Ćwiczenie 1.

METABOLIZM GLUKOZY
OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY METODĄ ENZYMATYCZNĄ

Część praktyczna obejmuje:

- porównanie właściwości spektralnych nukleotydów pirydynowych (NAD+ i NADH+H+)
- wykorzystanie enzymów szlaków przemian glukozy do oznaczania stężenia glukozy w suro-
wicy krwi

WSTĘP
Podstawowym szlakiem degradacji glukozy zachodzącym w cytoplazmie wszystkich komó-
rek, niezależnie od tego czy są to organizmy zależne od tlenu (tlenowce) czy organizmy żyjące
w warunkach braku tlenu (beztlenowce), jest glikoliza. W szlaku glikolizy następuje prze-
kształcenie glukozy w dwie cząsteczki pirogronianu, z jednoczesnym wytworzeniem dwóch
cząsteczek ATP i dwóch cząsteczek NADH+H+. Można w nim wyodrębnić dwie fazy (Ryc. 1.).
Pierwsza obejmuje przekształcenie glukozy do fruktozo-1,6-bisfosforanu, natomiast druga faza,
to rozszczepienie fruktozo-1,6-bisfosforanu na dwa cukry trójwęglowe – aldehyd
3-fosfoglicerynowy i fosfodihydroksyaceton, które dzięki izomerazie fosfotrioz mogą się prze-
kształcać jeden w drugi (reakcja 4). Dzięki tej reakcji izomeryzacji obie triozy mogą być dalej
metabolizowane w szlaku przemian związków trójwęglowych. Aldehyd 3-fosfoglicerynowy w
wyniku działania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego zostaje utleniony, z jednocze-
sną redukcją NAD+ do NADH+H+ (reakcja 6). Drugim substratem tej reakcji jest ortofosforan
(HPO4-2), który zostaje włączony do utlenianego aldehydu 3-fosfoglicerynowego (reakcja fos-
forylacji substratowej) i w efekcie powstaje 1,3-bisfosfoglicerynian. Jest to mieszany bezwod-
nik kwasowy, z którego reszta fosforanowa przy węglu-1 w następnej reakcji zostaje przenie-
siona na ADP (reakcja 7). Produktami tej reakcji są ATP i 3-fosfoglicerynian. W dwóch kolej-
nych reakcjach następuje najpierw przesunięcie reszty fosforanowej wewnątrz cząsteczki, a z
powstałego 2-fosfoglicerynianu w następnej reakcji zostaje odszczepiona woda i w efekcie po-
wstaje fosfoenolopirogronian. W ostatniej, 10 reakcji, kinaza pirogronianowa przenosi resztę
fosforanową z fosfoenolopirogronianu na ADP i ostatecznie produktami końcowymi przemiany
1 cząsteczki glukozy są 2 cząsteczki pirogronianu i 2 cząsteczki ATP. Tylko trzem reakcjom (1,
3 i 10) towarzyszą znaczne zmiany energii swobodnej ΔG’ i tylko te 3 reakcje są praktycznie
nieodwracalne, natomiast wszystkie pozostałe reakcje, w tym również reakcje 7 i 6, są odwra-
calne. Ma to ważne znaczenie w szlaku glukoneogenezy, w którym reakcje 10, 3 i 1 muszą być

1
omijane, natomiast wszystkie pozostałe reakcje mogą zachodzić w przeciwnym kierunku i są
katalizowane przez te same enzymy.

Ryc.1. Schemat glikolizy (Koolmam, Röhm 2005, zmieniono)

Alternatywnym szlakiem metabolizmu glukozy jest szlak heksozomonofosforanowy, na-

zywany także szlakiem pentozofosforanowym, również zachodzący w cytoplazmie. Rozpoczy-
na się on od reakcji utleniania glukozo-6-fosforanu katalizowanej przez dehydrogenazę gluko-
zo-6-fosforanu z udziałem NADP+ jako koenzymu (Ryc. 2). Produktami reakcji są:
NADPH+H+ i 6-fosfoglukonolakton – wewnątrzcząsteczkowy ester (lakton) 6-fosfoglukonianu.
W reakcji 2 następuje hydrolityczne rozszczepienie (hydroliza) laktonu, którego produktem jest
6-fosfoglukonian (ufosforylowany przy węglu-6 kwas glukonowy). Dehydrogenaza
6-fosfoglukonianowa utlenia, z udziałem NADP+ grupę hydroksylową przy weglu-3 z jedno-
czesnym odszczepieniem grupy karboksylowej w postaci CO2 (reakcja 3.).

2
 Ryc. 2. Szlak heksozomonofosforanowy – faza oksydacyjna (Stryer, 2005)

Produktami tej reakcji są zatem NADPH+H+ i rybulozo-5-fosforan (ufosforylowana ketopento-

za). Tak więc, w fazie oksydacyjnej szlaku heksozomonofosforanowego z 1 cząsteczki glu-
kozo-6-fosforanu powstaje 1 cząsteczka rybulozo-5-fosforanu, 1 cząsteczka CO2 i 2 cząsteczki
NADPH+H+. Zredukowany koenzym NADPH+H+ pełni ważną funkcję w reakcjach anabolicz-
nych, np. w biosyntezie kwasów tłuszczowych, natomiast rybulozo-5-fosforan w fazie nieok-
sydacyjnej szlaku heksozomonofosforanowego może być przekształcany do trioz, tetroz, pen-
toz, heksoz i heptoz (patrz podręcznik, kurs podstawowy).

Właściwości spektralne nukleotydów pirydynowych (NAD+ i NADH+H+)

Nukleotydy pirydynowe (NAD+, NADP+) pełnią funkcję koenzymów dehydrogenaz prze-
noszących jony wodorkowe (2e- i 1H+) (równoważniki redukcyjne) między utlenianym substra-
tem, a redukowanym akceptorem. Częścią aktywną koenzymów jest pierścień nikotynoami-
dowy pochodny pirydyny (Ryc. 3.).

Ryc. 3. Amid kwasu nikotynowego i dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH+H+)

Przedstawiona na ryc. 3 forma przechodzących w siebie utlenionych struktur koenzymu NAD+

(NADP+) ma w położeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom
węgla. W to miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane formy

3
NADH (NADPH). Ponieważ jednocześnie uwalniany jest proton, zredukowane koenzymy nu-
kleotydu pirydynowego powinny być poprawnie zapisywane jako NADH+H+ (NADPH+H+).

Ryc. 4. Formy utlenione amidu kwasu nikotynowego i przyłączenie jonu wodorkowego

Możliwości szerokiego wykorzystania nukleotydów pirydynowych w analityce wynikają z

ich specyficznych właściwości:
- formy zredukowane koenzymów (NADH+H+, NADPH+H+) wykazują absorbancję przy dłu-
gości fali λ= 340 nm; formy utlenione koenzymów (NAD+, NADP+) nie absorbują światła o tej
długości.
- formy zredukowane koenzymów są trwałe w środowisku alkalicznym i wykazują wówczas
intensywną fluorescencję „własną”. Formy utlenione ulegają w takich warunkach natychmia-
stowej destrukcji. Zredukowane koenzymy są nietrwałe w środowisku kwaśnym, natomiast
utlenione wykazują trwałość w niskim pH. Różnice w tych właściwościach umożliwiają „znisz-
czenie” nadmiaru koenzymu pozostającego po zakończeniu reakcji, pozostawiając do pomiaru
tylko trwałą w danych warunkach formę koenzymu – zredukowaną w środowisku alkalicznym,
utlenioną w środowisku kwaśnym.
- zarówno zredukowana jak i utleniona forma koenzymu może być przekształcana w silnie
fluoryzującą pochodną, dzięki czemu obie formy można oznaczać w stężeniach rzędu
10-10–10-9 M.
Właściwości spektralne utlenionych i zredukowanych form nukleotydów pirydynowych
są bardzo często wykorzystywane w analityce biochemicznej, np.:

1. Stosując odpowiedni substrat (AH2) można oznaczać aktywność specyficznej względem

niego dehydrogenazy na podstawie ilości zredukowanego koenzymu (NADH+H+ lub
NADPH+H+) powstałego zgodnie z reakcją
AH2 + NAD+  A + NADH+H+
(NADP+) (NADPH+H+)

4
2. Stosując odpowiednią oczyszczoną dehydrogenazę lub odpowiedni układ enzymatyczny
można oznaczać małe ilości metabolitów selektywnie utlenianych lub redukowanych przez te
enzymy. Powstające w tych reakcjach stechiometryczne ilości zredukowanego lub utlenionego
koenzymu można oznaczać spektrofotometrycznie. Przykładem takich sprzężonych reakcji jest
układ heksokinazy i dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu używany do oznaczania ATP lub glu-
kozy.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

A. Porównanie właściwości spektralnych nukleotydów pirydynowych (NAD+ i NADH+H+)

Odczynniki:
- 0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0 i pH 6,5
- 0,2 mM NAD+ w 0,05 M buforze fosforanowym o pH 6,5
- 0,2 mM NADH+H+ w 0,05 M buforze fosforanowym o pH 9,0

Wykonanie:
Przygotować po 1ml 0,1 mM roztworu NAD+ i 0,1 mM roztworu NADH+H+ wykorzystując
odpowiednie bufory fosforanowe. Wyznaczyć widmo przygotowanych roztworów w zakresie
od 220 do 400 nm. Pomiary wykonać w kuwetach kwarcowych, stosując bufor fosforanowy o
pH 6,5 jako próba odniesienia dla NAD+ i bufor fosforanowy o pH 9,0 jako próba odniesienia
dla NADH+H+.

Opracowanie wyników:
Przedstaw i opisz widmo utlenionej i zredukowanej formy nukleotydu.

5
B. Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi wołowej
W analizie stężenia glukozy wykorzystuje się oczyszczoną heksokinazę katalizującą reakcję 1
glikolizy i oczyszczoną dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu przekształcającą glukozo-6-
fosforan do 6-fosfoglukonolaktonu (reakcja 1 szlaku heksozomonofosforanowego):

ATP + glukoza  ADP + glukozo-6-fosforan

glukozo-6-fosforan + NADP+  6-fosfoglukonolakton + NADPH+H+

Forma utleniona NADP+ ulega redukcji do NADPH+H+ w ilościach stechiometrycznych (na

każdą cząsteczkę glukozy ulegającą fosforylacji w reakcji 1, w reakcji 2 powstaje jedna czą-
steczka NADPH+H+). Warunkiem prowadzenia poprawnych oznaczeń jest nadmiar w środowi-
sku reakcyjnym ATP i NADP+, właściwe pH oraz odpowiednia czystość oraz aktywność katali-
tyczna preparatów enzymatycznych.

Odczynniki:
- 50 mM bufor Tris-HCl, pH 7,6 zawierający 4 mM MgCl2
- 20 mM ATP w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 7,6 zawierającym 4 mM MgCl2
- 4 mM NADP+ w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 7,6 zawierającym 4 mM MgCl2
- 1 mM roztwory glukozy, fruktozy i galaktozy przygotowane w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 7,6,
zawierającym 4 mM MgCl2
- preparat zawierający oczyszczoną heksokinazę i oczyszczoną dehydrogenazę glukozo-6-
fosforanu o aktywności około 1 U każda w 100 µl 50 mM buforu Tris-HCl, pH 7,6, zawierają-
cego 4 mM MgCl2

Wykonanie:

1. Materiał do badań:
Płodowa surowica wołowa (FBS) 5-krotnie rozcieńczona 0,9% NaCl.

2. Wykonanie oznaczeń:
Do 7 probówek Eppendorfa o objętości 1,5- 2,0 ml dodać składniki reakcyjne zgodnie z przed-
stawioną tabelą:

6
 Nr próby
Składnik
1 2 3 4 5 6 7
50 mM Tris-HCl, pH 7,6
600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 700 µl 600 µl
z 4 mM MgCl2
20 mM ATP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
4 mM NADP+ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
roztwór heksokinazy i dehy-
100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl - 100 µl
drogenazy glukozo-6-fosforanu
1 mM glukoza - 20 µl 40 µl - - - -
1 mM fruktoza - - - 40 µl - - -
1 mM galaktoza - - - - 40 µl - -
50 mM Tris-HCl, pH 7,6
100 µl 80 µl 60 µl 60 µl 60 µl - -
z 4 mM MgCl2
5-krotnie rozcieńczona suro-
- - - - - 100 µl 100 µl
wica krwi (FBS)
Próba 1 jest próbą odniesienia (zerówką) dla prób 2-5, natomiast próba 6 jest próbą odniesienia
dla próby 7.

Próby inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, po czym zmierzyć absorbancję prób
od 2 do 5 względem próby 1, a próbę 7 względem próby 6, przy dł. fali λ=340nm.

Opracowanie wyników:

1. Przedstawić w tabeli i skomentować wyniki pomiaru spektrofotometrycznego. Obliczyć koń-

cowe stężenie cukru (nmol/ml) w próbach 2-5.
2. Obliczyć stężenie procentowe (w/v) glukozy w nierozcieńczonej surowicy krwi.
Molowy współczynnik absorpcji (ε) dla NADH.H+ wynosi 6220 [l · mol-1 · cm-1]. To znaczy,
że 1 M roztwór NADH.H+ wykazuje przy 340 nm absorbancję równą 6220.

7
Zagadnienia do przygotowania
- przebieg i znaczenie glikolizy i szlaku heksozomonofosforanowego
- właściwości spektralne i rola nukleotydów pirydynowych (NAD+, NADP+)
- wykorzystanie właściwości spektralnych nukleotydów pirydynowych do oznaczania stężenia
metabolitów i aktywności enzymów w oparciu o pomiary zmian absorbancji towarzyszących
utlenianiu lub redukcji koenzymów NAD+, NADP+.

Literatura
1. Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
2. Zarys biochemii – P Karlson PWN, Warszawa, 1987
3. Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
4. Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005