Thử nghiệm khả năng điều hòa in vitro của Omega-3 (EPA và DHA) đối với

quá trình thực bào của bạch cầu trung tính ở dê

Mục đích
Đánh giá tác dụng điều hòa miễn dịch của EPA và DHA đối với bạch cầu trung tính thông
qua hoạt động chống lại mầm bệnh xâm nhập như quá trình thực bào.

Nguyên vật liệu và phương pháp

1. Thuốc thử và môi trường
Cytochrome c, phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA), EPA and DHA, PBS không chứa
Ca2+ và Mg2+, nước không chứa nội độc tố (endotoxin-free), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-
1-piperazineethanesulfonic acid), đệm ly giải Hybri-Max và Percoll [Sigma–Aldrich
Corporation (St. Louis, MO, USA)], môi trường nuôi cấy tế bào RPMI-1640 với phenol red
[Invitrogen Life Technologies (Paisley, UK)], PBS [Biochrom AG (Berlin, Germany)],
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles, chất đánh dấu huỳnh quang [Molecular Probes
(Invitrogen, San Giuliano Milanese (Mi), Italy)].

2. Chuẩn bị EPA và DHA

Các muối sodium của DHA và EPA được hoàn nguyên trong nước với nồng độ 14.3 mM và
15.4 mM bảo quản trong tối ở -80C. Nồng độ PUFA được sử dụng là 25 mM.

3. Phân lập bạch cầu trung tính Caprine

Mẫu máu được lấy từ 6 con dê đang cho con bú, từ 5-6 tuổi và trong khoảng 30-33 tuần sau
khi sinh. Máu được lấy bằng cách chọc tĩnh mạch từ tĩnh mạch cảnh vào ống thủy tinh vô
trùng chân không 10 ml K3 EDTA và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ ở 5C.
Phân lập bạch cầu trung tính bằng PBS và Percoll. Đánh giá khả năng sống của bạch cầu
trung tính bằng trypan blue và nhuộm Wright.

4. Điều kiện nuôi cấy

Nồng độ PMN được điều chỉnh với RPMI-1640 bổ sung 10% FCS bất hoạt bằng nhiệt, 100
IU penicillin/ml, 100 mg streptomycin/ml, 1 aminoacid không thiết yếu và 20 mM HEPES và
được bảo quản với đá lạnh cho đến khi sử dụng. EPA và DHA được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy tế bào để tạo ra nồng độ cuối cùng là 25 mM.

5. Thử nghiệm quá trình thực bào

Đánh dấu huỳnh quang với Escherichia coli (chủng K12) và bảo quản ở -20C. Bạch cầu
trung tính được ủ trong 3 giờ với EPA và DHA với nồng độ 25 mM. E. Coli đã đánh dấu
huỳnh quanh (bioparticles) sẽ được thêm vào ủ cùng trong 2 giờ (tỷ lệ 30 particles/cell). Mẫu
đối chứng âm là mẫu bạch cầu trung tính được ở 37C và không bổ sung EPA và DHA, sau
đó thêm E. Coli đã đánh dấu huỳnh quang (bioparticles) và ủ trong 2 giờ. Các tế bào được ủ
với 100 ml trypan blue (1 phút ở nhiệt độ phòng), sau đó hút và thay thế bằng 100 ml PBS vô
trùng. Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện bằng đầu đọc tấm huỳnh quang Fluoroscan
Ascent (Thermo Electron Corporation, Vantaa, Phần Lan) và được biểu thị bằng RFU (Đơn
vị huỳnh quang tương đối). Sau 5 giờ, khả năng sống sót của bạch cầu trung tính nuôi cấy
được đánh giá bằng trypan blue.

Tài liệu tham khảo

 Một nghiên cứu cho thấy EPA và DHA có tác dụng gia tăng khả năng thực bào của bạch
cầu trung tính mà không phụ thuộc vào nồng độ sử dụng.
(https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0165242709001275)

 Một thí nghiệm khác cũng được tiến hành với bạch cầu đơn nhân ở dê và cho kết quả
tương tự về sự gia tăng khả năng thực bào của bạch cầu khi ủ với EPA và DHA so với
nhóm đối chứng. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20889357/)
Tác dụng của EPA và DHA đối với sự tăng sinh và sản xuất cytokine của tế
bào lympo B (tế bào Raji)

Mục đích

Đánh giá tác dụng của EPA và DHA đối với tế bào lympho B thông qua quá trình tăng sinh
và sản xuất cytokine, từ đó cho thấy ảnh hưởng tích cực đến chức năng miễn dịch của cơ thể.

Nguyên vật liệu và phương pháp

1. Điều kiện nuôi cấy và xử lý acid béo (EPA, DHA)

Các tế bào Raji (Dunn School of Pathology, Oxford University, England) được nuôi cấy
trong môi trường RPMI 1640 được bổ sung 10% FCS. Acid béo được hòa tan trong ethanol
trước khi bổ sung vào môi trường chứa protein để nuôi cấy (tỷ lệ ethanol luôn thấp hơn
0.05%).

2. Thử nghiệm tăng sinh tế bào Raji

5
Tế bào Raji (3.3 x 10 tế bào/ml) được cố định trong các đĩa microtiter 96 giếng và được xử
14
lý bằng EPA và DHA (12.5 µM). [ C]Thymidine (1 µCi/mL) được thêm vào môi trường khi
bắt đầu thí nghiệm. Các đĩa được ủ trong môi trường ẩm 5% CO2 và 95% không khí ở 37°C.
Các tế bào được thu thập bằng cách sử dụng Máy thu hoạch đa tế bào Skatron Combi
14
(Suffolk, United Kingdom) và độ phóng xạ của [ C]Thymidine gắn vào DNA của tế bào
được xác định bằng cách sử dụng bộ đếm β (Packard Tri-Carb 2100 TR counters; Downers
Grove, IL) thể hiện dưới dạng tổng số lượng trên phút (cpm).

3. Thử nghiệm sản xuất cytokine từ tế bào Raji

5
Tế bào Raji (2 x 10 tế bào/ml) được cố định trong các đĩa 24 giếng và được xử lý trong 24
giờ bằng EPA và DHA (25 µM). Sau đó, các tế bào này được nuôi cấy trong 24 giờ nữa với
sự có mặt của 25 µg/mL concanavalin A (Con A). Sau đó, chất lỏng nổi trên bề mặt nuôi cấy
tế bào được thu thập để xác định các cytokine được tiết ra. Quá trình sản xuất IL-10, INF-γ
và TNF-α được đánh giá bằng ELISA bằng cách sử dụng Kit OptEIA™ của Pharmingen
(San Diego, CA). Giới hạn phát hiện của IL-10 và TNF-α là 7,8 pg/mL và của INF-γ là 4,7
pg/mL (theo nhà sản xuất).
 Tài liệu tham khảo

 Một nghiên cứu đã kiểm chứng thấy các tế bào Raji đã được tăng sinh bởi cả EPA và
DHA. Sự gia tăng được cho thấy nhiều hơn với EPA (1,8-, 1,9-, 2,0- và 2,0 lần tại tương
ứng là 12,5, 25, 50 và 75 µM) so với DHA (lần lượt là 1,5- và 1,3 lần ở 12,5 và 25 µM).
DHA ở nồng độ 50 µM không có tác dụng lên sự tăng sinh tế bào Raji và ở 75 µM gây ra
sự sụt giảm tế bào. Bên cạnh đó, cả EPA và DHA đều làm giảm đáng kể việc sản xuất IL-
10 (59% và 70% tương ứng), TNF-α (lần lượt là 29% và 42%) và INF-γ (lần lượt là 23%
và 28%). (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15669761/)
Một số nghiên cứu, báo cáo khác nhau về tác dụng của Omega-3 lên các tế bào
của hệ thống miễn dịch

 Sự sản xuất ROS của bạch cầu trung tính

- Cả EPA và DHA đều làm tăng sản xuất ROS theo cách phụ thuộc vào liều lượng ở bạch
cầu trung tính của chuột. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23086551/)
- Trong bạch cầu trung tính của dê, việc sản xuất các loại oxy phản ứng bị giảm bởi DHA
và không bị ảnh hưởng bởi EPA. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19395090/)
 Quá trình kích thích tế bào B
- DHA và EPA có tác động tiêu cực đến việc kích hoạt miễn dịch của các tế bào B được
chiết xuất từ PBMCs của con người và được điều trị ex vivo. EPA và DHA làm giảm
chuyển vị hạt nhân p50 chống CD-40 gây ra, sự phosphoryl hóa Stat6 và bài tiết IL-6
(https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0955286310000628?via%3Dihub
Chất chuyển hóa có nguồn gốc từ DHA 17-hDHA làm giảm sự bài tiết IL-6 và IL-10 của
các tế bào B ở người khi được kích thích bằng TLR CpG ODN 2395 và kháng IgM.
(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22711890/)
- Ở chuột, trong môi trường in vitro, EPA và DHA đã cải thiện tỷ lệ PUFA n-6/n-3 của
màng tế bào và DHA làm giảm bài tiết interleukin (IL)-6; nhưng không ảnh hưởng đến sự
kích hoạt tế bào B (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20071694/)