DENEY 2.

BEYAZ PEYNİRDEN KOLİFORM GRUBU

MİKROORGANİZMALARIN İZOLASYONU

Beyaz peynir, çiğ sütlerin veya karışımlarının pastörize edilmesi veya pastörize
sütlerin üretim tekniğine göre işlenmesi, bu işlenme sırasında gerektiğinde katkı
maddelerinin ilavesi ve olgunlaştırılması sonucu elde edilen bir üründür.
Mycobacterium tuberculosis bakterisini içerme olasılığı nedeni ile çiğ sütten peynir
yapılması sakıncalıdır. Ayrıca peynir çiğ sütten imal edildiğinde çeşitli kirlilik
öğelerini de içerebilmektedir.

Patojen mikroorganizmalar gıda maddelerine herhangi bir yolla bulaşabilirler.

Bağırsak kökenli patojen mikroorganizmaların en önemlisi Salmonella olarak kabul
edilmektedir. Ancak, Salmonella izolasyonu oldukça pahalı ve zaman alıcıdır. Bu
nedenle gıdalarda doğrudan Salmonella aranması yerine, indikatör mikroorganizmalar
olarak kabul edilen mikroorganizmaların aranması yoluna gidilmektedir. İndikatör
olarak en çok kullanılan mikroorganizmalar arasında koliform grubu
mikroorganizmalar yer almaktadır. Koliform grubu mikroorganizmalar; fakültatif
anaerob, Gram negatif, spor oluşturmayan, 35-37 oC’de 48 saat içerisinde laktozdan
asit ve gaz oluşturabilen çubuk şekilli bakterilerden oluşmaktadır. Koliform grubu
içerisinde yer alan bakteriler; Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter
cloacae, Klebsiella pneumoniae ve Citrobacter freundii’dir.

Koliform grubu mikroorganizmalar kirlilik belirtisi olarak kabul edildikleri için,

beyaz peynir üretiminde çiğ süt kullanılıp kullanılmadığı, uygulanan ısıl işlemin
yeterliliği ve ürüne sonradan kontaminasyon olup olmadığı hakkında fikir
verebilmektedir. Bu nedenle koliform varlığının test edilmesi bir çok gıda maddesi
için temel bir mikrobiyolojik inceleme olarak kabul edilmektedir. Koliform grubu
bakteriler pastörizasyon sıcaklığında (63-65 oC’de 30 dakika veya 72-75 oC’de 15-30
saniye) öldürülebilmektedirler. Koliformların varlığı, üründe Salmonella, Shigella,
Klebsiella gibi patojen mikroorganizmaların varlığına işaret etmektedir.

Çiğ sütten ve pastörize sütten yapılan peynirlerde salamura içerisinde belirli bir
olgunlaşma süresi bulunmaktadır. Çiğ sütten yapılan peynirler için bu süre yaklaşık
olarak 3 ay, pastörize sütten yapılan peynirler için ise 1 ay olarak belirtilmektedir. Bu
süre içerisinde mikroorganizmaların faaliyetleri sonucunda ortamda artan asitlik,
koliformları inhibe etmekte ve ürünün daha sağlıklı bir şekilde tüketime sunulmasını
sağlamaktadır. Beyaz peynirin yüzeyinde gözlenebilecek aşırı gözeneklenme;
koliform bakterilerin gaz üretimi sonucu oluşan hava kabarcıklarından
kaynaklanabilmekte ve koliform varlığını gösterebilmektedir.

Gıdalardan koliform grubu bakterilerin izolasyonu amacıyla kullanılan

besiyerlerinden bir tanesi Violet Red Bile agar (VRBA) besiyeridir. Bu besiyeri seçici
bir besiyeri olup, içerisinde bulunan selektivite ajanları; safra tuzları ve kristal violet
boyasıdır. Her iki selektivite edici madde de gıda florasında bulunabilecek olan Gram
pozitif bakterileri inhibe etme özelliğine sahiptirler. Koliform grubu bakteriler laktozu
kullanarak asit oluşturabilmektedirler. Asit oluşumu, VRBA besiyerinde bulunan
nötral red boyasının renk değiştirmesi ve safra asitlerinin asidik koşullarda çökmesi
ile gözlenebilmektedir. VRBA besiyeri kaynar su banyosunda besiyerinin 2 dakika
sıkça karıştırılarak tutulması ile sterilize edilmektedir. Gıdalardan koliform
bakterilerin izolasyonu amacı ile, bu besiyeri için önerilen inkübasyon sıcaklık ve
süresi; 35 oC’de 18-24 saat olarak belirtilmektedir. Süt ürünleri için önerilen
inkübasyon sıcaklığı ise; 30-32 °C olarak verilmektedir.

Son yıllarda geliştirilmiş olan ve MUG (4-Methylumbelliferyl-glucuronide) içeren

besiyerleri gıdalarda E. coli varlığını belirlemede yaygın olarak kullanılmaktadırlar.
E. coli suşlarının %95’den fazlasının β-glucuronidase enzimini içerdiği belirlenmiştir.
E. coli’ nin geliştirileceği sıvı veya katı besiyerlerine MUG bileşiğinin eklenmesi ile
çeşitli besiyerleri geliştirilmiştir. MUG bileşiği E. coli’de bulunan β-glucuronidase
enzimi ile parçalandığında oluşan parçalanma ürünü; methylumbelliferone’nun 366
nm dalga boyunda floresan ışıma yaptığı belirlenmiştir. Bu prensipten yararlanarak,
kültürlerin UV altında incelenmesi ile araştırılan gıdada E.coli varlığı
belirlenebilmektedir. MUG içeren sıvı besiyerine Fluorocult Lauryl Sulfate (LST)
broth besiyeri örnek verilebilir.
Aşağıdaki şemada; MUG içeren besiyerlerinde gerçekleşen reaksiyon
gösterilmektedir.

4- methylumbelliferyl-glucoronide (MUG) (renksiz)

β-D- glucuronidase

glucuronic asit + methylumbelliferon (366 nm.UV ışını

(renksiz) altında floresans verir.)

Türk Standardları Enstitüsü (TSE) tarafından yayınlanan, TS 591/Mart 2013 Beyaz

Peynir standardına göre; beyaz peynirin mikrobiyolojik özellikleri aşağıda
belirtilmektedir.

Özellikler n c m M
Koagülaz pozitif stafilokoklar 5 2 102 103
kob/g-mL kob/g-mL
Salmonella 5 0 25 g veya mL’de
bulunmayacak
L. monocytogenes 5 0 25 g veya mL’de
bulunmayacak
n = Analize alınacak deney numunesi sayısı
c = (M) değerinin bulunabileceği en yüksek deney numunesi sayısı
m = (n-c) sayısındaki deney numunesinde bulunabilecek en üst sınır
M = (c) sayıdaki deney numunesinde bulunabilecek en üst sınır
kob: Koloni oluşturan birim (katı besiyerinde)
Bu özelliklere göre; alınan beş adet beyaz peynir örneğinin 25 gramında Salmonella,
ve L. monocytogenes bulunmamalıdır. Aynı standarda göre; incelenen 5 örnekten en
fazla 2 örnekte koagülaz pozitif stafilokok sayısı 102 ile 103 kob/g arasında olabilir.
Üç veya daha fazla örnekte koagülaz pozitif stafilokok sayısı 102 kob/g’dan daha
fazla olduğunda kitle reddedilir. Aynı örnekleme planında, eğer incelenen 5 örnekten
herhangi birindeki koagülaz pozitif stafilokok sayısı 103 kob/g ‘ı geçerse yine tüm
kitle reddedilmelidir.

AMAÇ:
Bu uygulamanın amacı, beyaz peynirden koliform grubu bakterilerin izolasyonlarının
gerçekleştirilmesi ve elde edilen sonuçlara göre incelenen beyaz peynir örneğinin
standarda uygunluğunun tartışılmasıdır.

MATERYAL:
Beyaz peynir örneği
Violet Red Bile agar besiyeri
MUG (4-Methylumbelliferyl-glucuronide) MacConkey agar besiyeri
Serum fizyolojik
Steril kum içeren steril havan
Steril cam malzemeler
Steril spatül ve pens
Stomacher

Steril kumun hazırlanışı: Beyaz peynir gibi katı gıda maddeleri ile çalışılırken,
örneğin önce uygun şekilde homojenize edilmesi gerekmektedir. Bu işlem Stomacher
gibi mekanik karıştırma sağlayan aletler ile yapılabileceği gibi, içerisinde steril kum
bulunan steril havanlarda da gerçekleştirilebilmektedir. Homojenizasyon için havan
kullanıldığında, steril kum özel olarak hazırlanmaktadır. Bu amaçla kum, önce bir
gece derişik hidroklorik asit çözeltisinde ardından bir gece derişik sodyum hidroksit
çözeltisinde bekletilmelidir. Her aşamada kum saf su ile yıkanmalıdır. Alkali ile
muamelenin ardından yıkama işlemi kumun pH derecesi 7 olana kadar devam
etmelidir. Kumun alkali olarak kalması örnekteki mikroorganizma florasına zarar
verebileceği için yıkama işleminin, yıkama suyundan örnek alınarak ve pH ölçümü
yapılarak kontrol edilmesi gerekmektedir. Kum içeren havan kullanılmadan önce
sterilizatörde 160-180 oC’de1-2 saat kuru sterlizasyona tabi tutulur.

METOT:
1. Laboratuvara getirilen gıda örnekleri mikrobiyolojik analizleri yapılana kadar
buzdolabında saklanmalıdırlar. Analiz sırasında, beyaz peynir örneğinden
aseptik koşullarda 25 gram steril Stomacher torbasına veya içerisinde kum
bulunan steril havana tartılır.
2. Havan veya torbaya steril 225 mL serum fizyolojik aseptik koşullarda eklenir.
Stomacher çalıştırılarak 1dakika süre ile örnek homojenizasyonu sağlanır.
Havan kullanılıyor ise, tartılan peynir örneği dikkatli şekilde kum ile ezilerek
homojenizasyon gerçekleştirilir. Hazırlanan bu dilüsyon 10-1 dilüsyonudur.
3. Mikroorganizmaların katı gıda partikülleri ile birlikte dibe çökmesine izin
vermeden, hızlı bir şekilde diğer desimal dilüsyonlar serum fizyolojik
kullanılarak hazırlanırlar.
 4. Sterilize edilmiş VRBA besiyerine çift katlı dökme plaka yöntemi
kullanılarak, MUG MacConkey agar besiyerine ise Drigalski özesi ile yüzeye
sürme tekniği kullanılarak ekimler gerçekleştirilir. Tüm ekimler paralel olarak
yapılır ve her besiyeri için kontrol besiyeri de dökülür.
5. Ekim yapılan Petri’ler 35-37 oC’de 24-48 saat inkübasyona bırakılırlar. 24. ve
48. saatlerin sonunda inceleme yapılır.
6. İnceleme aşağıdaki koloni özellikleri dikkate alınarak gerçekleştirilir ve 30-
300 koloni sayısı içeren Petri’lerde sayım yapılarak sonuç cfu/gram beyaz
peynir olarak hesaplanır.

.
İnkübasyon sonucu VRBA besiyerinde oluşabilecek koloniler:

Laktoz pozitif bakteriler

Enterobacter aerogenes Yaklaşık 1-2 mm. çaplı veya biraz daha büyük çapta koyu

E. coli kırmızı etraflarında pembe zon bulunan koloniler

Enterococci Pembe, iğne başı şeklinde koloniler

Klebsiella cinsi bakteriler

Laktoz negatif bakteriler : Renksiz koloniler

İnkübasyon sonucu MUG MacConkey agar besiyerinde oluşan koloniler:

Laktoz negatif bakteriler:Renksiz koloniler

Laktoz pozitif bakteriler:Kırmızı renkli genellikle safra presipitasyonu sonucu oluşan
bulanık zon ile çevrili koloniler
E.coli: 366nm.dalga boyunda UV altında incelendiğinde floresans veren koloniler
oluşturmaktadırlar.

Prof.Dr.Z.Yeşim Özbaş
Ar.Grv. Betül Vazgeçer
Ar.Grv. Seda Karasu
Ar.Grv. Şule Şenses