (
III: Hình 1). Nhóm bên axit 4-Ô-Me---D-GlcA(1-2) đã có mặt trong OSAX, CCAX, WStAX và
ít hơn trong RiHAX. Các kết quả NMR đại diện cho toàn bộ chuỗi AX polyme và cung cấp
một cái nhìn bao quát về cấu trúc của nó. Phân tích NMR định lượng không được thực
hiện, nhưng cường độ của các cực đại từ phổ NMR có thể được so sánh đại khái.
Bảng 12.Sự tồn tại của các đơn vị phụ trong arabinoxylan ngũ cốc theo quang phổ NMR.
+ + + = (các) pic chính, ++ = nhiều, + = có, - = không có trong phổ NMR. Mono hoặc di với --L-
Arafđơn vị đề cập đến sự xuất hiện của --L-Arafdư lượng trong mono-/dissubstituting
- - D-XylPcác đơn vị.
cặn đường
CÂY RÌU - - L-Araf - - L-Araf - - L-Araf - - D-XylP(1-2)---L- 4-Ô-Tôi---Đ-
(1-3) đơn sắc (1-3)đi (1-2) đi Araf(1-3) GlcA(1-2)
RAX* +++ ++ ++ - -
WAX-mv* +++ +++ +++ - -
WBAX +++ +++ +++ - -
RAX +++ ++ ++ - -
OBAX +++ + + - -
RiHAX +++ + + + ++
BHAX +++ + + ++ -
OSAX +++ + + + ++
CCAX +++ + + ++ ++
WStAX +++ + + + ++
*
Thông qua Pitkänen et al. (2009)
67
Ngoài các đơn vị phụ được trình bày trong Bảng 12, --L-Araf(1-2)Có thể tìm thấy dư
lượng mono từ BHAX, WBAX và RBAX. Các tín hiệu kép rộng có lẽ bắt nguồn từ các đơn
vị phụ --L-Araf(1-2)đơn sắc và --L-Araf(1-3)di được tìm thấy từ các mẫu này trong phép
đo phổ NMR (III, Hình 1). Tuy nhiên, dựa trên quang phổ NMR, sự hiện diện của --L-Ara
f(1-2)Các đơn vị bên đơn trong AX được kiểm tra vẫn chưa chắc chắn.
Các mẫu AX tương tự cũng được thủy phân bằng Shearzyme (I-III) và các sản phẩm thủy
phân đã được xác định và định lượng. Sắc đồ HPAEC-PAD được trình bày trongTÔI: Hình 2,II
: Hình 2 vàIII:Hình 4. Trong tất cả các sản phẩm thủy phân AX ngũ cốc được kiểm tra, chất
thay thế đơn chất A3X được tạo thành nhiều (Bảng 13). nhất là A3X có mặt trong các sản
phẩm thủy phân AX có nguồn gốc từ bột và cám (RAX, WAX-mx, WBAX, RBAX và OBAX), đồng
thời cũng là AXOS chính trong các sản phẩm thủy phân RiHAX, OSAX và WStAX. Đ.2,3X là
oligosacarit phổ biến nhất trong BHAX và CCAX và cũng được tìm thấy với lượng ít hơn trong
OSAX, RiHAX và WStAX. Hơn nữa, thay thế kép AXOS A2+3X và A2+3XX được phát hiện trong tất
cả các mẫu, ngoại trừ RiHAX. Trong BHAX và CCAX, một đỉnh nhỏ đại diện cho A2+3XX đã
được tìm thấy trong sắc ký đồ, nhưng số lượng quá nhỏ để định lượng. AXOS với --L-Araf
(1-2) thế đơn --D-XylPđơn vị (A2X hoặc A2XX) không được xác định từ các sản phẩm thủy
phân. Tổng lượng định lượng của các sản phẩm thủy phân trong tổng lượng AX đã cân là
10-40%. Số tiền cao nhất được định lượng trong WStAX và thấp nhất trong WBAX.
Bảng 13.Phân phối monosacarit, XOS tuyến tính và AXOS trong sản phẩm thủy phân thu
được bằng cách ủ ngũ cốc AX với Shearzyme. Phân phối (wt%) carbohydrate được tính toán
từ các sản phẩm thủy phân được định lượng trong phân tích HPAEC-PAD.
sản phẩm thủy phân
CÂY RÌU Phân phối carbohydrate định lượng (wt%)
MỘT X X2 X3 X4 Đ.2,3X MỘT3X MỘT2+3X MỘT2+3XX
RAX 2 15 56 - - - 20 4 3
WAX-mv 2 12 47 - - - 14 9 16
WBAX 2 17 51 - - - 16 7 7
RAX 3 18 49 - - - 22 5 3
OBAX 4 19 45 - - - 21 5 6
RiHAX 1 18 61 - - 5 15 - -
BHAX - 12 66 1 - 14 4 3 nq
OSAX - 10 68 9 1 4 6 1 1
CCAX 1 13 61 1 - 15 7 2 nq
WStAX - 12 72 3 2 1 7 1 2
nq = không định lượng
68
Các đặc điểm tương tự của cấu trúc AX được tìm thấy khi kết quả NMR (Bảng 12) và thông
tin thu được từ các sản phẩm thủy phân (Bảng 13) được so sánh. Không tìm thấy AXOS thay
thế kép nào trong dịch thủy phân RiHAX, mặc dù trong phân tích NMR chúng có mặt. Mặt
khác, các yếu tố cấu trúc giống nhau đã xảy ra trong AX ngũ cốc tương ứng trong cả hai
phân tích.
xyloza. Sự hình thành của A2X và A2XX được thể hiện tốt nhất với chất thủy phân WAX-lv (TÔI
; Hình 1) nhưng những AXOS này không được xác định cho đến khi nghiên cứuII. Phần lớn
AXOS được tạo ra trong quá trình thủy phân Shearzyme mang nhóm thế cuối cùng không
khử và chỉ một lượng nhỏ AXOS được thay thế bên trong (TÔI; Hình 7). Bất chấp các hoạt
trong Shearzyme, các chất thủy phân bằng tinh khiếtA. aculeatus endo-1,4---D-xylanase và
Shearzyme tương tự nhau (TÔI; Hình 7) và do đó, để sản xuất AXOS, chỉ có tác động của kết thúc
-1,4---D-xylanase trong Shearzyme là đáng kể. Để Shearzyme hành động, ít nhất một
không được thay thế --D-XylPđơn vị giữa thay thế --D-XylPđơn vị là cần thiết, vì AXOS ngắn nhất
được hình thành trong quá trình thủy phân là A3X, MỘT2X và D2,3X. Ngoài AXOS, xyloza và
xylobiose là những sản phẩm thủy phân chính trong quá trình thủy phân mở rộng.
TLC được sử dụng trong lần sàng lọc đầu tiên của các phân đoạn thu được từ quá trình tách các
mẫu AX thủy phân (I-III) với AEC và/hoặc GPC. Trong GPC, thứ tự rửa giải của cacbohydrat chủ
yếu dựa trên kích thước của chúng (Hình 7b), nhưng trong TLC, tốc độ rửa giải cũng bị ảnh hưởng
bởi sự hấp phụ khác nhau của cacbohydrat vào tấm silica. tăng dần của
69
tám AXOS đã được kiểm tra trên tấm TLC và Rfcho mỗi AXOS đã được xác định
(Bảng 14). Trong phân tích TLC, Rfcác giá trị của AXOS tăng theo thứ tự: XA3XX,
MỘT2XX và MỘT2+3XX, D2,3X và XA3X, MỘT2X và A2+3X, MỘT3X (Hình 8). Do đó, trong
số AXOS được nghiên cứu, A3X thăng xa nhất (Rf0,57) trên tấm TLC và XA3XX ít nhất
(Rf0,41). Tuy nhiên, một số Rfcác giá trị của AXOS giống nhau đến mức sự khác biệt
giữa AXOS chỉ dựa trên Rfgiá trị là khó khăn.
5.5.2 Thứ tự rửa giải của AXOS và phản ứng của chúng trong HPAEC-PAD
AXOS tinh khiết (0,011 mol mỗi loại) được trộn trong dung dịch và thứ tự rửa giải của
AXOS (I-III) và phản hồi của chúng trong hệ thống HPAEC-PAD được sử dụng đã được
nghiên cứu. Thứ tự rửa giải trong HPAEC-PAD là (Hình 9a): A2X, MỘT2XX, D2,3X, MỘT3X,
MỘT2+3X và A2+3XX. Mặc dù A2XX và D2,3Không thể tách hoàn toàn X ra khỏi nhau trong
hỗn hợp, xuất hiện pic tách đôi sau 30 phút và thứ tự rửa giải được xác định
từ các mũi tiêm riêng biệt của các AXOS này. XOS tuyến tính (XX4; 0,011 mol của mỗi
loại) cũng được trộn với sáu AXOS (Hình 9b). Hơn nữa, thêm hai AXOS (XA3X và XA3XX)
được trộn với dung dịch của sáu AXOS và thứ tự rửa giải của tám AXOS này đã được
kiểm tra (Hình 9c). Thứ tự rửa giải của tám AXOS là: A2X, MỘT2XX, D2,3X, MỘT3X và XA3X,
XA3XX, MỘT2+3X, MỘT2+3XX. các trcủa A3X và XA3X hoàn toàn giống nhau và không thể
xác định thứ tự rửa giải của chúng trong hệ thống HPAEC-PAD này.
70
X MỘT
| \
300 MỘT
6 trục |
MỘT
\
XX
AA Một
mV XXX \|
XX
200 XX
MỘT
AA
|
\|
100 XX
XXX
X3 dư lượng X4
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu
50
X
MỘT
300 MỘT | \
6 TRỤC + XX4 | MỘT
XXAA b
mV XXX \
XX \|
200 XX
MỘT
| AA
100 X X2 XXX \|
X3 4
XXX
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
MỘT
MỘT
X \
\
300 MỘT |
MỘTXXX XXXX
8 TRỤC + XX4 | MỘT c
mV \ +
XXX \
XX AA
200 XX
\|
MỘT XX
| AA
100 X X2 X3 X4XX \|
XXX
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 phút 50
Hình 9.Sắc ký đồ HPAEC-PAD của các AXOS khác nhau. Nội dung của AXOS và XX4là
0,011 mol trong các dung dịch, trừ A chưa định lượng2X, XA3X và XA3XX. A = arabinose,
X = xyloza, X2= xylobiose, X3= xylotriose, X4= xylotetraose, \ = liên kết 1-3, | = trái phiếu
1-2.
Các phản hồi cho các AXOS khác nhau là khác nhau trong phân tích HPAEC-PAD.
Do đó, không thể đưa ra kết luận đơn giản về chiều cao pic (mV) trong sắc ký đồ và
số lượng. Từ một3X dường như là đỉnh AXOS chính trong một số sản phẩm thủy
phân, phản ứng của A3X được đặt là 1 và các phản hồi AXOS khác từ Hình 9 được
so sánh với phản hồi trong Bảng 15. Trong hỗn hợp sáu AXOS, một số gốc của X3
và X4bắt nguồn từ Đ.2,3Mẫu X đã được tìm thấy (Hình 9a), làm tăng chiều cao của
các pic tương ứng trong hỗn hợp có thêm X3và X4
(Hình 9b và c). X dư3và X4đã được định lượng và số lượng của chúng đã giảm về mặt lý thuyết.
Ngoài việc so sánh các phản hồi từ hỗn hợp trong Hình 9, so sánh phản ứng tương đối của A2XX
và D2,3X với A3X cũng được thực hiện từ các mẫu nguyên chất để cho thấy hiệu ứng của các đỉnh
chồng lấp. Trong Hình 9, cả hai đầu của đỉnh phân tách đều khá bằng nhau, nhưng phân tích
riêng biệt cho thấy phản hồi tương đối kém hơn một chút đối với D2,3X hơn cho A2XX. Trong hệ
thống gradient HPAEC-PAD được sử dụng, các phản hồi tương đối
71
cho XX4dường như kém hơn so với AXOS, trong khi sự thay đổi trong các phản hồi cũng được
Bảng 15.Phản ứng của xyloza, XOS tuyến tính và AXOS so với phản ứng của A3X.
Các cacbohiđrat đều bằng nhau về số mol (0,011 mol). phản hồi = chiều cao (mV)
của đỉnh trong phân tích HPAEC-PAD s (Hình 9a và b).
phản ứng tương đối
cacbohydrat
(cacbohydrat/A3X)
X 0,2
X2 0,2
X3 0,1
X4 0,1
MỘT2XX 0,5 (0,4*)
Đ.2,3X
0,5 (0,3*)
MỘT3X 1
MỘT2+3X
0,7
MỘT2+3XX 0,5
* Được tính toán từ các sắc ký đồ riêng biệt ngoài hỗn hợp mà các AXOS này chồng lên nhau
5.6.1 Thành phần cacbohydrat của sản phẩm thủy phân XOS và AX
Thành phần cacbohydrat của hỗn hợp XOS thương mại và các sản phẩm thủy phân RAX và
WAX, được sử dụng làm chất nền trong các thí nghiệm lên men (IV.), đã được phân tích. Hỗn
hợp XOS thương mại chứa chủ yếu là xylobiose (26% trọng lượng) và một lượng nhỏ
xylotriose và xylotetraose (Bảng 16,IV.: Hình 1a). Do đó, trong hỗn hợp này chỉ có 37% lượng
cân được phát hiện là XOS tuyến tính. Ngoài XOS đã được xác định, sản phẩm XOS thương
mại còn chứa một số oligosacarit không xác định lâu hơn với tr
từ 30 đến 35 phút. Các sản phẩm thủy phân RAX và WAX được tạo ra từ AX thương mại chiết
xuất từ lúa mạch đen và bột mì (RAX và WAX-hv, tương ứng). Carbohydrat được xác định và
định lượng trong dịch thủy phân RAX là 14% trọng lượng và trong dịch thủy phân WAX là
20% trọng lượng (Bảng 16,IV.: Hình 1b và 1c). Hai sản phẩm thủy phân chứa lượng xyloza,
xylobiose và A tương tự nhau.3X, nhưng dịch thủy phân WAX có nhiều oligosacarit bị phân
Bảng 16.Thành phần carbohydrate của hỗn hợp xylo-oligosacarit thương mại (XOS),
thủy phân AX lúa mạch đen và thủy phân AX lúa mì.
X X2 X3 X4 MỘT3X MỘT2+3X MỘT2+3XX Tổng cộng
cacbohydrat
wt% của AX
XOS - 26 số 8 3 - - - 37
RAX thủy phân (aq.) 2 số 8 - - 4 nq nq 14
WAX thủy phân (aq.) 2 9 - - 4 2 3 20
aq. = dung dịch nước (không đệm), nq = không định lượng
5.6.2. Sự phát triển của các nền văn hóa bifidobacteria tinh khiết
Các ưu tiên cơ chất của ba loài vi khuẩn bifido khác nhau (Bifidobacterium vị thành niên,B.
breveVàB. longum) đã được nghiên cứu bằng cách ủ vi khuẩn với các chất thủy phân
Dxylose, L-arabinose, XOS, RAX và WAX và FOS (chất nền đối chứng). Quá trình lên men của
AXOS thay thế đơn lẻ và kép tinh khiết đã được nghiên cứu bằng cách nuôi cấy hỗn hợp của
ba vi khuẩn bifidobacteria trước đó với A2XX và MỘT2+3XX. Việc sử dụng các chất nền khác
Bảng 17.Sự phát triển của ba loài bifidobacteria và hỗn hợp của chúng.
Tăng trưởng của
D-xylose + +++ - - - -
L-arabinose - - - - +++ +++
XOS +++ +++ - - - -
RAX thủy phân + + - + + +
WAX thủy phân + ++ - - + +
FOS +++ +++ ++ ++ +++ +++
Cơ chất Sự phát triển của hỗn hợpB. vị thành niên,B. breveVàB. longum
60 giờ 140 giờ
Bifidobacterium vị thành niênđã có thể phát triển trên các sản phẩm thủy phân D-xylose, XOS và
RAX và WAX, trong khiB. longumsử dụng L-arabinose và thủy phân.Bifidobacterium brevechỉ cho
thấy sự tăng trưởng nhẹ trên RAX thủy phân sau 140 giờ. Với thời gian lên men dài hơn, một số
thay đổi cũng được quan sát thấy trong sự phát triển củaB. vị thành niêntrên D-xylose và WAX
thủy phân, vì sự tăng trưởng tăng từ nhẹ sau 60 giờ đến mạnh hoặc trung bình sau 140 giờ. sự
tăng trưởng củaB. vị thành niênVàB. longummạnh trên cơ chất kiểm soát FOS, trong khiB. breve
đã có thể tăng trưởng vừa phải trên FOS. Hỗn hợp bifidobacteria sử dụng gần như hoàn toàn
AXOS tinh khiết thay thế đơn lẻ, nhưng AXOS tinh khiết với dư lượng xyloza thay thế kép không
Thậm chí, thông tin chi tiết hơn về các ưu tiên cơ chất của ba loại vi khuẩn bifido này đã
thu được bằng cách phân tích các cơ chất trước và sau khi ủ, sử dụng sắc ký HPAEC-
PAD. Định lượng cơ chất giúp hiểu rõ hơn về số phận của mono- và oligosacarit trong
quá trình lên men (Hình 10).Bifidobacterium vị thành niênlên men tất cả AXOS (Hình
10b) nhưng tiêu thụ chủ yếu là XOS, khiến Larabinose và một số D-xylose không được
sử dụng.Bifidobacterium longumcũng lên men AXOS, nhưng sử dụng chúng với chiến
lược khác với chiến lược củaB. vị thành niên, vì nó tiêu thụ L-arabinose được giải phóng
chứ không tiêu thụ XOS (Hình 10c).Bifidobacterium brevesử dụng chất thủy phân RAX
kém và không quan sát thấy sự tăng trưởng với chất thủy phân WAX làm chất nền
(Hình 10d).
74
150 Một
mV WAX thủy phân
X2 2+ 3X
100 X MỘT3XA
316 g/ml g/ml MỘT2+3XX
62 g/ml 121 g/ml 72
91 g/ml
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50
MỘT
mV
400
265 g/ml B. vị thành niên b
300
X
200 135 g/ml
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50
400 B. longum c
mV X2
300 1115 g/ml
200 X3
471 g/ml
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50
400 B. breve đ
mV
300 MỘT2+3
X
X X2
200 g/ml MỘT3X 76 g/ml MỘT2+3XX
84 g/ml 310 84 g/ml 112 g/ml
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tối thiểu 50
Hình 10.Phân tích carbohydrate bằng HPAEC-PAD của sản phẩm thủy phân WAX a)
trước khi lên men và b) sau 140 giờ lên men bằngBifidobacterium vị thành niênATCC
15703, c)B. longumATCC 15700 và d)B. breveATCC 15707.
Trong quá trình lên men với hệ vi sinh vật trong phân, các yếu tố được đo lường cung cấp
thông tin về sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria là pH, áp suất và sự hình thành VFA và
H2. Sau thời gian ủ, người ta quan sát thấy những thay đổi về độ pH, cho thấy rằng hỗn hợp
hệ vi sinh vật trong phân đã lên men carbohydrate được cung cấp. Trong các mẫu có FOS, L-
arabinose, D-xylose, XOS, và RAX và WAX thủy phân, pH cuối là 5. Với RAX và WAX polyme là
nguồn carbon, độ pH cao hơn một chút (5,5) ở cuối quá trình thủy phân. thời kỳ lên men. Với
oligosacarit tinh khiết A2XX và MỘT2+3XX, độ pH lần lượt là 6 và 4. Áp suất tăng trong tất cả
các mẫu (0,8-2,2 psi) và sự thay đổi ít nhất được phát hiện trong các mẫu được trồng trên A
2+3XX và lớn nhất với RAX thủy phân như một nguồn carbon (Bảng 18). Sự hình thành hydro
(0,2-3,8 v/v %) được phát hiện trong các mẫu với tất cả các nguồn carbon khác ngoại trừ A2+3
hydro đã được tìm thấy. Hầu hết hydro được hình thành trong các mẫu phát triển
trên xyloza và FOS. Với các mẫu phân, sự thay đổi nồng độ axetat sau thời gian ủ,
so với mẫu đối chứng sau 48 giờ, thường là khoảng 15 mM, nhưng trong các mẫu
có A2XX và MỘT2+3XX, sự thay đổi nồng độ axetat lần lượt là 22 và 31 mM. Trong
hầu hết các mẫu, một số thay đổi về nồng độ propionate và butyrate cũng được
phát hiện (tương ứng là 0,3-6,9 và -1,3-5,8 mM).
Bảng 18.sự hình thành của H2, áp suất và VFA (acetate, propionate và butyrate) trong thời
gian ủ (48 giờ) trong nuôi cấy hệ vi sinh vật trong phân.
h2 Áp lực axetat đề xuất butyrat
cacbohydrat pH cuối
(v/v %) (psi) ( triệu phút) ( triệu phút) ( triệu phút)
Việc sử dụng các loại carbohydrate khác nhau đã được phân tích bằng phương pháp HPAEC-
PAD và những thay đổi trong phân phối bifidobacteria đã được nghiên cứu, bằng cách sử
dụng phân tích t-RFLP. Các sản phẩm thủy phân Larabinose, D-xylose, XOS, FOS, WAX và
RAX, và polyme WAX và RAX được sử dụng gần như hoàn toàn và chỉ còn lại dấu vết của các
hợp chất này (với polyme, dấu vết của XX4) đã được nhìn thấy trong sắc ký đồ HPAEC-PAD.
AXOS đơn thế tinh khiết (A2XX) cũng được lên men hoàn toàn và chỉ có dấu vết của xyloza
được tìm thấy trong sắc ký đồ (Bảng 19). Trong trường hợp AXOS tinh khiết được thay thế
kép (A2+3XX), oligosacarit không được tiêu thụ hoàn toàn (Bảng 19,IV.: Hình 4) và một lượng
nhỏ arabinose, xyloza, xylobiose, xylotriose và AXOS (A2+3XX và MỘT2XX) được phát hiện sau
48 giờ lên men. Kết quả cho thấy rõ ràng rằng trong các mẫu này, A2XX được hình thành
trong quá trình ủ từ A2+3XX bởi vi khuẩn trong hệ vi sinh vật trong phân.
76
Bảng 19.Việc sử dụng AXOS tinh khiết bằng hệ vi sinh vật trong phân được phân tích bằng
sắc ký HPAEC-PAD.
Trước khi lên men Sau khi lên men
(g/ml) (g/ml)
cacbohydrat MỘT X X2 X3 MỘT2XX MỘT2+3XX
MỘT2XX 2300 - 7 - - - -
MỘT2+3XX 2900 53 28 120 136 25 14
RRNA 16S của vi khuẩn bifido được chiết xuất từ các mẫu được lấy trước và sau khi ủ hệ vi
sinh vật trong phân với hai AXOS tinh khiết và không bổ sung nguồn carbon và được phân
tích, sử dụng t-RFLP để đánh giá tác động của AXOS đối với sự phân bố của vi khuẩn
bifidobacteria. Để phân tích dữ liệu t-RFLP, vi khuẩn bifidobacteria có liên quan được chia
thành hai nhóm dựa trên kích thước chiều dài đoạn cuối đã biết của chúng trong các cặp cơ
sở (bp); nhóm 1:B. pseudocatenulatum(299 bp),B. catenulatum(299 bp) vàB. longum(299 bp);
nhóm 2:B. breve(470 bp),B. trẻ sơ sinh(480 bp),B. vị thành niên(469 bp),B. bifidum (467 bp)
vàB. denti(468 bp). Sự phân bố của hai nhóm bifidobacteria này được đo trước và sau 48 giờ
ủ.
Vi khuẩn nhóm 2 chiếm ưu thế trước khi ủ, nhưng trong các mẫu đối chứng không bổ
sung nguồn carbon, chỉ tìm thấy vi khuẩn bifidobacteria nhóm 1 sau 48 giờ (IV.: Hình
5). Với AXOS thế đơn (A2XX) làm nguồn carbon, sự phân bố của các nhóm bifidobacteria
giống như trong các mẫu đối chứng sau 48 giờ, trong khi với AXOS không được thay
thế (A2+3XX), nhóm 2 cũng chiếm ưu thế sau thời gian ủ bệnh. Trong thí nghiệm này,
AXOS đơn thế (A2XX), gần như được sử dụng hoàn toàn bởi vi khuẩn trong bùn phân,
gây ra sự phát triển hoặc sống sót của vi khuẩn bifidobacteria nhóm 1, cũng như
trường hợp trong các mẫu không có nguồn carbon bổ sung. Với AXOS bị phân hủy lên
men kém hiệu quả hơn, tỷ lệ vi khuẩn bifidobacteria nhóm 1 tăng khoảng 20% trong
quá trình ủ, so với các mẫu đối chứng trước khi ủ. Số lượng bifidobacteria không đạt
được với phương pháp được sử dụng.
77
6. THẢO LUẬN
Hợp chất cacbohydrat của 10 arabinoxylan được chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây ngũ cốc
đã được phân tích bằng nhiều phương pháp khác nhau. Khi bắt đầu nghiên cứu, H.2VÌ THẾ4
quá trình thủy phân đã được sử dụng, bởi vì trong các thử nghiệm sơ bộ, năng suất monosacarit cao
hơn thu được với H2VÌ THẾ4thủy phân hơn so với quá trình metanol hóa bằng axit trong quá trình phân
hủy RAX (TÔI). Sau đó (II,III), phương pháp metanol hóa bằng axit được chọn làm phương pháp thông
thường cho hầu hết các mẫu vì sản lượng monosacarit cao và độ lặp lại của kết quả tốt hơn so với H2VÌ
THẾ4thủy phân. WAX-mv được thủy phân, sử dụng hỗn hợp enzyme được thiết kế đặc biệt cho bột mì AX
(Virkki et al., 2008) (IV.). Quá trình thủy phân bằng enzyme là một lựa chọn nhẹ nhàng hơn so với quá
trình thủy phân bằng axit hoặc metanol hóa bằng axit để khử polyme hóa AX vì không xảy ra sự phá hủy
không mong muốn các monosacarit được giải phóng. Do đó, quá trình thủy phân bằng enzyme là một
lựa chọn tốt để khử polyme chọn lọc AX, thành monosacarit, nhưng thách thức là tạo ra hỗn hợp bằng
cách bao gồm tất cả các enzyme cần thiết để phân hủy hoàn toàn AX. Quá trình metanol hóa bằng axit
hiện đang dễ dàng thích ứng hơn để phân hủy các AX khác nhau và các polysacarit có thể khác có trong
mẫu.
Hàm lượng arabinose, xyloza và glucose đã được xác định và tỷ lệ Ara/Xyl được
tính toán cho tất cả AX. Tỷ lệ Ara/Xyl đại diện cho số lượng --D-XylPcác đơn vị
được thay thế bằng --L-Arafdư lượng; tỷ lệ Ara/Xyl được tìm thấy càng cao thì càng cao
độ thay thế của AX là. Tuy nhiên, DS không chỉ định phân phối của --L-
Arafđơn vị (số lượng mono- và disubstituting --D-XylPđơn vị) trong chuỗi chính xyloza. Tỷ lệ Ara/Xyl
ảnh hưởng đến hành vi và đặc điểm của AX, chẳng hạn như độ hòa tan trong nước và độ nhớt của
dung dịch AX. AX có tính thay thế cao đang là thách thức đối vớikết thúc-1,4---Dxylanase phân hủy
và DS cao làm giảm sản lượng AXOS thu được trong quá trình thủy phân.
Thành phần monosacarit của WAX-mv thương mại cho thấy cấu trúc AX được thay
thế tương đối cao, mặc dù có sự khác biệt nhỏ giữa các kết quả thu được với quá
trình metanol hóa bằng axit và thủy phân bằng enzyme (tỷ lệ Ara/Xyl lần lượt là
0,47 và 0,56). Các kết quả phù hợp với tỷ lệ Ara/Xyl do nhà sản xuất báo cáo
(Megazyme; 0,61). Trong tài liệu trước đây, tỷ lệ Ara/Xyl được báo cáo cho
78
bột mì AX dao động từ 0,52 đến 0,80 (MacArthur và D´Appolonia, 1980; Gruppen và
cộng sự, 1991). Tỷ lệ Ara/Xyl đối với RAX (quá trình metanol hóa axit; 0,42 và H2VÌ THẾ4
thủy phân; 0,46) thấp hơn trạng thái của nhà sản xuất (Megazyme) (0,64) hoặc báo
cáo của Cyran et al. (2003 và 2004) (0,67-0,75). Tỷ lệ Ara/Xyl của OSAX (0,09) tương
ứng tốt với tỷ lệ Ara/Xyl được báo cáo bởi nhà sản xuất (Sigma-Aldrich Chemie;
0,08) và Gruppen et al. (1991) (0,12).
Tỷ lệ Ara/Xyl cao nhất trong tất cả các AX được kiểm tra được tìm thấy ở WBAX
(0,60), nhưng các nghiên cứu khác đã báo cáo tỷ lệ Ara/Xyl thậm chí còn cao hơn
đối với cám lúa mì chiết xuất bằng kiềm AX (0,73 và 0,81) (Gruppen et al., 1991;
Nandini và Salimath, 2001). Từ cám lúa mạch đen, cả AX phân nhánh cao (tỷ lệ Ara/
Xyl 0,87) và AX với DS thấp (tỷ lệ Ara/Xyl 0,18) đều được chiết xuất bằng kiềm bởi
Hromádková et al. (1987) và kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại (0,43)
được tìm thấy ở giữa phạm vi đó. Tỷ lệ Ara/Xyl cao hơn cũng được báo cáo đối với
OBAX chiết xuất bằng kiềm (1,07) (MacArthur và D Áppolonia, 1980) so với được
phát hiện trong nghiên cứu này (0,53). Sự thay thế arabinose vừa phải được tìm
thấy trong CCAX (tỷ lệ Ara/Xyl là 0,33), cao hơn đáng kể so với báo cáo trước đó đối
với lõi ngô chiết xuất bằng kiềm AX (0,06-0,11) (Kabel và cộng sự, 2002a; Ramirez
và cộng sự, 2008 ).
Các biến thể tự nhiên trong tỷ lệ Ara/Xyl rất rộng (Izydorczyk và Biliaderis, 1995), điều này giải
thích một phần sự khác biệt về tỷ lệ Ara/Xyl được phát hiện trong các nghiên cứu khác nhau. Hơn
nữa, các quy trình khác nhau được sử dụng trong quá trình tách các mô hạt ngũ cốc, dẫn đến các
bộ phận thực vật hơi khác nhau (phần còn lại từ các lớp mong muốn), điều này có thể dẫn đến sự
khác biệt trong cấu trúc AX được chiết xuất. Sự khác biệt cũng có thể là do các loại ngũ cốc khác
nhau, cũng như các phương pháp chiết xuất và phân tích đa dạng.
6.2 Đặc điểm cấu trúc của các loại ngũ cốc khác nhau AX
Cấu trúc của tám AX được chiết xuất bằng kiềm từ các phụ phẩm ngũ cốc khác nhau và hai
AX thương mại đã được nghiên cứu, sử dụng phân tích NMR đối với AX cao phân tử và bằng
cách thủy phân AX bằng enzym và nghiên cứu AXOS được tạo ra bằng HPAEC-PAD
79
sắc ký. Phân tích NMR của các mẫu polyme cung cấp thông tin về toàn bộ phân tử và
do đó, là một phần quan trọng trong việc làm sáng tỏ cấu trúc của AX. Tuy nhiên, có
một số hạn chế trong kỹ thuật NMR; để có kết quả định lượng cần độ hòa tan tổng, độ
phân giải tín hiệu tốt, hàm lượng mẫu phải đủ và điều kiện chạy máy NMR phải tối ưu.
Trong nghiên cứu hiện tại, nồng độ mẫu là phù hợp, nhưng không phải tất cả các mẫu
đều hòa tan hoàn toàn trong D2O và độ phân giải của các đỉnh không hoàn chỉnh do
một số đỉnh chồng lên nhau. Sự chồng chéo của các tín hiệu là điển hình cho các cấu
trúc phức tạp của AX và bắt nguồn từ --L-Arafcác đơn vị gắn với hai gốc xyloza được
thay thế liên tiếp (Hoffmann et al., 1992). Mặc dù vậy, thông tin cấu trúc có giá trị về
phần hòa tan trong nước của AX được chiết xuất bằng kiềm đã thu được, mặc dù các
điều kiện phân tích không thỏa đáng cho phân tích định lượng.
Các sản phẩm thủy phân của AX đã được xác định và định lượng. Tuy nhiên, AXOS thu được
và phân tích chỉ là các oligosacarit ngắn từ phần thủy phân của phân tử AX; do đó, sự xuống
cấp của AX có thể không phải lúc nào cũng hoàn tất. Một số AX có tính thay thế cao, hoặc có
thể xen kẽ giữa các vùng phân nhánh cao và ít phân nhánh (Ewald và Perlin, 1959; Gruppen
et al., 1993), trong đó các vùng thay thế cao hạn chế hoạt động của các enzym. Các sản
phẩm thủy phân được định lượng từ quá trình thủy phân Shearzyme chiếm 28% trọng
lượng của AX (TÔI), trong khi họcIIhơn 40% trọng lượng đã được định lượng. Năng suất cao
trong học tậpIII, tổng lượng sản phẩm thủy phân định lượng cao nhất là 40% tổng lượng AX đã cân.
Điều này đã đạt được trên WStAX với mức độ thay thế thấp. Sản lượng của các sản phẩm thủy phân được
định lượng cũng thấp một cách đáng ngạc nhiên trong các sản phẩm thủy phân của AX với DS thấp. Mặc
dù thiếu sót về khả năng hòa tan hoàn toàn của AX không ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân thành
công bằng enzym, nhưng khả năng hòa tan hoàn toàn có thể quan trọng hơn so với những gì đã được
xem xét trước đây. Ngoài các sản phẩm thủy phân đã xác định, một số AXOS nhỏ hơn không xác định
cũng thường được tìm thấy. Bằng cách kết hợp các kết quả từ quá trình thủy phân AX với phân tích NMR,
sẽ thu được thông tin chi tiết hơn về cấu trúc của AX.
80
Cường độ của tín hiệu NMR được so sánh trong các mẫu và tất cả các AX được nghiên
cứu đều sở hữu --L-Araf(1-3) chuỗi bên đơn thế. Xem lại các sản phẩm thủy phân (Bảng
13), oligosacarit A3X thường xuất hiện và rõ ràng là AXOS chiếm ưu thế nhất trong các
sản phẩm thủy phân RAX, WBAX, RBAX, OBAX, RiHAX và WStAX. Trong phân tích NMR,
người ta quan sát thấy sự tương đồng về cấu hình thay thế giữa các AX có nguồn gốc
phân nhánh (Bảng 12), nhưng người ta thấy có sự khác biệt về số lượng chuỗi bên.
Quang phổ NMR cho thấy, WAX-mv (Pitkänen et al., 2009) và WBAX chứa một phần ba
--L-Araf(1-3) được thay thế đơn lẻ --D-XylPdư lượng
và hai phần ba là --L-Araf(1-2) và (1-3) được thay thế kép --D-XylPcác đơn vị (III;
Hình 1), trong khi RAX (Pitkänen et al., 2009) và RBAX chứa hai phần ba --
L-Araf(1-3) thế đơn --D-XylPdư lượng và một phần ba của các đơn vị thay thế kép. Những kết quả
này tương ứng với các báo cáo trước đây về bột mì và lúa mạch đen thương mại AX (Sørensen et
al., 2006; Höije et al., 2008). Mặc dù lúa mì và bột lúa mạch đen và cám AX có tỷ lệ Ara/Xyl tương tự
nhau, nhưng sự khác biệt chính trong sự phân bố của các nhóm thế là
thành lập. Thay thế kép --D-XylPcác đơn vị không thường xuyên hơn trong OBAX so với lúa mạch đen và
lúa mì dựa trên AX, trên NMR sprectra (III; Hình 1). Tất cả các AX được nghiên cứu đều chứa --L-Araf
bị loại --D-XylPđơn vị theo phân tích NMR, nhưng chỉ trong các sản phẩm thủy
phân của RiHAX không tìm thấy AXOS bị thay thế.
Trong dịch thủy phân WAX-mv, 14% khối lượng sản phẩm được định lượng là A3X, trong khi
25% trọng lượng chiếm các oligosacarit được thay thế kép A2+3X và A2+3XX, nhưng trong
WBAX, cùng một lượng AXOS đơn và không được thay thế (tương ứng là 16% trọng lượng và
14% trọng lượng) đã được phát hiện. Khoảng ba phần tư AXOS trong RAX và RBAX được
thay thế một lần và một phần tư bị loại bỏ, trong khi hai phần ba số AXOS được định lượng
là một loại và một phần ba bị loại bỏ trong dịch thủy phân OBAX. Không thể so sánh dễ
dàng giữa các kết quả phép đo phổ NMR và AXOS được định lượng từ các sản phẩm thủy
phân, vì không phải tất cả các sản phẩm thủy phân đều được xác định và AXOS không bị
thủy phân hoàn toàn. Dựa trên quang phổ NMR, OBAX (Ara/Xyl 0,53) chứa các đơn vị gây sốt
thay thế gấp đôi so với RBAX (Ara/Xyl 0,43), nhưng tỷ lệ AXOS không được thay thế trong sản
phẩm thủy phân cao hơn trong OBAX. Điều này có thể cho thấy phân phối --L-Ara đồng đều
hơnfnhóm thế trong chuỗi xyloza của OBAX. Sản lượng của AXOS bị phân hủy vẫn thấp một
có lẽ bởi vì một lượng lớn các đơn vị xyloza được thay thế kép nằm ở những khu vực có DS
cao và không có vị trí nào trên xương sống xylan mà enzyme có thể tiếp cận được.
Sự tồn tại của một --D-Xyl khá hiếm gặpP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên đã được báo cáo
trước đây trong lõi ngô AX và vỏ lúa mạch AX (Aspinall, 1959; Ebringerová et al., 1992;
Höije et al., 2006). Ngoài CCAX và BHAX, --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên cũng được
phát hiện ở đây trong RiHAX, OSAX và dấu vết trong WStAX, sử dụng quang phổ NMR.
Những phát hiện này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu về các sản phẩm thủy phân AX, vì
oligosacarit D2,3X được HPAEC-PAD xác định từ các nguyên liệu làm từ ngũ cốc giống
như trong phân tích NMR. Đáng ngạc nhiên là trong các sản phẩm thủy phân BHAX và
CCAX, D2,3X là AXOS chiếm ưu thế nhất.
Ngoài các chuỗi bên được xác định, dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của --L-Araf(1-2)
monosubstituting --D-XylPdư lượng trong BHAX đã được tìm thấy bằng quang phổ NMR (III:
Hình 1, tín hiệu ở 5,30 ppm trong BHAX). Đỉnh cao có lẽ đang trình bày --L-Araf
(1-2)mono chồng lên nhau với các tín hiệu bắt nguồn từ --L-Araf(1-3)di và/hoặc 4-O-
Tôi---D-GlcPA(1-2) và không thể phân tích chính xác. Tuy nhiên, trong BHAX,
kích thước của các tín hiệu, biểu thị sự hiện diện của --L-Araf(1-3)di và --L-Araf(1-2)di
chuỗi bên, không bằng nhau như đáng lẽ phải có nếu chỉ bắt nguồn từ --L-Araf dư
lượng liên quan đến thay thế kép. Sự khác biệt về kích thước cực đại cho thấy rõ ràng
sự hiện diện của --L-Araf(1-2) chuỗi bên đơn. Tuy nhiên, trong các mẫu thủy phân
được phân tích bằng HPAEC-PAD, không đủ AXOS với --L-Araf(1-2) thế đơn -- D-XylPđơn
vị (A2X hoặc A2XX) được hình thành trong bất kỳ mẫu nào để xác định rõ ràng. MỘT2XX
trùng với D2,3X, khiến cho việc xác định thậm chí còn khó khăn hơn. Không có bằng
chứng cho các oligosacarit với 4-Ô-Tôi---D-GlcPDư lượng trong BHAX đã được tìm thấy,
nhưng trong RiHAX, OSAX, CCAX và WStAX thì oligosacarit U4m2XX đã được xác định.
Như vậy, 4-Ô-Tôi---D-GlcPMột đơn vị bên đã được tìm thấy trong cùng một AX, sử dụng
phân tích HPAEC-PAD và quang phổ NMR.
Sự xuất hiện của các đơn vị bên, được gắn vào các gốc xyloza của chuỗi chính AX được tìm thấy
trong nghiên cứu này, phù hợp với sự xuất hiện của các nhóm thế AX trong các bộ phận của cây
ngũ cốc tương ứng được báo cáo trong tài liệu. Tuy nhiên, sự tồn tại của --D- phức tạp hơn
82
XylP(1-2)---L-Araf(1-3) chuỗi bên trong RiHAX, OSAX và WStAX, ngoài các nguồn BHAX và
CCAX đã biết trước đây, lần đầu tiên được báo cáo ở đây. Rơm rạ, rơm rạ, vỏ trấu và lõi
ngô là những phụ phẩm nông nghiệp không được tiêu thụ và do đó chúng có thể là
nguyên liệu thô có giá trị cho AXOS. Trong quá trình thủy phân AX, được chiết xuất từ
các sản phẩm phụ này, một lượng lớn phức hợp, có thể lên men chậm AXOS với nhóm
phụ --D-XylP(1-2)---L-Araf(1-3) (D2,3X) được sản xuất. Mặt khác, một lượng lớn AXOS,
được điều chế từ bột mì và cám AX, được thay thế gấp đôi, điều này cũng rất thú vị do
khả năng lên men chậm của chúng. Tuy nhiên, vì bột được sử dụng làm nguyên liệu
thực phẩm và cám cũng có thể được khai thác trong dinh dưỡng của con người nên
chúng không phải là nguồn hợp lý nhất để chiết xuất AX để sản xuất AXOS. Do đó, AX
có trong bột và cám, có thể bị thủy phân thành AXOStại chỗmà không cần giải nén AX
trước.
Sáu AXOS khác nhau (A3X, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2X, MỘT2XX, D2,3X) được điều chế bằng
phương pháp enzym từ RAX, WAX-mv và OSAX trên thang chuẩn (bắt đầu từ 1,5 đến 5,0 g
AX). AXOS đã được làm sạch và cấu trúc của chúng được phân tích đầy đủ (I-III). Shearzyme,
sở hữu hoạt động cao đối với liên kết xylosidic trước --L-Araf-được thay thế --D-XylPcặn,
do đó tạo thành AXOS với các nhóm thế được gắn vào đầu không khử của chuỗi xyloza
tuyến tính ngắn. Các oligosacarit A2X và D2,3X là tiểu thuyết và cấu trúc chi tiết H1và/
hoặc C13quang phổ NMR của A2+3X và A3X được trình bày lần đầu tiên trong nghiên cứu
này.
AXOS thay thế kép lần đầu tiên được sản xuất với năng suất tốt (A2+3XX 11,8% trọng lượng
của AX (0,22 mmol) và A2+3X 5,6 wt% của AX (0,13 mmol)) và --L-Ara đơn lẻ tương ứngf-(1-2)
AXOS được thay thế cũng có thể được điều chế với năng suất tương tự bằng cách xử lý thêm
AXOS được thay thế kép bằng AXH-d3. Trong số AX bị thủy phân, 11,7 wt% (0,22 mmol) là A2
XX. số lượng của A2X không định lượng được do thiếu mẫu tinh khiết. Tuy nhiên, nếu A.2X
được biến đổi tương tự từ A2+3X, lượng của nó có thể được ước tính là 0,13 mmol. Sản lượng
của A3X (3% của AX, 0,11 mmol) tương đối thấp,
83
bởi vì RAX (với Ara/Xyl 0,46) đã bị thủy phân vớikết thúc-1,4---D-xylanase không có tiền xử lý,
và có lẽ các khu vực được thay thế cao không bị thủy phân, do cơ chất phân nhánh dày đặc
không phù hợp với vị trí hoạt động của enzyme. Các AXOS khác có sản lượng rõ ràng cao
hơn (A2X, MỘT2XX, MỘT2+3X và A2+3XX) đã được điều chế bằng cách xử lý AX trước với --
khiết D2,3X chỉ được định lượng sau khi phân đoạn từ mẫu tốt nhất chứa 443 g/ml (3,9 mol
trong một phần 5 ml). Hầu hết các nghiên cứu trước đây báo cáo về AXOS tinh khiết đã được
thực hiện trên quy mô phân tích. Bột mì AX (80 mg) được thủy phân bởiA. awamori endo
-1,4---D-xylanase I trong nghiên cứu của Kormelink et al. (1993b), và 50-72% khối lượng sản
phẩm thủy phân (monosacarit, XOS và AXOS) đã được định lượng. Từ dịch thủy phân mạch
nha lúa mạch, thu được tối đa 26nmol AXOS tinh khiết chính (A2XX, MỘT2+3XX và XA2+3XX) đã
được định lượng (Broberg et al., 2000). Nghiên cứu của Ordaz-Ortiz et al. (2004) đã được
thực hiện trên quy mô chuẩn bị và từ bột mì AX (2,5 g) từ đó 8% trọng lượng AXOS được sản
xuất với hai oligosacarit chiếm ưu thế nhất, XA3XX và XA2+3XX, tương ứng với 3% trọng lượng
(0,11 mmol) của AX và 2,3% trọng lượng (0,07 mmol) của AX.
Shearzyme là một chế phẩm thương mại phù hợp để sản xuất AXOS, bởi vì nó có
sẵn rất nhiều với giá tương đối thấp so với các enzyme tinh khiết. AXOS tinh khiết,
được sản xuất trên thang miligam, được sử dụng làm mẫu chuẩn để nhận dạng và
định lượng AXOS tương ứng từ các sản phẩm thủy phân trong đó tất cả các sản
phẩm thủy phân đều có mặt dưới dạng hỗn hợp. Các tiêu chuẩn tự tạo là rất cần
thiết vì các tiêu chuẩn AXOS thương mại không có sẵn. AXOS tinh khiết cũng được
sử dụng làm chất nền cho các nghiên cứu lên men trong đó ảnh hưởng của các
kiểu thay thế khác nhau được đánh giá về khả năng sử dụng AXOS của vi khuẩn
bifidobacteria. Để hiểu vai trò của từng AXOS riêng lẻ trong quá trình lên men, các
AXOS chuỗi ngắn được tinh chế là những mô hình tốt để sử dụng,
84
6.4 Những thách thức trong việc xác định và định lượng AXOS
Sau khi AXOS được tinh chế và cấu trúc của chúng được đặc trưng đầy đủ, việc nhận dạng
bằng TLC hoặc HPAEC-PAD có thể được thực hiện từ các sản phẩm thủy phân với hỗn hợp
của một số AXOS, sử dụng AXOS tinh khiết làm hợp chất tiêu chuẩn. Tuy nhiên, việc xác định
AXOS từ các sản phẩm thủy phân, chỉ sử dụng một phương pháp, là một thách thức vì trên
TLC, Rfcác giá trị cho A2XX và MỘT2+3XX (0,45 và 0,46), D2,3X và XA3X (0,48) và A2X và A2+3X
(0,51 và 0,52) tương tự nhau (Bảng 14), trong khi ở HPAEC-PAD sắc ký A2XX rửa giải cùng với
D2,3X (30,1 và 30,2 phút) và A3X và XA3X (31,0 phút) đồng rửa giải với cùng thời gian lưu (Hình
9). Việc sử dụng hai phương pháp này thuận lợi cho việc nhận dạng chính xác, vì các AXOS
giá trị trên TLC. Việc xác định chính xác AXOS rất quan trọng để định lượng, vì
trong HPAEC-PAD, mỗi oligosacarit yêu cầu carbohydrate tiêu chuẩn tương ứng.
Sự hình thành arabinoxylotrioza (XA3X) rất khó phân tích bằng HPAEC-PAD, do quá trình rửa giải
gần như đồng thời của nó với arabinoxylobiose (A3X) (Kabel và cộng sự, 2002a) (TÔI). Trong các
sản phẩm thủy phân của Shearzyme, một số XA3X ngoài A3X có thể được hình thành. Sự hình
thành của XA3X ngoài A3X được hiển thị trên tấm TLC (TÔI: Hình 7). AXOS chính được hình thành
trong quá trình thủy phân Shearzyme mang --L-Araf(các) đơn vị ở đầu không khử của chuỗi chính
xyloza, và do đó A3X rõ ràng được tạo ra hầu hết và chỉ một lượng nhỏ XA3X thường được hình
Một lượng nhỏ --L-Araf(1-2)-các AXOS được thế đơn (A2X và A2XX) có thể được tạo ra
trong quá trình thủy phân AX, vì tất cả AX ngũ cốc đều chứa một lượng nhỏ --L-Ara tự
nhiênf(1-2)nhóm thế đơn (Izydorczyk và Biliaderis, 1995). Tuy nhiên, trong
Chỉ quang phổ NMR BHAX, WBAX và RBAX của AX được nghiên cứu có thể chứa --L-Araf
(1-2)đơn vị một phía, nhưng việc nhận dạng không chắc chắn do các đỉnh của --L-Ara
chồng lên nhauf(1-2)đơn sắc và --L-Araf(1-3)di (III; Hình 1). Chỉ BHAX trong số này
phổ biến hơn trong BHAX hơn --L-Araf(1-2)đơn vị bên, nhưng trong HPAEC-PAD A2XX có thể
không được xác định do đồng rửa giải với D2,3X. Tuy nhiên, A.2X có thể được xác định trong
HPAEC-PAD và do đó có sự tồn tại của --L-Araf(1-2)Các đơn vị một bên cũng có thể được hiển
Bột mì không chiết xuất được bằng nước AX chứa các vùng phân nhánh cao và ít phân
nhánh. Các khu vực phân nhánh cao được làm giàu bằng cả --L-Araf(1-2 và 1-3)
bị loại và --L-Araf(1-2) đơn vị xyloza được thay thế đơn, nhưng loại thứ hai không có ở những vùng
ít phân nhánh hơn (Gruppen et al., 1993). Các vùng phân nhánh cao sẽ khó khăn hơn cho các
enzyme hoạt động và do đó, điều này cũng có thể dẫn đến việc đánh giá thấp lượng
- - L-Araf(1-2) các đơn vị xyloza được thay thế đơn trong AX trong khi kiểm tra quá trình thủy phân
các sản phẩm. Tuy nhiên, --L-Araf(1-2)nhóm thế mono thường không phải là nhóm phụ chiếm ưu
thế vì chúng đóng góp dưới 10% nhóm thế trong bột mì không chiết xuất được trong nước AX
(Gruppen và cộng sự, 1993) và chỉ có dấu vết trong bột lúa mạch đen hòa tan trong nước AX
(Vinkx và cộng sự cộng sự, 1995). --L-Araf(1-2)nhóm thế mono có nhiều nhất trong hạt lúa mạch
hòa tan trong kiềm và bột mì AX (22-28% nhóm thế) (Viëtor et al., 1992; Trogh et al., 2005;
Các arabinoxylo-oligosacarit A3X, XA3X, XA3XX, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2X, MỘT2XX và D2,3X
đã được xác định thành công, sử dụng kết hợp TLC và HPAEC-PAD. Định lượng thành công
trong A3X, MỘT2+3X, MỘT2+3XX, MỘT2XX và D2,3X trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, nếu cả A2
XX và D2,3X được xác định từ cùng một mẫu thủy phân, định lượng của chúng không chính
xác do rửa giải đồng thời. Tương tự, sự có mặt của A3X và XA3X trong cùng một mẫu cản trở
việc định lượng chính xác do hiện tượng đồng rửa giải.
Thứ tự rửa giải của AXOS trong hệ thống HPAEC-PAD rất khó dự đoán, do một số tương tác
giữa cột, chất rửa giải và cacbohydrat rửa giải ảnh hưởng đến quá trình rửa giải. HPAEC-
PAD có thể tách các oligosacarit dựa trên sự thay đổi nhỏ về điện tích thực của chúng,
86
vị trí phân nhánh hoặc đồng phân liên kết (Thayer et al., 1998). Carbohydrat được
phân tách hoàn toàn ở độ pH cao được sử dụng trong phương pháp HPAEC-PAD.
Do đó, điều cần thiết để lưu giữ trong cột sắc ký trao đổi anion là sự có mặt của
các nhóm –OH có sẵn để phân ly và tương tác với vật liệu cột. các trvà pKMộtgiá trị
của carbohydrate tương quan nghịch và trtăng khi khối lượng phân tử tăng (Antec
Leyden). XOS tuyến tính khác nhau tùy theo chuỗi oligosacarit tương đồng và XOS
càng ngắn thì chúng càng sớm rửa giải khỏi cột.
Các arabinose (--L-Araf) các nhóm thế dường như làm tăng thời gian lưu của các phân
tử do arabinoxylobiose rửa giải muộn hơn xylotriose và xylotetraose. Hơn nữa, số
lượng ngày càng tăng của --L-Arafchuỗi bên tăng khả năng lưu giữ trong vật liệu cột.
Như vậy arabinoxylobioses (A2X và A3X) rửa giải trước diarabinoxylobiose (A2+3X), trong
khi arabinoxylotrioses (A2XX và XA3X) rửa giải trước diarabinoxylotriose (A2+3XX). AXOS
với --L-Araf(1-2)đơn vị đơn liên kết với --D-XylPđơn vị ở đầu không khử của chuỗi xyloza
cho thấy khả năng lưu giữ vật liệu cột thấp hơn
hơn AXOS tương ứng với --L-Araf(1-3)nhóm thế đơn. Trên thực tế, kiểu liên kết của
(1-3) đã làm tăng trvề cơ bản, tương ứng tốt với tính axit mạnh hơn của nhóm 2-
OH so với nhóm 3-OH đã báo cáo trước đó (Roberts et al., 1971). Do đó, nhóm thế
ở O-2 của --D-XylPngăn chặn sự tương tác của 2-
nhóm và cột OH, và với nhóm thế ở O-3 của --D-XylP,nhóm 2-OH có tính axit hơn sẽ tự
do phản ứng. Với các AXOS được thay thế tương tự, những chất có chuỗi chính xyloza
ngắn hơn được rửa giải trước. Với --L-Arafđơn vị được gắn vào đầu không khử của
chuỗi xyloza, oligosacarit dường như rửa giải muộn hơn so với AXOS tương ứng có
nhóm thế bên trong. Điều này được kết luận từ quá trình rửa giải đồng thời của A3X và
XA3x.
Các phản hồi cho các AXOS khác nhau là khác nhau khi phát hiện ampe kế dạng xung. Việc
sử dụng PAD là thuận lợi, vì không cần tạo dẫn xuất của cacbohydrat được nghiên cứu và
phương pháp này rất nhạy. Mặc dù carbohydrate có thể được phát hiện ở cấp độ picomolar,
nhưng phản ứng không giống nhau đối với những oligosacarit mang tương tự
87
nhóm thế gắn vào các vị trí khác nhau của chuỗi chính oligosacarit (Lee, 1990). Do đó,
cần có một tiêu chuẩn định lượng cho từng oligosacarit khác nhau được xác định.
Trong nghiên cứu này, phản ứng PAD tương đối tốt nhất trên cơ sở mol thu được đối
với A3X và xấu nhất đối với xylotriose và xylotetraose trong các điều kiện phân tích
HPAEC-PAD được sử dụng khi chiều cao của các pic được so sánh. Trong AXOS, với
double --L-Arafthay thế ở đầu không khử, chiều dài ngày càng tăng của chuỗi xyloza
làm giảm phản ứng PAD; do đó, phản ứng tương đối cho A2+3X tốt hơn cho A2+3XX. Hơn
nữa, chuỗi chính kéo dài trong AXOS với các mẫu thay thế khác nhau đã làm giảm phản
ứng của PAD. Tuy nhiên, AXOS dài hơn cũng bị rửa giải muộn hơn, điều này có thể đã
mở rộng các đỉnh và hạ thấp độ cao của các đỉnh. Phản ứng tương đối yếu nhất của
AXOS được nghiên cứu thu được đối với D2,3X. Vị trí của --L-Araf
nhóm thế giữa hai đơn vị xyloza trong D2,3X, so với thiết bị đầu cuối --L-Araf(các) thiết bị
trong AXOS khác, có thể đã ảnh hưởng đến phản hồi thấp. Ít thông tin về phản ứng PAD của
Trong các thí nghiệm lên men, sự phát triển củaB. vị thành niênATCC 15703,B. longum ATCC
15707,B. breveATCC 15700 và hệ vi sinh vật trong phân trên L-arabinose, D-xylose, XOS,
AXOS và trên hỗn hợp của chúng (các chất thủy phân WAX và RAX) đã được thử nghiệm,
đồng thời đánh giá tiềm năng tiền sinh học của AXOS. Các dấu hiệu về sự ưu tiên cơ chất rõ
ràng giữa các chủng vi khuẩn bifido khác nhau đã được tìm thấy.Bifidobacterium vị thành
niênđã có thể phát triển trên XOS, chậm trên D-xylose nhưng không phát triển trên L-
arabinose. Ngược lại,B. longumưa thích L-arabinose và không phát triển trên D-xylose hoặc
XOS tinh khiết. Cả hai chủng đều có thể sử dụng AXOS nhưng với các chiến lược khác nhau,
vì sau khi phân tách L-arabinose,B. vị thành niêntiêu thụ XOS hình thành, trong khiB.
longum lên men L-arabinose được giải phóng.Bifidobacterium brevephát triển kém trên tất
cả các chất nền được cung cấp, mặc dù nó có thể sử dụng từ từ một số xylobiose và AXOS từ
hỗn hợp, vì một số lượng giảm được phát hiện sau khi ủ, so với tình huống ban đầu.
có thể phát triển như nhau trên các sản phẩm thủy phân AX, nhưng sự phát triển quan sát được rõ ràng
là ít hơn so với trên FOS, cho thấy khả năng lên men bị hạn chế hơn của hỗn hợp giàu XOS và AXOS. Tất
cả các chất nền được cung cấp gần như được sử dụng hoàn toàn bởi vi khuẩn từ hệ vi sinh vật trong
phân.
B. breveATCC 15700 trên D-xylose, L-arabinose, XOS và AXOS đã được một số nhóm báo cáo
trước đây và kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại nhìn chung phù hợp với những
điều này.B. vị thành niênATCC 1570 trước đó cho thấy sự tăng trưởng khiêm tốn trên xyloza
(Palframan et al., 2003; Moura et al., 2007), mặc dù Crittenden et al. (2002) và Gullón et al.
(2008) suy đoán về sự bất lực củaB. vị thành niênđể sử dụng xyloza. Trong nghiên cứu hiện
tại, sự phát triển rõ ràng trên xyloza tinh khiết đã được phát hiện sau thời gian ủ kéo dài
(140 giờ). Hơn nữa, phân tích HPAEC-PAD cho thấy xyloza tinh khiết được tiêu thụ bởi
B. vị thành niênATCC 15703; tuy nhiên, không phát hiện thấy giảm hàm lượng xyloza trong các
sản phẩm thủy phân AX. Sự khác biệt này thực sự có thể giải thích các kết luận khác nhau về khả
năng củaB. vị thành niênATCC 15703 để lên men xyloza. Trong các nghiên cứu trước đây, sự tăng
trưởng củaB. longumATCC 15707 được phát hiện với xyloza tinh khiết (Palframan et al., 2003),
trong khi đó trong nghiên cứu hiện tại xyloza được sử dụng bởiB. longumATCC 15707 chỉ khi có
trong hỗn hợp với xylobiose và AXOS. kết quả màB. longumATCC 15707 có thể, nhưngB. vị thành
niênATCC 15703 không thể, việc sử dụng L-arabinose rất phù hợp với dữ liệu đã công bố (Roy và
Ward, 1990; van Laere và cộng sự, 1999; Moura và cộng sự, 2007). Các báo cáo trước đây cũng chỉ
ra sự bất lực củaB. breveATCC 15700 để phát triển trên xyloza và L-arabinose tinh khiết (Mitsuoka,
Sự phát triển mạnh mẽ củaB. vị thành niênATCC 15703 trên XOS thương mại (X2, X3và X4)
phù hợp với một số báo cáo trước đó (van Laere và cộng sự, 1999, 2000; Moura và cộng sự,
2007; Gullón và cộng sự, 2008). Những phát hiện khác biệt chính giữa nghiên cứu này và các
kết quả trước đó đã được tìm thấy trong khả năng của XOS để thúc đẩy sự phát triển củaB.
longumATCC 15707. Trong nghiên cứu của Crittenden et al. (2002),B. longumATCC 15707
(VTT E-96664) có thể phát triển hiệu quả trên hỗn hợp XOS (Xylo-oligo 70, Suntory Co. Ltd.,
Osaka, Japan), tuy nhiên, chứa hơn 40% monosacarit tự do, bao gồm xyloza và một ít
glucose . Như vậy, sự tăng trưởng củaB. longumcó thể đã xảy ra do việc sử dụng các
monosacarit thay vì XOS. Gullón et al. (2008) báo cáo mức tăng trưởng khiêm tốn củab.
89
longumATCC 15707 về XOS chế biến từ trấu. Ngoài XOS, sản phẩm còn chứa một số
arabinose và xyloza tự do, và do nguyên liệu thô được sử dụng để sản xuất XOS, nó cũng có
thể chứa một số AXOS, tất cả đều có thể thúc đẩy sự phát triển củaB. longumATCC 15707
(Gullón và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, van Laere et al. (2000) báo cáo khả năng củaB. longum
ATCC 15707 để phát triển trên hỗn hợp XOS không có xyloza (X2, X3và X4). Trong nghiên cứu
hiện tại, XOS là nguồn carbon duy nhất quá thách thức đối vớiB. breveATCC 15700, cũng
được quan sát thấy trong nghiên cứu của Palframan et al. (2003), trong khi Gullón et al.
(2008) đã báo cáo về khả năng phát triển của cùng một dòng trên XOS. Trong hỗn hợp XOS
thương mại (Wako) được sử dụng làm chất nền trong quá trình lên men vi sinh vật trong
phân và bifidobacteria tinh khiết, một số oligosacarit không xác định có thể là AXOS, vì
Moura et al. (2007) đã báo cáo sự hiện diện của AXOS trong sản phẩm XOS thương mại
(Xylo-oligo 95P; Suntory). Tuy nhiên, sự hiện diện có thể có của AXOS là không mong muốn
trong XOS, vì nó có thể ảnh hưởng đến khả năng sử dụng XOS của bifidobacteria khi việc sử
Các nghiên cứu với AXOS hiếm hơn so với XOS. van Laere và cộng sự. (2000) báo cáo rằng AXOS
(chủ yếu là L-Arafthay thế kép XOS) được lên men một phần bằngB. vị thành niên ATCC 15703 và
hoàn toàn bởiB. longumATCC 15707. Điều này hỗ trợ dữ liệu của chúng tôi rằng cả hai chủng đều
có thể tiêu thụ AXOS, nhưng chúng tôi đã chứng minh việc sử dụng một phần AXOS của cả hai
loài; I EB. vị thành niênATCC 15703 đã sử dụng XOS xương sống chứ không phải L-Ara đã phát
hànhfthay thế, vàB. longumATCC 15707 sử dụng L-Arafđược phát hành nhưng không phải là XOS
còn lại.
Trong nghiên cứu hiện tại, một phương pháp quy mô nhỏ và môi trường cực kỳ nghèo dinh
dưỡng đã được áp dụng. Việc sử dụng phương pháp quy mô nhỏ này là cần thiết để thử
nghiệm các AXOS tinh khiết khó thu được với số lượng lớn. Để có được kết quả tương
đương, tất cả các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô nhỏ. Việc giảm tỷ lệ thể tích nuôi cấy
của các môi trường nuôi cấy thuần túy phải được thực hiện trong các ống nghiệm mà thông
thường 10 ml môi trường được thêm vào để đảm bảo duy trì các điều kiện kỵ khí và phép đo
OD đáng tin cậy. Thể tích nhỏ (3 ml) đã thay đổi tỷ lệ của môi trường và vùng trời, và có thể
khiến việc đạt được các điều kiện kỵ khí hoàn toàn trở nên khó khăn hơn. Hơn nữa, khối
lượng nhỏ này đã cản trở việc sử dụng chất khử natri sunfua (Na2S), cũng có thể đã thay đổi
môi trường tăng trưởng. Thời gian canh tác dài, lên đến 140 h, đã
90
được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại để đảm bảo tăng trưởng trong các điều kiện hơi không điển hình được
áp dụng. Trong các nghiên cứu được báo cáo khác, thời gian lên men ngắn hơn nhiều đã được sử dụng, độ tinh
khiết và thành phần của XOS và AXOS khác nhau và môi trường cơ bản trung tính khác nhau được áp dụng. Sự
khác biệt giữa nghiên cứu này và các nghiên cứu trước đây có thể đã xảy ra một phần vì những lý do này.
Bifidobacteria được cho là sử dụng oligosacarit bằng cách vận chuyển các oligosacarit nhỏ
vào tế bào và thủy phân chúng hơn nữa bằng các enzyme nội bào, hoặc bằng cách thủy
phân các oligosacarit bằng các enzyme ngoại bào và vận chuyển các monosacarit được hình
thành vào tế bào (Amaretti et al., 2006). Tăng trưởng mạnh hơn củaB. vị thành niênATCC
15703 trên XOS so với trên xyloza chỉ ra rằng XOS ngắn (X2, X3) được vận chuyển vào bên
trong tế bào chứ không bị thủy phân ngoại bào thành xyloza. Các ưu tiên tương tự của cùng
một chủng vi khuẩn đối với di- và oligosacarit so với monosacarit cũng đã được ghi nhận
trong các nghiên cứu trước đây (Crittenden et al., 2002; Palframan et al., 2003; Amaretti et
al., 2006). Hơn nữa, Palframan et al. (2003) cho thấy rằngB. vị thành niên ATCC 15703 tạo ra
hoạt động --D-xylosidase ngoại bào khi được nuôi cấy trên XOS. Các
sự hiện diện của --D-xylosidase ngoại bào cũng được chỉ ra trong nghiên cứu này, vì xyloza
hình thành được phát hiện sau khi nuôi cấyB. vị thành niênATCC 15703 về sản phẩm thủy
phân XOS và AX. Việc tăng chiều dài chuỗi XOS lên DP 4-6 làm giảm hiệu quả củaB. vị thành
niênATCC 15703 trong việc sử dụng các XOS này (Moura et al., 2007; Gullón et al., 2008), rất
có thể là do XOS dài hơn trước tiên cần được thủy phân bởi một enzyme ngoại bào thành
XOS ngắn hơn. Trái ngược vớiB. vị thành niênATCC 15703, Palframan và cộng sự. (2003) báo
cáo rằngB. longumATCC 15707 cho thấy không có hoạt động --D-xylosidase ngoại bào, đồng
ý với nghiên cứu hiện tại trong đó không phát hiện thấy việc tiêu thụ xylobiose.
Từ dữ liệu thu được, rõ ràng là AXOS bị thủy phân ngoại bào bởi
-Larabinofuranosidase. Cả haiB. vị thành niênATCC 15703 vàB. longumATCC 15707
có thể tách mối liên kết giữa L-arabinose và xyloza, do không phát hiện thấy AXOS
chuỗi ngắn nào sau khi nuôi cấy bằng các sản phẩm thủy phân AX.Bifidobacterium
vị thành niênATCC 15703 được biết là thể hiện hai --Larabinofuranosidase ngoại
bào riêng biệt (van Laere et al., 1999; van Den Broek và Voragen, 2008).
91
Bifidobacterium breveK-110, được phân lập từ ruột người, cũng tạo ra --D-
xylosidase và --L-arabinofuranosidase (Shin và cộng sự, 2003a, 2003b). Mặt khác, kết
quả sơ bộ từ trình tự bộ gen củaB. breveUCC2003 cho thấy không có enzyme phân hủy
AX (van Den Broek và Voragen, 2008). Trong các nghiên cứu hiện tại và trước đây,B.
breveATCC 15700 không thể phát triển trên xylose hoặc L-arabinose (Mitsuoka, 1982;
Roy và Ward, 1990; Palframan và cộng sự, 2003). Degnan và Macfarlane (1993) đã chỉ ra
rằng để vận chuyển L-arabinose,B. breveNCFB 2257 yêu cầu glucose trong môi trường
nuôi cấy, cho thấy có sự đồng vận chuyển. Việc thiếu đồng vận chuyển có thể, ngoài
việc thiếu enzyme để thủy phân (A)XOS, một lời giải thích tiềm năng khác cho sự tăng
trưởng kém củaB. breveATCC 15700 khi xyloza, L-arabinose và (A)XOS là cacbohydrat
duy nhất có trong môi trường canh tác.
Sau khi ủB. vị thành niênvới các sản phẩm thủy phân WAX và RAX, lượng L-arabinose tự do được
tìm thấy trong các mẫu nhiều gấp đôi so với lượng L-arabinose có thể được tạo thành từ AXOS
ngắn, được định lượng trong các sản phẩm thủy phân. Điều này chỉ ra rằng L-arabinose cũng
được giải phóng khỏi AXOS dài hơn, không xác định có trong các mẫu. Hơn nữa,B. longumđã
không thể sử dụng xylobiose và xylotriose từ các sản phẩm thủy phân WAX và RAX, và đáng ngạc
nhiên là lượng XOS ngắn này được phát hiện trong các mẫu sau khi lên men, nhiều hơn 7-8 lần so
với lượng có thể được giải phóng từ AXOS đã định lượng. Trong trường hợp này, xylobiose và
xylotriose bổ sung cũng có thể bắt nguồn từ AXOS dài hơn. Sau khi phát hành L-Arafthay thế,B.
longumcó thể thủy phân XOS thu được hơn nữa, ví dụ như sử dụng xylanase (exo) cụ thể như
được tạo ra bởiAeromonas caviaeME-1 (Kubata và cộng sự, 1994). Sự hình thành nhiều xylobiose
và xylotriose trong quá trình sinh trưởng củaB. longumkhá thú vị vì nó không tiêu thụ những
carbohydrate này.
Một số kết quả liên quan đến việc sử dụng D-xylose, L-arabinose và XOS không
phù hợp với tài liệu, có thể do một số lý do, từ các điều kiện thí nghiệm khác nhau
đến các chất nền khác nhau và khó khăn trong việc giải thích
92
kết quả. Trong nghiên cứu hiện tại, vi khuẩn bifidobacteria chỉ có thể sử dụng một số
chất nền trong điều kiện khắc nghiệt, khi không có sẵn chất nền phù hợp hơn hoặc
mặt khác, chỉ khi các chất nền khác cũng có mặt để kích hoạt việc sử dụng
carbohydrate khó khăn hơn. Hàm lượng cacbohydrat ban đầu của các chất nền đã
được nghiên cứu và ngoài việc chỉ quan sát sự phát triển của vi khuẩn, HPAEC-PAD còn
theo dõi nồng độ của từng loại cacbohydrat để cung cấp bằng chứng về việc
cacbohydrat nào gây ra sự phát triển.
6.6.3 Các tính năng cụ thể trong việc sử dụng AXOS tinh khiết
Các thí nghiệm lên men với AXOS tinh khiết cho thấy rằng A2XX là một chất nền dễ dàng hơn
so với A được thay thế kép2+3XX, vì loại thứ nhất được lên men hoàn toàn bởi cả hỗn hợp vi
khuẩn bifidobacteria thuần túy và hệ vi sinh vật trong phân, trong khi loại thứ hai chỉ được
sử dụng bởi hỗn hợp vi khuẩn trong phân. Tuy nhiên, ngay cả sau khi hệ vi sinh vật trong
phân phát triển, một số mono- và oligosacarit đã được phát hiện, bao gồm A2XX được hình
thành sau sự phân tách của một L-Arafđơn vị từ D-Xyl được thế képPdư trong A2+3XX. Loại bỏ
L-Ara đầu tiênfđơn vị dường như là một thách thức, nhưng sau đó, có thể đạt được quá trình
lên men hoàn toàn của AXOS thay thế đơn lẻ được hình thành. Tuy nhiên, việc tiêu thụ AXOS
thay thế kép chậm do carbohydrate vẫn được phát hiện sau 48 giờ ủ A2+3XX dễ dàng được sử
dụng trong các quá trình lên men khác. Do đó, có thể giả định rằng chỉ một số loài vi khuẩn
trong hệ vi sinh vật trong phân người có thể giải phóng L-Ara được liên kết --1-3fđơn vị từ D-
Xyl được thay thế képPphần còn lại. Hơn nữa, sau khi lên men hệ vi sinh vật trong phân trên
A2+3XX, độ pH là 4 và sự phát triển của các loài bifidobacteria trong ruột ở độ pH thấp hơn
4,5 là rất hạn chế (Biavati và Mattarelli, 2006), cho thấy rõ ràng rằng các vi khuẩn khác ngoài
bifidobacteria lên men phân hủy AXOS. Điều này được hỗ trợ bởi mô hình lên men đã thay
Phân tích t-RFLP của các mẫu phân chỉ ra rằng các AXOS khác nhau có thể dẫn đến sự phân bố
khác nhau của vi khuẩn bifidobacteria, vì không phải tất cả các AXOS đều hỗ trợ sự phát triển của
cùng một loài vi khuẩn bifidobacteria. Với AXOS được thay thế kép làm chất nền, không rõ liệu sự
thay đổi nhỏ trong phân bố bifidobacteria là do vi khuẩn nhóm 2 chết nhanh hơn hay do vi khuẩn
nhóm 1 tăng trưởng nhanh hơn. Phân tích t-RFLP không cung cấp
93
số lượng vi khuẩn bifidobacteria, nhưng việc giảm số lượng vi khuẩn bifidobacteria có thể
xảy ra nếu các vi khuẩn khác đang sử dụng AXOS bị phân hủy tinh khiết, như đã đề xuất ở
trên. Vì các AXOS được thay thế kép đã được tiêu thụ bởi tinh khiếtB. vị thành niênATCC
15703 vàB. longumATCC 15707 từ sản phẩm thủy phân WAX, A tinh khiết2+3XX có thể đã
không thể kích thích sản xuất --L-arabinofuranosidase thiết yếu. Gueimonde và cộng sự.
(2007) báo cáo rằng GH 51 --L-arabinofuranosidase củaB. longumNIZO B667 được tạo ra bởi
Một cách thú vị,B. vị thành niênATCC 15703 không lên men L-arabinose, mặc dù nó có -- L-
arabinofuranosidase. Nhu cầu sinh vật này sản xuất các enzym này có thể là để phân giải AXOS để
thu được xyloza, không phải L-arabinose. Nó cũng hấp dẫn để đưa ra giả thuyết rằng
sự giải phóng L-arabinose là kết quả của hành động củaB. vị thành niên--
Larabinofuranosidase có thể cung cấp nguồn carbon cho các vi khuẩn bifidobacteria khác, ví
dụ:B. longum, cho thấy sự hiệp đồng phức tạp của vi khuẩn sinh học. Điều này thực sự đã
được quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại khi tinh khiết A2XX đã được tiêu thụ hoàn toàn
bởi hỗn hợp củaB. vị thành niên,B. breveVàB. longum. Dấu hiệu khác cho thấy có thể có một
sức mạnh tổng hợp linh hoạt giữaB. vị thành niênVàB. longumlà sự tích tụ của xylobiose và
xylotriose bởiB. longumkhi phát triển trên các chất thủy phân AX, vì XOS ngắn là cơ chất ưa
Phân tích sắc ký chi tiết của mono- và oligosacarit sau quá trình lên men cho thấy cái nhìn
sâu sắc mới về carbohydrate, đặc biệt là AXOS, được tiêu thụ bởi vi khuẩn bifidobacteria đã
nghiên cứu. Kiến thức mới về sự bất lực củaB. vị thành niênATCC 15703 để tiêu thụ L-
arabinose mà nó tách ra từ các AXOS khác nhau cũng đã thu được. Dựa trên kết quả của
chúng tôi và kết hợp với các nghiên cứu trước đây của các nhóm khác, (A)XOS ngắn hạn hỗ
trợ sự tăng trưởng củaB. vị thành niênATCC 15703, trong khi AXOS được thay thế cao và
thậm chí cả AX polyme, hỗ trợ sự phát triển củaB. longumATCC 15707, chủ yếu sử dụng L-
Araf nhóm thế. AXOS rõ ràng là những ứng cử viên tiềm năng cho prebiotic chọn lọc, nhưng
hiệu quả lên men và hiệu ứng prebiotic dường như phụ thuộc vào loại L-Arafthay thế. AXOS
với D-Xyl được thay thế képPđược lên men kém hiệu quả hơn AXOS với D-Xyl được thay thế
đơn lẻP. Mặc dù bị cô lập A2+3XX không được lên men bởi hỗn hợp các chủng bifidobacteria
tinh khiết, nó được tiêu thụ bởi hệ vi sinh vật phân đa năng. AXOS được thay thế kép cũng
VàB. longumATCC 15707 khi có mặt trong dịch thủy phân cùng với xyloza, XOS và AXOS thế
đơn. Do đó, một hỗn hợp các AXOS thay thế đơn lẻ và kép khác nhau có thể hoạt động như
một chất tiền sinh học, lên men chậm, phù hợp. Kết quả cũng phản ánh sự hợp tác phức tạp
giữa bifidobacteria trong việc tiêu thụ AXOS. Trong nghiên cứu hiện tại, các sacarit tinh khiết
có nguồn gốc từ AX được sử dụng làm nguồn carbon duy nhất, nhưng trong ruột kết cũng
có sẵn các loại carbohydrate khác. Điều này có thể góp phần vào quá trình lên men của
AXOS đầy thách thức thông qua việc kích hoạt các enzym thủy phân, hệ thống vận chuyển
hoặc kích hoạt con đường bifidus. Do đó, cần nghiên cứu thêm về sự tương tác của các
prebiotic giả định khác nhau liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn sinh học.
95
kết luận
Ngũ cốc AX được thủy phân hiệu quả bởi Shearzyme (A. aculeatusGH 10kết thúc-1,4---
Dxylanase) thành xylose, XOS và AXOS. Enzyme này hoạt động trên liên kết xylosid ở
đầu không khử của chuỗi xyloza, trước cả hai mono --L-Araf(1-2)- và --L-
Araf(1-3)-được thay thế --D-XylPđơn vị, cũng như gấp đôi --L-Araf(1-2)- và (1-3)-
thay thế --D-XylPdư lượng và cũng 2-Ô---D-XylP---L-Arafchuỗi bên gắn vào
- - D-XylPđơn vị. Do đó, Shearzyme tạo ra AXOS chuỗi ngắn với các nhóm thế cuối
cùng không khử. Hiệu suất của XOS và AXOS được khuếch đại, sử dụng kết hợp --
L-arabinofuranosidase khác nhau (AXH-m và AXH-d3) để sửa đổi thay thế
mô hình của AX trướckết thúc-1,4---Điều trị D-xylanase. Hơn nữa, các AXOS thay thế đa dạng
được điều chế bằng quá trình thủy phân từng bước bằng sự kết hợp của các enzym trước
đó.
Sự khác biệt trong cấu trúc của một số AX được chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây ngũ
cốc đã được phát hiện bằng cách nghiên cứu cấu trúc của AX cao phân tử bằng quang phổ NMR
và bằng cách kiểm tra các sản phẩm thủy phân bằng HPAEC-PAD. Hai phương pháp này đang hỗ
trợ, vì quang phổ NMR cung cấp thông tin về toàn bộ phân tử AX từ phần hòa tan trong nước của
mẫu, nhưng thông tin về phần không hòa tan trong nước bị mất. Sử dụng các sản phẩm thủy
phân để làm sáng tỏ AX, khả năng hòa tan hoàn toàn không quan trọng trong việc chuẩn bị các
sản phẩm thủy phân, nhưng các khu vực được thay thế nhiều nhất của AX có thể vẫn còn nguyên
vẹn bởi enzyme. WAX-mv, WBAX, RAX, RBAX và OBAX khá giống nhau với mức DS tương đối cao.
Những loại bột và cám AX này chứa một lượng lớn --L-
AXOS tinh khiết được chuẩn bị với năng suất tốt trong nghiên cứu này là: A3X, MỘT2X, MỘT2XX,
MỘT2+3X, MỘT2+3XX và D2,3X. Với AXOS được thay thế kép, A2+3XX là oligosacarit chính được tạo
thành trong quá trình thủy phân và A2+3X là tiểu phẩm, ngược lại với sản phẩm tương ứng
96
AXOS đơn thế từ đó A2X là chính và A2XX sản phẩm thủy phân nhỏ. AXOS tinh khiết
là công cụ vô giá để nghiên cứu thứ tự rửa giải và phản ứng trong HPAEC-PAD,
đồng thời chúng còn được sử dụng làm hợp chất chuẩn trong phân tích TLC và
HPAEC-PAD.
Việc tách hoàn toàn AXOS là cần thiết để định lượng chính xác. Với phương pháp
HPAEC-PAD được sử dụng, khả năng tách A tốt3X, MỘT2X, MỘT2+3X và A2+3Đã thu
được XX, nhưng A2XX và D2,3X không tách rời hoàn toàn. Thường là A2XX hiếm khi
có được, vì --L-Araf(1-2)mono là nhóm thế nhỏ trong AX. MỘT2XX và D2,3X được
phân tách trên TLC, có thể được sử dụng kết hợp với HPAEC-PAD để xác định
AXOS. Để định lượng AXOS và các cacbohydrat khác được tạo ra trong quá trình
thủy phân, cần có các tiêu chuẩn tương ứng cho từng hợp chất vì không thể so
sánh chiều cao pic như vậy, do phản ứng với các monosacarit khác nhau, XOS và
AXOS khác nhau trong PAD.
Lần đầu tiên, tiềm năng tiền sinh học của AXOS tinh khiết đã được nghiên cứu trongtrong ống
nghiệm thí nghiệm lên men. Các chất thủy phân AXOS, L-arabinose, D-xylose, XOS, RAX và WAX,
và FOS (kiểm soát tích cực) đã được sử dụng làm chất nền cho hệ vi sinh vật phân và
bifidobacteria tinh khiết. Dựa trên kết quả thu được,B. vị thành niênATCC 15703 có thể sử dụng
XOS, một số D-xylose, nhưng không sử dụng L-arabinose.B. longumATCC 15707 thích Larabinose
hơn, nhưng không thể phát triển trên D-xylose hoặc XOS thuần túy.B. breveATCC 15700 phát triển
kém trên tất cả các chất nền được cung cấp. Thông tin chi tiết mới về số phận của từng AXOS
trong quá trình lên men đã được thu thập. Cả haiB. vị thành niênVàB. longumcó thể phát triển
trên AXOS, nhưng chúng đã lên men oligosacarit với các chiến lược khác nhau, vì sau khi phân
tách L-arabinoseB. vị thành niênsử dụng XOS hình thành, trong khiB. longumsử dụng L-arabinose
được giải phóng. Kết quả cho thấy rằng khả năng phát triển trên một số AXOS nhất định không
phải lúc nào cũng có nghĩa là sử dụng hoàn toàn. AXOS tinh khiết với D-Xyl được thay thế képP
được lên men kém hiệu quả hơn AXOS với D-Xyl được thay thế đơn lẻPbởi sự kết hợp của ba vi
khuẩn bifidobacteria. Tuy nhiên, AXOS thay thế kép cũng được sử dụng bởiB. vị thành niênVàB.
longumkhi có mặt trong dịch thủy phân cùng với xyloza, XOS và AXOS thế đơn. AXOS thay thế kép
được phân lập đã được lên men bởi hệ vi sinh vật phân linh hoạt. Do đó, một hỗn hợp các AXOS
thay thế đơn lẻ và kép khác nhau có thể hoạt động như một chất tiền sinh học lên men chậm, phù
hợp.
97
AACC. 2001. Định nghĩa về chất xơ. Thế giới thực phẩm ngũ cốc 46, 112-126.
Alonso, JL, Domínguez, H., Garrote, G., Parajó, JC và Vázquez, MJ 2003. Xylooligosacarit:
đặc tính và công nghệ sản xuất. điện tử. J. Môi trường. nông nghiệp. Hóa chất thực
phẩm 2.
Amaretti, A., Tamburini, E., Bernardi, T., Pompei, A., Zanoni, S., Vaccari, G., Matteuzzi, D. và
Rossi, M. 2006. Ưu tiên cơ chất của Bifidobacterium Teenis MB 239: so sánh tăng trưởng
trên carbohydrate đơn và hỗn hợp. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 73, 654-662.
Andersson, R. và Åman, P. 2001. Ngũ cốc arabinoxylan: Sự xuất hiện, cấu trúc và đặc tính.
quảng cáo Công nghệ chất xơ ăn kiêng. 301-314.
Andrewartha, KA, Phillips, DR và Stone, BA 1979. Tính chất dung dịch của
arabinoxylans bột mì và arabinoxylans biến đổi enzym. Cacbohydrat độ phân giải 77,
191- 204.
Angelidaki, I., Petersen, SP và Ahring, BK 1990. Ảnh hưởng của lipid đối với quá trình tiêu
hóa kỵ khí ưa nhiệt và giảm ức chế lipid khi bổ sung bentonit. ứng dụng vi sinh vật. công
nghệ sinh học. 33, 469-472.
Aspinall, GO 1959. Hóa học cấu trúc của hemiaellulose. quảng cáo Cacbohydrat hóa học. 14,
429-468.
Aspinall, GO 1980. Hóa học của polysacarit thành tế bào. hóa sinh. Thực vật 3, 473-500.
Aspinall, GO và Ferrier, RJ 1957. Cấu tạo của hemicellulose vỏ lúa mạch. J. Chem.
Sóc. 4188-4194.
Bacic, A. và Stone, B. 1980. A (1-3)- và (1-4)---glucan trong thành tế bào nội nhũ của lúa
mì. Cacbohydrat độ phân giải 82, 372-377.
Bacic, A. và Stone, BA 1981. Hóa học và tổ chức của các thành phần thành tế bào
aleurone từ lúa mì và lúa mạch. Aust. J. Sinh lý thực vật. 8, 475-495.
Bataillon, M., Mathaly, P., Nunes Cardinali A.-P. và Duchiron, F. 1998. Chiết xuất và tinh chế
arabinoxylan từ cám lúa mì đã tách tinh bột ở quy mô thí điểm. Ind. Cây trồng. sản xuất. 8,
37-43.
98
Beaugrand, J., Chambat, G., Wong, VWK, Goubet, F., Rémond, C., Paës, G., Benamrouche, S.,
Debeire, P., O'Donohue, M. và Chabbert, B. 2004. Tác động và hiệu quả của endoxylanase
chịu nhiệt GH10 và GH11 đối với cám lúa mì và arabinoxylan có thể chiết xuất bằng kiềm.
Cacbohydrat độ phân giải 339, 2529-2540.
Biavati, B. và Mattarelli, P. 2006. Họ bifidobacteriaceae. Trong: Sinh vật nhân sơ. Dworkin,
M., Falkow, S., Rosenberg, E. và Schleifer, K.-H. (Biên tập), Springer, New York, trang
3322-3382.
Bicking, MKL 2006. Lỗi tích hợp trong phân tích sắc ký, Phần I: Các đỉnh có kích
thước xấp xỉ bằng nhau. (Bìa truyện). LC-GC Bắc Mỹ 24, 402-414.
Bielecka, M., Biedrzycka, E. và Majkowska, A. 2002. Lựa chọn men vi sinh và prebiotic cho chế phẩm sinh tổng
hợp và xác nhận tác dụng của chúngtrong cơ thể sốngtính hiệu quả. Thực phẩm Res. quốc tế 35, 125-131.
Biely, P. 1985. Hệ thống phân giải xylan của vi sinh vật. Xu hướng Công nghệ sinh học. 3, 286-290.
Brillouet, JM, Joseleau JP, Utille JP và Lelievre D. 1982. Cô lập, tinh chế và mô tả đặc tính của
phức hợp heteroxylan từ cám lúa mì công nghiệp. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 30,
488-495.
Broberg, A., Thomsen, KK và Duus, JO 2000. Ứng dụng NMR đầu dò nano để xác định
cấu trúc của lượng nanomole thấp arabinoxylan oligosacarit được phân đoạn bằng
HPAEC-PAD phân tích. Cacbohydrat độ phân giải 328, 375-382.
Campbell, JM, Fahey GC, Jr. và Wolf BW 1997a. Các oligosacarit khó tiêu được chọn lọc
ảnh hưởng đến khối lượng ruột già, axit béo chuỗi ngắn phân và phân, pH và hệ vi sinh
vật ở chuột. J. Nutr. 127, 130-136.
Campbell, JM, Fahey, GC, Jr, Demichele, SJ và Garleb, KA 1997b. Đặc điểm trao đổi chất của nam
giới trưởng thành khỏe mạnh khi bị ảnh hưởng bởi việc uống công thức dinh dưỡng dạng lỏng có
chứa dầu cá, oligosacarit, kẹo cao su arabic và vitamin chống oxy hóa. Hóa chất thực phẩm chất
độc. 35, 1165-1176.
Carpita, NC và Gibeaut, DM 1993. Mô hình cấu trúc của thành tế bào sơ cấp ở thực vật có
hoa: tính nhất quán của cấu trúc phân tử với các đặc tính vật lý của thành trong quá trình
tăng trưởng. Nhà máy J. 3, 1-30.
Cleemput, G., van Laere, K., Hessing, M., Van Leuven, F., Torrekens, S. và Delcour,
JA 1997. Xác định và mô tả đặc tính của arabinoxylanase mới từ bột mì. Vật lý thực
vật. 115, 1619-1627.
99
Cloetens, L., De Preter, V., Swennen, K., Broekaert, WF, Courtin, CM, Delcour, JA, Rutgeerts, P. và
Verbeke, K. 2008. Tác dụng đáp ứng liều lượng của arabinoxylooligosacarit đối với nhu động và trên
đường tiêu hóa sự trao đổi chất của vi khuẩn đại tràng ở những người tình nguyện khỏe mạnh. Mứt. sưu
tầm. Dinh dưỡng. 27, 512.
Collins, MD và Gibson, GR 1999. Probiotic, prebiotic và synbiotic: phương pháp điều chỉnh hệ
sinh thái vi sinh vật trong ruột. Là. J. Lâm sàng. Dinh dưỡng. 69, 1052S-1057.
Collins, T., Gerday, C. và Feller, G. 2005. Các xylanase, các họ xylanase và các
xylanase cực ưa nước. Vi sinh vật FEMS. Kh 29, 3-23.
Courtin, CM và Delcour, JA 2001. Hoạt động tương đối của endoxylanase đối với arabinoxylan có thể chiết xuất
được từ nước và nước không thể chiết xuất được. J. Khoa học ngũ cốc. 33, 301-312.
Crittenden, RG và Playne, MJ 1996. Sản xuất, tính chất và ứng dụng của oligosacarit cấp thực
phẩm. Xu hướng khoa học thực phẩm. công nghệ. 7, 353-361.
Crittenden, R., Karppinen, S., Ojanen, S., Tenkanen, M., Fagerström, R., Mättö, J., Saarela, M.,
Mattila-Sandholm, T. và Poutanen, K. 2002.Trong ống nghiệmlên men carbohydrate chất xơ ngũ
cốc bằng vi khuẩn sinh học và đường ruột. J. Khoa học. Thực phẩm nông nghiệp. 82, 781-789.
Cyran, M., Courtin, CM và Delcour, JA 2003. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan được chiết xuất bằng
nước ở các nhiệt độ khác nhau từ hai loại bột lúa mạch đen có chất lượng làm bánh mì đa dạng. J. Nông
nghiệp. Hóa chất thực phẩm 51, 4404-4416.
Cyran, M., Courtin, CM và Delcour, JA 2004. Tính không đồng nhất trong cấu trúc mịn của arabinoxylan
có thể chiết xuất bằng kiềm được phân lập từ hai loại bột lúa mạch đen có chất lượng làm bánh mì cao
và thấp và sự cùng tồn tại của chúng với các thành phần khác của thành tế bào. J. Nông nghiệp. Hóa
chất thực phẩm 52, 2671-2680.
De Preter, V., Geboes, K., Verbrugghe, K., De Vuyst, L., Vanhoutte, T., Huys, G., Swings, J., Pot, B. và
Verbeke, K. 2004. Thetrong cơ thể sốngsử dụng các chất đánh dấu sinh học được đánh dấu bằng đồng vị
ổn định là lactose-[N]ureide và [H4]tyrosine để đánh giá tác động của pro- và prebiotic đối với hệ vi
khuẩn đường ruột của những người tình nguyện khỏe mạnh. anh J. Nutr. 92, 439.
Dekker, RFH và Richards, GN 1975. Tinh chế, đặc tính và phương thức hoạt động của
hemicellulase II được sản xuất bởiCeratocystis nghịch lý. Cacbohydrat độ phân giải 42, 107-123.
Delcour, JA, Rouseu, N. và Vanhaesendonck, IP 1999. Phân lập ở quy mô thí điểm các arabinoxylan có thể
chiết xuất từ nước từ lúa mạch đen. Ngũ cốc Chem. 76, 1-2.
Dervilly, G., Leclercq, C., Zimmermann, D., Roue, C., Thibault, JF và Saulnier, L. 2002. Phân lập và
mô tả đặc tính của arabinoxylan tan trong nước có khối lượng mol cao từ lúa mạch và mạch nha
lúa mạch. Cacbohydrat polyme. 47, 143-149.
100
Dervilly-Pinel, G., Rimsten, L., Saulnier, L., Andersson, R. và Åman, P. 2001. arabinoxylan có thể chiết xuất
bằng nước từ bột lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen và triticale. Bằng chứng về sự hiện diện của các chất
làm mờ axit ferulic và sự tham gia của chúng trong quá trình hình thành gel. J. Khoa học ngũ cốc. 34,
207-214.
Duncan, SH, Louis, P. và Flint, H. 2004. Vi khuẩn sử dụng lactate, được phân lập từ phân người, tạo
ra butyrate như một sản phẩm lên men chính. ứng dụng môi trường. Vi khuẩn. 70, 5810-5817.
Dyson, NA 1998. Diện tích cực đại so với chiều cao cực đại. TRONG:Phương pháp tích hợp sắc ký.
Humana Press, Totowa, NJ USA, trang 83-88.
Ebringerová, A., Hromádková, Z., Petráková, E. và Hricovíni, M. 1990. Đặc điểm cấu trúc của L-
arabino-D-xylan hòa tan trong nước từ cám lúa mạch đen. Cacbohydrat độ phân giải 198, 57-66.
Ebringerová, A., Hromádková, Z., Alfoldi, J. và Berth, G. 1992. Đặc tính cấu trúc và dung dịch
của heteroxylan lõi ngô. Cacbohydrat polyme. 19, 99-105.
Ebringerová, A., Hromádková Z., Burchard W., Dolega R. và Vorwerg W. 1994. Tính chất dung dịch
của arabinoxylan cám lúa mạch đen không tan trong nước. Cacbohydrat polyme. 24, 161- 169.
Ebringerová, A. và Hromádková Z. 1997. Ảnh hưởng của siêu âm đến cấu trúc và tính
chất của heteroxylan vỏ ngô tan trong nước. siêu âm. Sonochem. 4, 305-309.
Ebringerová, A. và Heinze, T. 2000. Xylan và các dẫn xuất của xylan - polyme sinh học có
các đặc tính quý giá. 1. Cấu trúc, quy trình và đặc tính của xylans tự nhiên. Macromol.
Cộng đồng nhanh chóng 21, 542-556.
EFSA (Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu). 2009. Ý kiến khoa học (bản thảo); Giá trị tham
khảo chế độ ăn uống cho carbohydrate và chất xơ. EFSA J. 1-76.
Ewald, CM và Perlin, AS 1959. Sự sắp xếp phân nhánh trong arabino-xylan từ bột
mì. Có thể. J. Chem. 37, 1254-1259.
Faulds, CB, Sancho, AI và Bartolomé, B. 2002. Sự giải phóng axit ferulic mono và dimeric từ ngũ cốc đã qua sử
dụng của nhà sản xuất bia bởi các este feruloyl của nấm. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 60, 489-494.
Fauré, R., Courtin, CM, Delcour, JA, Dumon, C., Faulds, CB, Fincher, GB, Fort, S., Fry, SC,
Halila, S., Kabel, MA, Pouvreau, L., Quemener , B., Rivet, A., Saulnier, L., Schols, HA, Driquez,
H. và O D́onohue, MJ 2009. Một hệ thống đặt tên ngắn gọn và giàu thông tin cho các họa tiết
oligosacarit của heteroxylan được tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Aust. J. Chem. 62,
1-5.
Ferré, H., Broberg, A., Duus, JO và Thomsen, KK 2000. Một loại arabinoxylan
arabinofuranohydrolase mới được phân lập từ lúa mạch nảy mầm. Phân tích ưu tiên cơ chất
và tính đặc hiệu bằng đầu dò nano NMR. Ơ. J. Hóa sinh. 267, 6633-6641.
Fincher, GB 1975. Hình thái và thành phần hóa học của thành tế bào nội nhũ lúa mạch. Viện
J. Sản xuất bia 81, 116-122.
101
Fujimoto, Z., Kaneko, S., Kuno, A., Kobayashi, H., Kusakabe, I. và Mizuno, H. 2004. Cấu trúc
tinh thể của xylooligosaccharide được trang trí liên kết với họ 10 xylanase từ Streptomyces
olivaceoviridisE-86. J. Sinh học. hóa học. 279, 9606-9614.
Fulcher, RG và Duke, TKR 2002. Cấu trúc và tổ chức của ngũ cốc nguyên hạt: Ý nghĩa đối với các
chuyên gia dinh dưỡng và các nhà chế biến.Trong: Thực phẩm nguyên hạt đối với sức khỏe và
bệnh tật. Marquart, L., Slavin, JL và Fulcher, RG (Eds.), Hiệp hội các nhà hóa học ngũ cốc Hoa Kỳ, St.
Paul, Minnesota, Hoa Kỳ, trang 9-45.
Garrote, G. và Parajó, JC 2002. Tự thủy phân không đẳng nhiệt củabạch đàngỗ. Khoa học gỗ
công nghệ. 36, 111-123.
Gibson, GR và Roberfroid, MB 1995. Điều chỉnh chế độ ăn uống của hệ vi sinh vật ruột kết
của con người: giới thiệu khái niệm về prebiotic. J. Nutr. 125, 1401-1412.
Gibson, GR, Probert, HM, van Loo, J., Rastall, RA và Roberfroid, MB 2004. Điều chỉnh chế độ ăn
uống của hệ vi sinh vật đại tràng ở người: cập nhật khái niệm về prebiotic. Dinh dưỡng. độ phân
giải Rev. 17, 259-275.
Glitsø, LV và Bach Knudsen, KE 1999. Xay lúa mạch đen nguyên hạt để thu được các phần có
đặc tính chất xơ khác nhau. J. Khoa học ngũ cốc. 29, 89-97.
Grootaert, C., Delcour, JA, Courtin, CM, Broekaert, WF, Verstraete, W. và Van de Wiele, T.
2007. Chuyển hóa vi sinh vật và tiềm năng tiền sinh học của arabinoxylan oligosacarit trong
ruột người. Xu hướng khoa học thực phẩm. Công nghệ. 18, 64-71.
Grootaert, C., Van den Abbeele, P., Marzorati, M., Broekaert, WF, Courtin, CM, Delcour,
JA, Verstraete, W. và Van de Wiele, T. 2009. So sánh tác dụng tiền sinh học của
arabinoxylan oligosacarit và inulin trong một mô phỏng hệ sinh thái vi khuẩn đường
ruột của con người. Vi sinh vật FEMS. sinh thái. 69, 231-242.
Gruppen, H., Hamer, RJ và Voragen, AGJ 1991. Bari hydroxit như một công cụ để chiết xuất arabinoxylan
tinh khiết từ vật liệu thành tế bào không tan trong nước của bột mì. J. Khoa học ngũ cốc. 13, 275-290.
Gruppen, H., Kormelink, FJM và Voragen, AGJ 1993. Vật liệu thành tế bào không thể chiết xuất
bằng nước từ bột mì. 3. Mô hình cấu trúc của arabinoxylan. J. Khoa học ngũ cốc. 18, 111- 128.
Gueimonde, M., Noriega, L., Margolles, A. và de los Reyes-Gavilan, C. 2007. Cảm ứng hoạt
động của -L-arabinofuranosidase bởi monomeric carbohydrate trongBifidobacterium
longumvà tính phổ biến của các gen mã hóa. Vòm. vi sinh vật. 187, 145-153.
Gullón, P., Moura, P., Esteves, MP, Girio, FM, Domínguez, H. và Parajó, JC 2008. Đánh giá khả
năng lên men của xylooligosaccharides từ vỏ trấu bằng vi khuẩn probiotic. J. Nông nghiệp.
Hóa chất thực phẩm 56, 7482-7487.
102
Hardy, MR và Townsend, RR 1988. Tách các đồng phân vị trí của oligosacarit và
glycopeptide bằng sắc ký trao đổi anion hiệu suất cao với phát hiện ampe kế xung.
PNAS, Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 85, 3289-3293.
Härkönen, H., Pessa, E., Suortti, T. và Poutanen, K. 1997. Sự phân bố và một số tính chất của
polysaccharid vách tế bào trong các phần nghiền lúa mạch đen. J. Khoa học ngũ cốc. 26, 95-104.
Henry, RJ 1985. So sánh các loại carbohydrate không chứa tinh bột trong hạt ngũ cốc. J. Khoa học. Thực phẩm
nông nghiệp. 36, 1243-1253.
Hoffmann, RA, Kamerling, JP và Vliegenthart, JFG 1992. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan
tan trong nước từ nội nhũ của lúa mì. Cacbohydrat độ phân giải 226, 303-311.
Höije, A., Sandström C., Roubroeks JP, Andersson R., Gohil S. và Gatenholm P. 2006. Bằng chứng
về sự hiện diện của chuỗi bên 2-O---D-xylopyranosyl- -L-arabinofuranose trong vỏ lúa mạch
arabinoxylan . Cacbohydrat độ phân giải 341, 2959-2966.
Höije, A., Sternemalm, E., Heikkinen, S., Tenkanen, M. và Gatenholm, P. 2008. Tính chất vật
liệu của màng từ arabinoxylan được điều chỉnh bằng enzym. Đại phân tử sinh học 9,
2042-2047.
Holzapfel, WH và Schillinger, U. 2002. Giới thiệu về men vi sinh và tiền sinh học. Thực phẩm Res. quốc tế
35, 109-116.
Hopkins, MJ, Englyst, HN, Macfarlane, S., Furrie, E., Macfarlane, GT và McBain, AJ 2003. Sự
thoái hóa của arabinoxylan liên kết chéo và không liên kết chéo bởi hệ vi sinh vật đường
ruột ở trẻ em. ứng dụng môi trường. vi sinh vật. 69, 6354-6360.
Hromádková, Z., Ebringerová, A., Petráková, E. và Schraml, J. 1987. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan
cám lúa mạch đen với mức độ phân nhánh thấp. Cacbohydrat độ phân giải 163, 73-79.
Hughes, SA, Shewry, PR, Li, L., Gibson, GR, Sanz, ML và Rastall, RA 2007.Trong ống nghiệm
lên men bởi hệ vi sinh phân người của lúa mì arabinoxylans. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực
phẩm 55, 4589-4595.
Imaizumi, K., Nakatsu, Y., Sato, M., Sedarnawati, Y. và Sugano, M. 1991. Ảnh hưởng của xylooligosaccharides đối
với đường huyết, lipid huyết thanh và gan và axit béo chuỗi ngắn ở manh tràng ở chuột mắc bệnh tiểu đường.
nông nghiệp. sinh học. hóa học. 55, 199-205.
Ishii, T. 1997. Cấu trúc và chức năng của polysacarit feruloyl hóa. Khoa học thực vật 127,
111-127.
Izydorczyk, MS và Biliaderis, CG 1993. Tính không đồng nhất về cấu trúc của arabinoxylan nội nhũ
lúa mì. Ngũ cốc Chem. 70, 641-646.
Jaskari, J., Kontula, P., Siitonen, A., Jousimies-Somer, H., Mattila-Sandholm, T. và Poutanen, K.
1998. Beta-glucan và xylan yến mạch thủy phân làm chất nền chọn lọc cho Bifidobacterium
VàLactobacilluschủng. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 49, 175-181.
Jeffries, TW 1990. Sự phân hủy sinh học của phức hợp lignin-carbohydrate. Phân hủy sinh học, 1,
163-176.
Johansson, L., Virkki, L., Anttila, H., Esselström, H., Tuomainen, P. và Sontag-Strohm, T. 2006.
Thủy phân --glucan. Hóa chất thực phẩm 97, 71-79.
Johnson, DC và LaCourse, WR 1990. Sắc ký lỏng với phát hiện điện hóa xung ở các
điện cực vàng và bạch kim. hậu môn. hóa học. 62, 589A-597A.
Johnson, DC, Dobberpuhl, D., Roberts, R. và Vandeberg, P. 1993. Phát hiện bằng phép đo
dòng điện xung của cacbohydrat, amin và các loại lưu huỳnh trong sắc ký ion. Hiện trạng
nghiên cứu. J. Sắc ký đồ. 640, 79-96.
Kabel, MA, Carvalheiro, F., Garrote, G., Avgerinos, E., Koukios, E., Parajó, JC, Girio, FM,
Schols, HA và Voragen, AGJ 2002a. Các sản phẩm phụ giàu xylan được xử lý thủy nhiệt
tạo ra các loại xylo-oligosacarit khác nhau. Cacbohydrat polyme. 50, 47-56.
Kabel, MA, Kortenoeven, L., Schols, HA và Voragen, AGJ 2002b.Trong ống nghiệm khả năng lên
men của các xylo-oligosacarit thay thế khác nhau. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 50,
6205-6210.
Kabel, MA, Schols, HA và Voragen, AGJ 2002c. Xylo-oligosacarit phức hợp được xác định từ gỗ bạch
đàn được xử lý bằng phương pháp thủy nhiệt và hạt đã qua sử dụng của nhà máy bia.
Cacbohydrat Polime., 50, 191-200.
Karppinen, S., Kiiliäinen, K., Liukkonen, K., Forssell, P. và Poutanen, K. 2001. Trích xuất vàtrong
ống nghiệmlên men các phần cám lúa mạch đen. J. Khoa học ngũ cốc. 34, 269-278.
104
Khandke, KM, Vithayathil, PJ và Murthy, SK 1989. Sự phân hủy xylan của gỗ thông rụng lá bởi
enzym của một loại nấm ưa nhiệt,Thermoascus aurantiacus. Vòm. hóa sinh. lý sinh học. 274,
501-510.
Koizumi, K., Kubota, Y., Tanimoto, T. và Okada, Y. 1991. Sắc ký trao đổi anion hiệu
năng cao của D-gluco-oligosacarit đồng nhất và - polysacarit (độ trùng hợp 50) với
phát hiện ampe kế xung. J. Sắc ký đồ. A 464, 365-373.
Kontula, P., Suihko, M.-L., Suortti, T., Tenkanen, M., Mattila-Sandholm, T. và von Wright, A.
2000. Phân lập vi khuẩn axit lactic từ sinh thiết ruột kết của con người sau khi làm giàu trên
dẫn xuất đường sữa và arabinoxylo-oligosacarit lúa mạch đen. Vi sinh vật thực phẩm. 17,
13-22.
Kormelink, FJM, Gruppen, H., Viëtor, RJ và Voragen, AGJ 1993b. Phương thức hoạt động của các
enzym phân giải xylan từnấm mốc Aspergillustrên arabinoxylan ngũ cốc có thể chiết xuất bằng
kiềm. Cacbohydrat độ phân giải 249, 355-367.
Kormelink, FJM, Gruppen, H. và Voragen, AGJ 1993c. Phương thức hoạt động của (1-4)--- D-
arabinoxylan arabinofuranohydrolase (AXH) và --L-arabinofuranosidase trên arabinoxylan bột mì
có thể chiết xuất bằng kiềm. Cacbohydrat độ phân giải 249, 345-353.
Kormelink, FJM và Voragen, AGJ 1993. Sự phân hủy các xylan [(glucurono)arabino] khác
nhau bằng sự kết hợp của các enzyme phân hủy xylan tinh khiết. ứng dụng vi sinh vật. công
nghệ sinh học. 38, 688-695.
Kubata, BK, Suzuki, T., Horitsu, H., Kawai, K. và Takamizawa, K. 1994. Làm sạch và mô tả
đặc tính củaAeromonas caviaeME-1 xylanase V, tạo ra xylobiose độc quyền từ xylan.
ứng dụng môi trường. vi sinh vật. 60, 531-535.
Kulkarni, N., Shendye, A. và Rao, M. 1999. Các khía cạnh công nghệ sinh học và phân tử của
xylanase. Vi sinh vật FEMS. Rev. 23, 411-455.
Kusakabe, I., Ohgushi, S., Yasui, T. và Kobayashi, T. 1983. Các nghiên cứu về hệ thống
xylanase của Streptomyces. Phần X. Cấu trúc của arabinoxylo-oligosacarit từ các sản phẩm
thủy phân của arabinoxylan lõi ngô bởi xylanase từ Streptomyces. nông nghiệp. sinh học.
hóa học. 47, 2713-2723.
105
Lebet, V., Arrigoni, E. và Amadò, R. 1997. Xác định đường trung tính bằng HPAEC-PAD
để mô tả sự phân hủy polysacarit bởi vi khuẩn đường ruột. Zeitschrift fuer
Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A: Food Res. công nghệ. 205, 257-261.
Lee, YC 1990. Sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao để phân tích carbohydrate. hậu
môn. hóa sinh. 189, 151-162.
Lee, YC 1996. Phân tích cacbohydrat bằng sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao. J.
Sắc ký đồ. A, 720, 137-149.
MacArthur, LA và D`Appolonia, BL 1980. So sánh các polysacarit không tinh bột trong yến
mạch và lúa mì. Ngũ cốc Chem. 57, 39-45.
Maes, C. và Delcour, JA 2002. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan chiết xuất được trong nước và không
thể chiết xuất được trong nước trong cám lúa mì. J. Khoa học ngũ cốc. 35, 315-326.
Maes, C., Vangeneugden, B. và Delcour, JA 2004. Hoạt động tương đối của hai endoxylanase đối
với arabinoxylan không chiết xuất được trong nước trong cám lúa mì. J. Khoa học ngũ cốc. 39,
181-186.
Margolles-Clark, E., Tenkanen, M., Luoteri, E. và Penttilä, M. 1996. Ba -- gen galactosidase của
Trichoderma reeseinhân bản vô tính bằng cách biểu hiện trong nấm men. Ơ. J. Hóa sinh. 240,
104-111.
Markwalder, HU và Neukom, H. 1976. Axit diferulic có thể liên kết ngang trong
hemiaellulose từ mầm lúa mì. Hóa thực vật, 15, 836-837.
Maslen, SL, Goubet, F., Adam, A., Dupree, P. và Stephens, E. 2007. Làm sáng tỏ cấu trúc của
các đồng phân arabinoxylan bằng HPLC–MALDI-TOF/TOF-MS/MS pha thường. Cacbohydrat
độ phân giải 342, 724-735.
McNeil, M., Alberheim, P. Taiz, L. và Jones, RL 1975. Cấu trúc của thành tế bào thực vật. VII. Tế bào
aleurone lúa mạch. Vật lý thực vật. 55, 64-68.
Meyer, VR 1995. Định lượng pic sắc ký trong khoảng 0,1 đến 1,0 %. Sắc ký, 40,
15-22.
Mitsuoka, T. 1982. Các xu hướng nghiên cứu gần đây về hệ vi khuẩn đường ruột. Hệ vi sinh Bifidobacteria, 1,
3-24.
Modler, HW 1994. Yếu tố Bifidogen - Nguồn, Trao đổi chất và Ứng dụng. quốc tế
Sữa J. 4, 383-407.
Moura, P., Barata, R., Carvalheiro, F., Gírio, F., Loureiro-Dias, MC và Esteves, MP 2007.Trong ống
nghiệmquá trình lên men xylo-oligosacarit từ quá trình tự thủy phân lõi ngô bởi các chủng
Bifidobacterium và Lactobacillus. LWT - Khoa học thực phẩm. công nghệ. 40, 963-972.
Moure, A., Gullon, P., Dominguez, H. và Parajo, JC 2006. Những tiến bộ trong sản xuất,
tinh chế và ứng dụng xylo-oligosacarit làm phụ gia thực phẩm và dược phẩm dinh
dưỡng. Quy trình Hóa sinh. 41, 1913-1923.
106
Nandini, CD và Salimath, PV 2001. Thành phần carbohydrate của lúa mì, cám lúa mì, lúa miến và
bajra với chất lượng làm chapati/roti (bánh mì dẹt của Ấn Độ) tốt. Hóa chất thực phẩm 73,
197-203.
Nilsson, M., Andersson, R., Andersson, RE, Autio, K. và Åman, P. 2000. Tính không đồng nhất trong
arabinoxylan lúa mạch đen có thể chiết xuất bằng nước với mức độ thay thế thấp. Cacbohydrat polyme.
41, 397-405.
Okazaki, M., Fujukawa, S. và Matsumoto, N. 1990. Ảnh hưởng của xylooligosaccharide đối với sự phát
triển của vi khuẩn bifidobacteria. Nippon Eiyo, Shokuryo Gakkaishi 43, 395-401.
Ordaz-Ortiz, JJ, Guillon, F., Tranquet, O., Dervilly-Pinel, G., Tran, V. và Saulnier, L. 2004. Tính
đặc hiệu của kháng thể đơn dòng được tạo ra chống lại arabinoxylan của hạt ngũ cốc.
Cacbohydrat polyme. 57, 425-433.
Ordaz-Ortiz, JJ, Devaux, MF và Saulnier, L. 2005. Phân loại các giống lúa mì dựa trên các đặc
điểm cấu trúc của arabinoxylan được tiết lộ khi xử lý bột và hạt bằng endoxylanase. J. Nông
nghiệp. Hóa chất thực phẩm 53, 8349-8356.
Palframan, R., Gibson, GR và Rastall, RA 2003. Sở thích carbohydrate của các loài
Bifidobacterium được phân lập từ ruột người. Curr. là. ruột. vi sinh vật. 4, 71- 75.
Pell, G., Taylor, EJ, Gloster ,TM, Turkenburg, JP, Fontes, CMGA, Ferreira, LMA, Nagy, T.,
Clark, SJ, Davies, GJ và Gilbert, HJ 2004. Các cơ chế theo đó họ 10 glycoside hydrolase
liên kết các chất nền được trang trí. J. Sinh học. hóa học. 279, 9597-9605.
Pitkänen, L., Tuomainen, P., Virkki, L., Aseyev, V. và Tenkanen, M. 2008. So sánh cấu trúc của
arabinoxylan từ hai phân số dòng lúa mạch. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 56,
5069-5077.
Pitkänen, L., Virkki, L., Tenkanen, M. và Tuomainen, P. 2009. Nghiên cứu HPSEC đa đầu dò
toàn diện về các đặc tính dung dịch của arabinoxylan ngũ cốc trong dung dịch nước và dung
dịch DMSO. Biomacromolecules 10, 1962-1969.
Poutanen, K., Sundberg, M., Korte, H. và Puls, J. 1990. Khử acetyl của xylan bằng acetyl esterase
củaTrichoderma reesei. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 33, 506-510.
Puls, J., Schmidt, O. và Granzow, C. 1987. --Glucuronidase trong hai hệ thống phân giải xylan của vi sinh
vật. Enzym vi sinh vật công nghệ. 9, 83-88.
Puls, J. 1993. Phân tích chất nền của rừng và chất thải nông nghiệp.Trong: Chuyển đổi sinh
học của rừng và tàn dư thực vật nông nghiệp.Saddler, JN (Eds.), CAB International,
Wallingford, UK, trang 13-32.
107
Puls, J., Schroeder, N., Stein, A., Janzon, R. và Saake, B. 2006. Xylan từ bột yến mạch và bột giấy
kraft bạch dương. Macromol. Triệu chứng 232, 85-92.
Puls, J. và Schuseil, J. 1993. Hóa học của hemicellulose: mối quan hệ giữa cấu trúc
hemicellulose và các enzym cần thiết cho quá trình thủy phân. TRONG:Hemicellulose
và hemicellulase. Coughlan, MP và Hazlewood, GP (Eds.), Portland Press, London, UK
trang 1-28.
Ramirez, F., Puls, J., Zúñiga, V. và Saake, B. 2008. Sự hấp thụ của lõi ngô và yến mạch đánh vần
arabinoxylan lên bột giấy kraft gỗ mềm. Holzforschung 62, 329-339.
Roberts, EJ, Wade, CP và Rowland, SP 1971. Ảnh hưởng của nồng độ bazơ đến khả năng phản ứng
của các nhóm hydroxyl trong methyl d-glucopyranoside. Cacbohydrat độ phân giải 17, 393-399.
Roubroeks, JP, Andersson, R. and Åman, P. 2000. Đặc điểm cấu trúc của (1-3),(1-4)-
- - Các phần D-glucan và arabinoxylan được phân lập từ cám lúa mạch đen. Cacbohydrat polyme. 42, 3-
11.
Roy, D. và Ward, P. 1990. Đánh giá các phương pháp nhanh chóng để phân biệt các loài
Bifidobacterium. J. Ứng dụng. vi khuẩn. 69, 739-749.
Roy, D. và Sirois, S. 2000. Phân biệt phân tử của các loài Bifidobacterium với phân
tích giới hạn DNA ribosome khuếch đại và sắp xếp các vùng ngắn của gen ldh. Vi
sinh vật FEMS. Hãy để. 191, 17-24.
Salminen, S., Bouley, CH, Boutro-Ruault, MC, Cummings, JH, Franck, A., Gibson, GR,
Isolauri, E., Moreau, MC, Roberfroid, MB và Rowland, I. 1998. Khoa học thực phẩm chức
năng và sinh lý và chức năng đường tiêu hóa. anh J. Nutr. 80, S147-S171.
Saulnier, L., Marot, C., Chanliaud, E. và Thibault, J. 1995a. Tương tác polysacarit thành tế bào
trong cám ngô. Cacbohydrat polyme. 26, 279-287.
Saulnier, L., Vigoroux, J. và Thibault, J.-F. 1995b. Phân lập và mô tả đặc tính một phần của
oligosacarit ferulo hóa từ cám ngô. Cacbohydrat độ phân giải 272, 241-253.
Scharlau, D., Borowicki, A., Habermann, N., Hofmann, T., Klenow, S., Miene, C., Munjal, U., Stein, K. và
Glei, M. 2009. Cơ chế của ung thư nguyên phát ngăn ngừa bằng butyrate và các sản phẩm khác được
hình thành trong quá trình lên men chất xơ qua trung gian hệ thực vật đường ruột. đột biến. Res./Rev.
đột biến. độ phân giải 682, 39-53.
Schell, MA, Karmirantzou, M., Snel, B., Vilanova, D., Berger, B., Pessi, G., Zwahlen, M.,
Desiere, F., Bork, P., Delley, M., Pridmore , RD và Arigoni, F. 2002. Trình tự bộ gen của
Bifidobacterium longumphản ánh sự thích nghi của nó với đường tiêu hóa của con người.
Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 99, 14422-14427.
Scheppach, W., Bartram HP và Richter F. 1995. Vai trò của axit béo chuỗi ngắn trong việc
ngăn ngừa ung thư đại trực tràng. Ơ. J. Ung thư 31, 1077-1080.
Scheppach, W., Luehrs, H. và Menzel, T. 2001. Những ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe của
việc tiêu thụ carbohydrate ít tiêu hóa. anh J. Nutr. 85, S23-S30.
108
Schooneveld-Bergmans, MEF, Beldman, G. và Voragen, AGJ 1999. Đặc điểm cấu trúc của
(glucurono)arabinoxylan được chiết xuất từ cám lúa mì bằng bari hydroxit. J. Khoa học
ngũ cốc. 29, 63-75.
Shibuya, N. và Misaki, A. 1978. Cấu trúc của hemiaellulose được phân lập từ thành tế bào nội nhũ
lúa: Phương thức liên kết và trình tự trong xyloglucan, --glucan và arabinoxylan. nông nghiệp.
sinh học. hóa học. 42, 2267-2274.
Shibuya, N., Nakane, R., Yasui, A., Tanaka, K. và Iwasaki, T. 1985. Nghiên cứu so sánh về việc
chuẩn bị thành tế bào từ cám gạo, mầm và nội nhũ. Ngũ cốc Chem. 62, 252-258.
Shiiba, K., Yamada, H., Hara, H., Okada, K. và Nagao, S. 1993. Tinh chế và mô tả đặc
tính của hai arabinoxylan từ cám lúa mì. Ngũ cốc Chem. 70, 209-214.
Shin, H., Lee, J., Lee, J., Han, Y., Han,, MJ và Kim, D. 2003a. thanh lọc và
đặc tính của ginsenoside Ra-thủy phân --D-xylosidase từBifidobacterium breveK-110, một loại vi
khuẩn kỵ khí đường ruột của con người. sinh học. dược phẩm. Bò đực. 26, 1170-1173.
Shin, H., Park, S., Sung, JH và Kim, D. 2003b. Thanh lọc và đặc tính của --L-
arabinopyranosidase và --L-arabinofuranosidase từBifidobacterium breveK-110, một loại vi khuẩn
kỵ khí đường ruột của con người chuyển hóa ginsenoside Rb2 và Rc. ứng dụng môi trường. vi sinh
vật. 69, 7116-7123.
Sjöström, E. 1981.Hóa chất gỗ. Cơ bản và ứng dụng.Nhà xuất bản Học thuật, Inc.,
New York,
Smith, MM và Hartley, RD 1983. Sự xuất hiện và bản chất của sự thay thế axit ferulic của
polysacarit thành tế bào ở thực vật có hạt. Cacbohydrat độ phân giải 118, 65-80.
Snyder, LR 1972. Phương pháp tiếp cận nhanh để lựa chọn các điều kiện thí nghiệm tốt nhất cho
sắc ký lỏng tốc độ cao. 1. Ước tính độ phân giải mẫu ban đầu và độ phân giải cuối cùng theo yêu
cầu của một vấn đề nhất định.J. Sắc ký đồ. Khoa học.10, 200-212.
Sørensen, HR, Jørgensen, CT, Hansen, CH, Jørgensen, CI, Pedersen, S. và Meyer, AS 2006. Một tiểu
thuyết GH43 -L- arabinofuranosidase từmiếng lót Humicola: phương thức hoạt động và sức mạnh
tổng hợp với GH51 -L- arabinofuranosidase trên lúa mì arabinoxylan, Appl. vi sinh vật. công nghệ
sinh học. 73, 850-861.
Sternemalm, E., Höije, A. và Gatenholm, P. 2008. Ảnh hưởng của sự thay thế arabinose đến tính
chất vật liệu của màng arabinoxylan. Cacbohydrat độ phân giải 343, 753-757.
Sun, R., Lawther, JM và Banks, WB 1996. Đặc điểm cấu trúc và phân số của
hemiaellulose rơm lúa mì. Cacbohydrat polyme. 29, 325-331.
109
Sun, H., Yoshida, S., Park, N. và Kusakabe, I. 2002. Chuẩn bị (1-4)--- xylooligosaccharides
từ quá trình thủy phân bằng axit của xylan hạt bông: tính phù hợp của xylan hạt bông
làm nguyên liệu ban đầu để điều chế (1-4)---xylooligosacarit. Cacbohydrat độ phân giải
337, 657-661.
Sundberg, A., Sundberg. K., Lilandt. C. và Holmbom. B. 1996. Xác định hemiaellulose và
pectin trong sợi gỗ và bột giấy bằng phương pháp metanol axit và sắc ký khí. Bắc Âu.
bột giấy. độ phân giải J. 11, 216-219, 226.
Suwa, Y., Koga, K., Fujikawa, S., Okazaki, M., Irie, T. và Nakada, T. 1999
Bifidobacterium bifidumthúc đẩy tăng sinh có chứa xylooligosaccharide, US Patent
5939309.
Swennen, K., Courtin, CM, Lindemans, GC và Delcour, JA 2006. Sản xuất quy mô lớn và
đặc tính của arabinoxylooligosacarit cám lúa mì. J. Khoa học. Thực phẩm nông nghiệp.
86, 1722-1731.
Tenkanen, M. 2004. Cắt hemicellulose bằng enzym. Triệu chứng ACS Ser. 864, 292- 311.
Tenkanen, M., Luoteri, E. và Teleman, A. 1996. Ảnh hưởng của các nhóm bên đối với hành động của
- - xylosidaza từTrichoderma reeseichống lại xylo-oligosacarit thay thế. Thư tháng 2.
399, 303-306.
Tenkanen, M. và Siika-aho, M. 2000. Một --glucuronidase củaxã Schizophyllum tác dụng lên cao
phân tử xylan. J. Công nghệ sinh học. 78, 149-161.
Tenkanen, M., Bürgermeister, M., Vršanská, M., Biely, P., Saloheimo, M. và Siika-aho, M. 2003. Một
xylanase mới XYN IV từTrichoderma reeseivà hành động của nó trên các xylan khác nhau.Trong:
Những tiến bộ gần đây về enzyme trong chế biến ngũ cốc.Courtin, C., Veraverbeke, W. và Delcour,
J. (Eds.). ACCO, Leuven, Bỉ, trang 41-46.
Thayer, JR, Rohrer, JS, Avdalovic, N. và Gearing, RP 1998. Những cải tiến đối với quá trình khử
muối trong dây chuyền của oligosacarit được phân tách bằng sắc ký trao đổi anion pH cao với
phát hiện ampe kế xung. hậu môn. hóa sinh. 256, 207-216.
Trogh, I., Croes, E., Courtin, CM và Delcour, JA 2005. Khả năng phân hủy bằng enzym của các phân đoạn
arabinoxylan hòa tan trong kiềm của bột lúa mạch không vỏ bởi các endoxylanase. J. Nông nghiệp. Hóa chất
thực phẩm 53, 7243-7250.
Van Craeyveld, V., Swennen, K., Dornez, E., Van de Wiele, T., Marzorati, M., Vestraete,
W., Delaedt, Y., Onagbesan, O., Decuypere, E., Buyse, J., De Ketelaere, B., Broekaert,
WF, Delcour, JA và Courtin, CM 2008. Các arabinoxylooligosacarit có nguồn gốc từ lúa mì
khác nhau về cấu trúc có các đặc tính lên men và tiền sinh học khác nhau ở chuột. J. Nutr.
138, 2348-2355.
Van Craeyveld, V., Holopainen, U., Selinheimo, E., Poutanen, K., Delcour, JA và Courtin, CM 2009.
Xay xát khô cám lúa mì và lúa mạch đen rộng rãi dẫn đến sản xuất tại chỗ các oligosacarit
arabinoxylan thông qua quá trình phân mảnh kích thước nano . J. Nông nghiệp. Hóa chất thực
phẩm 57, 8467-8473.
110
Van den Broek, LAM, Lloyd, RM, Beldman, G., Verdoes, JC, McCleary, BV và Voragen, AGJ
2005. Nhân bản vô tính và mô tả đặc điểm của arabinoxylan arabinofuranohydrolase-
D3 (AXHd3) từBifidobacterium vị thành niênDSM20083. ứng dụng vi sinh vật. công
nghệ sinh học. 67, 641-647.
Van den Broek, LAM, Hinz, SWA, Beldman, G., Vincken, J.-P. và Voragen, AGJ 2008.Bifidobacterium
carbohydrase-vai trò của chúng trong việc phân hủy và tổng hợp prebiotic (tiềm năng). mol. Dinh
dưỡng. Thực phẩm Res. 52, 146-163.
Van den Broek, LAM và Voragen, AGJ 2008. Bifidobacterium glycoside hydrolase và (tiềm năng)
prebiotic. đổi mới. Khoa học thực phẩm nổi lên. công nghệ. 9, 401-407.
Van Laere, KMJ, Voragen, CHL, Kroef, T., Van den Broek, LAM, Beldman, G. và Voragen, AGJ
1999. Tinh chế và phương thức hoạt động của hai arabinoxylan arabinofuranohydrolases
khác nhau từBifidobacterium vị thành niênDSM 20083. Ứng dụng. vi sinh vật. công nghệ
sinh học. 51, 606-613.
Van Laere, KMJ, Hartemink, R., Bosveld, M., Schols, HA và Voragen, AGJ 2000. Sự lên men của các
polysacarit có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật và các oligosacarit tương ứng của chúng bởi vi
khuẩn đường ruột. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 48, 1644-1652.
Van Loo, J., Cummings, J., Delzenne, N., Englyst, H., Franck, A., Hopkins, M., Kok, N.,
Macfarlane, G., Newton, D., Quigley, M. , Roberfroid, M., van Vliet, T. và van den Heuvel,
E. 1999. Đặc tính thực phẩm chức năng của oligosacarit không tiêu hóa: một báo cáo
đồng thuận từ dự án ENDO (DGXII AIRII-CT94-1095). anh J. Nutr. 81, 121- 132.
Vardakou, M., Katapodis, P., Samiotaki, M., Kekos, D., Panayotou, G. và Christakopoulos, P. 2003.
Phương thức hoạt động của họ 10 và 11 endoxylanase trên arabinoxylan không thể chiết xuất
được trong nước. quốc tế J. Sinh học. Macromol. 33, 129-134.
Vardakou, M., Palop CN, Gasson, M., Narbad, A. và Christakopoulos, P. 2007.Trong ống nghiệm quá trình
lên men liên tục ba giai đoạn của các phần arabinoxylan lúa mì và kích hoạt hoạt động hydrolase của hệ
vi sinh vật đường ruột. quốc tế J. Sinh học. Macromol. 41, 584-589.
Vardakou, M., Palop, CN, Christakopoulos, P., Faulds, CB, Gasson, MA và Narbad, A. 2008. Đánh
giá các đặc tính tiền sinh học của các phần arabinoxylan lúa mì và cảm ứng hoạt động hydrolase
trong hệ vi sinh đường ruột. quốc tế J. Vi sinh vật thực phẩm. 123, 166-170.
Vázquez, MJ, Alonso, JL, Domínguez, H. và Parajó, JC 2000. Xylooligosacarit. Sản xuất và ứng
dụng. Xu hướng khoa học thực phẩm. công nghệ. 11, 387-393.
Verwimp, T., Van Craeyveld, V., Courtin, CM và Delcour, JA 2007. Sự thay đổi trong cấu trúc của các arabinoxylan
có thể chiết xuất bằng kiềm từ bột lúa mạch đen. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 55, 1985- 1992.
111
Viëtor, RJ, Angelino, SAGF và Voragen, AGJ 1992. Đặc điểm cấu trúc của arabinoxylan từ vật
liệu vách tế bào lúa mạch và mạch nha. J. Khoa học ngũ cốc. 15, 213-222.
Viëtor, RJ, Hoffmann, RA, Angelino, S., AGF, Voragen, AGJ, Kamerling, JP và Vliegenthart, JFG
1994. Cấu trúc của các oligome nhỏ được giải phóng khỏi arabinoxylan lúa mạch bởi
endoxylanase từnấm mốc Aspergillus. Cacbohydrat độ phân giải 254, 245-255.
Vinkx, CJA, Delcour, JA, Verbruggen, MA và Gruppen, H. 1995. Các arabinoxylan hòa tan trong nước của lúa
mạch đen cũng khác nhau về hàm lượng xyloza 2 chất thay thế đơn của chúng. Ngũ cốc Chem. 72, 227- 228.
Virkki, L., Johansson, L., Ylinen, M., Maunu, S. và Ekholm, P. 2005. Đặc tính cấu trúc của các
polysacarit không tinh bột không tan trong nước của yến mạch và lúa mạch. Cacbohydrat
polyme. 59, 357-366.
Virkki, L., Maina, HN, Johansson, L. và Tenkanen, M. 2008. Phương pháp dựa trên enzyme mới để
phân tích arabinoxylan lúa mì hòa tan trong nước. Cacbohydrat độ phân giải 343, 521-529.
Visek, W. 1978. Điều chỉnh chế độ ăn uống và tăng trưởng tế bào bằng amoniac. Là. J. Lâm sàng. Dinh dưỡng. 31,
216S-220.
Voragen, AGJ 1998. Các khía cạnh công nghệ của carbohydrate liên quan đến thực phẩm chức năng. Xu hướng
khoa học thực phẩm. công nghệ. 9, 328-335.
Weisburg, WG, Barns, SB, Pelletier, DA và Lane, DJ 1991. Khuếch đại DNA ribosome 16S
cho nghiên cứu phát sinh loài. J. Vi khuẩn. 173, 697-703.
Westerlund, E., Andersson, R. và Åman, P. 1993. Phân lập và xác định đặc tính hóa học của --glucans và
arabinoxylans hỗn hợp liên kết hòa tan trong nước trong các phân đoạn nghiền yến mạch. Cacbohydrat
polyme. 20, 115-123.
Wilkie, KCB 1979. Hemicelluloses của cỏ và ngũ cốc. quảng cáo Cacbohydrat hóa học. hóa
sinh. 36, 215-264.
Wolin, EA, Wolin, MJ và Wolfe, RS 1963. Hình thành khí mê-tan bằng chất chiết xuất từ vi khuẩn. J.
Sinh học. hóa học. 238, 2882-2886.
Wollowski, I., Rechkemmer G. và Pool-Zobel, BL 2001. Vai trò bảo vệ của men vi sinh và prebiotic
trong ung thư ruột kết. Là. J. Lâm sàng. Dinh dưỡng. 73, 451S-455.
Wong, JMWRD, de Souza, RRD, Kendall, CWC, Emam, A. và Jenkins, DJA 2006. Sức khỏe
đại tràng: Quá trình lên men và axit béo chuỗi ngắn. J. Lâm sàng. tiêu hóa. 40, 235-243.
112
Yuan, X., Wang, J. và Yao, H. 2005. Feruloyl oligosacarit kích thích sự phát triển của
Bifidobacterium bifidum. Kỵ khí 11, 225-229.