M C, E C M G: Étodos Romatográficos Letroforese Apilar E Étodos Ravimétricos

Métodos Cromatográficos,
Eletroforese Capilar e
Métodos Gravimétricos
Brasília-DF.
Elaboração
Guilherme Lopes Batista
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração

Sumário
Apresentação.................................................................................................................................. 5
Organização do Caderno de Estudos e Pesquisa..................................................................... 6
Introdução.................................................................................................................................... 8
Unidade I
Revisão Conceitual.......................................................................................................................... 11
Capítulo 1
Propriedades da matéria.................................................................................................... 12
Capítulo 2
Transporte e transformações da matéria...................................................................... 16
Unidade iI
Métodos Gravimétricos.................................................................................................................. 29
Capítulo 1
Gravimetria Clássica.......................................................................................................... 29
Capítulo 2
Gravimetria Instrumental................................................................................................... 37
Unidade iII
Cromatografia................................................................................................................................ 42
Capítulo 1
Aspectos gerais e cromatografia planar...................................................................... 42
Capítulo 2
Cromatografia a gás........................................................................................................ 49
Capítulo 3
Cromatografia a líquido de alta eficiência.................................................................. 56
Unidade iV
Eletroforese Capilar....................................................................................................................... 60
Capítulo 1
História e Fundamentos...................................................................................................... 60
Capítulo 2
Instrumentação e Aplicação............................................................................................ 66
Unidade V
Detectores e Interpretação dos Resultados................................................................................ 76
Capítulo 1
Sinais em técnicas químicas de separação..................................................................... 76
Capítulo 2
Detectores para sistemas analíticos de separação........................................................ 85
Unidade Vi
Guia Prático de seleção e realização de técnicas..................................................................... 93
Capítulo 1
Gravimetria e pesagens...................................................................................................... 94
Capítulo 2
Cromatografia................................................................................................................... 97
Capítulo 3
Eletroforese capilar........................................................................................................ 107
Referências................................................................................................................................. 110
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se

entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade.
Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela
interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da
Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade

dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos
específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém
ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a
evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo

a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na
profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
5
Organização do Caderno
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em

capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos
básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam tornar
sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta para
aprofundar seus estudos com leituras e pesquisas complementares.
A seguir, apresentamos uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos
Cadernos de Estudos e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.
Sugestão de estudo complementar
Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,

discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a

síntese/conclusão do assunto abordado.
6
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões

sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o

entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
Para (não) finalizar
Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem

ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.
7
Introdução
Este módulo apresenta algumas ferramentas e técnicas instrumentais essenciais para a
realização de análises químicas forenses. Por meio delas, podemos obter informações
detalhadas acerca da composição de materiais, documentos ou obras de arte.
A gravimetria é, certamente, a primeira técnica analítica aplicada pelo homem. Ela consiste
em examinar um material medindo sua massa, ou, coloquialmente, pesando-o, sendo
uma técnica primordial e fundamental na prática analítica. Apesar da grande evolução
de instrumentos e técnicas, com grande versatilidade e simplificação nas operações
de análise, a gravimetria ainda é utilizada e essencial na elaboração de padrões de
referência empregados em outras técnicas analíticas.
Já para análise de misturas complexas, frequentemente é necessário separar os

componentes da amostra em momento prévio à sua observação e medida. As principais
alternativas aos métodos laboriosos de tratamento de amostras clássicos são as técnicas
Cromatográficas e a Eletroforese Capilar. Nestas, uma amostra contendo uma mistura
complexa sofre um processo pelo qual seus compostos se separam uns dos outros,
permitindo sua medida.
Como será visto posteriormente, o desenvolvimento das técnicas de separação

supracitadas se deu em momento posterior ao da gravimetria, apesar de ter origem em
procedimentos bastante antigos de preparação e tratamento de amostras. A difusão
de seus usos como técnicas analíticas, contudo, se deu pelo desenvolvimento de
equipamentos e procedimentos instrumentais que permitiram a realização das análises
de maneira mais reprodutível e prática.
A Eletroforese Capilar e as técnicas Cromatográficas, em suas diversas modalidades,

possuem aplicações diferentes em função da amostra a ser analisada e das substâncias
a serem investigadas. A compreensão dos princípios de funcionamento, bem como do
instrumento utilizado, permite melhor seleção de técnicas a serem utilizadas bem como
melhor interpretação dos dados adquiridos.
Espera-se, neste momento, que o aluno possua conhecimentos de Química Geral para
acompanhar o curso ministrado. Contudo, os conceitos essenciais serão apresentados,
e aspectos mais fundamentais que não puderem ser retomar serão explicitados ao longo
do texto, bem como serão apresentadas referências selecionadas para estudo.
8
Objetivos
»» Compreender os princípios físico-químicos envolvidos em cada tipo de
análise estudada.
»» Compreender o funcionamento dos instrumentos de análise, suas peças

principais e de que forma operam.
»» Entender as aplicações possíveis para cada procedimento de análise,

fornecendo senso crítico para a seleção de técnicas para amostras
apropriadas.
»» Entender como é realizada a operação dos métodos pelo químico analítico

em prática laboratorial.
»» Possibilitar a interpretação dos resultados finais de análise, por meio da

compreensão dos dados obtidos por cada procedimento.
9
10
Revisão Conceitual Unidade I
Na prática analítica é essencial realizar procedimentos que permitam tratar moléculas de

acordo com sua reatividade e propriedades. Processos são realizados para condicionar
amostras, separar moléculas, bem como reações específicas podem ser exploradas para
purificação e/ou detecção de compostos. De forma a facilitar a compreensão sobre os
tais fenômenos, é realizada aqui uma breve retomada de conceitos pertinentes para o
desenvolvimento dos temas.
Esta revisão, breve e resumida, não pretende substituir ou compensar um curso de

Química, mas relembrar aspectos essenciais para melhor entendimento das técnicas.
Para aqueles que sentirem maiores dificuldades, ou que quiserem aprofundar mais
nos assuntos abordados, serão apresentadas referências bibliográficas que tratam tais
assuntos de forma mais dedicada.
Muitos aspectos reativos só podem ser explicados considerando de que forma as

moléculas se movem. O transporte de matéria é essencial em quase todos os aspectos
da Química, em especial nas técnicas de separação que serão abordadas neste texto e
nas técnicas eletroquímicas..
11
Capítulo 1
Propriedades da matéria
Neste capítulo serão apresentados alguns aspectos sobre as propriedades da matéria que
são imprescindíveis para a compreensão dos fenômenos aqui estudados. A composição
da matéria e algumas de suas propriedades explicam a maneira que elas interagem, e o
que podemos esperar do seu comportamento.
Massa Molar
Em sua essência, a matéria é formada por elementos químicos, cada qual com sua
massa característica. É por meio desta relação fundamental muito bem conhecida,
entre a fórmula de substâncias puras e suas massas, que a gravimetria se baseia. Uma
vez purificado um composto ou elemento de interesse, a pesagem guarda relação direta
com a quantidade de átomos e moléculas em uma amostra.
A quantidade de átomos presente em uma determinada massa de material é dependente

da natureza do átomo. Cada elemento químico possui uma massa atômica e pode ser
consultada na tabela periódica. Um grama é 6,0221 . 1023 vezes maior do que uma
unidade de massa atômica, ou seja, quando se reúnem 6,0221 . 1023 átomos de um
elemento de “x” massa atômica, eles pesarão “x” gramas.
A este número peculiar (6,0221 x 1023) dá-se o nome de Constante de Avogadro, ou

mol. Ao indicar, por exemplo, que há 1 mol de cloreto de sódio em 1 litro de água (NaCl 1
mol / l) é o mesmo que dizer que há 6,0221 x 1023 moléculas de NaCl em 1l de água, e
equivale a dizer que há 58,4 g deste composto neste volume.
Esta relação entre os elementos e as massas é importante, não apenas registrar e

relacionar as concentrações obtidas, mas para entender a relação entre a concentração
de reagentes utilizados em uma reação química.
Interações Intermoleculares
Para realizar a separação e purificação de substâncias para análises, outras propriedades
da matéria são exploradas. Na gravimetria, um conjunto de reações específicas são
conduzidas de forma a se obter um sólido puro. Existem reações específicas descritas
em literatura para os mais diversos elementos (VOGEL etc.); no próximo capítulo desta
unidade revisaremos a forma que estas reações acontecem.
12
Revisão Conceitual │ UNIDADE I
De que outras formas é possível realizar a separação de substâncias de uma amostra?

O que torna cada substância diferente e única em uma mistura? Quais diferenças
presentes em cada composto podem ser exploradas para o diferenciar?
Existem diversos tipos de Cromatografia, contudo todas exploram, principalmente,

propriedades que resultam em diferentes interações intermoleculares para realizar
uma separação. Já a Eletroforese Capilar explora a diferente interação das moléculas
com um campo elétrico constante.
As moléculas se ligam umas às outras por meio de interações relativamente brandas.

É por meio destas ligações, ou, em alguns casos, da ausência delas, que os compostos
se distribuem na natureza. Estas interações resultam no estado físico que o composto
se encontra (sólido, líquido ou gasoso), da maneira que os compostos se misturam, se
solubilizam, ou mesmo como se aderem uns aos outros.
Pensemos em um composto puro como um conjunto de moléculas iguais. Se estas

possuem alta energia térmica, elas se movem livremente e ocupam todo o espaço no
qual se encontram. Nesta situação, dizemos que o composto se encontra na forma de
gás, ou estado gasoso.
Agora, consideremos que a temperatura seja diminuída e/ou o espaço que elas ocupam
seja menor. A velocidade menor e/ou a maior proximidade entre as moléculas favorecem
que elas interajam umas com as outras. Nesse caso, formam ligações intermoleculares.
Quando moderadas, ainda permitem um grau de movimentação que torna o material
fluido, estado físico definido como líquido. Quando mais intensas, o material se torna
sólido e possui forma definida.
Volatilidade
Cada substância possui uma tendência própria a permanecer em cada estado físico
descrito, a uma dada temperatura. A tendência desta de se converter para o estado
gasoso é denominada volatilidade e varia de acordo com sua estrutura química,
em especial sua massa molecular e polaridade. Em relação à massa, compostos
maiores tendem a se agregar mais do que compostos menores, devido a energia
que precisam para se movimentar livremente. Esta influência é mais considerável
quando comparados compostos de polaridade similares. Este segundo parâmetro, no
entanto, é muito relevante para determinar a volatilidade e será melhor apresentado
a seguir.
13
UNIDADE I │ Revisão Conceitual
Polaridade
Os compostos químicos são formados por átomos, que compartilham elétrons por meio de
ligações químicas de modo a estabilizar sua carga e sua estrutura interna. A distribuição
local dos campos elétricos varia de acordo com a capacidade de estabilizar carga
(eletronegatividade) e com a geometria da molécula, assim cada composto possui uma
polaridade. Quando átomos se distribuem na molécula induzindo um vetor de campo
elétrico local, chamado de dipolo, dizemos que o composto é polar, enquanto compostos
cujas ligações ‘compensam’ e ‘anulam’ os campos locais, dizemos que um composto é
apolar. Consideremos os exemplos abaixo:
Figura 1. Estrutura Química das moléculas de metano (à esquerda) e da água (à direita).
Fonte: composição e adaptação das seguintes imagens disponíveis: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/56/

Dipole_Water.svg>; <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ae/Methane-2D-small.png>
Na molécula de água, um átomo de oxigênio se liga a dois átomos de hidrogênio

formando um ângulo de 104,5°. O oxigênio possui capacidade maior do que o hidrogênio
de acomodar cargas negativas, formando um dipolo elétrico. A água, portanto, é uma
molécula polar.
Já na molécula de metano, o carbono ao centro da molécula se liga a quatro hidrogênios

dispostos no vértice de um tetraedro perfeito. Apesar do átomo de hidrogênio possuir
uma tendência levemente maior do que o carbono de acomodar cargas negativas, os
campos formados pelas ligações se anulam. O metano, então, é uma molécula apolar.
Eletronegatividade
A polaridade de uma molécula é determinada pela sua geometria e pela eletronegatividade
dos átomos que a compõe. Tais fatores não serão abordados nesta apostila, no entanto
é sempre bom relembrar a fila de eletronegatividade, por meio da qual pode-se intuir
14
a polaridade de uma ligação. Os átomos que acomodam melhor cargas negativas, em

ordem decrescente de afinidade pelos elétrons, se encontra a seguir:
Figura 2. Série de Eletronegatividade.
F > O > N > Cl > Br > I > S > C > P > H

Fonte disponível e adaptada: <https://www.ptable.com/#Property/State>.
Desta forma, uma molécula de ácido fluorídrico (H-F), por exemplo, é muito mais polar
do que uma molécula de cloreto de bromo (Cl-Br). Com base nesta fila e na estrutura da
molécula, somos capazes de inferir quais destas são mais ou menos polares.
Vamos agora retomar o conceito de volatilidade e observar com base na polaridade.

Imagine um recipiente contendo apenas moléculas de água: cada molécula,
isoladamente, possui um campo negativo e positivo induzido em sua estrutura.
Quando duas moléculas se aproximam, as partes de polaridades opostas interagem,
equilibrando a carga do sistema. Isso implica que substâncias mais polares tendem a
ser menos voláteis, pois suas moléculas tendem a interagir mais do que moléculas em
substâncias menos polares.
Assim como uma molécula de água pode formar ligações com outra para estabilizar essa
polaridade, moléculas diferentes podem interagir de modo similar. Portanto, substâncias
polares tendem a interagir melhor com substâncias polares. Isso explica a solubilidade
e a miscibilidade entre diferentes compostos.
Algumas substâncias possuem uma tendência tão grande em ceder ou em adquirir

cargas que podem, de fato, apresentar cargas elétricas, tornando-se íons. Estes íons,
muito instáveis se isolados no meio ambiente, podem ser bem estáveis especialmente
quando em meio a uma substância polar, cujos dipolos estabilizam sua carga.
O comportamento da formação de íons e seu comportamento são essenciais para

compreensão dos fenômenos envolvidos na Eletroforese Capilar. Neste documento não
falaremos da natureza destes compostos, porém, na próxima seção será explicando a
forma que estes interagem, influenciam e se transformam no meio e o mesmo modelo
também pode explicar bem outras interações relevantes para a Cromatografia e para
a Gravimetria.
15
Capítulo 2
Transporte e transformações da matéria
Por meio do conhecimento das propriedades da matéria, pode-se conhecer e prever o

comportamento que determinadas espécies podem apresentar no ambiente. Existe uma
forma pela qual estas propriedades se manifestam, e os modelos que permitem explicar
esta manifestação, de acordo com a maneira que estas espécies se transportam e a
forma que elas interagem.
As explicações contidas neste capítulo são resumos de temas bastante complexos.

Apesar de serem assuntos que podem ser bastante aprofundados, o conhecimento
destes temas mesmo que superficial permitirá uma melhor compreensão dos sistemas
de análise estudados.
Agitação térmica
O meio no qual nos encontramos é repleto de moléculas e espécies químicas, e todas elas
apresentam movimento. Uma das formas que este movimento se manifesta é por meio
do calor. Podemos entender, pois, o calor como a intensidade média da movimentação
das moléculas em um meio: quanto mais agitadas elas se encontram, maior a velocidade
média que elas se encontram.
É interessante notar que a movimentação das moléculas pode acontecer de diversas

formas. A maneira mais intuitiva é pensar no movimento translacional, no qual a espécie
se move de um lugar a outro do espaço. Contudo, outros movimentos podem ocorrer, e,
salvo a regra, ocorrem simultaneamente. Além da translação, as moléculas apresentam
movimentos de rotação em torno de si e também de vibração, de suas ligações e das
nuvens eletrônicas de seus átomos.
A maneira que este calor se manifesta em cada espécie no ambiente varia de acordo
com suas propriedades. Um aspecto bastante relevante é seu estado físico: moléculas
de gás podem se mover livremente no ambiente no qual se encontram, realizando os
mais diversos tipos de movimentos. Já no caso do líquido, há algumas ligações entre
as moléculas que não permite movimentação livre, mas estas ainda podem apresentar
movimentos de translação, mesmo que limitados. No caso dos sólidos, os movimentos
de translação e rotação são bastante limitados, sendo mais recorrentes om movimentos
de vibração.
16
Figura 3. Agitação térmica das partículas.

Quadro esquerda: sólido; Quadro central: líquido; Quadro direita: gás.
Fonte disponível em: <https://www.physics.utoronto.ca/~jharlow/teaching/everyday06/reading10.pdf>.
A temperatura se refere à energia média das partículas no meio. Um corpo que

contenha um maior número de moléculas pode apresentar maior energia total
do que um corpo com menos moléculas que apresente maior temperatura,
pois, apesar da energia média das moléculas ser maior, a soma das energias do
primeiro é maior do que a do segundo.
Difusão
Suponha que algumas moléculas de uma substância sejam adicionadas em meio a
outra, de forma que elas se misturem livremente. No momento inicial, as moléculas
que adicionamos estão em uma determinada região do espaço, enquanto as moléculas
do meio ocupam outros espaços em seu entorno.
Considerando a agitação térmica, todas as moléculas estão se movendo de forma aleatória.

Se não há preferência para a movimentação de moléculas específicas, certamente algumas
moléculas adicionadas na solução se moverão para regiões da mistura mais distantes do
ponto no qual foram adicionadas, como se pode ver na Figura 4.
Em uma questão quantitativa, percebemos que, nos pontos de maior concentração

destas moléculas, mais rapidamente elas se misturam no meio no qual foram inseridas,
conforme descreve a Lei de Fick, apresentada na Figura 5. Como se pode imaginar, isso
varia também de acordo com a natureza da molécula e a temperatura do sistema.
Figura 4. Transporte de matéria por difusão.
Fonte: composição das seguintes imagens disponíveis em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/12/Diffusion.

svg>; < https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f9/Blausen_0315_Diffusion.png>.
17
Figura 5. Lei de Fick.
ߜ݊
‫ ܬ‬ൌ െ‫ܦ‬
ߜ‫ݔ‬
Em nosso escopo de estudo, não será necessário realizarmos cálculos desta natureza,
mas esta equação pode ser vista como um resumo do parágrafo anterior: o fluxo de
matéria (J) é proporcional a uma constante (D, constante de difusão) e a diferença de
concentração da espécie (n) ao longo do espaço (x). O valor negativo da equação mostra
que o movimento das moléculas se dá do local de maior concentração para o local de
menor concentração.
Transporte Pneumático
Agora, consideremos um material fluido dentro de um tubo, de forma que uma das
extremidades apresente uma pressão positiva em relação à outra. A pressão provoca força no
fluido que o move em direção à região de menor pressão. O modo que este fluido se desloca
depende da velocidade em que se move, bem como de propriedades do fluido e da tubulação,
podendo ser classificado como laminar, turbulento, ou uma transição entre ambos.
Nas técnicas cromatográficas de separação, o fluxo ocorre de modo laminar. Nele, o

fluido se desloca de maneira ordenada e faz com que suas moléculas sigam paralelamente
a parede do tubo. Em função das propriedades coligativas, ou seja, interação entre as
moléculas, estas mais próximas à parede dos tubos se moverão mais lentamente do que
aquelas em seu centro, conforme ilustrado na figura 6:
Figura 6. Perfil de Fluxo Laminar.
Fonte: adaptado (redesenhado a partir) de disponíveis em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8a/Fig.1_

Velocity_flow_profile.GIF>.
Migração
A migração é a forma de transporte de moléculas sob ação de um campo elétrico,
fenômeno explorado na Eletroforese Capilar. Espécies contendo carga positiva ou
18
negativa são atraídas por polos opostos, seja negativa ou positiva, e possuem velocidades
diferentes de acordo com sua carga e seu tamanho. Particularidades a respeito da
migração de moléculas, bem como o fluxo de um fluido sob campo elétrico em uma
tubulação, serão discutidos posteriormente.
O comportamento da matéria depende de algumas características intrínsecas de átomos

e moléculas. Por meio do conhecimento de algumas destas características, podemos
entender melhor seu comportamento e as transformações que estas sofrem.
Equilíbrio Químico
Todos os processos físicos e químicos comentados na seção anterior possuem uma
forma pela qual ocorrem. O modelo de equilíbrio reversível é um aspecto central na
ciência hoje, e entendê-lo e intuí-lo é essencial em ciências naturais. Ainda que o leitor
já conheça esse assunto, sempre é relevante revisitá-lo.
Para melhorar a compreensão sobre o assunto, vamos considerar uma situação hipotética
completamente diferente: um estacionamento. A todo o momento, há carros entrando
e saindo do estacionamento, e comumente um mesmo carro entra e sai diversas vezes
em um mesmo estacionamento ao longo do tempo. Contudo, podemos considerar uma
condição regular na qual a quantidade de carros dentro do estacionamento é constante.
É importante frisar algo neste modelo: se você contabilizar o movimento dos estacionamentos
pelo número de veículos estacionados, terá a impressão de que praticamente nada acontece
em função do tempo, visto que o número de veículos não varia. No entanto, a dinâmica do
estacionamento ocorre justamente pelo movimento de entrada e saída de veículos, sendo o
número de carros em ambas as portas iguais em uma situação de equilíbrio.
Figura 7. Estacionamento de carros em analogia a equilíbrio químico.
Fonte: composição e adaptação das seguintes imagens disponíveis em: <https://pixabay.com/pt/carro-de-corrida-ferrari-

red-296772/>; < https://www.goodfreephotos.com/vector-images/blue-car-vector-graphic.png.php. https://pixabay.com/pt/
carro-de-corrida-carro-cinzento-303766/>.
19
Ainda neste modelo, se soubermos o número total de carros que frequenta o estacionamento,
podemos inferir o tempo médio que cada carro passa estacionado em um dado período,
pela razão entre o número de carros estacionados e o de carros totais.
Podemos imaginar que é de interesse do proprietário aumentar o número de clientes,

ou seja, de carros estacionados em seu estacionamento. Para tanto, são oferecidas
condições diferenciadas de pagamento e/ou benefícios, para que mais pessoas venham
ou que voltem mais vezes. Nesse caso, continuam entrando e saindo pessoas do
estacionamento, mas haverão mais vagas ocupadas. É possível até pensar que, se há
mais pessoas na cidade, o estacionamento tende a estar cada vez mais cheio.
Agora vamos considerar que está ocorrendo, aos poucos, um êxodo da cidade. Com
moradores saindo da cidade, a quantidade de pessoas no estacionamento é cada vez
menor. Em uma situação extrema, em que todos saíssem da cidade, não haveria mais
ninguém para parar o carro neste estacionamento.
Um químico poderia descrever a situação acima com uma equação envolvendo veículo
(Ve) e vaga (Va) como se fossem reagentes (I), ou ainda, como se fosse a “mudança de
estado” do veículo, de uma forma estática (sólida) para uma forma fluida (líquido)(II)
Figura 8. Equação de Equilíbrio de Estacionamento.
��(�) � � ��(�) � � � ��(�)
��(�) � � � ��(�)
As comparações não param por aí. As influências externas no número de vagas ocupadas
também possuem contrapartida em nível molecular, como a temperatura, a pressão ou
até mesmo o transporte das moléculas.
Agora vamos ver a similaridade com um sistema químico. Considere, novamente, um

recipiente com água pura, fechado, cheio à metade. Parte da água está, a todo momento,
se tornando vapor de água, enquanto parte do vapor condensa novamente na superfície
da água (III):
Figura 9. Equilíbrio de Vaporização da água.
‫ܪ‬ଶ ܱሺ௟ሻ ֖ ‫ܪ‬ଶ ܱሺ௚ሻ
Percebe-se que a equação acima muito se assemelha com a equação do equilíbrio

no estacionamento. Agora, bem como os carros, será que conseguimos favorecer o
“estacionamento” das moléculas de água no recipiente, ou, até mesmo, “espantá-las”?
Coloque o recipiente fechado com água na geladeira. Após algum tempo, verá que a
parede de seu recipiente ficou embaçada, com água condensada, logo, aumentamos o
20
número de moléculas de água “estacionadas”. O efeito contrário também é relevante: se

aquecer o recipiente, verá menos água condensada.
Por outro ponto de vista, podemos dizer que a água líquida sempre forma vapor de água,
com mais ou menos intensidade de acordo com a temperatura. Esse líquido, ao formar
vapor, gera um gás que exerce pressão no sistema, denominada pressão de vapor.
Quando esta temperatura é relativamente alta, a pressão exercida se iguala a pressão
do ambiente, e a formação de líquido é desfavorável. Esta temperatura é denominada
ponto de ebulição.
Agora, se o recipiente for aberto e deixado por dias, especialmente em local bem ventilado,
a água começará a sumir. Esse é o “êxodo” da água para fora da “cidade” (recipiente),
podendo, em caso extremo, “esvaziar o estacionamento” (secar o recipiente).
Vamos considerar esta outra reação química, a dissociação do ácido acético:
Figura 10. Equilíbrio de dissociação do ácido acético.
‫ܪܥ‬ଷ ‫ ܪ ֖ ܪܱܱܥ‬ା ൅ ‫ܪܥ‬ଷ ‫ିܱܱܥ‬
De acordo com o modelo discutido, podemos prever que a proporção entre a formação
do ácido acético (CH3COOH) e do acetato (CH3COO-) pode ser deslocada por meio
da concentração de H+ na solução, favorecendo a formação da espécie com carga em
menores concentrações de H+. Na prática, isso pode ser equacionado pela lei de ação
das massas, que diz que a razão entre os produtos de reação (multiplicados entre si) e
dos reagentes (multiplicados entre si), chamada constante de equilíbrio é constante,
e varia de acordo com cada reação.
Figura 11. Lei de ação das massas para dissociação do ácido acético.
[� � ] � [�� ]
��
[�� ]
Vamos entender melhor, numericamente, como funciona este sistema. Para esta
reação, neste meio, a equação apresenta valor de K constante, de forma que o produto
entre [H+] e [CH3COO-] é igual ao produto entre K e [CH3COOH] (o que pode ser
verificado manipulando a equação). Se, por exemplo, o valor de [H+] aumenta, o
valor das outras espécies em solução variam de forma que os produtos indicados
sejam respeitados.
Consideremos, agora, que o K para a equação acima seja 1,8.10-5 mol.l-1, e que tenham
sidos adicionados inicialmente 0,1 mol.l-1 de ácido acético em solução. Qual será a
concentração de [H+] presente da amostra?
21
Para melhor entendimento deste tipo de processo, recomendo fazer a tabela a seguir.
Abaixo da reação química, são colocadas três linhas: as concentrações iniciais no
sistema, o que se espera formar para atingir o equilíbrio, e o estado final.
Tabela 1. Cálculo da dissociação do ácido acético.
CH3COOH H+ CH3COO-
Inicial 0,1 0 0
Formado -x +x +x
Final 0,1 - x x x
Fonte: autor. Neste caso, note que a tabela é montada de acordo com os dados descritos nos parágrafos anteriores.
Para descobrir o valor de [H+] em solução, basta substituir cada elemento pela linha
final, de modo que a equação resolvida para x resultará no valor desejado:
Figura 12. Equacionamento da dissociação do ácido acético.

�∙�
1,8 ∙ 10�� =
0,1 � �
Essa equação pode ser resolvida como um polinômio de segundo grau. No entanto,
como esta constante é muito mais baixa do que a concentração de ácido em solução
(0,1 > 1,8.10-5), podemos simplificar o termo (0,1 - x) como sendo 0,1. Neste caso:
Figura 13. Concentração de H+ decorrente da dissociação do ácido acético.
� � = 1,8 ∙ 10��
�� = � = 1,� ∙ 10�� ∙ l��
Como saber quando posso simplificar a equação conforme mostrado? Quando

houver dúvida, pode-se fazer uma conta simplificada e, posteriormente, repete-se
a conta considerando o valor encontrado para x, ou seja, ao invés de considerar 0,1,
considerar-se-ia 0,0987, aproximando o resultado para o valor mais próximo do
verdadeiro (que, neste caso, é o mesmo para o grau de precisão que temos nesse cálculo).
Perceba que, quando a solução de ácido acético é colocada em 0,1 mol.l-1 em

solução, forma-se 0,0013 mol.l-1 de base dissociada (acetato). Podemos dizer,
nesse caso, que a fração dissociada, ou o grau de dissociação (α) do ácido
acético nestas condições, é igual a 1,3% (0,0013/0,1).
Agora vamos considerar uma situação diferente: se houver 0,1 mol.l-1 de [H+] junto
a quantidade de ácido inicialmente adicionada, qual vai ser a concentração final de
acetato? Vamos realizar o cálculo utilizando a tabela novamente (Tabela 2).
22
Tabela 2. Cálculo da dissociação do ácido acético em presença de íons H+
CH3COOH H+ CH3COO-
Inicial 0,1 0,1 0
Formado -x +x +x
Final 0,1 - x 0,1 + x x
Fonte: autoria própria. Neste caso, note que a tabela é montada de acordo com os dados descritos nos parágrafos anteriores.
Prosseguindo os cálculos:
Figura 14. Equacionamento da dissociação do ácido acético em presença de íons H+.

�0,1 � �� ∙ �
1,8 ∙ 10�� =
0,1 � �
�� = � = 1,8 ∙ 10�� ∙ l��
Perceba que, quando há íons H+ inicialmente presentes na solução, a formação de íons

acetato é inibida, sendo seu grau de dissociação, neste caso, inferior a 0,1%. Isso mostra
que a composição do meio pode influenciar na dissociação de espécies da solução.
A relevância deste fato será apresentada a seguir.
Quando discutimos a reatividade química de soluções aquosas, é fundamental sempre

termos em mente equilíbrio de dissociação da água:
Figura 15. Equilíbrio de dissociação da água.
��
� � [�� ] = �� = [�� ] � [�� ] = 10��
É comum esta equação ser manipulada matematicamente, calculando-se o negativo do

logaritmo ao lado de cada um dos valores, para simplificar cálculos posteriores:
Figura 16. Negativo do logaritmo do equilíbrio de dissociação da água.
�� ) = �� ]) � �� ]) = 14
Substituindo o nome da operação de -log por p, podemos escrever:
Figura 17. pH e pOH

‫ܭ݌‬௪ ൌ ‫ ܪ݌‬൅ ݈‫݃݋‬ሺܱ‫ܪ‬ሻ ൌ ͳͶ.
Mesmo que você não tenha estudado esta disciplina antes, já deve ter ouvido bastante
se falar sobre pH. Essa importância se deve ao número de equilíbrios e reações que este
íon participa, como é o caso da dissociação do ácido acético, discutida anteriormente.
23
Vale ressaltar que, também é comum expressar constantes de equilíbrio na forma pK.
Neste caso, pode-se dizer, por exemplo, que o pKa para o ácido acético é 4,75.
Para cada uma das situações que vimos anteriormente, podemos ver que o ácido acético
pode influenciar no pH da solução, bem como o pH da solução pode influenciar na
formação de íons dissociados ou da molécula não dissociada. E, claro, em uma mistura
mais complexa podem ocorrer mais reações paralelas com íons comuns!
Para pensar um pouco: caso eu queira fazer a detecção do íon acetato em uma
análise química, seria interessante a solução apresentar pH baixo ou pH alto?
Por quê?
Vamos considerar agora um exemplo um pouco mais complexo. O ácido carbônico

(H2CO3) sofre dissociação parcial formando hidrogenocarbonato (HCO3-). Este íon, por
sua vez, pode se associar novamente ao próton voltando à forma ácida ou dissociar
formando carbonato (CO3-). Dizemos que um composto que pode se comportar como
ácido e também como base é um composto anfótero. Os equilíbrios envolvidos seguem
a seguir:
Figura 18. Equilíbrio de dissociação do ácido carbônico.
‫ܪ‬ଶ ‫ܱܥ‬ଷ ֖ ‫ ܪ‬ା ൅ ‫ܱܥܪ‬ଷି ‫ ܽܭ݌‬ൌ ͸ǡ͵͹
‫ܱܥܪ‬ଷି ֖ ‫ܪ‬ା ൅ ‫ܱܥ‬ଷଶି ‫ ܽܭ݌‬ൌ ͳͲǡ͵ʹ
Em casos como o do ácido carbônico, o pH da solução influencia completamente

na forma que este pode assumir no meio, podendo ser neutro, possuir uma carga,
duas cargas, ou mesmo se apresentar como uma mistura de algumas destas formas,
dependendo do pH do meio.
A composição de uma espécie de acordo com as características ácido-base do meio é

frequentemente representada por curvas de distribuição, que indicam o percentual da
concentração de cada uma das espécies de acordo com o pH do meio. Podemos ver na
figura 19 curvas de distribuição para o carbonato em água.
Apesar de parecer um caso bastante específico, espécies que possam sofrer

mais de uma ionização de acordo com o pH são bastante comuns na natureza.
Dois exemplos muito corriqueiros são as moléculas de proteínas e o DNA.
24
Figura 19. Distribuição do ácido carbônico em função do pH.
Fonte disponível em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/82/Carbonate_Bjerrum.gif>.
Além dos equilíbrios supracitados, o ácido carbônico ainda pode formar o gás carbônico,
que vai ao estado gasoso e, em sistemas abertos, é liberado da solução, conforme
equação da figura 20. Note que a constante está representada na forma do negativo de
seu logaritmo, ou seja, o número negativo representa um valor muito elevado para a
formação dos produtos.
Figura 20. Formação do gás carbônico a partir do ácido carbônico.

‫ܪ‬ଶ ‫ܱܥ‬ଷ ֖ ‫ܪ‬ଶ ܱ ൅ ‫ܱܥ‬ଶ ‫ ܽܭ݌‬ൌ െʹǡͻ
Desta forma, quando o carbonato é submetido a um meio bastante ácido, sua protonação
gera a formação de gás e liberação dos íons da amostra, mudando não apenas o estado
de dissociação dos compostos em solução, mas até mesmo sua composição.
Agora mais uma situação: como se comportaria uma solução preparada com 0,1 mol.l-1
de ácido acético adicionada de 0,1 mol.l-1 de íons acetato? Novamente, vamos utilizar a
tabela 3.
Apesar da inversão das variáveis, temos a mesma equação já resolvida acima para os
íons acetato, resultando em 1,8.10-5 mol.l-1 de íons H+. Este resultado também pode ser
expresso em forma de pH = 4,75.
Tabela 3. Formação de íons H+ pela dissociação do ácido acético em presença de íons acetato.
CH3COOH H+ CH3COO-
Inicial 0,1 0 0,1
Formado -x +x +x
Final 0,1 - x x 0,1 + x
Fonte: autor. Neste caso, note que a tabela é montada de acordo com os dados descritos nos parágrafos anteriores.
25
Esta última solução, contudo, tem uma propriedade bem interessante em seu equilíbrio:
perceba que, caso eu realize uma alteração na concentração de H+ neste sistema, tanto o
ácido não dissociado quanto o íon acetato irão sofrer reações para manter o equilíbrio do
sistema. Vale lembrar que, o efeito também ocorre quando as concentrações de ácido e base
dissociada são diferentes, mas possui mais eficiência quando as concentrações são iguais.
Por exemplo: quando adicionamos H+ à mistura acima, o íon acetato se consumirá

parte dos íons adicionados, ao mesmo tempo em que o ácido não dissociado produzirá
novos íons acetato e H+, para manutenção do equilíbrio do sistema. Neste caso, existe
uma espécie de amortecimento das alterações de pH desta solução, contrabalanceadas
pelo equilíbrio.
Outro aspecto interessante é que o pH da solução tamponada nessas condições é igual

ao pKa do ácido, o que também indica que metade das moléculas estão ionizadas, ou
seja, o grau de dissociação do ácido acético em pH 4,75 é 50% (ou 0,5).
Soluções com a característica apresentadas são fundamentais para a prática laboratorial,

e são denominadas soluções tampão. A manutenção de pH de forma robusta
no sistema permite maior previsibilidade e controle de reações, visto que pequenas
alterações de composição do sistema não alterarão seu pH, mesmo que as espécies
adicionadas ou removidas tenham influência neste equilíbrio.
Os princípios estudados para o equilíbrio acima, relativos à dissociação de um ácido

(ácido acético) e sua base conjugada (íon acetato), podem ser utilizados para descrever
diversos sistemas de reações.
Tomemos como exemplo a solubilização do cloreto de prata: quando misturados em

solução aquosa, os íons cloreto e prata podem se combinar formando uma espécie
sólida, processo representado pela reação da figura 21.
Figura 21. Equilíbrio formação do Cloreto de Prata.

� �
�� ↓
O equilíbrio apresentado, da mesma forma que a dissociação de ácido acético, pode ser
equacionada conforme figura 22.
Figura 22. Lei de ação das massas para formação do cloreto de prata.
[�� ] � [�� ]
��
[��]
O cloreto de prata forma uma espécie sólida, de forma que sua concentração no meio
pode ser considerada constante. Desta forma, a equação pode ser reescrita conforme
26
equação XX, sendo que o produto entre a concentração dos íons dissociados será uma
constante, denominada constante de solubilidade (Kps). Nesse caso, pode-se dizer
que a constante de solubilidade da prata é 1,8 . 10-10.
Figura 23. Constante de solubilidade.

� �
�� ↓
� ∙ [��] = �� = [�� ] ∙ [�� ] = 1,8 ∙ 10��
O cálculo da solubilidade do cloreto de prata em água pura pode ser realizado igualando-se
a quantidade de prata e de cloreto na equação, como se mostra na figura a seguir.
Figura 24. Cálculo da solubilidade do cloreto de prata em água.
1,8 ∙ 10�� ∙ ��
� � 1,� ∙ � 10�� ∙ l��
Um pouco mais de atenção deve ser tomada quando o íon possui mais de um cátion
ou ânion. Pode-se considerar a solubilidade do carbonato de prata como exemplo,
representada na figura 25:
Figura 25. Equilíbrio formação do Carbonato de Prata.

� ��
�� ↓
�� = �� ]� ∙ �� ] = 8,5 ∙ 10��
Note que a concentração de íons prata é contabilizada ao quadrado e, quando o carbonato

de prata é adicionado a água pura, haverá o dobro da quantidade dos íons de prata do
que de íons carbonato em solução. Desta forma, o equacionamento da solubilidade do
carbonato de prata em água é feito conforme figura 26:
Figura 26. Cálculo da solubilidade do carbonato de prata em água.
8,5 ∙ 10�� ∙ �
� � 1,� ∙ � 10�� ∙l��
Vale lembrar que, bem como a adição de íons acetato ou de íons H+ influenciam
diretamente na concentração de todas as espécies envolvidas no equilíbrio de dissociação
do ácido acético, a presença de um íon que influencie o equilíbrio de solubilidade
interferirá diretamente na solubilidade de um sal em solução. A isto se dá o nome de
efeito do íon comum.
A título de exemplo, podemos calcular qual a solubilidade do carbonato de prata em

uma solução contendo 0,1 mol . l-1 de carbonato de sódio (Na2CO3).
27
Figura 27. Cálculo da solubilidade do carbonato de prata em solução com carbonato.
�� = �� ]� ∙ �� ] = 8,5 ∙ 10��
8,5 ∙ 10�� = �� ∙ �0,1 � ��
�� = 8,5 ∙ 10��
� = �,� ∙ 10�� ∙ l��
Note que no cálculo deste exemplo, o valor (0,1 + x) foi substituído por 0,1, de
forma a simplificar as operações de cálculo. Vale lembrar que, este procedimento de
simplificação, bem como as situações nas quais podem ser aplicadas.
O caso do carbonato de prata mostra bem a como a composição do meio pode influenciar
como cada espécie se comporta em solução. Além da influência da concentração de
carbonato e de prata para a solubilização do carbonato de prata, o pH apresenta um
aspecto muito relevante neste meio.
Em pHs mais baixos, o carbonato é deslocado para a formação de gás carbônico, tornando
a solução menos concentrada de íons carbonato e, consequentemente, aumentando a
solubilidade da prata na solução. Perceba que a adição de ácidos na solução, neste caso, é
efetiva em solubilizar a prata, mesmo em concentrações maiores de carbonato de prata.
Outra reação importante a ser considerada em relação ao pH e a presença de metais em

solução é a formação de hidróxidos insolúveis com grande parte dos metais, fazendo
com que soluções com metais frequentemente formem sólidos precipitados em pHs
mais elevados.
A formação de sólidos em reações é aspecto muito importante para a Química Analítica.

Existe uma série de reações específicas que possibilitam a quantificação de compostos
pela formação de sólidos que podem ser filtrados e pesados. Este é um dos assuntos a
serem tratados na unidade que se segue.
28
Métodos Unidade iI
Gravimétricos
A gravimetria é uma técnica analítica que se baseia na medida da massa de uma dada
substância ou mistura para determinar seu teor em uma amostra. Como já citado
anteriormente, a quantidade de matéria é diretamente proporcional a sua massa, de
forma que sua medida é suficiente para quantificações.
A gravimetria, certamente, é a técnica analítica mais antiga que existe, sendo fundamental
para o desenvolvimento da Química e da ciência, de forma geral. Se, por um lado, a
evolução científica trouxe ferramentas mais convenientes para substituir a gravimetria
em um grande número de análises, ela ainda é fundamental inclusive para a realização
de técnicas instrumentais modernas.
Capítulo 1
Gravimetria Clássica
As medidas de massa foram fundamentais para o desenvolvimento da civilização.

Admite-se que a balança tenha origem no Egito antigo, mas sua origem é tão antiga
que sua criação é atribuída, por muitas civilizações, aos deuses. Desde a Antiguidade,
a balança sempre encontrou emprego nas áreas comercial e econômica de diversos
povos (egípcios, babilônios, gregos, etruscos e romanos). Afora esse emprego normal,
a balança teve uma conotação mística em algumas civilizações. Por exemplo, as
balanças dos antigos egípcios, representadas nos “Livros dos Mortos”, simbolicamente
representavam a pesagem do coração do defunto contra o peso da verdade. Conforme
as culpas carregadas pelo morto, a balança pendia para o prato do coração (destino,
condenação da alma) ou da pena (destino, felicidade eterna). A balança, aqui, tinha uma
simbologia associada à justiça. Para os babilônios, a balança simbolizava a igualdade dos
dias e das noites, já que o sol entrava na constelação de Libra no equinócio de Outono
(quando o dia e a noite tem igual duração). Com efeito, de todos os signos do zodíaco,
Libra é o único representado por um objeto: a balança. (AFONSO; SILVA, 2004)
De um ponto de vista prático, o controle da pureza do ouro e da prata e a prevenção

da falsificação sempre foram de primordial importância para os administradores
29
UNIDADE II │ Métodos Gravimétricos
das comunidades iniciais. Não é surpreendente, portanto, que os métodos de análise

de ouro e prata tenham sido desenvolvidos tão cedo. O procedimento mais antigo
conhecido que ainda está em uso hoje, é conhecido como o ensaio de fogo ou cupelação.
O ensaio de fogo é um procedimento quantitativo e depende da pesagem da substância
a ser testada antes e após o aquecimento. Em 2600 antes de Cristo, na Babilônia, já
haviam pesos utilizados como padrão de comparação. Eles eram feitos de pedra, em
forma de figura geométrica ou animal, apresentavam inscrições indicando sua massa
e também tinham selos sacerdotais. Durante o reinado de Dungi na cidade de Ur
(Suméria, 2300 a.C.), formou-se um instituto para o teste de medidas presidido pelos
sacerdotes. No sistema babilônico de pesos e medidas, semelhante ao sistema métrico,
havia uma relação entre medidas de comprimento, peso e volume. É interessante notar
que a unidade de peso da Babilônia era igual a 491,29 g, compatível com a massa da
libra francesa antiga que era 489,5 g e a da libra holandesa 492,17 g, enquanto a de
Hannover era 489,6 g. A libra inglesa, ainda em uso em algumas situações, equivale a
453,592g. (SZABADVÁRY_F.,1966)
O surgimento da Química moderna está intrinsecamente ligado com a realização de

análises gravimétricas. Os experimentos de pesagem, em um momento fortalecendo
a teoria do flogisto (teoria superada na ciência moderna, na qual alguns corpos, em
algumas condições, liberavam um corpo de massa negativa quando queimados), deram
base posterior para a teoria da conservação de massa (um dos pilares da Química
moderna).
Em meio a estudos acadêmicos sobre a matéria, muitos métodos gravimétricos foram

desenvolvidos, antes mesmo de se conhecer a relação de proporção entre reações.
A precisão das medidas foi aumentando e o conhecimento acerca das reações foi se
estabelecendo de forma que a Química Analítica se desenvolveu junto com a teoria que
hoje conhecemos.
O desenvolvimento histórico da gravimetria a transformou, no início do século XX,

na técnica analítica mais recorrente e precisa de sua época, status preservado por
décadas. O seu uso mais intensivo só começou a diminuir com o advento das técnicas
instrumentais a partir da segunda metade do século XX. Ainda assim, a balança é um
dos equipamentos indispensáveis para qualquer laboratório químico.
A determinação gravimétrica pode ser realizada de diversas formas. Na questão da

determinação da massa propriamente dita, a gravimetria pode ser realizada de forma
direta ou indireta.
Na medida direta, a medida de massa obtida pelo procedimento realizado fornece o

resultado procurado. Por exemplo, a determinação de teor de sólidos em uma suspensão
30
Métodos Gravimétricos │ UNIDADE II
pode ser feita por filtragem da amostra em filtro previamente pesado após secagem,
resultando na massa final dos sólidos.
Na medida indireta, a espécie a ser determinada não é pesada diretamente.

Um exemplo é a determinação de umidade de uma amostra sólida. Ao invés de tentar
isolar a água do alimento e realizar sua pesagem, a amostra inteira é pesada antes da
remoção de umidade e logo após, de forma que o resultado analisado é a diferença
encontrada.
O conceito de medida direta e medida indireta é recorrente em diferentes tipos

de análise, não apenas a gravimetria. Em todos os casos, as medidas diretas
representam medida direta do analito de interesse, enquanto a medida indireta
se determina a espécie analisada pela medida de algum sinal relacionado.
Além da forma de se realizar a medida, os procedimentos de pré-tratamento de amostra

são fundamentais na Gravimetria. Os processos físico-químicos realizados para
purificar o composto de interesse previamente a pesagem são de grande importância
para a qualidade da análise, e serão apresentados a seguir.
Em algumas situações, o analito a ser determinado já se encontra presente na amostra de

forma que ele possa ser separado por algum processo físico. Neste caso, a Gravimetria
de Particulado exige apenas etapas de tratamento de amostras físicas, sendo algumas
das abordagens descritas a seguir.
Em muitos casos, a separação de analitos sólidos em matrizes fluidas pode ser realizada
por meio de filtração. Os filtros podem ser feitos de diversos materiais e com poros de
tamanhos variados, escolhidos de acordo com a aplicação. Na determinação de sólidos
em amostras gasosas, é possível se utilizar uma sequência de filtros, de modo a realizar
uma separação de partículas de acordo com o seu tamanho.
Há casos, no entanto, que o analito se encontra em uma forma na qual não pode ser
filtrado, seja como, gás, líquido, ou mesmo alguns sólidos. Neste caso, é possível realizar
a extração do analito da amostra. Para entendermos este processo, precisamos ter em
mente o processo de equilíbrio químico descrito na Unidade I deste curso.
Na extração em fase líquida, um solvente ou solução com maior afinidade pelo analito
é misturado com a amostra. O analito, inicialmente na fase da amostra, é particionado
para o solvente, reduzindo sua concentração na amostra e aumentando no solvente de
extração. Em condições favoráveis, o analito pode ser quantitativamente extraído da
amostra para o solvente. A quantificação gravimétrica pode ser feita pela diretamente,
pela secagem do solvente e posterior pesagem, ou indiretamente, medindo a massa
perdida pela amostra após o processo de extração.
31
Figura 28. Etapas para extração líquido-líquido.
Extrato
(será
evaporado
e pesado se
determinação
for direta)
Amostra
(será pesada
se
determinação
Adição de Misturar Separar for indireta
Amostra solvente p/ extrair frações
Fonte: autor.
Já na extração em fase sólida, a amostra é colocada em contato com uma superfície

sólida. Tal superfície possui afinidade pelo analito de forma que este se adsorve o analito,
de forma a extraí-lo do meio original. A quantificação pode ser direta ou indireta, de
forma similar a descrita para a extração em fase líquida.
Estes processos de extração e particionamento entre fases são fundamentais no

tratamento de amostras em Química Analítica, e são utilizados não apenas em
gravimetria, mas em diversas técnicas de análise. Como será visto posteriormente,
a cromatografia também se baseia em princípios de extração e particionamento
entre fases.
Em outros casos, é importante tratar a amostra para que o analito a ser pesado seja
purificado previamente a pesagem. Em outros casos, o analito pode se encontrar
dissolvido em fase aquosa, e precisa ser transformado em um sólido.
A gravimetria por precipitação explora a propriedade da solubilidade de substâncias

para realizar a determinação. Por meio de reações específicas, íons presentes em solução
são precipitados, ou seja, formam sólidos por meio de uma reação química.
Um exemplo de procedimento de gravimetria por precipitação é a determinação de

íons prata em solução. Para tanto, pode-se adicionar uma solução de cloreto de sódio,
provocando a precipitação do cloreto de prata, conforme equação apresentada na figura
29. O precipitado é então filtrado e a quantidade de prata é determinada pela pesagem
do cloreto de prata.
32
Figura 29. Precipitação do cloreto de prata.
�� ↓
É importante lembrar que, a massa a ser pesada nesse caso, de cloreto de prata, é
diferente da massa de íons prata anteriormente presente em solução. Em todos
os casos de gravimetria por precipitação, não se pode esquecer a massa do
contra íon precipitado junto à amostra.
Para garantir bons resultados na gravimetria por precipitação deve-se tomar uma
série de cuidados, explicados abaixo. A não atenção nos aspectos abaixo podem levar a
resultados imprecisos na determinação.
Para determinação de uma espécie em particular, é necessário que uma reação

específica, ou seja, é necessário garantir que a espécie adicionada no meio reaja
seletivamente ao analito a ser determinado.
Em alguns casos, é possível que haja presença de outros compostos em solução que
reajam ou interfiram na reação entre o agente precipitante e o analito. Estes compostos
são chamados de interferentes na análise.
Na gravimetria, os interferentes podem provocar erros positivos quando o agente

precipitante também provoca a precipitação de uma espécie diferente da analisada,
gerando uma massa maior do que aquela que seria relativa à formação do composto
puro, levando a resultados superestimados (superiores a concentração real na solução).
Neste caso, se diz que a espécie provoca interferência positiva.
Caso haja algum composto em solução que participe de alguma reação consumindo
o agente precipitante ou inibindo a formação da espécie precipitada, a determinação
pode ter erros negativos, levando a resultados subestimados (inferiores a concentração
real na solução). Neste caso, se diz que a espécie provoca interferência positiva.
O conceito de interferente em uma análise pode ser utilizado para qualquer

procedimento de análise, no qual o sinal referido (na gravimetria, a massa do
analito estudado) pode estar confundido com um sinal indesejado (a massa do
interferente).
A análise gravimétrica de prata por precipitação utilizando cloreto de prata pode

sofrer interferência de alguns outros metais. Neste caso, outros metais podem
ser precipitados simultaneamente caso estejam presentes na amostra, sendo os
principais, os íons chumbo, cobre (I) (Cu+), paládio (II) (Pd2+), mercúrio (I) (Hg+) e
tálio (I) (Tl+).
33
Em muitos casos, a presença de interferentes pode ser contornada por meio de

procedimentos de tratamento de amostras. Por exemplo, o tratamento da amostra pela
adição de ácido nítrico concentrado provoca a oxidação de íons metálicos em solução, e
elimina a interferência dos íons Hg+, Cu+ e Tl+.
A interferência de chumbo, contudo, não pode ser eliminada pela oxidação com ácido
nítrico concentrado. Entretanto, a constante de solubilidade do cloreto de chumbo
(Kps = 1,7 . 10-4) é consideravelmente menor do que a do cloreto de prata (Kps = 1,8 . 10-10),
de forma que a influência deste analito pode ser eliminada por meio de diluição
adequada da solução, sem comprometer a determinação do cloreto de prata.
Outras espécies presentes em solução podem reagir com o analito ou o reagente

utilizado de forma a formar uma massa menor do que a esperada sem a presença deste
interferente, resultando em interferência negativa. Exemplos de interferentes
que causam este efeito para a determinação de prata por titulação com cloreto são o
tiossulfato (S2O3-) e o cianeto (CN-), que formam junto à prata espécies solúveis mais
estáveis que o cloreto de prata, levando a não precipitação de parte da prata presente
na amostra. Estes íons também sofrem oxidação quando em contato com ácido nítrico
concentrado, que elimina esta interferência.
Perceba que existem procedimentos que podem ser realizados de forma padrão
para tratamento de amostras. Neste exemplo, a adição de ácido nítrico pode ser
realizada como medida preventiva para evitar interferências, mesmo que não
haja certeza de alguns interferentes na amostra. Já no caso da diluição, deve-se
conhecer bem a amostra para que este tratamento seja realizado apenas em
caso de necessidade.
Em relação à composição da solução, um fator que pode influenciar determinações

e muitas vezes não se contabiliza como um interferente é o pH do meio.
Frequentemente, os radicais H3O+ e OH- participam de equilíbrios secundários em
solução, sendo importante atentar se há necessidade de realizar este controle.
Como pudemos ver no exemplo apresentado, a presença de interferentes pode ser

contornada por meio de reações prévias na amostra, capazes de isolá-los. Em alguns
casos, etapas de reação específicas sequenciais permitem a determinação de mais de
uma espécie em um mesmo procedimento.
Em muitos procedimentos para determinação de mais de um analito são

utilizadas algumas reações progressivamente específicas, isolando um analito
em cada momento. Nesta situação, a ordem de adição dos agentes precipitantes
é fundamental para garantir resultados corretos de análise.
34
O tamanho da partícula formada também interfere na análise, sendo necessário garantir

um tamanho mínimo de partícula que permita uma filtração quantitativa do material.
A formação de um precipitado nestas condições é favorecida pela adição lenta de agente
precipitante e aumento da temperatura do sistema.
O precipitado, após ser formado nas condições adequadas, segue em sua etapa de
filtração. Após passagem pelo filtro, algumas impurezas podem estar presentes no sólido
filtrado, sendo necessária uma etapa de lavagem com jatos de solução. Vale lembrar que,
a composição da solução utilizada pode influenciar no processo, podendo gerar perdas
de analito por ressolubilização ou contaminação do produto final, pela não remoção das
impurezas ou, em casos extremos, formação de interferentes durante a lavagem.
Após lavagem do precipitado, o filtro deve ser seco antes da pesagem. Esta secagem pode
ser realizada em temperatura ambiente ou sob aquecimento, havendo-se o cuidado de
não induzir nenhuma reação pelo aumento de temperatura do sistema. Após seco, o
filtro é pesado, finalizando a determinação.
É sempre fundamental tarar o filtro (ou seja, pesá-lo previamente ao

procedimento) para que a medida de massa ao final seja precisa.
Outra modalidade deste tipo de análise é a Eletrogravimetria. Nesta, eletrodos são

utilizados para a aplicação de um potencial entre a superfície de um deles, previamente
tarado, e a solução, de forma a induzir uma reação de formação de um sólido depositado,
posteriormente seco e pesado.
Outra abordagem deste tipo de análise é a Gravimetria por Volatilização, na

qual uma amostra é seca ou decomposta em função da temperatura, e sua variação de
massa, ou a massa dos gases formados (capturados via extração em líquido ou sólido)
corresponde ao sinal procurado.
A gravimetria clássica, conforme exposta, é uma técnica bastante laboriosa que exige
elevado grau de treinamento laboratorial para sua realização, mesmo apesar da grande
facilidade de operação que as balanças analíticas atuais apresentam. Desta forma, o
uso da gravimetria clássica perdeu em grande parte seu espaço para uso de técnicas
instrumentais mais modernas. Ainda assim, alguns conceitos e aplicações ainda são
essenciais no dia de hoje.
A gravimetria é um dos métodos primários de análise, e, salvo a regra, técnicas mais

modernas ainda dependem da elaboração de padrões e soluções de concentração
conhecida para realizar análises. Nesse contexto, a balança analítica é um instrumento
35
fundamental em um laboratório químico, e a pesagem direta de reagentes é a base do

trabalho analítico, utilizando-se substâncias puras.
Uma das características principais das balanças modernas é sua alta resolução. Quando
se necessita de resultados com alta resolução, a gravimetria ainda pode ser o método
mais preciso em alguns casos.
Ainda no início do século XX, a gravimetria por precipitação foi o método

utilizado para determinar a massa atômica de dezenas de elementos da tabela
periódica, chegando a seis dígitos de precisão. Este trabalho rendeu o prêmio
Nobel de Química a Theodore W. Richards, em 1914.
Outros procedimentos gravimétricos menos específicos também são amplamente

utilizados até os dias de hoje. A determinação de material particulado na atmosfera,
filtrado diretamente, é de grande importância em estudos ambientais. Outros exemplos
incluem a determinação de sólidos totais em amostras de efluentes, muito utilizada
em controle de processos de tratamento, e a determinação de teor de umidade em
alimentos.
36
Capítulo 2
Gravimetria Instrumental
Existem alguns procedimentos muito utilizados em química analítica e forense que,

apesar de envolverem o serem envolvidos com a medida de massa de corpos, não estão
no escopo da gravimetria clássica e são comentados abaixo.
A Termogravimetria (Thermogravimetric Analysis, TGA) é uma técnica instrumental

que mede a massa de um corpo após aquecimento em ambiente controlado. O
instrumento, apresentado na figura 30, consiste em uma balança de precisão com um
prato montado dentro de uma câmara com programação rigorosamente programada
de umidade, temperatura e composição de composição de atmosfera. Em alguns casos,
outros sensores também são incorporados ao sistema. A fim de entendermos melhor o
sistema, vamos entender o funcionamento de cada uma de suas partes, de acordo com
a sequência da figura.
Figura 30. Equipamento para realização de análises termogravimétricas.
Fonte: WHITE, J., 2012.
Entrada de gás seco (1)
A análise termogravimétrica é fortemente influenciada pela atmosfera na qual o

experimento é realizado, visto que os compostos presentes na atmosfera durante a
rampa de aquecimento podem interagir com a amostra. Desta forma, a composição e o
grau de umidade do ar do sistema devem ser controlados.
37
Controlador de fluxo de ar (2)
Para que a análise seja realizada de forma controlada, o fluxo de ar e a geração e

misturas do ar puro com eventuais reagentes incorporados à fase gasosa devem ter
controle rigoroso em dispositivo dedicado. Nesta parte do equipamento, a vazão do gás
seco é controlada para que a composição e o fluxo de gás durante a análise sejam bem
estabelecidos.
Entrada de gases (3, 4 e 5)
Uma vez regulados, diferentes correntes de fluxo de gás seguem para a formação de
atmosferas controladas. Neste caso, a presença de três correntes de ar se justificam pela
formação de duas correntes de atmosfera controlada, e uma corrente para estabilização
do sistema, evitando efeitos como contaminação cruzada.
Câmara dupla de geração de vapor (6)
Esta parte do equipamento consiste em duas câmaras controladas, nas quais os

reagentes em fase de vapor possam ser gerados por meio de volatilização. Por meio
deste procedimento, fluxos com composições bem controladas e concentrações bem
conhecidas de analitos gasosos são geradas para serem encaminhadas para a câmara
de pesagem.
Entrada de vapores (7 e 8)
Após mistura controlada na câmara (6), são gerados dois fluxos de gás de vapores
controlados, que são transportados pelo sistema.
Pesagem da amostra (9)
Neste ponto, a amostra é colocada em uma balança de grande precisão para monitoramento
da variação de massa do sistema em função do tempo. Ela fica em contato com um dos
vapores gerados pelo sistema combinado já apresentado, e sua massa é medida em
função do tempo.
Pesagem da referência (10)
De forma a garantir a precisão da medida pelo sistema, é realizada, simultaneamente,

a análise gravimétrica de um prato de referência. Desta forma, é possível monitorar
variações instrumentais decorrentes do sistema, podendo-se comparar e corrigir
variações instrumentais utilizando este valor de referência.
38
Câmera (opcional) (11)
O monitoramento da amostra analisada pode ser realizado não apenas gravimetricamente,

mas com sensores combinados ao sistema. Neste caso, é utilizada uma câmera para
avaliar o aspecto da amostra durante a pesagem.
Uma câmera é um dispositivo que analisa a reflexão da luz incidida sobre uma
amostra, sendo capaz de absorver a luz que lhe é incidida, de forma a registrar a
imagem. Este tipo de dispositivo pode apresentar variações, mas é baseado nos
mesmos princípios dos equipamentos de espectroscopia.
Opção de sensor de infravermelho e Raman (12)
Análises espectroscópicas dos gases formados e das amostras podem ser realizadas
paralelamente neste instrumento por meio da incorporação de sensores extras,
indicados na representação. O princípio de funcionamento e a aplicação de cada um
dos sensores citados (infravermelho e Raman) .
Sensores de temperatura e umidade (13)
Para garantir um ambiente controlado, é imprescindível a presença de sensores de

temperatura e umidade nas câmaras de pesagem, que contabilizam estes parâmetros
em tempo real na realização do experimento.
Controladores de temperatura e umidade (14)
Em muitos experimentos, não apenas é necessário conhecer as condições às quais as

amostras são submetidas, mas também garantir que elas estejam em um nível específico
para a realização da análise. Tais dispositivos interferem no sistema para garantir a
manutenção destes parâmetros.
Câmara com temperatura controlada e purga (15)
Além das pequenas câmaras onde se realizam as análises, o gabinete do equipamento

também é preparado para garantir o controle térmico das análises e a composição da
atmosfera. Desta forma, este gabinete possui controle geral de temperatura e purga
automática, para a liberação de gases presentes no sistema, para garantir a manutenção
dos parâmetros de análise.
Todas as programações do equipamento, bem como suas medidas, são monitoradas

em função do tempo de análise. Como resultado, obtém-se um gráfico da variação
percentual de massa da amostra em função da temperatura, como se pode ver na figura
39
20 para a Whewellita (oxalato de calcio monohidratado, CaC2O4.H2O), padrão para

verificação de funcionamento do equipamento.
Para compreendermos cada fenômeno apresentado, calculamos a massa perdida em

cada etapa, e associamos com a perda de massa pela formação de gás. A descrição dos
processos de decomposição se apresenta na tabela 4.
Diferentemente da gravimetria clássica, a intenção aqui, salvo a regra, não é determinar

o teor de algum dos analitos presentes na amostra, mas estudar suas características
reacionais em função da temperatura. Isso pode ser interessante tanto em um aspecto
físico-químico, para entender propriedades de substâncias, quanto em um aspecto
analítico, para entender a composição de uma amostra.
Como exemplo em química forense, a termogravimetria é utilizada para identificação de

polímeros em resíduos de disparo, podendo os discriminar mesmo quando misturados
com silicatos, orgânicos, umidade e carvão animal (IHMS; BRINKMAN, 2004)
Além dos aspectos acima expostos, a termogravimetria possui diversas aplicações,

necessita de cuidados especiais para a realização das análises, e outros dados comumente
também são estudados, por exemplo, entalpias reacionais e análises diferenciais, bem
como hifenação com métodos espectroscópicos e outros sensores. Uma abordagem
mais completa sobre este tipo de análise foge do escopo deste curso.
Figura 31. Curva termogravimétrica da Whewellita.
Fonte adaptada: <https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_Decomposition_Calcium%20Oxalate_

Monohydrate(013078_01).pdf>.
40
Tabela 4. Reações de decomposição da Whewellita.
MM (g/mol) perda M (%) Perda M (g/mol) Composição

146,11 0 CaC2O4.H2O(s)
128,72 11,9 17,39 CaC2O4.H2O(s) à CaC2O4(s) + H2O(g)
100,96 19 27,76 CaC2O4(s) à CaCO3(s) + CO(g)
56,84 30,2 44,13 CaCO3(s) à CaO(s) + CO2(g)
Fonte adaptada: <https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_Decomposition_Calcium%20Oxalate_

Monohydrate(013078_01).pdf.
Outro procedimento instrumental que se vale da gravimetria por volatilização é a

Análise Elementar CHNS. Nesta, uma amostra orgânica é aquecida sob atmosfera
rica em gás oxigênio, formando produtos de decomposição pela queima da
amostra. Os gases formados, em forma de óxidos, são coletados e pesados.
A detecção, em muitos casos, é realizada por técnicas não gravimétricas. De toda forma,
a aplicação do método de decomposição térmica pode ser vista como uma evolução da
análise gravimétrica.
Outra técnica associada a medidas de massa que se diferencia completamente da

gravimetria tradicional é a Espectrometria de Massas (Mass Spectrometry, MS).
Esta classe de análises provoca a formação de íons a partir dos componentes da amostra
e estes íons são detectados de acordo com a relação entre a sua carga e a sua massa
molecular, por vias instrumentais.
Apesar do emprego de medidas de massa, esta técnica não guarda relação com a
gravimetria apresentada nesta unidade. Apesar de fugir do tema deste capítulo, este
método de análise será apresentado na Unidade V desta apostila, por sua grande
relevância para detecção em processos de separação cromatográficas e eletroforéticas.
41
Cromatografia Unidade iII
A cromatografia é, indiscutivelmente, uma das principais técnicas analíticas utilizadas

atualmente. Explorando a forma única que as moléculas da mistura analisada
interagem entre si e com o meio em que se encontram, é possível separar eficientemente
componentes em uma mistura complexa.
Capítulo 1
Aspectos gerais e cromatografia planar
A cromatografia pode ser vista como uma evolução dos antigos métodos de tratamento
de amostras. Tais métodos, como a filtração para remoção de contaminantes são
descritos em trabalhos gregos e egípcios, além da Bíblia. Alquimistas também utilizavam
métodos como a extração, destilação e amalgamação.
Os efeitos resultantes da “adsorção” foram descritos no século 16 para um processo

de preparação de vinho branco a partir de vinho tinto. No século 19, alguns cientistas
aplicaram diferentes sólidos para “filtração”, remoção de algumas componentes ou
fracionamento de líquidos, enquanto outros fizeram esses fracionamentos em papel.
As primeiras separações realizadas em papel foram realizadas em 1834, visando a

identificação da “composição” de sais inorgânicos, sendo a obra publicada em 1855.
Também no meio do século 19 introduziu-se separações realizadas em tiras de papel,
utilizando desenvolvimento, já na época atribuído à “ação capilar”, comparando o
fenômeno a forma que a seiva ascende em uma árvore.
Trabalhos publicados na metade do século XIX, independentemente por dois

pesquisadores, já descreviam processo de troca iônica, na qual a amônia presente
em urina de vaca era trocada por potássio quando passada por uma zeólita natural.
Separações utilizando desenvolvimento circular e água como solvente, com uma camada
de gelatina depositada sobre vidro foram descritas em 1889.
Em 1893, sais inorgânicos foram separados utilizando passagem de água por caulim.
Técnicas de fracionamento de petróleo, desenvolvidas na Alemanha e nos Estados
42
Cromatografia │ UNIDADE III
Unidos, utilizavam um produto natural de silicato de alumínio e magnésio e soluções

de petróleo e éter de petróleo em eluição ascendente, processo hoje denominado análise
frontal. Neste momento, realizavam já as coletas de frações separadas, sendo capazes
de identificar a origem de amostras de petróleo.
Essas separações, cuja compreensão físico-química não era plena na época, são
explicadas pelos mecanismos de separação cromatográficos, que vieram a ser propostos
apenas no início do século XX, com os trabalhos de Tswett M.S., que reconheceu
mecanismos de adsorção como responsáveis pela separação e cunhou, pela primeira
vez, a palavra cromatografia, motivos pelos quais o tornam reconhecido pela criação do
método de separação.
Tswett descreveu um processo que, hoje, é chamado cromatografia líquido-sólido

em coluna seca, na qual a solução da amostra é colocada no topo de um sólido seco
(no vocabulário de hoje, uma fase estacionária) contido dentro de um tubo de vidro.
Aparentemente, nesses experimentos de Tswett, a solução inicial, contendo a amostra,
encontrava-se relativamente diluída, pois algumas bandas distintas já eram evidentes
somente com a passagem dessa solução. Após a passagem do solvente no qual a amostra
estava dissolvida, iniciou-se a passagem do solvente puro (no vocabulário de hoje, uma
fase móvel). Várias fases móveis apolares foram testadas e a melhor foi o dissulfeto de
carbono. A separação foi sinalizada pelas bandas de diferentes cores que apareceram e
a passagem da fase móvel foi cessada quando as substâncias se separaram, sem serem
eluídas da coluna. Nenhum dos trabalhos de Tswett descreveu a etapa de eluição como o
termo é empregado hoje. O isolamento das substâncias separadas foi feito empurrando
o sólido para fora da coluna, separando as bandas de cor diferente com uma espátula,
e extraindo com um solvente adequado a(s) substância(s) contida(s) nas bandas, para
obter o seu espectro de absorbância no UV-visível.
Em trabalhos publicados em 1906, Tswett já propunha um mecanismo de separação

baseada na adsorção diferenciada de cada composto a matriz sólida (fase estacionária),
eluída (ou desenvolvida) com a passagem de solvente, carregando compostos com
menos afinidade pelo sólido por distâncias maiores.
Nestes trabalhos, além do termo “cromatografia”, o pesquisador também descrevia

o resultado do processo de separação como “cromatograma”, na época formado
pelo desenho dos compostos separados na coluna, visualizados de maneira similar a
separação em calada planar (a ser apresentada posteriormente neste curso).
Hoje, o título de “pai” da cromatografia é atribuído a Tswett, sendo muitos de seus

trabalhos muito influentes a uma série de pesquisadores que seguiram por este
caminho para separação de compostos durante as décadas posteriores. As separações,
43
UNIDADE III │ Cromatografia
neste momento, ocorreram especialmente utilizando fase sólida, até por conta desta
influência direta. Apesar de seu grande reconhecimento hoje em relação a isso, Tswett
não pode experimentar este reconhecimento em vida.
Por outro lado, a data das primeiras separações empregando um dos processos que hoje
compõem as técnicas chamadas “cromatografia”, nas quais se aplica uma amostra com
seus diversos componentes dissolvidos em uma fase móvel e percorrê-la por meio de
uma fase estacionária, ocorrendo a separação devido à migração diferencial, encontra-
se realmente perdida na Antiguidade. (COLLINS, 2009)
Mas, afinal, como ocorre a cromatografia? De que forma o método é capaz de explorar as
interações intermoleculares para diferenciar componentes de uma amostra? Apesar de
haver uma grande variedade de cromatógrafos no mercado, a cromatografia pode ser
realizada, salvo a regra, de duas formas: planar e em coluna. As diversas variedades
de cromatografia podem ser vistas na figura 32. Vale ressaltar que há, dentro destas
categorias, diversas modalidades de cromatografia que podem ser realizadas, sendo
algumas essenciais para a prática analítica e forense. Estas serão apresentadas ao
decorrer do texto.
Figura 32. Classificação dos tipos de cromatografia.
Cromatografia
em Papel
Planar
Cromatografia em Camada Delgada
(CCD)
Thin Layer Chromatography (TLC)
Cromatografia
Cromatografia a gás (CG)
Gas Chromatography (GC)
Cromatografia Tradicional
Coluna
a líquido
Fluido Cromatografia a
Supercrítico Líquido de Alta
Eficiência (CLAE)
High
Performance
Liquid
Chromatography
(HPLC)
Fonte: adaptado de COLLINS, C.H., 1995.
Nas cromatografias planares um suporte sólido como o papel ou sílica em pó

depositada sobre uma placa de alumínio é utilizado como substrato para separação
cromatográfica. Uma alíquota da amostra é depositada sobre esta superfície, e em sua
44
extremidade é colocada em contato com um solvente ou uma mistura, de forma que ela
seja absorvida pelo suporte, passando pela amostra.
Quando este processo se inicia, o líquido flui pela superfície, “arrastando” a amostra
para uma de suas extremidades (processo chamado de eluição). Este é o momento em
que a separação ocorre: cada componente da amostra se move diferentemente.
Figura 33. Processo de separação por Cromatografia planar.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tlc_sequence.svg>.
O processo na cromatografia em coluna é comparável e se baseia nos mesmos princípios

físico-químicos. No entanto, sua realização é implementada de forma diferente, como
será visto nos próximos parágrafos.
Uma das formas mais simples de cromatografia, e ainda muito comuns em

laboratórios químicos de síntese orgânica, se realiza da seguinte maneira: um tubo
com extremidade afunilada é recheado com um pó inerte (frequentemente sílica) com
auxílio de uma solução e colocado com a ponta para baixo, e a amostra é colocada
na parte de cima, seguindo-se adição de solução. A eluição do líquido, agora para
baixo, provoca eluição sequencial dos compostos presentes na amostra. O processo é
esquematizado na figura 34.
Figura 34. Cromatografia em coluna.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Column_chromatography_sequence.png>.
Esta forma de cromatografia, ainda muito utilizada para fins preparativos, não é
prática para realização rotineira de análises. Os cromatógrafos, quase onipresentes
em laboratórios químicos, são capazes de realizar este processo com maior eficiência e
45
rapidez. Para entender seu funcionamento, conhecer as partes essenciais presentes em

um cromatógrafo, apresentadas na figura 35.
Figura 35. Partes principais de um cromatógrafo.
Injetor
Fase
Móvel Detector
Fase Estacionária
Fonte: Autoria do autor, composição e adaptação das seguintes imagens, disponíveis em: <https://pixabay.com/
pt/tubo-fluido-l%C3%ADquido-laborat%C3%B3rio-305154/. https://pixabay.com/pt/erlenmeyer-qu%C3%ADmica-
bal%C3%A3o-297345/>; <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Signal_processing.png>.
Podemos identificar, em qualquer cromatógrafo, estas quatro partes:
Injetor: este é o ponto no qual ocorrerá a injeção da amostra a ser analisada. A forma de
realizar a injeção variará de acordo com a configuração do experimento a ser realizado,
sendo em alguns casos possível fazê-la de forma manual ou automática.
Fase móvel: se trata de uma substância ou composto fluído, gás ou líquido, dependendo
do tipo de cromatografia, que será propulsionado pela fase estacionária, sendo o
modo de propulsão variável de acordo com o tipo de cromatografia. Bem como a fase
estacionária, irá interagir diretamente com a amostra e pode ter composições diversas,
a serem otimizadas de acordo com a análise a ser realizada.
Fase estacionária: se trata de um substrato sólido ou líquido imobilizado, com o qual

a amostra irá interagir durante a análise. Sua forma e composição varia enormemente
de acordo com o tipo de cromatografia e o tipo de amostra a ser analisada, de forma a
otimizar a análise esperada.
Detector: a amostra, após processo de separação, precisa ser observada de alguma

forma. O detector é um instrumento de análise química capaz de mensurar alguma
propriedade da(s) substância(s) de interesse. A sua montagem e princípio de
funcionamento pode variar de acordo com a técnica utilizada e a aplicação a ser realizada.
Neste caso, a amostra é inserida no injetor. Ela começa a ser carregada pela fase móvel,
fluindo pela fase estacionária. Os componentes da amostra começam a interagir tanto
com a fase móvel quanto com a fase estacionária, de acordo com a sua estrutura em
com a de cada um de seus componentes. Durante a eluição os compostos passam pelo
detector, em um momento definido, sendo identificados e quantificados.
46
Apesar de instrumentalmente diferentes, todas as partes e fenômenos presentes na

cromatografia planar podem ser observados na cromatografia em coluna, e vice-versa,
como pode ser visto na tabela a seguir:
Tabela 5. Correspondência das partes entre um cromatógrafo de coluna e cromatografia. planar.
Coluna Planar
Injeção Deposição da amostra sobre placa.
Fase Móvel Solvente ou mistura descrita.
Fase Estacionária Suporte Sólido.
Detector Observação Visual.
Fonte: autor.
Agora vamos olhar com mais atenção no processo de separação. Vamos considerar
uma substância A particionando-se no meio, em equilíbrio entre a fase estacionária
e a fase móvel.
Figura 36. Equilíbro de particionamento entre fases.
‫ܣ‬ሺ௘௦௧௔௖௜௢௡௥௜௔ሻ ֖ ‫ܣ‬ሺ௠×௩௘௟ሻ
A proporção entre as concentrações das moléculas em cada fase é dependente das

estruturas e das propriedades desta molécula, bem como da fase estacionária e da fase
móvel. Esta proporção é sempre a mesma quando as espécies são submetidas às mesmas
condições de separação, e é chamado de coeficiente de partição, representado na
equação da figura 37:
Figura 37. Coeficiente de partição.

��
�� ⇌
��
Para entender o processo cromatográfico, é imprescindível nos lembrarmos da natureza

dinâmica do equilíbrio. Apesar da proporção entre as concentrações ser sempre a
mesma, as moléculas presentes em cada fase mudam a cada instante. Como no exemplo
da garagem, o número de carros estacionados tende a ser o mesmo, mas os carros
presentes no estacionamento sempre variam.
Desta forma, para manter a proporção do coeficiente de partição e considerando

que todas as moléculas das substâncias participam do equilíbrio, pode-se dizer que
a proporção de tempo que cada molécula passa em cada fase (estacionária e móvel)
é constante. Ora, considerando o movimento das fases (móvel e estacionária), a
substância que tiver menor interação com a fase estacionária e/ou maior interação com
a fase móvel se moverá mais rapidamente.
47
O resultado observado frente a este fenômeno é um maior deslocamento espacial

dos compostos em cromatografias planares, e um tempo diferente de detecção para a
cromatografia em coluna. Vez que o processo de detecção e interpretação dos resultados
é um aspecto central das técnicas da cromatografia (e da eletroforese capilar, explicada
na próxima unidade), trataremos com mais atenção destes aspectos na Unidade V.
A grande variedade de métodos cromatográficos existe pela grande variedade de

problemas e amostras que possuímos no mundo real. Diferentes analitos em diferentes
amostras precisam de processos diferentes para serem analisados, explorando
propriedades físico-químicas diferentes de cada substância. Desta forma, seguimos o
texto apresentando um pouco sobre cada um dos principais métodos cromatográficos,
de modo a justificar qual tipo de amostra e analito ele pode lidar e quais parâmetros
ela permite que sejam trabalhados para potencializar a separação entre as substâncias.
48
Capítulo 2
Cromatografia a gás
Na Cromatografia a gás (Gas Chromatography, GC), a fase móvel se trata de um gás

inerte e a fase estacionária é uma coluna em sistema com temperatura precisamente
controlada. É uma técnica desenvolvida para análise de misturas gasosas ou voláteis, e
é apresentado na figura 38.
De forma geral, o cromatógrafo a gás possui as mesmas partes descritas na figura 35,
sendo a fase móvel um gás inerte, que fluirá pela coluna, que é a fase estacionária.
Contudo, o equipamento possui algumas características específicas que serão abordadas
nos próximos parágrafos.
A regulagem da vazão se dá pela presença de um regulador de fluxo de gás. Ele também

possui um injetor preparado para lidar com amostras gasosas ou voláteis. Além disso,
vemos um forno de temperatura controlada termostatizado praticamente todo o
sistema. Vamos entender a importância de cada parte do instrumento, bem como suas
particularidades, e os princípios químicos envolvidos.
Gás de arraste
O gás de arraste utilizado na cromatografia a gás tem função principal de transportar as
espécies a serem separadas para o detector. Lembrando que gases não apresentam fortes
interações moleculares, o gás não influenciará pouco nos parâmetros de separação,
sendo desejável então que este seja inerte e puro. A escolha do gás, contudo, é bastante
relevante de acordo com o detector a ser utilizado. Tais aspectos serão discutidos na
Unidade V desta apostila, dedicada a detecção e tratamento dos dados de análise.
Injetor
A injeção da amostra na cromatografia a gás é uma etapa de grande influência na qualidade
da análise. Primeiramente, deve-se garantir que a amostra esteja em fase gasosa quando
inserida na coluna, para evitar que esta sofra danos. A quantidade de amostra também
é crítica, sendo que a volumes muito grandes de amostra podem exceder a capacidade
da coluna, e variações na quantidade injetada podem influenciar até mesmo no tempo
e qualidade da análise. Considerando que esta análise é utilizada para fins qualitativos
e quantitativos, é necessário garantir, pois, o máximo de reprodutibilidade no processo
de injeção.
49
Figura 38. Representação esquemática de um Cromatógrafo a Gás.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:SchemaGaschromatograph_dutch.png>.
Os injetores cromatográficos podem assumir formas diferentes. Uma das mais comuns,
o injetor split/splitless, é apresentada na figura 39. Ele possui um septo, pelo qual a
amostra será inserida utilizando-se uma agulha. A amostra é inserida em uma câmara
de volatilização, aquecida a uma temperatura controlada para garantir que a espécie se
encontre em estado gasoso quando inserida na coluna.
Nesta câmara há três portas para fluxo de gás: a entrada do gás de arraste, a entrada da
coluna e uma saída para descarte de amostra (Válvula Split). Quando a válvula split está
fechada, toda a amostra injetada é inserida na coluna. Porém, em casos que é necessário
injetar um volume muito pequeno na coluna, esta válvula é regulada de forma a inserir
na coluna uma quantidade controlada e reprodutível de amostra. O sistema possui
também uma purga do septo, para impedir que algum resíduo indesejado do septo se
mistura à amostra.
Em alguns casos, tratamentos prévios são realizados com a amostra para análise de
seu conteúdo volátil. Na técnica por headspace, uma amostra líquida é aquecida em
recipiente fechado com septo, sendo coletada a fração gasosa em sua parte superior,
conforme mostra figura 40.
Quando realizada manualmente, a amostra é injetada utilizando-se uma seringa.

Visto que os volumes de injeção geralmente são pequenos (podendo chegar até a
1 microlitro), é necessário realizar o procedimento de maneira bastante cautelosa,
tomando-se o cuidado de injetar o volume precisamente e de maneira rápida, para que
a inserção de material no sistema seja o mais pontual possível, favorecendo o processo
de separação.
50
Figura 39. Injetor do tipo Split/Splitless.
Entrada Septo
Gá́ s de Purga do
Arraste Septo
Bloco Vá lvula Split

Termostatizado
Câ mara de
Tubo de Vidro Volatilizaçã o
Coluna
Fonte disponível em: adaptado de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Splitinj_copy.jpg.
Figura 40. Pré-Concentração por headspace.
Fonte: composição e adaptação das seguintes imagens, disponíveis em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/

File:Headspace_Vial.GIF>; <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Insulin_syringe_in_disassembled_form.jpg>.
Outra técnica comum de injeção com pré-tratamento de amostra é o Purge and

Trap. Nesta, a amostra é purgada com gás inerte, de forma a deslocar o equilíbrio de
solubilização de todos os voláteis dissolvidos para a fase gasosa. Esta fração gasosa
então é succionada para um tubo resfriado, frequentemente contendo alguma superfície
que favoreça a retenção dos analitos em baixa temperatura. Este tubo, agora contendo
os analitos, é então colocado em linha no sistema e aquecido, de forma a liberar os
analitos, que são inseridos na coluna.
Para aumentar a reprodutibilidade da injeção, especialmente quando tratamentos de

amostras como o headspace e o Purge and Trap são realizados, existem equipamentos
automatizados para injeção de amostra. Ainda assim, existem métodos experimentais
possíveis para corrigir eventuais problemas de reprodutibilidade, a serem apresentados
na unidade V.
51
Regulador de fluxo de gás

O fluxo de gás influencia diretamente no tempo de análise e na qualidade da separação,
interferindo em alguns aspectos da separação cromatográfica. Fluxos muito altos,
que são capazes de eluir a amostra rapidamente, não permitem que haja tempo de
contato suficiente entre fase estacionária e analito, de forma a diminuir a resolução
da separação.
Por outro lado, fluxo muito baixo de gás de arraste torna o tempo de análise muito
longo, o que é indesejável também não só pelo tempo de análise em si, mas também por
permitir que os compostos sofrem dispersão ao longo da separação por conta de efeitos
de difusão, o que também torna a separação menos eficiente.
A situação acima nos induz a pensar que deve existir um fluxo de gás para que a separação
seja ótima. Esta situação pode ser descrita pela equação de Van Deemter, que relaciona
a altura de um prato teórico (H) em função de parâmetros intrínsecos do sistema (A), do
coeficiente de difusão dos analitos eluídos (B), da resistência à transferência de massa
dos analitos entre as fases (C), e da velocidade do fluxo da fase móvel (u) conforme
apresentado abaixo.
Figura 41. Equação de Van Deemter.

‫ܤ‬
‫ܪ‬ൌ‫ܣ‬൅ ൅‫ܥ‬ή‫ݑ‬
‫ݑ‬
O conceito de altura de prato teórico (H) envolve modelos mais pormenorizados da

separação cromatográfica, não fazendo parte do escopo deste texto. O que é importante
entendermos agora é que esse termo é inversamente proporcional à eficiência de
separação dos compostos no sistema. Em suma, quanto menor for H, melhor a separação
entre meus componentes no procedimento cromatográfico.
Dito isso, podemos interpretar a equação de Van Deemter da seguinte forma: há um

fator intrínseco da qualidade da separação que independe do fluxo (A), e os fatores
inversa (B) e diretamente (C) proporcionais a velocidade de fluxo. Como podemos ver
no gráfico de H em função de u apresentado na figura 42, há um ponto de mínimo, que
corresponde ao fluxo ótimo de fase móvel.
Uma vez que a ordem de grandeza para cada um dos valores A, B e C é similar na
maioria das situações, a vazão do equipamento é otimizada e mantida constante em
sua operação, sendo os outros parâmetros de separação otimizados de acordo com
cada amostra.
52
Forno de temperatura programável

Para entender o processo de separação do cromatografia a gás, precisamos nos lembrar
do conceito de volatilidade, retomado na primeira unidade desta apostila. Uma substância
volátil é um gás ou líquido com temperatura de ebulição relativamente baixa. Uma
mistura de substâncias voláteis apresenta uma mistura de compostos que exercem uma
pressão de vapor diferente sob as mesmas condições ambientes, cada uma delas se
distribuindo entre fase gasosa e líquida diferentemente. Essa característica permite sua
separação cromatográfica.
Figura 42. Relação entre altura de prato teórico e vazão de fase móvel.
Fonte disponível e adaptada: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Van_Deemter_equation.png>.
O forno do cromatógrafo apresenta controle de temperatura com resolução típica de

0,1°C, podendo estabilizar temperaturas desde 40°C até superiores a 200°C, podendo
realizar variação de temperatura (esquentando e esfriando) de maneira bastante
controlada em função do tempo.
Quando é preciso realizar a separação de compostos de ponto de ebulição muito

próximos, o controle da temperatura do forno é essencial. Se a temperatura for muito alta,
o comportamento dos compostos se aproxima e eles não conseguem ser diferenciados
na separação. Por outro lado, temperaturas muito baixas podem tornar a análise muito
lenta ou mesmo deixar compostos retidos na coluna, interferindo análises posteriores.
53
O uso de rampas ou programas diferenciados de aquecimento permite a otimização de

condições para separação de compostos diferentes. Por exemplo, a separação de compostos
em uma mistura contendo um grupo de substâncias com baixo ponto de ebulição e outro
com ponto alto pode ser otimizada com dois patamares de temperaturas convenientes
para cada grupo, e aquecendo o forno em momento intermediário da separação.
Coluna Cromatográfica
No início do desenvolvimento da cromatografia a gás, as colunas eram tubos recheados
com substrato sólido, similar a cromatografia clássica de coluna apresentada no início
desta unidade. Este tipo de coluna, ainda utilizada para fins preparativos, deu espaço a
colunas capilares nos equipamentos de análise mais modernos.
As colunas capilares, em relação às recheadas, possuem claras vantagens para fins

analíticos. Seu diâmetro interno, tipicamente apresentam algumas dezenas de
micrômetros, lhe conferem um volume interno muito menor, de forma a requererem
um volume muito menor de amostra a ser inserida.
A fase estacionária nas colunas capilares, que pode ser líquida (Wall Coated Open
Tubular column, WCOT) ou sólida (Porous Layer Open Tubular column, PLOT), se
encontra nas paredes internas dos capilares, não preenchendo totalmente o tubo.
Desta forma, a pressão exercida sobre ela para o fluxo é menor, o que também permite
tubos mais longos para a separação. Tais fatores, combinados, aumentam a bastante à
eficiência de separação da coluna cromatográfica.
Apesar da temperatura ser extremamente relevante na cromatografia a gás, não é o

único parâmetro que pode ser otimizado. Apesar de algumas separações serem possíveis
apenas explorando o efeito da volatilidade, a interação do material interno da coluna
com os compostos eluídos pode ser essencial para a separação, atuando como um
fator adicional para a mudança de partição entre fase móvel e estacionária. Diferentes
colunas, de acordo com suas aplicações, são apresentadas na unidade VI.
Figura 43. Colunas capilares em Cromatografia a Gás.
Fonte disponível em: <https://chromatography.co/gc-columns>.
54
Detector
Ao final do processo de separação, alguma propriedade física ou química das substâncias
separadas precisam ser medidas, de forma a identificar o composto analisado.
Para tanto, um detector é utilizado, e seus resultados são registrados.
O tipo de detector utilizado, a resposta esperada de acordo com o analito utilizado, e

a forma de se interpretar esta resposta é explicada de forma dedicada na unidade V
desta apostila.
55
Capítulo 3
Cromatografia a líquido de alta eficiência
Na cromatografia a líquido de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography,

HPLC), a fase móvel utilizada é um líquido, sendo a fase estacionária também uma
coluna. É utilizada para separação e análise de amostras líquidas. Da mesma forma que
a cromatografia a gás, é formada pelas mesmas partes básicas conforme a seguir, mas
possui algumas partes características, ilustradas na figura 44 e discutidas a seguir.
Solvente para eluição (1)
Diferentemente da cromatografia a gás, a separação é fortemente influenciada pela

composição dos solventes, pois os líquidos tem uma interação maior entre si e seus
compostos dissolvidos.
Figura 44. Representação esquemática de um Cromatógrafo a Líquido.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus_(zh-cn).svg>.
Conforme visto na unidade I, a interação entre moléculas distintas é fortemente

influenciado por sua polaridade. Desta forma, são utilizados solventes com diferentes
polaridades na etapa de eluição, de acordo com a amostra e os analitos a serem separados.
Para otimizar a separação, frequentemente se usa uma mistura de solventes, fixa
durante a corrida (eluição isocrática) ou até mesmo variável (eluição por gradiente),
de forma a otimizar a separação. É importante frisar que uma análise de qualidade
exige o uso de solventes de grande pureza.
Vale ressaltar que, o cromatógrafo a líquido, salvo a regra, não possui forno com temperatura
controlada. É possível entender aqui a principal diferença entre cromatografia a líquido
56
de e a gás: enquanto na GC a volatilidade é fundamental, explorando-se gradientes de

temperatura, na HPLC a interação com o solvente é o principal parâmetro de otimização,
alterando-se suas proporções e concentrações em função do tempo.
Os solventes típicos para eluição em HPLC, bem como para quais tipos de compostos
eles são utilizados, estão resumidos na unidade VI.
Degaseificador (2)
O Cromatógrafo para realização da HPLC é um sistema projetado para operar com líquidos
e utiliza alta pressão. A presença de bolhas no sistema pode ser extremamente prejudicial
para o equipamento, comprometendo outras partes do instrumento como bombas e
coluna, bem como causando problemas para detecção. O desgaseificador não apenas
evita que ar entre no sistema, mas inclusive elimina os gases dissolvidos nos solventes.
Válvula de Gradiente (3), Vaso de Mistura (4), Bomba da

alta pressão (5)
Esta parte do sistema realiza a mistura dos solventes e propulsiona a fase móvel pelo
sistema. A maneira de realizar esta mistura pode ser diferente, envolvendo válvulas
comutando a entrada dos diferentes solventes, em diversas arquiteturas, ou até mesmo
se utilizando mais de uma bomba.
Devido às características físicas do sistema, é necessário que a bomba consiga exercer grande
quantidade de pressão. Para tanto, as bombas padrão para uso em HPLC são bombas de
infusão (que são câmaras comprimidas por um pistão, similares a uma seringa).
Vale lembrar que, a velocidade da fase móvel também influenciará a separação de acordo
com a equação de Van Deemter (vista no capítulo anterior), visto que os termos da
equação (velocidade de fluxo, parâmetros da coluna, coeficiente de difusão e resistência
a transporte de massa) também são parâmetros nas separações em fase líquida.
Injetor (6) e Alça de amostragem (7)
Como na cromatografia a gás, os injetores em HPLC podem ser manuais ou

automatizados, sendo os últimos preferidos em função do aumento de praticidade do
sistema. Dos injetores manuais, o mais comumente encontrado nos equipamentos
comerciais é o injetor comutador.
O injetor comutador é uma placa móvel com canais, montada sob uma placa perfurada.
De acordo com a posição da placa inferior, os canais da placa interligam furos diferentes,
permitindo o fluxo de fluidos por caminhos diferentes.
57
Figura 45. Injetor de HPLC.
Fonte: autor.
Quando a placa móvel é deslocada para a esquerda, os furos A e B acessam um canal e

os furos C e D acessam outro. Quando a placa está à direita, os furos B e C acessam um
canal e os furos D e E acessam o outro.
Sigamos agora pelo exemplo da figura 44. Quando na posição 6’, a amostra injetada no
comutador completa a alça de amostragem, enquanto a fase móvel flui para o detector.
Quando o comutador é chaveado, a fase móvel passa pela alça de amostragem e a
carrega para o detector.
O uso de alça de amostragem não apenas permite que a amostra seja colocada no fluxo
da fase móvel, mas também garante que o volume de solução injetado seja sempre o
mesmo (pois define, pelo seu tamanho, o volume de solução).
Pré-Coluna (8)
A pré-coluna é similar a uma coluna de separação, porém com pequenas dimensões,

colocada logo antes da coluna na qual ocorrerá a separação. Esta peça, contudo, não
tem função de separar os componentes: ela é utilizada apenas para preservar a coluna
principal, retendo possíveis contaminantes que potencialmente estragariam a coluna.
Coluna (9)
A coluna é a fase estacionária da HPLC. Existe uma variedade enorme de composições

de colunas para as mais diversas aplicações analíticas, tornando a HPLC uma das
técnicas mais versáteis da atualidade. Algumas aplicações, bastante recorrentes,
recebem nomenclatura específica.
Quando se utiliza uma coluna contendo um composto polar em sua fase estacionária
(por exemplo, sílica) e se realiza a eluição com um solvente apolar (por exemplo,
clorofórmio), denominamos a técnica de Cromatografia por fase normal. Este nome
se dá pelo desenvolvimento histórico da técnica, sendo uma das primeiras modalidades
de HPLC empregada.
58
Nos dias atuais, o modo mais comum de desenvolvimento é a Cromatografia de Fase

Reversa, com o uso de colunas com fase estacionária apolar, obtidas na maioria das
vezes por modificações químicas de superfícies polares. Um exemplo bastante comum
é a coluna popularmente conhecida como C18, na qual partículas de sílica estão ligadas
a uma cadeia carbônica ligada ao grupo octadecil (-C18H37). Vez que a fase estacionária
é apolar, a fase móvel é composta por solventes polares (frequentemente água, tampões
aquosos, metanol, acetonitrila, tetrahidrofurano, ou uma mistura destes).
Assim como se realiza a modificação de fases estacionárias com grupos apolares,

existem também colunas modificadas com grupos iônicos, capazes de reter e realizar
equilíbrios entre espécies iônicas presentes em solução. Neste caso, dizemos que a técnica
é a Cromatografia por troca iônica. É importante ressaltar que, esta técnica é,
conceitualmente, bastante diferente da Eletroforese Capilar, que será tratada na próxima
unidade, apesar de conseguir propor soluções aos problemas, por vezes, similares.
Existe também uma vertente cromatográfica cuja coluna possui poros de tamanho
controlado, e a interação entre os analitos e os poros se dá fisicamente, de forma a reter
melhor partículas menores que se possuem maior probabilidade de se encaixarem nos
poros. Esta técnica, predominantemente utilizada para análise de compostos de alta
massa molecular, é denominada Cromatografia por exclusão.
Detector (10)
Da mesma forma que a cromatografia a gás, o cromatógrafo de CLAE possui um

detector para medir alguma propriedade físico-química dos analitos utilizados, sendo
seus resultados registrados para interpretação.
Conforme já comentado anteriormente, esta apostila dedica a unidade V a apresentação

dos detectores comumente utilizados, seus princípios de funcionamento e sobre a
interpretação dos resultados analíticos.
59
Eletroforese Unidade iV
Capilar
A Eletroforese Capilar (Capillary Electrophoresis, CE) é uma técnica de separação,
em alguns aspectos, comparável à Cromatografia. Uma amostra líquida é propulsionada
por um tubo por meio de um processo de eluição, que provoca a separação de substâncias
presentes na amostra, detectadas e quantificadas ao final do processo.
Capítulo 1
História e Fundamentos
Apesar de comparável à Cromatografia, os processos que acontecem em CE apresentam

grandes diferenças em relação aos processos de separação descritos na unidade
anterior. Enquanto estes se baseiam nas interações entre fase estacionária e fase móvel,
a eletroforese se vale da migração das moléculas, induzida por um campo elétrico. Para
tanto, o equipamento opera de maneira consideravelmente diferente do cromatógrafo,
e os fenômenos envolvidos na separação também são substancialmente diferentes.
O movimento de partículas carregadas sob a influência de um campo elétrico foi

observado já em 1807, por Ferdinand Frederic Reuss. Em 1909, o termo, eletroforese, foi
introduzido por Michaelis como uma descrição desse fenômeno e é derivado da palavra
grega elektron que significa âmbar (isto é, elétrico) e phore que significa portador.
No entanto, apenas na década de 1930, que as técnicas de separação por eletroforese
se desenvolveram a partir do trabalho de Tiselius. Em decorrência deste seu trabalho,
conseguiu o Prêmio Nobel em 1948.
Os desenvolvimentos subsequentes da técnica de eletroforese a partir da década de

1930 culminaram na eletroforese em gel, ferramenta extremamente importante em
estudos bioquímicos para separação de macromoléculas de proteínas e DNA. Podemos
entender melhor esta técnica observando a figura 46.
Nesta modalidade, uma amostra a ser analisada é injetada em uma placa de gel
(compostos por agarose ou poliacrilamida, por exemplo) e é aplicado um campo elétrico
entre suas extremidades. Moléculas contendo carga são atraídas para os polos opostos,
60
Eletroforese Capilar │ UNIDADE IV
de acordo com seu tamanho e carga. As moléculas separadas são visualizadas como
bandas ao longo do gel, de maneira similar a cromatografia em papel.
A eletroforese em gel, muito importante para fins de comparação entre amostras, não se
mostra muito precisa para quantificação de componentes, além de ser um procedimento
demorado. O aumento do campo elétrico, a fim de acelerar as partículas e diminuir o
tempo de análise, gera aquecimento da placa devido ao efeito Joule e não pode ser
explorado de maneira intensa.
Figura 46. Representação esquemática da eletroforese em Gel.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gel_electrophoresis_procedure.png>.
Nesta modalidade, uma amostra a ser analisada é injetada em uma placa de gel
(compostos por agarose ou poliacrilamida, por exemplo) e é aplicado um campo elétrico
entre suas extremidades. Moléculas contendo carga são atraídas para os polos opostos,
de acordo com seu tamanho e carga. As moléculas separadas são visualizadas como
bandas ao longo do gel, de maneira similar a cromatografia em papel.
A eletroforese em gel, muito importante para fins de comparação entre amostras, não se
mostra muito precisa para quantificação de componentes, além de ser um procedimento
demorado. O aumento do campo elétrico, a fim de acelerar as partículas e diminuir o
tempo de análise, gera aquecimento da placa devido ao efeito Joule e não pode ser
explorado de maneira intensa.
O efeito Joule é um fenômeno físico no qual se observa aumento de temperatura

em um resistor quando sofre passagem de corrente. Esse efeito pode ser
entendido se pensarmos no atrito entre os elétrons da corrente e o material
do resistor, que um tanto será maior e gerará maior aquecimento quando a
intensidade de corrente, ou seja, o número de elétrons fluindo for maior.
Na década de 1950, a eletroforese era uma técnica de laboratório comum equivalente

em técnicas de cromatografia planar, tais como papel e camada fina. No entanto, com
61
UNIDADE IV │ Eletroforese Capilar
o advento da cromatografia líquida de alta performance (HPLC) na década de 1970, a

eletroforese era utilizada apenas em laboratórios bioquímicos e clínicos, como técnica
de separação qualitativa para macromoléculas, como proteínas e DNA.
Atualmente, pelo menos a metade de todas as separações são realizadas por eletroforese,
uma vez que esta técnica é utilizada de forma padrão para as separações de proteínas
do sangue e digestão de DNA. Ela é tão rotineira nos dias de hoje em biomedicina e
disciplinas relacionadas que raramente é mencionada nos resumos e títulos de artigos
onde é uma tecnologia básica, por exemplo, sequenciamento de DNA. Mesmo assim, é
mencionado pelo nome em quase tantos artigos quanto a cromatografia. No entanto,
com o desenvolvimento da eletroforese capilar 1981, a eletroforese retornou como um
tema substancial de interesse para a química analítica. (PERRETT, 1998)
O desenvolvimento da técnica de eletroforese dentro de um tubo capilar traz melhorias

significativas para a técnica analítica. Primeiramente, o uso de um capilar permite
maior dissipação térmica por maior área de troca de calor com o ambiente, permitindo
o uso de tensões mais elevadas. O uso de capilares permite, também, o uso de pequenos
volumes de amostra para análise. O aumento da tensão para separação analítica resulta
em tempos mais curtos de análise, e sua associação com pequenos volumes de amostra
permite que os componentes a serem separados se encontrem bem distintos entre si.
Com estas vantagens, a eletroforese capilar vem ganhando muito espaço e é hoje
uma técnica fundamental em laboratórios de análises químicas, mesmo apesar de
ser uma técnica criada mais recentemente do que as técnicas cromatográficas. Ela foi
fundamental no sequenciamento do DNA no projeto Genoma, e vem encontrando cada
vez mais aplicações analíticas.
Relembrando conceitos
A eletroforese é uma aplicação de uma das propriedades de uma pilha eletroquímica.
Os fenômenos presentes em uma pilha e suas implicações serão melhores estudados
na disciplina QF3, mas alguns conceitos essenciais para entendimento da técnica são
revisados aqui. Para tanto, considere uma pilha de Daniell.
Nesta imagem temos duas placas metálicas, uma de zinco (Zn) e uma de cobre (Cu),
denominadas eletrodos, imersas, respectivamente, em soluções de sulfato de zinco
e sulfato de cobre, denominadas eletrólitos. Estas duas placas estão ligadas por
um condutor metálico e as duas soluções estão ligadas por um tubo contendo um sal
dissolvido (por exemplo, cloreto de potássio, KCl), cujas pontas não deixam líquido
fluir, mas permite a passagem de pequenas moléculas, denominada ponte salina.
62
Nesta pilha ocorre o seguinte fenômeno: o zinco metálico (Zn0) possui maior tendência
para fornecer elétrons do que o Cobre, formando zinco oxidado (Zn2+) em solução.
O cobre oxidado (Cu2+), por sua vez, possui maior tendência a receber elétrons do que o
Zn2+. Desta forma, o zinco fornece elétrons para o cobre, formando Zn2+ e Cu0 no sistema,
de forma que a placa de zinco seja corroída e a solução de zinco fique mais rica em metal,
bem como formando cobre metálico e deixando a solução de cobre menos rica em metal.
Ora, se há formação de íons positivos de um lado e consumo de íons positivos do outro,

as soluções ficam eletricamente carregadas? Eis a função da ponte salina: os íons desta
ponte se moverão no sistema de forma a equilibrar a carga elétrica formada nas duas
soluções. Ou seja, se houver cloreto de potássio (KCl) na ponte salina, o cloreto se move
na direção da solução de Zn2+ e o potássio se move em direção da solução de Cu2+.
Frisamos que uma explicação aprofundada no fenômeno de pilha está fora do escopo
desta apostila, sendo abordada de maneira mais dedicada na apostila QF3. Neste momento
é importante entendermos o que acontece dentro da ponte salina. Ou seja, a aplicação
do campo elétrico entre os dois reservatórios, além de ter realizar as reações, provoca
movimento de íons na ponte salina.
Ora, se há formação de íons positivos de um lado e consumo de íons positivos do outro,

as soluções ficam eletricamente carregadas? Eis a função da ponte salina: os íons desta
ponte se moverão no sistema de forma a equilibrar a carga elétrica formada nas duas
soluções. Ou seja, se houver cloreto de potássio (KCl) na ponte salina, o cloreto se move
na direção da solução de Zn2+ e o potássio se move em direção da solução de Cu2+.
Figura 47. Pilha de Daniel.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Daniell-Element.jpg>.
63
Frisamos que uma explicação aprofundada no fenômeno de pilha está fora do escopo
desta apostila, sendo abordada de maneira mais dedicada na apostila QF3. Neste
momento é importante entendermos o que acontece dentro da ponte salina. Ou seja, a
aplicação do campo elétrico entre os dois reservatórios, além de ter realizar as reações,
provoca movimento de íons na ponte salina.
Agora precisamos considerar a seguinte situação: se, ao invés de um sal puro como
cloreto de potássio, houvesse uma mistura de íons na ponte salina, eles todos se
moveriam da mesma forma em função do campo elétrico exercido nas extremidades da
ponte salina?
Se pensarmos em cada íon como uma partícula carregada no vácuo, a força aplicada
no corpo (Fef) é proporcional ao campo elétrico (E) e a carga da partícula (q) de acordo
com a equação:
Figura 48. Força de campo elétrico.
‫ܨ‬௘௙ ൌ ‫ ݍ‬ή ‫ܧ‬
A situação que os íons se encontram, contudo, não é o vácuo. Desta forma, existem
forças de resistência ao fluxo que as partículas enfrentam ao se mover em solução.
A resistência ao fluxo das partículas neste meio é chamado de arraste por fricção (Ffr),
e é equacionado de acordo com o raio iônico hidratado da partícula (r), a viscosidade do
meio (ƞ) e a velocidade da partícula (v):
Figura 49. Força de arraste por fricção.

‫ܨ‬௙௥ ൌ ͸ ή ߨ ή ‫ ݎ‬ή ‫ ݒ‬ή ߟ
Nesse contexto, a força aplicada pelo campo elétrico é contraposta pelo arraste por
fricção. Visto que a partícula sofre mais arraste em velocidades maiores, haverá uma
velocidade específica na qual as forças se anulam, e ela trafegará com velocidade
constante, conforme equação apresentada na figura 50.
Figura 50. Velocidade de arraste.

‫ݍ‬ή‫ܧ‬
‫ݒ‬ൌ
͸ήߨή‫ݎ‬ήߟ
No geral, ao falarmos da propriedade de separação de um íon por eletroforese, utilizamos

o conceito de mobilidade, que é definido como a velocidade que um determinado íon
trafega em um determinado meio em relação a um campo elétrico unitário, conforme
equação da figura 51.
64
Figura 51. Mobilidade.

� �
�= =
� ��
A separação eletroforética ocorre, pois, justamente porque cada íon diferente deve
se mover com uma velocidade constante e diferente em um determinado meio.
Considerando um meio de viscosidade constante, temos que a mobilidade de um íon
é relacionada à sua carga (diretamente proporcional), e a seu raio iônico hidratado
(inversamente proporcional).
65
Capítulo 2
Instrumentação e Aplicação
Para entendermos melhor como funciona a eletroforese do ponto de vista prático, vamos
começar observando com mais atenção para o instrumento, cujas partes essenciais são
representadas.
Figura 52. Representação esquemática da Eletroforese Capilar.
Fonte disponível em: <https://c1.staticflickr.com/1/758/21589986780_4c4ba18b8e_b.jpg>.
Nele, dois reservatórios são ligados por um capilar contendo uma solução e monitorado
por um detector em um ponto específico. No processo de separação, um potencial elétrico
é aplicado entre os dois reservatórios, de forma a fazer a solução e os analitos fluírem
pelo capilar. Desta forma, o movimento diferente de cada espécie será responsável pela
sua separação, de acordo com a teoria explicada acima.
Contudo, o movimento descrito não explica todo o fluxo de solução em uma corrida
eletroforética. Outro fenômeno que deve ser considerado quando falamos do movimento
de espécies em eletroforese capilar é o fluxo eletrosmótico. As paredes internas do
capilar, tipicamente formadas por sílica, são ionizadas em contato com a solução de
eletrólito aquoso, de acordo com o equilíbrio:
Figura 53. Ionização da sílica.

ା ି
ܱܵ݅‫ܪ‬ሺ௦ሻ ֖ ‫ܪ‬ሺ௔௤ሻ ൅ ܱܵ݅ሺ௦ሻ
66
Como se pode imaginar, esse equilíbrio é deslocado para a direita em soluções com pH
mais alto, sendo mais relevante em soluções com pH > 3.
A carga formada na superfície induz a aproximação eletrostática de íons positivos do

eletrólito à superfície em função do potencial elétrico local. Quando o campo elétrico
é aplicado, tais íons são atraídos pelo campo, arrastando toda a solução para um dos
eletrodos. O fenômeno é ilustrado na figura 54.
Figura 54. Formação do Fluxo eletrosmótico.
Fonte disponível em: <https://en.wikipedia.org/wiki/Capillary_electrophoresis#/media/File:Capillarywall.png>.
O fluxo Fluxo eletrosmótico, que propele o eletrólito da CE em direção do final do

sistema, possui um perfil diferente do perfil de propulsão pneumática da cromatografia,
conforme ilustra figura 55. Conforme explicado anteriormente, no fluxo laminar o fluido
é “empurrado”, sofrendo atrito entre suas “lâminas” e a parede do tubo. Já no fluxo
Fluxo eletrosmótico, as partículas homogeneamente distribuídas na solução sofrem
atração eletrostática, de forma que elas são propulsionadas em perfil plano.
Figura 55. Comparação entre perfis de fluxo de solução.
Fonte disponível em: https://en.wikipedia.org/wiki/Capillary_electrophoresis#/media/File:Flowprofile.gif.
67
Os eletrólitos utilizados em eletroforese possuem concentração relativamente alta

de íons, que favorecem seu “carregamento” por meio da ação do fluxo eletrosmótico.
A presença de fluxo eletrosmótico, muito mais intensa e relevante em eletroforese
capilar do que eletroforese em gel, traz características peculiares a esta técnica de
análise, ressaltados a seguir.
Considerando a situação acima, os íons da amostra sofrerão ação de dois fenômenos

durante sua movimentação: da sua mobilidade e da mobilidade do fluxo eletrosmótico.
A estas mobilidades somadas se dá o nome de mobilidade aparente.
Esta mobilidade aparente, maior do que na eletroforese em gel por conta dos campos
elétricos maiores e da presença do fluxo eletrosmótico, permitem que as separações em
CE sejam muito mais rápidas do que separações em gel.
Perceba também que, em alguns casos, a mobilidade aparente de um íon pode ser
positiva mesmo se ele tem mobilidade negativa, ou seja, eventualmente íons negativos
sejam atraídos a um polo negativo.
Apesar de ser possível, em alguns casos, analisar ânions que movem em contraposição
do fluxo eletrosmótico, também é possível modificar a superfície interna do capilar de
sílica de modo a induzir a formação de íons positivos em sua superfície pelo uso de
surfactantes catiônicos, aqui chamados de inversores de fluxo. A figura pode ser
melhor compreendida quando comparada com a figura a seguir já apresentada (note a
seta de fluxo em direção oposta nas duas figuras).
Como podemos ver, a composição do meio influenciam na formação de íons na parede

do capilar, determinando características de análise. Da mesma forma, a composição do
eletrólito de corrida é extremamente relevante para o processo de análise também pela
sua influência na amostra.
Para entendermos a influência do eletrólito no processo de análise, consideremos a

análise de cocaína em presença de lidocaína (adulterante comum) em tampão TRIS
(hidroximetil) aminometano (HELLER, M. et. al., 2003). As moléculas encontram-se
representadas na figura 57.
As três substâncias apresentam afinidade por prótons em meio aquoso, sendo o pKa
das espécies relativamente próximos, como se pode ver na figura. O tamanho das
moléculas também difere: o TRIS é muito menor do que as outras moléculas estudadas
neste sistema.
68
Figura 56. Inversão de fluxo eletrosmótico.
Fonte disponível e adaptada: <https://en.wikipedia.org/wiki/Capillary_electrophoresis#/media/File:Capillarywall.png>.
Vamos pensar a respeito do pKa de cada uma destas moléculas. Em pH próximo a 8,6,
a cocaína possui grau de ionização igual a 0,5, ou seja, se apresenta dividida igualmente
entre sua forma neutra e protonada. Tal divisão ocorre, para as moléculas de Lidocaína
e TRIS em pH próximo a 8,0. Vale lembrar que, esta divisão acontece em um equilíbrio
dinâmico, conforme apresentado na Unidade II desta apostila, ou seja, na prática é
como se observássemos um agrupamento de moléculas com carga fracionária. A esta
mobilidade dependente do grau de ionização se dá o nome de mobilidade efetiva,
descrita pela equação da figura 58:
Figura 57. Representação das moléculas de Cocaína, Lidocaína e TRIS(hidroximetil)aminometano.
Fonte disponível em: <https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/>.
69
Figura 58. Mobilidade Efetiva.

ߤ௘௙ ൌ ߙ௜ ή ߤ௘
Cuidado para não confundir mobilidade efetiva com mobilidade aparente.

A primeira se refere ao grau de ionização da espécie estudada e independe do
fluxo eletrosmótico, enquanto a segunda se refere a mobilidade da espécie já no
processo de separação considerado.
Em pHs mais baixos do que 7,5, as três moléculas discutidas aqui majoritariamente
estarão em sua forma protonada, sendo que a molécula de TRIS se transporta mais
rapidamente por ter um menor raio hidrodinâmico. Já em pHs maiores do que 9,
todas as moléculas descritas se encontram desprotonadas e, consequentemente, sem
carga. Em pHs intermediários, contudo, a mobilidade efetiva será intermediária.
Para que entendamos melhor, a mobilidade efetiva das três espécies estudadas, em
função do pH.
Este gráfico permite visualizar em qual situação deve ocorrer uma melhor separação
entre estes componentes. Em pHs mais altos (acima de 10), podemos ver que a
mobilidade efetiva das espécies é praticamente nula, situação na qual sua mobilidade
aparente é igual a do fluxo eletrosmótico, e elas não serão separadas. Em pHs mais
baixos (abaixo de 6), será possível separar o tampão TRIS das outras espécies
estudadas, contudo a cocaína e a lidocaína apresentarão mobilidade muito semelhante,
dificultando sua separação.
Há algumas situações, contudo, que conseguimos observar as três espécies com

mobilidades efetivas diferentes, como, por exemplo, em pH 8,4. Observe, inclusive, que
o TRIS será mais lento do que a cocaína nesta situação, pois apesar de ser uma molécula
menor, estará proporcionalmente menos ionizada do que a cocaína neste pH.
Além da influência do pH na mobilidade efetiva pela alteração do grau de ionização da

espécie, outras alterações do meio podem interferir na mobilidade efetiva da espécie.
Como exemplos, podemos citar efeitos de complexação que alteram a carga efetiva do
íon ou mesmo a conformação de proteínas, bem como a formação de pares iônicos com
alguns aditivos. Uma tabela mais completa será apresentada na unidade VI desta apostila.
Em meio a todo o contexto acima, a eletroforese se mostra uma técnica muito versátil
e poderosa, e pode-se realizar de formas diferentes dependendo do problema analítico
a ser resolvido, e até mesmo não se limita a separação de amostras contendo íons.
Características relevantes sobre a operação e a montagem do equipamento, bem como
as diferentes formas que a técnica pode se apresentar e suas aplicações serão descritas
a seguir.
70
Figura 59. Dependência da Mobilidade da Lidocaína, da Cocaína e da TRIS com o pH do meio.
Fonte: HELLER M. et. al., 2003.
Vamos retomar as principais partes de um equipamento de CE. Vamos voltar a

observar a figura 52 e, a partir dela, explicar um pouco melhor cada etapa de análise e
o funcionamento de cada componente.
Para a realização da análise em CE, primeiramente o eletrólito a ser utilizado é colocado

em dois frascos (vials), posicionados em cada uma das extremidades do equipamento.
Uma diferença de potencial é aplicada entre cada uma das soluções, tipicamente entre
10kV e 30kV, de forma a preencher o capilar que as liga com o eletrólito. Um vial,
contendo amostra, é colocado em contato com o capilar preenchido e a amostra é
injetada. Depois desta etapa, o vial contendo tampão entra em contato novamente com
o capilar e a separação é realizada, aplicando novamente a diferença de potencial entre
os vials.
Como já comentado anteriormente, a composição do eletrólito de corrida dependerá

do tipo de análise a ser realizada. Contudo, é necessário que ele seja condutor de forma
a permitir a aplicação do campo elétrico. Vale lembrar também que, a aplicação do
campo elétrico nos reservatórios gera eletrólise da solução utilizada, ou seja, reações
eletroquímicas com são induzidas na superfície do eletrodo. Tais reações formam íons
que podem mudar o pH e influenciar nos equilíbrios químicos do sistema.
Desta forma, o eletrólito utilizado em CE deve conter íons para condução elétrica e ser
robusto frente a variações de pH e de composição induzidas pelas espécies formadas
71
durante sua eletrólise. Para tanto, comumente se utilizam soluções aquosas com forte
capacidade tamponante, sendo o pH escolhido e ajustado de acordo com a separação a
ser realizada.
Também pode-se dizer que a escolha do eletrólito influencia a etapa de detecção ao final
da análise, sendo alguns tampões mais favoráveis do que outros para alguns detectores
específicos.
O capilar utilizado, na grande maioria das aplicações, é um capilar de sílica cujo

comprimento típico é até 1m, e diâmetro interno entre 25 μm e 100 μm, revestido com
uma camada de poliimida, de forma a oferecer a ele flexibilidade e resistência mecânica.
Um diagrama com o corte transversal do capilar, em proporção, é apresentado na
figura 60.
Figura 60. Representação do capilar de eletroforese em escala proporcional.
Fonte: adaptado de HARVEY, 2000.
Conforme falado anteriormente, a superfície interna do capilar pode ser ativada e/ou
modificada quimicamente. Para tanto, é adicionado um componente no eletrólito de
corrida ou em algum outro eletrólito a ser utilizado previamente, e ele é propulsionado
para o capilar pela aplicação do potencial, ocorrendo o fluxo eletrosmótico.
A troca de soluções para pré-tratamento e injeção da amostra, em eletroforese capilar,

se fazem por meio do intercambiamento de frascos contendo as soluções. Desta forma,
as etapas de pré-tratamento e injeção da amostra são um pouco diferentes do que na
cromatografia, na qual existem bifurcações para inserção da amostra.
A injeção da amostra pode ser realizada de diversas formas, sendo duas mais comuns:
por hidrodinâmica e eletrocinética. Na injeção hidrodinâmica, uma pressão positiva
é aplicada no frasco de amostra, de forma a induzir o fluxo de amostra por pressão para
o capilar. Já na injeção eletrocinética, aplica-se uma diferença de potencial entre o
frasco da amostra e o frasco de eletrólito na outra extremidade do capilar, de forma que
o fluxo eletrosmótico insira a solução no capilar.
72
A injeção hidrodinâmica pode ser realizada com a gravidade como força motriz
para geração de pressão, colocando o frasco de amostra e a entrada do capilar
em altura conveniente.
A diferença de potencial aplicada pelo equipamento para favorecer a separação é

realizada por uma fonte de alta tensão. Esta fonte, salvo a regra, fornece diferenças
de tensão na ordem de dezenas de milhares de volts, e essa tensão gera uma corrente
no sistema. Visto que a corrente que flui pelo sistema é diretamente proporcional ao
aquecimento do capilar, é importante que esta corrente seja controlada e monitorada
pelo sistema. Além disso, alguns equipamentos permitem a inversão de polaridade dos
seus eletrodos, de forma a realizar corridas em sentidos opostos, o que é equivalente a
inverter a posição de injeção e de detecção no sistema.
Considerando a possibilidade de aquecimento do sistema, em especial em função

do efeito Joule, alguns equipamentos de CE apresentam controle de temperatura do
capilar. Além de permitir resultados mais reprodutíveis, alguns estudos cinéticos em
função da temperatura também podem ser realizados.
O equipamento de CE pode apresentar diferentes tipos de detectores, de acordo com a

aplicação a ser realizada. A discussão sobre os detectores para é realizada na Unidade
V deste curso.
A forma de eletroforese mais comum e mais próxima do que foi discutido até
agora é a Eletroforese Capilar de Zona (Capillary Zone Electrophoresis, CZE).
Nesta modalidade, injeta-se a amostra no capilar já previamente preenchido com
eletrólito de corrida. A diferença de potencial então é aplicada entre as extremidades
do capilar, de forma que as espécies presentes na amostra migrem em zonas distintas,
de acordo com suas mobilidades aparentes.
Em algumas situações, a coluna capilar pode ser preenchida com uma matriz polimérica.
Neste caso, denominado Eletroforese Capilar em Gel (Capillary Gel Electrophoresis,
CGE), a coluna com gel provoca também um efeito de separação por tamanho, sendo
especialmente interessante para macromoléculas orgânicas como proteínas e sequências
de DNA, visto que moléculas de tamanhos diferentes frequentemente apresentam relações
muito próximas entre carga molecular e raio hidrodinâmico (pois uma macromolécula
maior apresenta maior número de cargas pontuais).
É interessante notar que este a Eletroforese Capilar em Gel se assemelha muito a

eletroforese clássica apresentada no início desta unidade, e, conceitualmente, guarda
relações com a Cromatografia por Exclusão de tamanho. Note que a separação,
neste caso, ocorre mesmo quando a relação carga/raio hidrodinâmico é próxima.
73
Também é possível realizar a eletroforese capilar com uma coluna recheada de forma
similar a cromatografia, em técnica chamada Cromatografia Eletrocinética Capilar
(Electrokinetic Chromatography, EKC). Esta técnica se diferencia da cromatografia
pelo modo de propulsão do eluente: neste se utiliza fluxo eletrosmótico ao invés de
bombeamento pneumático do eletrólito.
Apesar de ser um método eletroforético, a separação aqui pode ser entendida como um
processo cromatográfico, contendo particionamento de amostra entre fase estacionária
e fase móvel. Neste caso, o processo de partição permite separação entre espécies
neutras de acordo com as interações descritas.
Outra estratégia para a separação de compostos neutros é a Cromatografia

Eletrocinética Micelar (Micellar Electrokinetic Chromatography, MEKC). Nesta,
utilizam-se surfactantes aniônicos que formam micelas com mobilidade efetiva no
meio. As moléculas a serem separadas se particionam entre o eletrólito e as micelas,
sendo separadas de acordo com o grau de particionamento de cada substância.
É interessante comparar a EKC com a MEKC, sendo que uma se vale de interações
entre a coluna e o eletrólito de corrida, enquanto a outra se vale da interação
entre o eletrólito de corrida e as micelas. Apesar de serem interações de natureza
diferente, conceitualmente as duas técnicas são bastante próximas.
Outra modalidade eletroforética é a Isotacoforese Capilar (Capillary Isotachophoresis,

CITP). Nesta, se insere uma amostra (A) com componentes de mobilidades intermediárias
entre dois eletrólitos de corrida de mobilidades extremas (Eletrólito Líder, EL, colocado
antes da amostra, e Eletrólito Terminador, ET, colocado depois). Quando aplicado o campo
elétrico, os analitos fluem ao detector entre os dois tampões utilizados.
Figura 61. Representação da separação por Isotacoforese.
Fonte disponível e adaptada: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:ITP_separation_model.png>.
74
Veja que, nesta técnica, é possível realizar a pré-concentração dos analitos, ou seja, as
espécies analisadas se distribuem em um volume menor de amostra. Isso favorece a
detecção posterior dos compostos analisados.
Com a miniaturização dos sistemas de análise, há uma grande tendência no

desenvolvimento da CE em pequenos microchips, que utilizam placas milimétricas
contendo canais micrométricos para realizar a separação. Apesar dos avanços nesta
modalidade de CE e suas potenciais aplicações, sua apresentação e discussão do assunto
fogem do escopo desta apostila.
75
Detectores e
Interpretação dos Unidade V
Resultados
Como visto anteriormente, os métodos apresentados realizam a separação de componentes
de uma mistura complexa e identificam cada um dos componentes isoladamente de
modo a realizar a análise. Mas como funciona este detector? Como é o resultado que se
espera obter ao final de um processo de separação? De que forma este resultado pode
ser interpretado?
A etapa de detecção, realizada por sensores, é uma ciência complexa e o assunto

pode ser estendido por diversas apostilas, dependendo do grau de abrangência e de
detalhamento que o tema for exposto. Alguns dos detectores apresentados aqui são
a integração dos métodos com as técnicas de separação, enquanto outros não serão
aprofundados aqui. Nesta disciplina será realizada uma apresentação conceitual que
possibilite a utilização dos métodos de separação. O mesmo vale para a interpretação
dos dados obtidos, que serão tratados em nível operacional, seguindo-se referências
para maior aprofundamento, caso tenham interesse.
Capítulo 1
Sinais em técnicas químicas de separação
Vamos retomar pelo processo de separação de cromatografia por camada delgada.

Observemos a análise qualitativa da amostra de tinta preta apresentada na figura
abaixo. É possível saber se a amostra é uma substância pura ou uma mistura?
Figura 62. Separação por Cromatografia de Camada Delgada.
Fonte disponível e adaptada: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:TLC_black_ink.jpg>.
Ao olharmos para esta tira, podemos notar diferentes manchas em diferentes distâncias
da camada delgada. De acordo com a discussão do Capítulo 3, podemos ver que há
uma mistura de compostos inseridas na superfície e cada um deles interage de forma
76
Detectores e Interpretação dos Resultados │ UNIDADE V
diferente com ela. Além do ponto de injeção (escurecido, à esquerda), se veem três
zonas distintas, sendo a primeira quase mesclada à segunda e a terceira mais à direita.
A posição e intensidade destas plumas na camada delgada pode ser estimada. Pode-se
ver quatro regiões com analito: uma na posição de injeção (~28 mm), à esquerda,
outras duas quase sobrepostas (em ~64 mm e ~74 mm), ao meio e uma última região
à esquerda (~100 mm). As manchas maiores e mais intensas, como se deve imaginar,
correspondem aos compostos em maiores concentrações.
A intensidade do tom acinzentado das manchas acima pode ser lido via software para
tratamento de dados. A imagem foi lida ponto a ponto e a intensidade de cor foi colocada
em um gráfico, como mostra a figura 52. O gráfico apresentado é a forma mais comum
de representação de dados de separação e a ela se dá o nome de cromatograma.
Quando a separação é realizada por técnica de eletroforese, dá-se ao gráfico resultante
o nome de eletroferograma.
Figura 63. Cromatograma correspondente à separação por CCD.
Fonte: Criação do autor, CCD com design inspirado em figura adaptada de <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:TLC_
black_ink.jpg>. Gráfico de Intensidade de sinal x Posição foi realizado por meio de dados hipotéticos simulados.
No exemplo anterior, a separação entre os compostos se mede de acordo com a distância

entre as manchas. Na maior parte das modalidades cromatográficas e na eletroforese
capilar, no entanto, se registra o sinal em função do tempo. Nestes casos, um detector
pontual é colocado em uma posição específica da fase estacionária e os compostos são
eluídos em função do tempo.
É interessante notar que, a ordem dos picos da figura 66, correspondente a leitura
do detector da figura 65, é invertida em relação à ordem que vemos na tira: neste
77
UNIDADE V │ Detectores e Interpretação dos Resultados
cromatograma, os picos que aparecem antes são aqueles que tem menor interação com
a fase estacionária e eluem mais rapidamente pelo equipamento.
Como a cromatografia é um processo reprodutível quando mantidas as condições

de análise, o tempo que um dado composto leva para chegar ao detector também é
característico e pode ser utilizado para sua identificação. Este tempo característico
é chamado de tempo de retenção.
Quando há componentes mal separados de uma amostra, eles se apresentarão como picos
muito próximos ou mesmo como um pico único na análise, como pode ser observado no
cromatograma de camada delgada discutido no começo dessa unidade. Esta separação
entre picos é chamada de resolução, pode ser calculada considerando os tempos de
retenção de cada substância e a largura de seu pico, conforme seguinte equação:
Figura 64. Equação da resolução entre picos.
� � �� )
�� =
��
Figura 65. Separação Cromatográfica em função do tempo.
Fonte disponível e adaptada: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:TLC_black_ink.jpg>.
Figura 66. Sinal Cromatográfico em função do tempo.
Fonte: Criação do autor, o gráfico que compõe a imagem foi realizado por meio de dados hipotéticos simulados (soma de
funções gaussianas e ruído aleatório).
78
Nesta equação, a resolução (Rs) é calculada em função do tempo de retenção dos dois
analitos (tR1 e tR2) e da largura de seus picos na base (wb1 e wb2). Na prática analítica,
recomenda-se que estes picos possuam uma resolução maior do que 1,5 para realizar
sua quantificação.
Mas se estamos colocando uma amostra de composição desconhecida no equipamento,

como podemos saber quantos, quais e em que quantidade as substâncias nela se
encontram? Responder esta pergunta não é trivial e envolve diversas variáveis, havendo
estratégias analíticas que nos auxiliam neste trabalho.
Como foi visto na Unidade II, a determinação gravimétrica é um método primário,

ou seja, pode ser realizada sem a necessidade de nenhuma comparação com outro
procedimento ou método. Já nas técnicas de separação utilizadas, esta comparação é
necessária e suas propriedades são apresentadas a seguir.
Para saber o comportamento de uma dada substância em uma análise cromatográfica,

podemos injetar uma alíquota pura desta no sistema, ou mesmo misturada a um
solvente de característica já bem conhecida. Esta substância é o padrão analítico.
O padrão, no caso da identificação de compostos em técnicas de separação, terá o mesmo

comportamento do analito procurado e, desta forma, possuirá o mesmo tempo de
retenção dele. Vale lembrar que o tempo de retenção não é absolutamente seletivo, isto
é, pode haver compostos que, em uma dada condição de separação, tenham tempos de
retenção similares. Alguns detectores apresentam mais de um sinal simultaneamente,
permitindo detecções mais seletivas e serão abordados mais à frente nesta unidade.
Além do tempo de retenção, utilizado para identificação do composto, o padrão também

é utilizado para realizar sua quantificação na amostra. Para tanto, é realizada uma
curva de calibração para o método analítico desenvolvido, conforme procedimento
a seguir.
Inicialmente, são preparadas soluções com quantidades absolutamente bem conhecidas

do padrão analítico a ser determinado em meio a um solvente adequado. As quantidades,
nesse caso, são definidas por meio da pesagem deste composto e diluídas em uma
quantidade determinada (por medida de volume ou mesmo massa) de solvente.
Neste momento, pode-se notar a inequívoca relevância da gravimetria. Ela,

enquanto método primário, permite que padrões analíticos sejam preparados
de maneira precisa, sem depender de outras técnicas.
Cada solução preparada, então, é injetada no equipamento e analisada. Poder-se-á

notar o aumento da intensidade (seja na altura, na largura ou na área) dos picos em
79
função da concentração da solução padrão injetada. A intensidade do sinal, graficada em

função da concentração da solução preparada, é a curva de calibração. Nesta imagem,
representam-se à esquerda os picos de um mesmo analito em concentrações diferentes,
na figura da direita, o gráfico da curva de calibração propriamente dita.
Figura 67. Intensidade de sinais e curva de calibração.
Fonte: Autoria própria, sinais hipotéticos simulados por computador.
As curvas cheias dos sinais indicam o sinal proveniente da injeção de amostras. Salvo a
regra, espera-se que o sinal obtido seja linearmente correlacionado a concentração de
amostra medida. Esta correlação matemática pode ser equacionada por meio de uma
regressão linear, de forma que a concentração de amostras, diferentes das dos padrões,
podem ser calculados a partir da interpolação do resultado de sua leitura na equação
obtida.
Esta correlação linear obtida, para técnicas de separação, é uma equação de primeiro
grau com intercepto em zero, ou seja, considera-se que o sinal de uma amostra sem
analito seja nulo (as implicações do sinal do branco serão discutidas nos parágrafos
posteriores). Desta forma, o sinal se relaciona diretamente com a concentração, sendo
ponderado por uma constante, na qual denominamos sensibilidade. Quanto maior for
a constante k em Sinal = k ∙ Canalito, maior a capacidade de se diferenciar concentrações
próximas, visto que, variações pequenas de analito renderão variações grandes de sinal.
Agora vamos observar a linha pontilhada no gráfico à esquerda. Esta curva se trata da
injeção de uma alíquota de solução que não contém a substância que quero identificar,
isto é, o branco. Como se pode observar, ele não tem medida absolutamente nula.
Mesmo nas condições ideais de análise, o sinal do branco ainda possui variações
aleatórias devido a ruídos presentes na medida, decorrentes de fenômenos naturais
aleatórios. A contabilização do branco, pois, é uma medida da variação do sinal do meu
procedimento de análise, independente da variação de concentração de meu analito.
Esse dado será utilizado para caracterizar o método, como será visto adiante.
80
As medidas em concentrações muito baixas apresentam limitações e desafios. Se até o

branco apresenta sinal com variações aleatórias, como posso saber se um sinal muito
pequeno se refere ao branco ou ao analito de interesse? A realização de diversas medidas
de branco resultará em valores aleatórios diferentes, de forma que, se minha amostra
apresentar um sinal de magnitude comparável ao branco, não terei como saber se o
sinal medido é referente às variações do equipamento ou a concentração de meu analito
de interesse na amostra.
A partir do sinal obtido por diversas injeções do branco, posso estimar qual o nível
de variação médio e sua distribuição. A partir destes dados, posso estimar que só será
possível detectar substâncias em amostras cujo sinal seja certamente maior do que o
sinal do branco. Considera-se que o branco possui distribuição normal, e se conclui que
o nível mínimo de concentração que pode ser observado é três vezes a média do sinal do
branco dividido pela sensibilidade do método, conforme equação seguinte:
Figura 68. Limite de Detecção.
ܵ௕௥௔௡௖௢
‫ ܦܮ‬ൌ ͵ ή
݇
A este nível mínimo de concentração que pode ser estimado dá-se o nome de limite
de detecção. Este limite pode variar bastante de acordo com o método utilizado, e,
em alguns casos, há demandas críticas de métodos cada vez mais sensíveis. Em valor
próximo ao limite de detecção, é possível afirmar a presença do analito na amostra,
porém, estimar o valor de concentração encontrado ainda é muito incerto. Desta forma,
pode-se calcular, também, um limite de quantificação para o método a partir destes
desvios, convencionado como dez vezes a razão entre o sinal do branco e a sensibilidade
do método, conforme equação:
Figura 69. Limite de Quantificação.
ܵ௕௥௔௡௖௢
‫ ܳܮ‬ൌ ͳͲ ή
݇
Para concentrações superiores, a relação linear entre a concentração e o sinal também

não pode ser estendida para quaisquer concentrações. É comum que concentrações
muito altas não possuam resposta tão intensa quanto se espera devido aos fenômenos
como a saturação do detector, de forma que os resultados não podem ser extrapolados
para além da curva de calibração. Neste sentido, é interessante que a curva de
calibração seja realizada com uma faixa de concentrações de solução que abranja, ao
máximo, as concentrações das amostras. A essa faixa com respostas lineares se dá o
nome de faixa linear.
81
Se olharmos com atenção, os picos apresentados na figura 67 não se apresentam

perfeitamente regulares. A altura deles, representada na curva de calibração, possui algumas
variações que não se correlacionam perfeitamente com a concentração. Além disso,
o tempo de retenção de cada um deles também não é idêntico. Tais desvios podem ser
ocasionados por diversos fatores e devem ser mínimas em métodos otimizados.
Em algumas situações, contudo, maiores desvios são consequência de alguma

irreprodutibilidade na manipulação da amostra. Em um procedimento de injeção
manual, por exemplo, a sincronia de tempo entre o início do experimento e a injeção
pode não ser perfeita. Outro exemplo de variação que pode ser provocada em uma
injeção manual é uma pequena variação de volume de amostra injetada.
Para compensar tais variações experimentais, é possível se adicionar uma substância

em concentração conhecida a seus padrões e amostras. Desta forma, todas as condições
de manipulação que a amostra é submetida também são sofridas por esta substância
e a alteração de sua resposta pode então ser utilizada para realizar correções nessas
variações. A esta espécie se dá o nome de padrão interno.
A realização da correção se dá da seguinte maneira: o dado utilizado agora para calcular

a concentração das substâncias na amostra não será mais simplesmente a altura do pico
do composto de interesse, mas a relação entre a altura do composto de interesse com o
padrão interno. Assim, pequenas flutuações no tempo de retenção do analito podem ser
comparadas e eventualmente corrigidas pela comparação do padrão interno.
A escolha do padrão interno, no entanto, exige bastante atenção e cuidado. Primeiramente,

é necessário que seja uma substância que nunca esteja presente na amostra e que não
tenha tempo de eluição igual ou muito próximo de alguma substância da amostra.
Por outro lado, é desejável que ela tenha comportamento próximo às substâncias de
interesse, para que as alterações que esta sofra durante a manipulação sejam similares
àquelas sofridas pelos analitos. Além disso, é preciso garantir que o padrão não reaja ou
provoque nenhuma alteração química na amostra.
Em alguns casos, as substâncias a serem analisada podem não ser adequadas para uma
determinada técnica de análise e/ou de detecção da forma que elas se encontram na
amostra. Ainda assim, é possível realizar uma reação química com estes compostos
para formar uma espécie detectável de acordo com a técnica analítica utilizada. A esse
tipo de estratégia se dá o nome de derivatização da amostra.
Detectores
Os sinais apresentados nesta unidade foram medidos pela intensidade em escala de
cinza das manchas da tira. Podemos imaginar, no entanto, uma cromatografia de uma
82
amostra de tinta composta de corantes de diferentes tonalidades. Nesse caso, seria

possível medir a intensidade não apenas da tonalidade das manchas, mas até mesmo
de cada cor encontrada.
A imagem da figura 62 é originalmente colorida (ainda que não reproduzida de forma

colorida nesta apostila). Se analisarmos a imagem original, sem nenhum tratamento,
apenas a colocando em escala para a leitura da imagem e traçarmos o gráfico de absorção
das cores vermelho, verde e azul, teremos o gráfico apresentado na figura 70.
Figura 70. Detecção Espectrofotométrica RGB de separação em cromatografia planar.
Fonte: Criação do autor, leituras foram realizadas em software de tratamento matricial de dados GNU Octave. O Gráfico
corresponde às leituras das cores da imagem correspondente após edição em software CamScanner. Figura inspirada a parti
de resultado verificado em <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:TLC_black_ink.jpg>.
É interessante notar as diferenças entre os gráficos das imagens 52 e 59. Na imagem

monocromática, pode-se ver, de certa forma, a soma dos três gráficos, indicando sinais
similares aos encontrados. Contudo, quando somos capazes de separar os sinais em
seus componentes de cores originais, podemos identificar alguns sinais de forma
mais isolada.
Um exemplo bem interessante são os sinais próximos a 64 e 74 mm. Quando observados

juntos no gráfico monocromático, os dois sinais se sobrepõem, enquanto no gráfico
com o sinal de cada cor separada, podemos ver claramente um pico de absorção do azul
e o outro pico que indica absorção das cores verde e vermelha.
Apesar de não serem detectores específicos, ou seja, capazes de identificar uma única
substância, sua capacidade de detectar propriedades diferentes (no caso, absorção de
luz em cores diferentes) fornece informações mais aprofundadas a respeito da amostra.
Alguns detectores podem fornecer resultados bem seletivos, apresentando propriedades
específicas de moléculas.
83
O universo dos detectores para técnicas de separação cromatográfica e eletroforética é

imenso. Parte dos detectores são baseados em princípios e técnicas a serem apresentadas
no curso de técnicas Espectroscópicas, Eletroquímicas e Titrimétricas, enquanto
outros, de forma aprofundada, não constam no escopo deste curso. De toda forma,
uma explanação, em nível básico sobre alguns detectores importantes nas técnicas
estudadas, será apresentada.
Figura 71. Cromatograma com Espectrometria de Massas.
Cromatograma
Intensidade
Espectro de massa
dos picos resolvidos
Tempo de Retenção Relação Massa/Carga
Separação
Cromatográfica Análise por espectrometria de massas
Fonte disponível em: <https://en.wikipedia.org/wiki/File:Liquid_chromatography_MS_spectrum_3D_analysis.png>.
84
Capítulo 2
Detectores para sistemas analíticos
de separação
A escolha do detector mais apropriado para a técnica de análise a ser realizada é essencial
para o sucesso de uma análise química. Dentre os fatores que influenciam diretamente
a escolha do detector, são de grande relevância:
»» Técnica Analítica utilizada (GC, HPLC, CE, TLC).
»» Característica do analito estudado.
»» Custo e infraestrutura necessários para detector.
Este texto não pretende, de forma alguma, esgotar o assunto, dada a grande complexidade
dos temas, tanto pelo número de detectores existentes no mercado, quanto pelas
peculiaridades de cada detector. Como já falado anteriormente, alguns dos detectores
citados aqui são assuntos de outro módulo do curso (QF3).
Para facilitar a apresentação, vamos fazer algumas separações, de acordo com o tipo de
equipamento utilizado.
Cromatografia a Gás
Impressionantemente, o primeiro detector desenvolvido para cromatografia a gás
se valia da análise de alíquotas colhidas por borbulhamento em uma solução e
quantificados por titulação, isto é, pela adição de quantidade conhecida de uma solução
até completar reação estequiométrica. Mesmo sem nos aprofundarmos na técnica de
titulação aqui (explicada no módulo QF3 do curso), podemos ver o quanto este método,
ainda realizado de forma manual, era trabalhoso.
Hoje em dia existem detectores dos mais variados tipos, integrados e automatizados
na operação do instrumento. Sem preocupação com uma perspectiva histórica, seguem
apresentados alguns dos mais utilizados nos dias atuais.
O detector por ionização em chama (Flame Ionization Detector, FID) é um dos

detectores mais comuns em cromatografia a gás e apresenta grande sensibilidade para
compostos orgânicos. Para melhor compreensão, segue esquema na figura 72.
85
Figura 72. Detector por Ionização de Chama (FID).
Reações de ionização na chama

+ -
Medida de CH + O  CHO + e
+ +
Corrente COH + 4H2O  (H2O)nH
~30 mL / min H2
~300 mL / min ar
~30 mL / min N2
Fase móvel vinda da

coluna (N2) ~ 1mL / min
Fonte disponível em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/45/Schematisch_weergave_FID_detector.jpg>.
Este detector funciona da seguinte forma: uma chama de hidrogênio é formada em

uma câmara conectada a saída da coluna cromatográfica. Os compostos presentes na
amostra entram em contato com esta chama, que os ioniza, ou seja, quebra as moléculas
fazendo com que se forme fragmentos com carga. Este processo de ionização ocorre
em uma câmara contendo dois eletrodos polarizados com cargas opostas e a corrente
induzida entre tais eletrodos é medida.
A capacidade do sistema em conduzir corrente elétrica é diretamente proporcional a

quantidade de íons do sistema, que, por sua vez, é proporcional a quantidade de material
ionizado. Moléculas orgânicas maiores, portanto, tendem a ter sensibilidade mais alta.
Para o funcionamento deste detector, é necessário que o cromatógrafo seja alimentado

por três gases. Além do gás de arraste para a cromatografia, frequentemente formado
por nitrogênio (N2) devido à inércia química e baixo custo, é necessário alimentar a
chama com hidrogênio (H2) e ar sintético, comburente para a chama (por conter 20%
de O2). Uma quantidade de N2 é misturada ao H2 quando inseridos no detector, para
otimizar o fluxo da amostra saindo da coluna para o detector.
A emissão de elétrons pode ser modulada de forma diferente. Em uma variação desta
técnica, uma pérola de rubídio ou césio é aquecida em posição acima da chama, de
modo a emitir elétrons por um efeito chamado emissão termoiônica. Quando compostos
contendo nitrogênio ou fósforo chegam à chama, os íons formados são adsorvidos
na superfície da pérola, diminuindo a função trabalho (energia necessária para
termoionização), aumentando o sinal. Este detector é chamado detector termiônico
86
específico (Thermionic Specific Detector, TSD) ou, mais popularmente, detector de

nitrogênio-fósforo (Nitrogen-Phosphorus Detector, NPD).
Ainda utilizando detecção com chama, o sinal observado pode ser diferente. É possível
utilizar um detector fotométrico e examinar a luz emitida pela chama ao invés da
corrente. Este detector por fotômetro de chama (Flame Photometric Detector,
FPD) pode ser mais específico, visto que é possível selecionar a frequência da luz a ser
medida, e oferece boas respostas para diversos compostos orgânicos contendo átomos
como enxofre e fósforo. Já o detector por emissão atômica (Atomic Emission
Detector, AED) é capaz de monitorar simultaneamente mais de uma frequência de
luz, tendo aplicação mais abrangente. A construção destes detectores e suas aplicações
serão tema abordado no módulo QF3.
A detecção por ionização ainda pode ser realizada por técnicas diferentes. Ao invés da
chama, a ionização das amostras pode ser provocada por luz ultravioleta, sendo um
detector de fotoionização (Photoionization detector, PID). Este detector, que não
tem necessidade de gases adicionais para a sua operação, frequentemente é utilizado
para detecção de compostos orgânicos voláteis (COVs) em áreas contaminadas e
frequentemente é acoplado como detector em cromatografia a gás..
Já no Detector por Captura de Elétrons (Electron Capture Detector, ECD), o sinal

examinado corresponde a radiação de uma fonte radiativa de partículas β (elétrons),
tipicamente 63Ni. Quando moléculas que absorvem essa radiação se encontram no
sistema, o transporte de elétrons na câmara fica comprometido e os íons gerados tem
maior probabilidade de serem neutralizados no sistema, levando a queda drástica
de corrente. Este detector, muito utilizado em análises forenses e ambientais, é
especialmente sensível para compostos halogenados.
Figura 73. Detector por fotoionização (PID).
Fonte disponível em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/dc/PID_detector.svg/2000px-PID_detector.svg.png>.
Na detecção de íons formados pode-se, ainda, classificar e quantificar os íons

formados de acordo com a relação entre sua carga e sua massa (m/z), em
87
uma técnica chamada espectrometria de massas (Mass Spectrometry, MS).

Esta técnica, consideravelmente mais complexa e dispendiosa, fornece informações
muito mais precisas acerca das amostras estudadas e, em muitos casos, permitem a
identificação de compostos antes desconhecidos, de acordo com a relação m/z dos
íons formados.
Os instrumentos que realizam espectrometria de massas são bem complexos e variados,

de acordo com a aplicação a ser utilizada. De maneira simplificada, ele consiste nas
seguintes partes descritas:
»» fonte de ionização: quando inserida no sistema, a amostra é ionizada para

análise subsequente. Existem diversas formas para realizar este processo,
sendo sua escolha de acordo com o tipo de análise a ser realizada;
»» analisador de íons: uma vez formados, os íons entram em uma câmara

e são submetidos a campos magnéticos, interagindo de acordo com sua
relação m/z;
»» detector de íons: após ação do campo magnético, os íons são detectados

e quantificados por um sensor.
As características dos íons formados dependem das configurações do sistema utilizado.

Em alguns casos, quando se procura aumento da sensibilidade, monitora-se a
intensidade de apenas um íon, mas também é possível monitorar uma grande variedade
de massas, de forma a ter um espectrograma abrangente de massas para cada momento
cromatograma. Em alguns equipamentos, inclusive, possuem mais de um setor com
estas partes, de modo a gerar íons e fragmentos a partir de amostras já fragmentadas,
fornecendo maiores informações sobre as amostras.
Uma discussão aprofundada a respeito de espectrometria de massas, apresentando as

reações envolvidas nos processos de ionização e detecção, bem como cada uma de suas
partes detalhadas e configurações alternativas dos instrumentos, está fora do escopo
deste curso.
Outro método de detecção diferente, que não envolve ionização dos compostos
analisados, é o detector por condutividade térmica (Thermal Conductivity
Detector, TCD). Neste, uma resistência elétrica é colocada em duas câmaras com fluxo
de gás, sendo uma o fluxo da coluna cromatográfica e outra o gás de arraste puro, como
referência. Quando a composição do eluente da coluna muda, a estabilização térmica
da câmara muda, alterando a corrente que passa pela resistência da primeira câmara.
O esquema do detector é apresentado na figura 74.
88
Figura 74. Detector por Condutividade Térmica.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:ThermalConductivityDetector.svg>.
A técnica GC-TCD é amplamente utilizada, nos dias atuais, para a realização de

Análise Elementar (CHNS), em substituição a análise gravimétrica.
Cromatografia a Líquido e Eletroforese Capilar

As separações realizadas por cromatografia a líquido, inicialmente, eram monitoradas
por inspeção visual. Durante o desenvolvimento da técnica, métodos de coleta de
alíquotas e análise em bateladas foram realizados de maneira similar à cromatografia a
líquido e, da mesma forma, fez-se necessário a implementação de sistemas capazes de
detectar automaticamente os compostos eluídos durante a análise.
Por serem técnicas de separação em amostras líquidas, os detectores utilizados para

HPLC e EC são, em princípio, os mesmos. Apesar de algumas peculiaridades entre cada
técnica (a serem comentadas a seguir), a apresentação de detectores para ambas as
técnicas será realizada ao longo deste mesmo texto.
O primeiro detector em linha desenvolvido para HPLC é o detector por índice de

refração. Neste, uma luz incide sobre a amostra e seu desvio (provocado pela refração
que cada material específico possui) é medido.
Este detector sofre muita influência do ambiente (temperatura, pressão, fluxo de fase
móvel), não pode ser utilizado com eluição por gradiente e possui baixa sensibilidade,
89
mas ainda é bastante útil para amostras que não podem ser detectadas por outros
detectores, descritos e explicados a seguir.
Hoje em dia, o detector por espectroscopia no ultravioleta-visível (UV-Vis) é

um dos detectores mais populares em HPLC e EC, sendo seus princípios e montagem
apresentados no módulo QF3. Em resumo, ele detecta a quantidade de luz absorvida
por uma amostra, podendo monitorar uma única frequência ou várias frequências
instantaneamente.
O uso inicial de detectores na região do ultravioleta se mostrou conveniente pelo grande

número de substâncias detectáveis (como por exemplo, inúmeros tipos de ligações
duplas em moléculas orgânicas). Em alguns casos, contudo, é necessário proceder a
derivatização da amostra para que a substância a ser analisada se torne detectável.
Em equipamentos de HPLC, a célula comumente se constitui de uma câmara de quartzo

em série com a coluna cromatográfica, cujos fluxos para entrada e saída se solução são
perpendiculares à fonte de emissão de luz e ao detector.
As células para medidas espectroscópicas em CE apresentam algumas especificidades.

Em virtude do pequeno volume de soluções que fluem durante a separação, o
interfaceamento de uma célula externa se torna menos viável. Neste caso, uma porção
do capilar de separação é tratado de forma a ficar transparente, de modo a permitir a
passagem de luz para medida de absorbância.
Em virtude da frequente utilização de capilares de sílica protegidos com poliimida

para separações eletroforéticas, a exposição da janela de separação pode ser realizada
pela degradação térmica do polímero que protege o capilar (por queima), deixando a
superfície transparente exposta, apesar de mais frágil.
É importante ressaltar que não é possível realizar medidas na região do

ultravioleta, pois o capilar de sílica absorve a radiação incidida.
Outra implicação dos pequenos volumes utilizados em CE é a baixa sensibilidade que

o sistema apresenta em medidas espectroscópicas, pois o caminho ótico, ou seja, a
distância percorrida pela luz na amostra é muito pequeno. Para aumentar esse caminho,
duas alternativas foram propostas: a célula em bolha e a célula em Z.
A célula em bolha consiste no aumento do diâmetro de uma região do capilar, de forma

a aumentar o caminho percorrido pela luz durante a análise, conforme figura 75(a). Já a
célula em Z se trata de uma estratégia de curvamento do capilar fazendo com que a fonte
de luz e o detector se encontrem alinhados ao fluxo de solução, conforme figura 75(b).
90
Figura 75. Célula em Bolha e Célula em Z.
Fonte disponível em: <https://en.wikipedia.org/wiki/Capillary_electrophoresis#/media/File:Extendedpathlength.gif>.
Outra estratégia de detecção, mais específica e, frequentemente, mais sensível, é a

fluorimetria, cujos fundamentos e maiores informações acerca deste detector serão
apresentados na unidade QF3. Ela consiste na medida da intensidade da fluorescência
de uma amostra sob excitação se fonte de luz coerente. Sua montagem é similar ao
detector UV-Vis, como a principal diferença de que o sensor do detector não se encontra
alinhado com a fonte de luz e a cela, mas sim em ângulo (geralmente 90°), assim, mede
apenas a luz decorrente do processo de fluorescência, não de excitação.
Vale lembrar que, a fluorimetria é um fenômeno específico, o que limita a detecção de

um grupo limitado de compostos. Apesar desta limitação, vale ressaltar a fluorimetria
é uma das técnicas de detecção mais sensíveis que existem para HPLC e para CE,
sendo amplamente utilizada para análise de alimentos, drogas e, até mesmo, corantes.
Similarmente a espectroscopia UV-Vis, estratégias de derivatização para viabilizar a
detecção por esta técnica, são comumente empregadas.
Além das propriedades óticas, a medida de propriedades elétricas é muito relevante para
a detecção em métodos de separação para líquidos. O detector por condutividade
elétrica mede a capacidade de uma amostra em conduzir corrente elétrica sob ação
de um potencial alternado, seus fundamentos serão explicados no módulo QF3 deste
curso. Sua utilização é mais recorrente em cromatografia por troca iônica e CE.
Em separações cromatográficas com detecção condutométrica, a alta concentração de

íons na fase móvel pode aumentar a condutividade da amostra de modo a prejudicar a
detecção. Neste caso, é comum utilizar uma coluna ao final do sistema para supressão
dos íons, ocasionando a troca ou retenção de íons presentes na amostra antes da
detecção.
Em meados da década de 1990, uma nova arquitetura de detectores de condutividade

foi desenvolvida. Nesta, um par de eletrodos é posicionado ao lado de fora dos tubos nos
91
quais ocorrem o fluxo de separação e a condutividade das espécies internas é medida

por meio da aplicação de um potencial alternado em alta frequência. Este dispositivo é
chamado detector de condutividade sem contato capacitivamente acoplado
(Contactless Capacitively Coupled Conductivity Detector, C4D).
O C4D ganhou rapidamente espaço no mercado, sendo popular em especial para CE,
pela praticidade em interfacear o detector com o capilar de separação. Vale lembrar
que, para a eletroforese, baseada na separação por mobilidade iônica, este detector é
praticamente universal.
Outras medidas também utilizadas como forma de detecção acoplada são: amperometria
e a voltametria, cujos fundamentos serão explicados com mais profundidade no módulo
QF3. Nestas, um potencial é aplicado entre a solução eluída e um eletrodo de trabalho,
que induz reação de oxidação ou redução no analito com o qual entra em contato.
Como vantagens, estas medidas eletroquímicas apresentam alta sensibilidade e seletividade,

porém, a manutenção dos eletrodos e a quantidade restrita de analitos que, por eles,
podem ser detectados. Assim, estes métodos são utilizados em aplicações específicas.
Apesar da arquitetura da CE apresentar pontos com diferenças de potencial bem mais

elevadas do que aquelas utilizadas em medidas eletroquímicas, é possível realizar
medidas amperométricas e voltamétricas. Neste caso, a arquitetura do sensor é
especificamente elaborada para que o potencial de detecção não seja influenciado pelo
potencial de separação.
Outra técnica muito importante de detecção para HPLC e CE é a espectrometria

de massas. Considerações a respeito deste detector, apenas ressaltando-se aqui a
grande importância deste detector nos dias de hoje, sendo cada vez mais utilizado nos
laboratórios analíticos para as mais diversas aplicações.
Cromatografia Planar
Tradicionalmente, a detecção em cromatografia planar ou em camada delgada é realizada
visualmente, conforme apresentado no exemplo do início da unidade. Em casos que o
analito não seja diretamente observável, após eluição, estratégias de derivatização são
amplamente utilizadas, bem como também se realiza a observação da fluorescência da
placa quando submetida à radiação ultravioleta.
Para medidas quantitativas, a digitalização da imagem permite que os sinais observados

sejam medidos em valores numéricos de intensidade, como apresentado pelo exemplo
no início da unidade.
92
Guia Prático
de seleção e Unidade Vi
realização de
técnicas
Tão importante quanto conhecer os princípios de cada técnica e suas potencialidades é
saber selecionar métodos e controlar parâmetros para uma boa análise. Complementando a
apresentação conceitual realizada nas unidades anteriores, esta unidade traz um guia
prático para a utilização das técnicas de análise estudadas.
Tratando de cada uma das técnicas apresentadas e de seus aspectos centrais, as

informações são oferecidas como tabelas e figuras esquemáticas de fácil visualização.
Esta unidade engloba todas as técnicas abordadas (gravimetria, cromatografia e
eletroforese capilar) e orienta como realizar os procedimentos analíticos.
A opção de separar estas informações ao final da apostila vem de encontro com a

elaboração de material claro, prático e de fácil consulta, que pode ser levado a tiracolo e
visto sempre que conveniente, seja no laboratório, seja para avaliação de dados e perícias.
É importante ressaltar que, as técnicas apresentadas neste curso são complexas, a ponto
de existirem pesquisadores especializados em cada uma delas ou em sua operação,
dedicando seu trabalho em desenvolver e adaptar métodos para os mais diversos
analitos em diversas matrizes. Contudo, este guia é um ponto de partida para a seleção
e realização de um método, permitindo maior aprofundamento posterior, bem como
permite identificar eventuais problemas de análise e potenciais soluções.
Ressalta-se aqui que este guia, em nenhum momento e em nenhum aspecto, substitui
os guias e manuais originais de quaisquer equipamentos e insumos, de forma que
recomendamos contato direto com os fornecedores em caso de dúvidas ou maiores
informações a respeito de um componente específico.
93
Capítulo 1
Gravimetria e pesagens
A gravimetria é, nos dias de hoje, uma medida instrumentalmente muito simples.

Balanças analíticas modernas são simples de serem operadas, e possuem frequentemente
sistemas internos de calibração. De toda forma, alguns cuidados devem ser tomados
para garantir seu bom funcionamento.
Para garantir um funcionamento ideal da balança analítica, deve-se:
»» posicionar a balança em bancada rígida, não suscetível a vibrações. A

balança analítica deve permanecer em um lugar fixo do laboratório;
»» estar protegida de correntes de ar, seja de janelas ou portas, seja

ventilação mecânica provocada por equipamentos como ar condicionado
e eletrônicos com coolers e dispositivos similares;
»» operar em sala com temperatura constante, e distante de possíveis

fontes de calor e distante da irradiação direta do sol;
»» manter os níveis de umidade relativa do ar acima de 45% (para evitar

formação de cargas eletrostáticas) e abaixo de 60% (para evitar processos
de condensação durante a pesagem);
»» evitar aproximação de campos magnéticos e eletrostáticos.
Além da instalação, também deve-se cuidar alguns aspectos operacionais:
»» verificar o nivelamento da balança. Para tanto, a balança possui um

nível constituído de um pequeno poço de óleo com uma bolha, que deve
estar posicionada em meio ao círculo demarcado, e seu nível pode ser
ajustado por meio de niveladores nos quais ela se apoia.
»» a balança deve estar ligada e estabilizada há algum tempo. Se a balança

estiver desligada antes do uso, será necessário deixá-la ligada para
estabilização durante tempo definido pelo fabricante. A balança, fora de
uso, pode ser deixada ligada em modo Standby;
»» utilizar o menor frasco de pesagem possível;
»» não tocar frascos ou recipientes de pesagem diretamente com os dedos.

Resíduos naturais da pele influenciam no resultado de pesagem mesmo
quando limpa;
94
Guia Prático de seleção e realização de técnicas │ UNIDADE VI
»» posicionar o frasco ao centro do prato de pesagem;
»» garantir que a temperatura do frasco de pesagem e seu conteúdo estejam

iguais à temperatura ambiente;
»» Retirar o frasco do prato logo após a pesagem.
Entre pesagens, também é necessário:
»» calibrar regularmente o instrumento. A calibração é essencial após

mudança de posição ou nivelamento da balança;
»» manter a câmara de pesagem limpa e seca. Para tanto, recomenda-se o

uso de pincel de cerdas macias para remoção de pós e resíduos de pesagem.
Maiores detalhes a respeito da operação da balança analítica podem ser encontrados em

<http://chemkeys.com/br/2011/12/02/quimica-analitica-basica-os-instrumentos-
basicos-de-laboratorio/>, e nos manuais dos fabricantes dos equipamentos.
Apesar de aspecto chave na gravimetria, a pesagem não é o único ponto que deve
ser cuidado durante a análise. Para realização da gravimetria por precipitação, são
realizadas diversas etapas laboratoriais, apresentadas no fluxograma da figura 76. Ao
lado do fluxograma, colocam-se alguns campos para preenchimento manual, que podem
ser utilizados no estudo de métodos ou mesmo prática laboratorial, por meio de cópia
simples desta folha. Como referência inicial para a busca de métodos gravimétricos
indicados para análise elementares, indica-se a consulta de VOGEL, 2002.
O cálculo das massas molares de cada composto, possibilitando sua quantificação de

maneira precisa, pode ser realizado somando-se a massa de cada elemento presente
na molécula ponderada por suas quantidades, sendo as massas encontradas na tabela
periódica, apresentada na figura 77. Na tabela, pode-se encontrar o símbolo de cada
elemento, abaixo de seu nome, e a sua massa, acima do símbolo.
Por exemplo, para calcular a massa molar do fosfato de cálcio (Ca3(PO4)2), soma-se a
massa de cada elemento (Cálcio, fósforo e oxigênio) multiplicada pelo índice no canto
inferior esquerdo do composto. Os parênteses indicam multiplicação distributiva, como
na matemática. O cálculo se apresenta logo abaixo.
Figura 76. Cálculo da massa molar do fosfato de cálcio.
�� (�� )� = 3 ∙ �� + 2 ∙ (�� + 4 ∙ �� )
�� (�� )� = 3 ∙ 40,078 + 2 ∙ (30,97686 + 4 ∙ 15,9994)
�� (�� )� = 310,1829�� ∙ ��
95
UNIDADE VI │ Guia Prático de seleção e realização de técnicas
A tabela periódica possui uma série de outras informações relevantes que podem
ser consultadas. As informações nela contidas e consultas mais aprofundadas
estão fora do escopo deste curso.
Figura 77. Tabela periódica dos elementos químicos.
Fonte disponível em: <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Periodic_table_large-pt_PT.svg#/media/File:Periodic_table_large-pt_BR.svg>.
Figura 78. Fluxograma de Análise Gravimétrica por Precipitação.
Início
Condicionamento Se necessá rio,

(Preparo de amostra para quais reagentes utilizados:
favorecer precipitação seletiva) _________________________
Derivatizante adicionado:
Derivatização _________________________
(Adição de reagente seletivo para
formação de produto de interesse)
Filtração Tarar Tara do filtro (g):

Filtro _________________________
Lavagem Soluçã o para lavagem:

_________________________
Tratamento
Temperatura (°C) e tempo (h):
térmico
_________________________
Pesagem Final (g): ___________

Analito (g): ___________
Fonte: autor.
96
Capítulo 2
Cromatografia
A cromatografia é um processo de separação conceitualmente simples, mas a prática

analítica é bastante complexa devido às inúmeras possibilidades que podem ser
exploradas para a sua realização.
Este guia se baseia em referências da literatura direcionadas ao desenvolvimento de

métodos e resolução de problemas. Por um lado, as modalidades cromatográficas
apresentam semelhanças entre si e podem, em muitos aspectos, ser pensadas da
mesma forma. No entanto, como autores diferentes se dedicam a cada uma das técnicas
apresentadas, pontos de vista diversos frente a cada problema e soluções otimizadas
em cada situação são obtidas, de forma a não apenas cobrirem aspectos diferentes do
universo das separações, mas até mesmo se complementarem.
A figura 66 apresenta a composição de algumas modificações de sílica utilizadas

como fase estacionária em cromatografia de fase reversa, seja em HPLC ou em TLC.
De acordo com a tabela de eletronegatividade apresentada na unidade I, pode-se
entender, pelas estruturas apresentadas, quais modificações abaixo apresentam
maior ou menor polaridade.
Figura 79. Composições recorrentes para fases móveis em Cromatografia a Líquido.
Nome da Fase
R
Estacionária
-OH Sílica
-C8H17 C8 ou Octil
-C12H25 C12 ou dodecil
-C18H37 C18 ou Octadecil
-C3H6-CN Cianopropil
-C3H6-NH2 Aminopropil
-C3H6-O-CH2-CHOH-CH2OH Diol
-C4H8-camada quiral Quiral
Fonte: adaptado de WILSON I., et. al., 2000.
97
Cromatografia em Camada Delgada (TLC)

A Cromatografia em Camada Delgada é uma técnica extremamente importante em
diversos contextos de análise, mas desenvolver um método capaz de realizar separação
com suficiente resolução é um aspecto crítico de sua realização.
Apesar de sua simples execução, existe um grande número de variáveis que influenciam
decisivamente no processo de separação. A otimização sistemática destes parâmetros é
bastante útil para o trabalho do analista, e um fluxograma apresentando estas variáveis
e uma sequência otimizada de estudo se encontra na figura 80.
Figura 80. Otimização de parâmetros para TLC.
Seleção da Fase Estacionária (FE)
Seleção da Fase de Vapor (FV)
Seleção dos Solventes Adequados
Otimização da Fase Móvel (FM)
Seleção do Modo de
Desenvolvimento
Transferir FM para método adequado

de propulsão
Seleção dos Parâmetros de

Operação
Um fluxograma é apresentado na figura 81 para a escolha da fase estacionária.

De maneira similar a HPLC, a fase escolhida varia de acordo com as propriedades das
soluções, e algum conhecimento sobre a composição da amostra ajuda a definir qual
solução analítica deve ser utilizada.
98
Desenvolvimento múltiplo automatizado se refere a uma técnica de TLC na qual uma

série de placas similares são eluídas com solventes diferentes, permitindo a separação
da amostra.
Para problemas de determinação mais complexos, cada variável precisa ser otimizada.
Para maior aprofundamento no assunto indicam-se referências para consulta (WILSON
I. et. al., 2000).
Figura 81. Fluxograma para seleção de fase estacionária para TLC.
S
Problema para
Cromatografia
Planar?
Utilize
N S Desenvol-
vimento
Amostra contém
múltiplo
hidrocarbonetos
automati-
aromáticos ou compostos
Utilize HPLC zado!
isoméricos?
S Utilize
Amostra com grande Fase
variabilidade de Reversa
polaridade? (RF)
S
Amostra muito polar ou Utilize
contém homólogos? placas de
alumina
Utilize RF
S com
Amostra contém tampão
principalmente compostos aquoso ou
dissociáveis? parea-
mento
iônico
N
Utilize placas de
alumina
99
Cromatografia a líquido (HPLC)

A Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência é uma das técnicas de separação mais
versáteis da atualidade. A figura 82 apresenta uma divisão de suas modalidades, de
acordo com sua aplicação. É certo que esta não é uma tabela definitiva, visto que alguns
problemas específicos podem ser resolvidos por outras técnicas (cromatográficas ou
não), mas este fluxograma serve como um ponto de partida para a procura ou mesmo
desenvolvimento de métodos para analitos de interesse.
Figura 82. Classificação de métodos de HPLC de acordo com a amostra.
Peso Propriedades Propriedades Propriedades Tipo Fase Fase

Molecular Cromatografia Estacionária Móvel
Líquido- Sílica (I)

Sólido (II)
Solúvel em
Não Polar
Hexano
Fase C-18 (III)
Reversa (IV)
Insolúvel Fase C-8

Reversa (IV)
em água Moderada
mente Líquido-
Polar Sílica (I)
Sólido
Solúvel em
Metanol Líquido- Sílica (I)
Sólido Desativada
Fase Clorofórmio
Polar CN
< 2000 normal (V)
Fase (IV)
Reversa C-8
Fase (III)
Não Iônico Reversa C-18
(IV)
Troca Trocadora Tampão

Solúvel em Base Forte Iônica de Cátions Aquoso
água
Base Fase HHS em
Amostra Fraca Reversa C-18 água
Iônico
Ácido Troca Trocadora Tampão
Forte Iônica de Ânions Aquoso
Ácido Fase TBAOH

C-18
Fraco Reversa em água
Insolúvel Gel THF

Exclusão
em água Poliestiren Clorofórmi
> 2000 Gel de Água

Não Iônico Exclusão
Dextrano Metanol
ooSolúvel em
água Troca Gel de Tampão
Básico
Iônica Dextrano Aquoso
Iônico
Troca Gel de Tampão
Ácido
Iônica Dextrano Aquoso
Perceba que o fluxograma acima possui, para amostras enquadradas em cada uma
das classificações propostas, as condições iniciais para desenvolvimento do método.
Elas englobam o método cromatográfico, a coluna utilizada e até mesmo a mistura de
100
solventes a ser testada. Para questão de clareza na tabela apresentada, alguns solventes
são indicados com caracteres romanos, e sua correspondência se encontra na tabela 6.
Tabela 6. Fases móveis para desenvolvimento de HPLC (ver figura 69).
Mistura Fórmula
(I) n-heptano/Clorofórmio nC7H16/CHCl3
(II) tolueno C6H5CH3
(III) metanol/água CH3OH/H2O
(IV) acetonitrila/água CH3CN/H2O
(V) n-heptano/isopropanol nC7H16/PrOH
HSS Ácido Hexanosulfônico CH3(CH2)5SO3-H
TBAOH Hidróxido de Tetrabutilamônio N(C4H9)4OH
THF Tetrahidrofurano C4H8O
Como falado no Capítulo 3 e pode ser visto acima, grande parte das análises atuais são
realizadas com cromatografia por fase reversa, sendo em muitos casos um bom ponto de
partida para o desenvolvimento de método para amostra desconhecida. Segue, na tabela
7, uma sugestão de parâmetros iniciais para teste de método em amostra desconhecida.
Tabela 7. Parâmetros iniciais para desenvolvimento de método em HPLC.
Tamanho da Coluna 150 x 4,6 mm.

Tamanho de Partícula 5 um.
Fase Estacionária Octil ou Dodecaoctil.
Fase Móvel (A/B) Água/Acetonitrila.
Variável (Isocrática).
%B 5-100% B em 20 minutos (Gradiente).
5-80% B se A for tampão Fosfato (Gradiente).
Tampão 25 mmol L-1 Fosfato ou 0,1% Ácido Trifluoroacético.

Se necessário
Aditivos
(Especialmente na separação de compostos ionizados).
Fluxo 1-2 mL L-1.
Temperatura 40 °C.
Volume máximo de amostra 50 uL.
Massa máxima de amostra 100 ug.
A separação utilizando os parâmetros iniciais funcionam como um ponto de partida

para o desenvolvimento do método. De acordo com os sinais obtidos, mudanças
sistemáticas nos parâmetros de separação devem ser realizadas, de forma a atingir
101
uma boa resolução dos picos em um tempo mínimo (ou minimamente aceitável)
de análise.
Inicialmente se ajustar a proporção do primeiro solvente B escolhido, quer seja

Acetonitrila ou Metanol, buscando a melhor separação, trocando-se um solvente pelo
outro (substituindo B) caso ainda não se consiga uma boa resolução.
Na sequência, a troca da temperatura da coluna pode mudar o fator de resolução entre

picos (apesar de pouco explorada), e, em algumas soluções (especialmente ionizáveis),
mudar o pH da fração aquosa pelo uso de um tampão pode influenciar bastante na
qualidade dos resultados.
Figura 83. Sequência de otimização de parâmetros para HPLC.
Mo
Ti
do
O A po
ti va T A
T de
mi li E de di
zar pH H
ar M ti
F se
P Co vos
%B pa
B lu
ra
na
ção
(Aceto- (Aceto- (C8 = C18

nitrila ou nitrila ou > CN >
Metanol) Metanol) Amida >
Fenil)
Ainda é possível buscar melhores resultados utilizando aditivos de pareamento iônico,

por exemplo, ou misturar tetrahidrofurano (THF) a fase B, no entanto estes compostos
químicos podem dificultar o trabalho cromatográfico posterior pela interação destas
espécies com o equipamento e a coluna.
Caso a separação não seja possível mesmo com todos estes estudos, é provável que haja
outro modo de separação cromatográfica diferente da cromatografia em fase reversa
que deve funcionar melhor para a amostra estudada.
Os cromatogramas esperados, para qualquer das técnicas instrumentais apresentadas,

possuem picos de grande intensidade e pequena largura, com grande resolução entre
si e a separação ocorre em tempos relativamente curtos. Na prática cromatográfica,
alguns problemas podem tornar a separação pior, e muitas vezes não é fácil deduzir,
prontamente, os motivos. Alguns problemas recorrentes em HPLC são listados na
tabela 8, indicando prováveis motivos e sugestões para solucionar o problema.
102
Tabela 8. Problemas comuns encontrados em HPLC.
Problema Observado Fonte do problema Solução

Tipo de sílica Inapropriada. Usar sílica tipo B (para amostras alcalinas).
Formato de pico defeituoso Frita bloqueada ou Vazio na coluna. Substituir frita, lavar coluna.
Interações com os Silanois da coluna. Usar aditivos (aminas), mudar pH, usar colunas “end-capped”*.
Coluna inapropriada. Trocar coluna.
Coluna sobrecarregada. Injetar menos amostra.

Largura excessiva de pico
Massa molecular muito grande. Normal (não há porque se preocupar).
Picos mal resolvidos. Melhorar método de separação.
Fase móvel muito forte. Usar menor proporção de solvente B
Coluna muito fraca. Mudar de coluna para C18.

Tempo de retenção
Amostras ionizadas. Mudar o pH da solução A.
inadequado
Amostras muito polares. Mudar para Cromatografia de fase normal.
Gradiente começando com muita força. Começar gradiente com menor proporção de solvente B
Fase móvel muito fraca. Usar maior proporção de solvente B
Coluna muito retentiva. Mudar de coluna para C8, C4 ou CN.

Retenção excessiva
Amostras muito hidrofóbicas. Mudar para Cromatografia de fase normal.
Gradiente se encerra muito cedo. Parar gradiente em maior proporção de solvente B.
Faixa muito ampla de Ácidos e bases ou bases e neutros em solução. Utilizar pareamento iônico.
tempos de retenção Polaridades muito abrangentes para método isocrático. Usar gradiente de eluição.
Tempo de retenção muito curto. Aumentar fator de retenção.
Resolução Inadequada Baixa seletividade. Aumentar fator de seletividade.
Eficiência de separação muito baixa. Usar colunas maiores ou com partículas menores.
*”end-capped” column: coluna de sílica tratada para inibir ionização de grupos silanois
Cromatografia a gás (GC)

Projetada para análise de compostos voláteis, a cromatografia a gás é capaz de lidar,
salvo a regra, com analitos com peso molecular até 1250, e/ou com temperatura
máxima de ebulição a 425°C. Para resolver problemas de baixa estabilidade térmica
dos analitos, bem como para melhorar características de separação, existem uma série
de agentes derivatizantes no mercado.
A programação de temperatura e a escolha da fase estacionária são os parâmetros mais

importantes de serem otimizados para a separação, sendo a composição da fase móvel
e seu fluxo otimizados de acordo com características do detector, devido a sua baixa
influência no processo de separação.
103
Para problemas desconhecidos, pode-se realizar um experimento inicial com os

parâmetros apresentados na tabela 9. Além dos parâmetros iniciais, há indicação de
como proceder para melhorar a separação em etapa posterior.
Tabela 9. Guia para otimização de métodos de HPLC.
Fase estacionária »» Apolar poli(dimetilsiloxano) ou poli(dimetildifenilsiloxano) com 5%(mol) difenilsiloxano.

»» Comprimento 10 a 30m.
Coluna »» Diâmetro interno de 0,25 a 0,32 mm.
»» Espessura do filme 0,25 um (1,0 um para compostos voláteis).
Fluxo »» Otimizada de acordo com gás de arraste.
»» Programada, de 50°C a 300°C a 20°C/min. (ou máximo suportado pela coluna).
»» Observe as temperaturas de eluição e seus intervalos
Temperatura
›› se o intervalo for menor que 25°C, proceda análise por isoterma;
›› se o intervalo for maior que 25°C, proceda análise por programação de temperatura.
Otimização Isoterma »» Otimizar intervalo de fatores de retenção, encontrado plotando log(k)/(1/T)
»» Do programa original:
Otimização Temperatura 1. T inicial (Tmin) 20°C menor que a temperatura de eluição do 1° componente.
Programada 2. T final (Tmáx) 20°C maior que a temperatura de eluição do último componente.
3. Para misturas simples, aumento de 10°C/min, ou 1 a 2°C/min para misturas complexas.
»» Inicialmente alta (350°C)
Temperatura do Injetor/Detector
›› Ajustar para ~25°C > Tmáx separação.
Divisão de injeção »» Split, com razão entre 1:50 e 1:100.
Detector »» Universal (Detector por Ionização de Chama, FID).
Os parâmetros para otimização de método em cromatografia a gás são bastante

diferentes das cromatografias líquidas apresentadas. Salvo a regra, a influência da fase
móvel é muito pequena na separação, sendo, via de regra, otimizado apenas de acordo
com o detector a ser utilizado.
Para a composição da fase estacionária, existem diversas colunas comerciais de GC

capazes de interagir de maneira diferente com a amostra. O uso de colunas gás-sólido
em GC são menos abrangentes do que o gás-líquido, reutilizadas para análise de gases
fixos, moléculas orgânicas menores e eventualmente separação de isômeros e isótopos.
Tabela 9. Tipos de Colunas PLOT para GC.
Fase estacionária Aplicações típicas

Alumina Alcanos, alcenos, alcinos e aromáticos até C10. Halocarbonos C1 e C2.
Sílica Gel Hidrocarbonetos (C1 a C4), gases inorgânicos, éteres voláteis, ésteres e cetonas.
Carbono Gases inorgânicos e hidrocarbonetos (C1 a C5).
104
Fase estacionária Aplicações típicas

Carbonsieves Compostos de C1 a C6.
Peneiras moleculares (5A e 13X) Hidrocarbonetos (C1 a C3) em 5A e alcanos maiores em 13X (até C12). Não separa isômeros.
Polímeros porosos Orgânicos voláteis de baixa massa molecular
Em relação às colunas gás-liquido, existe uma variedade muito maior no mercado,

e a figura 82 mostra um dendrograma agrupando colunas gás-líquido comerciais
comumente encontradas, agrupadas de acordo com suas propriedades.
As colunas com ligações mais próximas são mais parecidas, sendo as interações
dipolo-dipolo e ligações de hidrogênio mais fracas para os grupos mais ao alto do
esquema. Os últimos dois grupos, separados dos da parte de cima, possuem maiores
interações dipolo-dipolo, porém menor afinidade para realizar ligações de hidrogênio.
Para testes de colunas diferentes, é mais interessante inicialmente realizar experimentos

com colunas de grupos diferentes, fazendo-se um ‘ajuste fino’ na escolha de colunas de
um mesmo agrupamento, ao final da otimização.
Como em HPLC, a GC também está sujeita a problemas e pode apresentar resultados

ruins, em condições não ideais. Alguns dos problemas mais recorrentes e relevantes são
apresentados na tabela 10.
Figura 84. Tipos de colunas WCOT para GC.
105
Tabela 10. Problemas Comuns em GC e respectivas soluções.
Interferência
Causa Possível Sugestão
no sinal
Determine causa do dano. Pode ser por impurezas do gás ou temperaturas excessivas.
Deriva de linha Dano à coluna
Troque a coluna
base (para cima)
Deriva no fluxo de gás Limpe ou troque o regulador de pressão. Ajustar pressão.
Saída da coluna distante do
Reinstalar a coluna. Atenção a distância especificada no manual.
detector (FID, NPD, FPD)
Vazamento de ar (gera ruído em
Eliminar vazamento.
ECD e TCD)
Gases incorretos ou vazão
incorreta de gases (FID, NPD, Verificar composição e pureza dos gases. Reajustar vazão.
Ruído FPD)
Injetor contaminado Limpar injetor. Substituir liner de entrada, septo e lacres.
Aquecer a coluna ao máximo especificado para eliminar impurezas. Cortar primeiros 10
Coluna contaminada
cm da coluna. Se não resolver, substitua a coluna.
Problemas no detector Limpar e substituir peças conforme necessário.
Problemas na placa do detector Consulte representante do cromatógrafo.
Pontos espúrios
Distúrbios elétricos Desligue o cromatógrafo e o mova. Se necessário, usar regulador de tensão.
(spikes)
Variações ambientais
Tete correlacionar com algum evento do ambiente.
(Temperatura, Tensão na linha)
Controle de temperatura
Ler temperatura do detector.
inadequado
Flutuação
Contaminação no gás de arraste Mudar o gás e/ou os filtros de purificação.
Injetor contaminado Limpar injetor. Substituir liner de entrada, septo e lacres.
Aquecer a coluna ao máximo especificado para eliminar impurezas. Cortar primeiros 10
Coluna contaminada
cm da coluna. Se não resolver, substitua a coluna.
Fonte disponível em: <https://www.chromservis.eu/i/gc-troubleshooting/g/hints-and-tips>.
106
Capítulo 3
Eletroforese capilar
A CE deriva dos procedimentos de eletroforese nos quais os analitos são separados

ao migrarem em meio a um gel. Apesar de seguir os mesmos princípios, a CE é uma
técnica muito mais versátil nos dias de hoje, e apresenta variações de modalidade que
aumentam seu potencial substancialmente. Uma lista destas modalidades e aplicações
é mostrada na tabela 11.
Atualmente, a modalidade de CE mais realizada é a CZE, que se vale da separação

de íons cujas mobilidades são diretamente relacionadas à sua relação carga raio. Os
parâmetros de operação iniciais sugeridos para desenvolvimento de método para esta
modalidade se encontram na tabela 12.
Tabela 11. Modos de operação de CE.
Modalidade da técnica Mecanismo de separação Aplicações

Eletroforese Capilar em Zona (CZE) Diferença na relação carga/raio. Íons e compostos ionizáveis.
Cromatografia eletrodinâmica micelar Distribuição de analitos entre eletrólito e micelas Compostos neutros solúveis em água, ácidos e
(MEKC) carregadas. bases fracas.
Migração por matriz porosa, por influência do tamanho e
Eletroforese em Gel (CGE) Proteínas, macromoléculas e fragmentos de DNA.
da carga da partícula.
Distribuição entre uma fase estacionária sólida e solução Compostos neutros solúveis em água, ácidos e
Electrocromatografia Capilar (EKC)
móvel de eletrólito. bases fracas.
Diferenças em pontos isoelétricos em um gradiente
Focalização Isoelétrica (IEF) Proteínas, compostos zwitteriônicos.
contínuo de pH.
Diferença de mobilidade eletroforética de íons
Isotacoforese (CITP) ‘sanduichados’ entre dois tampões contendo íons de Pré-concentração de íons.
maior e de menor mobilidade.
Tabela 12. Parâmetros iniciais para separações em CZE.
Parâmetro Configurações
Sílica fundida.
Coluna 30 a 50 cm comprimento.
50 a 75 um diâmetro interno.
Lavar com NaOH 0,1M 30 min.
Condicionamento Lavar com água por 15 min.
Lavar com tampão de corrida por 15 min.
Tensão Aplicada 10-30kV
Temperatura 20-25°C.
Injeção Hidrodinâmica (0,5 p.s.i. por 3s) ou Eletrocinética (2-5 nL).
Detecção UV-Vis 200-230nm ou condutométrica.
107
Como visto na unidade IV, a influência do pH do meio no grau de ionização dos analitos
permite a manipulação da mobilidade efetiva dos analitos de forma a favorecer a
separação. Desta forma, uma dos parâmetros de otimização mais importantes da CZE
é a composição do eletrólito suporte.
É possível encontrar, sem grandes dificuldades, diversas receitas para a preparação

de soluções tampão com diversos valores de pH, bem como é possível estimar a
mobilidade de diversas espécies com dados de literatura especializada. Contudo, existe
uma ferramenta gratuita para cálculos de pH de soluções e simulação de corridas de
CZE, o software PeakMaster.
Podemos observar diversos painéis relativos ao programa. Em “BGE constituents”

adicionam-se os componentes do tampão a ser utilizado, enquanto em “Analytes” se colocam
os analitos a serem analisados. Os dados adicionados podem ser manuais, colocando-se os
valores das constantes de dissociação uma a uma, ou pode-se utilizar os valores da base
de dados interna do programa, contendo já centenas de compostos. Além da composição
da solução, o programa ainda permite colocar outros parâmetros específicos da corrida
simulada, como potencial de separação e comprimento do capilar, por exemplo.
No painel inferior do programa, a corrida simulada é plotada após rodar o comando

“calculate”. A separação apresentada é uma simulação da análise de uma mistura de
lidocaína e cocaína, utilizando tampão TRIS.
Além dos efeitos ligados ao pH, outras substâncias podem influenciar a separação
em equilíbrios secundários, podendo ser utilizadas como aditivos em separações
eletroforéticas, como pode ser visto na tabela 13.
Este guia apresenta alguns aspectos importantes do desenvolvimento de métodos e

da prática analítica das técnicas utilizadas, servindo como uma base inicial para a
compreensão ou realização de análises. Caso haja interesse pelo aprofundamento nos
conteúdos aqui apresentados, pode-se consultar a bibliografia e webgrafia desta apostila.
Figura 85. Interface do software Peakmaster.
Fonte disponível em: <https://web.natur.cuni.cz/~gas/PeakMaster%205.3%20Release%202011.zip>.
108
Tabela 13. Aditivos para CE.
Aditivos Função
Minimizam interações com parede do capilar.
Sais inorgânicos
Induzem conformação de proteínas.
Éteres Coroa Formação de complexos de inclusão (mudando de espécies).
Modificam EOF.
Solubilizam orgânicos.
Solventes Orgânicos
modificam solvatação de íons.
reduzem interações com parede do capilar.
Ureia Complexante para proteínas por ligação de hidrogênio.
Íons Metálicos Modificam mobilidade de ânions e EOF.
Ácidos Alcanossulfônicos Modificam parede do capilar, formação de pares iônicos.
Polímeros de Celulose Modificam parede do capilar e EOF.
Surfactantes Catiônicos Inversor de fluxo de EOF.
Ácidos Orgânicos Formação de pares iônicos.
109
Referências
AFONSO, J. C.; SILVA, R. M. D. A evolução da balança analítica. Química Nova, v.

27, n. 6, pp. 1021–1027, 2004.
COLLINS, C. H. Introdução a métodos cromatográficos. TraduçãoCampinas:

Editora da UNICAMP, 1995.
COLLINS, C. H. Michael. Tswett e o “nascimento” da Cromatografia. Scientia

Chromatographica, v. 1, n. 1, pp. 7–10, 2009.
CHRISTIAN, G. D.; DASGUPTA, P. K.; SCHUG, K. Analytical chemistry. Tradução

. Hoboken, NJ: John Wiley and Sons, Inc., 2014.HARVEY, D. Modern analytical
chemistry. Boston: McGraw-Hill, 2000.
HARRIS, DANIEL C. Análise química quantitativa, 6. ed. Rio de Janeiro: LTC -

Livros Técnicos e Científicos Editora S.A., 2005.
HELLER, M.; VITALI, L.; SIQUEIRA, M. A.; SAKO, A. V. F.; PIOVEZAN, M.; MICKE,
G. A. Capillary Electrophoresis with UV Detection to Determine Cocaine on Circulated
Banknotes.
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110
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<https://web.natur.cuni.cz/~gas/>.
<http://dpuadweb.depauw.edu/harvey_web/eTextProject/version_2.1.html>.
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<https://www.chromatography.co/>.
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<https://www.chromacademy.com/>.
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111
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fBPOgb0rUe9LyKsJKglJIXSQfm3BoWu25yE0CsZLr3chaqcSQU7yMX2OnNJ
mMN-gfk~SOho6kdi7j5sK5XaiFJGifw~jypTq2YnbJ2v2m4Tm-oA_&Key-Pair-
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https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Periodic_table_large-pt_PT.svg#/media/
File:Periodic_table_large-pt_BR.svg>.
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Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,

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Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões

Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o

Para (não) finalizar

Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem

Já para análise de misturas complexas, frequentemente é necessário separar os

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»» Entender as aplicações possíveis para cada procedimento de análise,

»» Entender como é realizada a operação dos métodos pelo químico analítico

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Na prática analítica é essencial realizar procedimentos que permitam tratar moléculas de

Esta revisão, breve e resumida, não pretende substituir ou compensar um curso de

Muitos aspectos reativos só podem ser explicados considerando de que forma as

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Existem diversos tipos de Cromatografia, contudo todas exploram, principalmente,

As moléculas se ligam umas às outras por meio de interações relativamente brandas.

Pensemos em um composto puro como um conjunto de moléculas iguais. Se estas

Figura 1. Estrutura Química das moléculas de metano (à esquerda) e da água (à direita).

Fonte: composição e adaptação das seguintes imagens disponíveis: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/56/

Na molécula de água, um átomo de oxigênio se liga a dois átomos de hidrogênio

Já na molécula de metano, o carbono ao centro da molécula se liga a quatro hidrogênios

a polaridade de uma ligação. Os átomos que acomodam melhor cargas negativas, em

Figura 2. Série de Eletronegatividade.

F > O > N > Cl > Br > I > S > C > P > H

Vamos agora retomar o conceito de volatilidade e observar com base na polaridade.

Algumas substâncias possuem uma tendência tão grande em ceder ou em adquirir

O comportamento da formação de íons e seu comportamento são essenciais para

Por meio do conhecimento das propriedades da matéria, pode-se conhecer e prever o

As explicações contidas neste capítulo são resumos de temas bastante complexos.

É interessante notar que a movimentação das moléculas pode acontecer de diversas

Figura 3. Agitação térmica das partículas.

Fonte disponível em: <https://www.physics.utoronto.ca/~jharlow/teaching/everyday06/reading10.pdf>.

A temperatura se refere à energia média das partículas no meio. Um corpo que

Considerando a agitação térmica, todas as moléculas estão se movendo de forma aleatória.

Em uma questão quantitativa, percebemos que, nos pontos de maior concentração

Figura 4. Transporte de matéria por difusão.

Fonte: composição das seguintes imagens disponíveis em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/12/Diffusion.

Figura 5. Lei de Fick.

Nas técnicas cromatográficas de separação, o fluxo ocorre de modo laminar. Nele, o

Figura 6. Perfil de Fluxo Laminar.

Fonte: adaptado (redesenhado a partir) de disponíveis em: <https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8a/Fig.1_

O comportamento da matéria depende de algumas características intrínsecas de átomos

Figura 7. Estacionamento de carros em analogia a equilíbrio químico.

��(�) � � ��(�) � � � ��(�)

�� = � = 1,� ∙ 10�� ∙ l��

�� = � = 1,8 ∙ 10�� ∙ l��

� � [�� ] = �� = [�� ] � [�� ] = 10��

�� ) = �� ]) � �� ]) = 14

� ∙ [��] = �� = [�� ] ∙ [�� ] = 1,8 ∙ 10��

�� = �� ]� ∙ �� ] = 8,5 ∙ 10��

8,5 ∙ 10�� ∙ �

� � 1,� ∙ � 10�� ∙l��

�� = �� ]� ∙ �� ] = 8,5 ∙ 10��

8,5 ∙ 10�� = �� ∙ �0,1 � ��

� = �,� ∙ 10�� ∙ l��