KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG
1. Tính chất chung của alkaloid
1.1. Tính kiềm của alkaloid Tính chất hoá học
Alkaloid là các base tự nhiên thường gặp trong thực vật. Tính kiềm của các alkaloid thường
Tính base của yếu. Tính kiềm của các alkaloid thay đổi tuỳ theo cấu trúc của alkaloid, đặc biệt là bởi khả
alkaloid và năng nhận proton của nguyên tử nitơ trong phân tử. Cặp điện tử tự do của nitơ nếu được các
yếu tố ảnh hiệu ứng đẩy điện tử từ các nguyên tử, nhóm thế kế cận sẽ thể hiện tính kiềm mạnh hơn.
Ngược lại, tính kiềm của nó sẽ yếu thậm chí có những trường hợp gần như không còn thể
hưởng
hiện tính kiềm. Các alkaloid có tính kiềm yếu nên trong đa số các trường hợp, dung dịch
amoniac hay natri carbonat cũng có thể đẩy alkaloid ra khỏi muối của nó.
Do có tính kiềm nên các alkaloid có khả năng tạo muối với các acid. Đặc tính này của
alkaloid có thể được ứng dụng trong việc chiết xuất, định tính và định lượng các alkaloid
trong dược liệu hay trong các sản phẩm.
Khi tạo muối, các alkaloid có thể phân ly trong nước nên tan được trong nước. Hằng số phân
ly của muối ảnh hưởng nhiều tới tính tan của alkaloid nói chung. Các alkaloid có tính kiềm
mạnh hơn khi tạo muối sẽ có hằng số phân ly lớn hơn và tan nhiều trong nước và các dung
môi phân cực mạnh. Các alkaloid base yếu, trong dung dịch nước sẽ ít phân ly hơn nên khó
Muối, hằng số
tan và dễ bị các base mạnh hơn đẩy ra khỏi muối của nó cũng như dễ bị cạnh tranh trong dung
phân ly từ đó dịch để chuyển dịch cân bằng về phía không phân ly khó tan hơn trong nước. Đặc tính này
ảnh hưởng đến của hỗn hợp alkaloid trong cây có thể được sử dụng để chiết xuất hay phân tách các nhóm
nhiều tính chất alkaloid có tính kiềm khác nhau thành các phân đoạn theo gradient pH.
của alkaloid
Các alkaloid có nhiều hơn 1 nitơ có thể tạo các muối khác nhau trên các nitơ này. Thứ tự tạo
muối của các nitơ phụ thuộc vào tính kiềm của nó.
Alkaloid khi tác dụng với các acid có nhiều bậc như acid sulfuric, acid phosphoric có thể tạo
ra các loại muối khác nhau. Độ tan của các muối này trong nước cũng khác nhau ảnh hưởng
tới việc chiết xuất các alkaloid.
Một số chất có thể tạo ra các muối không tan với các alkaloid có thể dùng để định tính
alkaloid. Các chất này làm thành nhóm các thuốc thử chung (tạo tủa vô định hình hay tạo tủa
kết tinh) của alkaloid.
Tính chất do Ngoài tính kiềm, cấu trúc phức tạp của các alkaloid cũng làm cho chúng dễ phản ứng cộng
cấu trúc hợp hay bị oxy hoá tạo nên các sản phẩm màu. Một số phản ứng, thuốc thử tạo màu với các
phức tạp alkaloid, nhóm alkaloid nhất định có thể được ứng dụng trong định tính (nhóm các thuốc thử
đặc hiệu).
1.2. Tính tan của alkaloid Tính chất vật lý
Alkaloid là các base hữu cơ nên nó có thể tồn tại dưới 2 dạng: dạng base và dạng muối.
Ở dạng base, alkaloid là những chất thường kém phân cực nên tan tốt trong các dung môi hữu
tan ở cơ từ phân cực trung bình tới kém phân cực. Khả năng tan trong dung môi phụ thuộc nhiều
dạng base vào cấu trúc của alkaloid. Các alkaloid có phân tử lượng nhỏ, có nhiều nhóm chức phân cực,
có nitơ với tính base mạnh thường dễ tan hơn trong các dung môi phân cực. Một số chất còn
có thể tan một phần trong nước.
 Ở dạng muối, alkaloid có thể tan trong các dung môi phân cực mạnh và trong nước. Khả năng
hoà tan của muối alkaloid phụ thuộc vào bản chất của alkaloid, của acid tạo muối với nó và
phụ thuộc vào loại muối được tạo ra.
tan ở dạng Muối của các acid hữu cơ thông thường (acid citric, tartric, acetic…) với các alkaloid thường
muối dễ tan hơn muối của alkaloid với các acid vô cơ. Muối của alkaloid với các acid vô cơ như
phosphoric, sulfuric thường dễ tan hơn so với muối của acid nitric, acid acid hydrochloric.
Các muối trung tính của các acid nhiều bậc phân ly (acid phosphoric, sulfuric) thường tan tốt
hơn so với các muối acid.
Khả năng phân ly của muối trong dung dịch, các yếu tố ảnh hưởng tới cân bằng phân ly,
Yếu tố khác Nhiệt độ cũng là những yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hoà tan của các muối alkaloid trong
dung dịch.
2. Kiểm định dược liệu chứa alkaloid Định tính cần để ý đến thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu
Trong kiểm định các dược liệu chứa alkaloid, ngoài các chỉ tiêu kiểm định chung cho mọi
dược liệu, thường phải tiến hành định tính và định lượng các alkaloid trong dược liệu đó.
Định tính alkaloid có thể thực hiện trực tiếp trên các mô thực vật hay trên dịch chiết dược
liệu. Để định tính alkaloid trong vi phẫu thực vật, người ta quan sát tủa của alkaloid với thuốc
Định tính thử tạo tủa với alkaloid (thuốc thử Bouchardat) dưới kính hiển vi. Đôi khi có thể định tính
trực tiếp alkaloid trên mặt cắt dược liệu bằng thuốc thử đặc hiệu (định tính Mã tiền, Vàng
trực tiếp đắng). Để định tính alkaloid trong dịch chiết dược liệu, các thuốc thử chung, thuốc thử tạo
màu và sắc ký lớp mỏng là những phương pháp thường dùng. GC, HPLC, CE ghép nối với
các detector phổ học hiện đại được dùng để định tính mang tính chất đặc hiệu hơn cũng như
sử dụng trong định lượng.
Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid trong dược liệu như phương pháp cân, phương
pháp thể tích, phương pháp quang phổ. Tuỳ trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích hợp.
Định lượng Cũng có thể kết hợp các phương pháp phân tách (thường là các phương pháp sắc ký) với việc
định lượng (thường là các phương pháp quang phổ) để định lượng riêng một hay một vài
alkaloid nào đó trong hỗn hợp alkaloid toàn phần.
Kết quả định lượng có thể được biểu thị bằng:
- % của alkaloid toàn phần có trong dược liệu (phương pháp cân trực tiếp),
- % của alkaloid toàn phần có trong dược liệu quy theo một alkaloid chính
(phương pháp cân gián tiếp, chuẩn độ acid-base, quang phổ)
- % của một alkaloid nào đó có trong dược liệu (phương pháp kết hợp sắc ký – quang phổ).
3. Chiết xuất các alkaloid
Để chiết các alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật, người ta chủ yếu dựa vào khả năng hoà tan
Yếu tố của alkaloid trong các dung môi ở các điều kiện khác nhau. Mỗi loài cây có thành phần hoá
alkaloid học khác nhau, thành phần và tính chất các alkaloid trong đó cũng rất khác nhau nên việc
trong chiết chiết xuất tối ưu cho mỗi loại nguyên liệu cần được nghiên cứu cụ thể. Tuy nhiên, do có
xuất những đặc tính chung nhất định, các alkaloid có thể được chiết bởi các phương pháp chung
tuân theo những quy tắc chung về khả năng hoà tan của alkaloid.
Người ta có thể chiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng nhiều cách nhưng nhìn chung
có thể quy về 2 cách chính là:
 Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng alkaloid base.
 Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng muối.

Trong chiết xuất, để ý đến 2 yếu tố là tính chất (kiềm + tan) và dạng tồn tại của alkaloid trong cây
Mỗi dược liệu sẽ chọn 1 phương pháp chiết xuất điển hình
 Ở mỗi cách, việc sử dụng dung môi, tác nhân kiềm, kỹ thuật chiết xuất hay loại tạp có thể
Yếu tố khác nhau tùy thuộc vào đặc tính của alkaloid muốn chiết và tạp chất có trong dược liệu…
Trong một số trường hợp đặc biệt, tính chất của một số alkaloid trong môi trường acid hay
ngoại cảnh
kiềm có những khác biệt so với alkaloid thông thường, có thể dựa vào sự khác biệt này để
trong chiết chiết alkaloid và tách chúng ra khỏi các alkaloid thông thường. Ví dụ như chiết berberin dựa
xuất vào tính tan muối amoni bậc IV trong nước (kiềm), chiết morphin và các alkaloid có (thêm)
nhóm chức phenol bằng nước kiềm…
Một vài alkaloid có các tính chất vật lý đặc biệt có thể sử dụng phương pháp đặc biệt để lấy
alkaloid ra khỏi nguyên liệu:
 Phương pháp cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (chiết xuất nicotin từ Thuốc lá).
 Phương pháp thăng hoa (chiết xuất cafein từ Trà). Có thể chiết bằng phương pháp muối có tính kiềm yếu
Trong cây, alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối hoà tan với acid hữu cơ hoặc vô cơ hay
Chiết xuất dạng kết hợp với tannin. Để chiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu dưới dạng base, người ta
dựa vào thường kiềm hoá nguyên liệu để đẩy alkaloid ra khỏi muối của nó. Các kiềm tường dùng là
amoniac, natri carbonat. Natri hay calci hydroxid cũng được dùng nhưng cần lưu ý về tính
dạng tồn
kiềm mạnh của chúng và khả năng hoà tan hạn chế của calci hydroxid trong nước. Trường
tại trong hợp các alkaloid trong cây kết hợp với tannin, các kiềm yếu như amoniac, natri carbonat
dược liệu không thể giải phóng hết alkaloid ra khỏi phức với tannin, đặc biệt là với các alkaloid base
mạnh. Khi đó, calci hydroxid hay natri hydroxid được ưu tiên sử dụng.
Ứng dụng Tính tan khác nhau của dạng base và dạng muối alkaloid trong các dung môi được sử dụng để
tính chất để loại phần nào các tạp chất ra khỏi dịch chiết trước khi định tính, định lượng hay phân lập các
alkaloid tinh khiết bằng cách chuyển đổi alkaloid qua lại giữa môi trường dung môi hữu cơ và
phân lập tinh
nước. Alkaloid cũng có thể được tinh chế bởi khả năng được lưu giữ trên nhựa trao đổi
chế cation. Điều kiện định tính thuốc thử đặc hiệu là khá tinh khiết
Các phương pháp chiết dưới đây thường được sử dụng trong chiết xuất alkaloid từ nguyên
liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid (phương pháp 1-3). Tuỳ theo dược liệu, có thể chọn
quy trình chiết thích hợp nhất. Phương pháp 4 chỉ dùng cho cho các alkaloid dạng base có
khả năng cất kéo được theo hơi nước như nicotin, spartein, arecolin…

Ghi chú:
Thể tích dung môi chiết, thời gian chiết trong các phương pháp trên có thể thay đổi tuỳ thuộc
vào dược liệu và phương tiện sử dụng.
3.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm (Phương pháp 1)

Bột dược liệu (2-5 g)

1
- Kiềm hoá bằng NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm)
- Chiết bằng 20 ml-30 ml CHCl3 ở nhiệt độ phòng
(hoặc có thể chiết bằng Sohxlet)

Dịch chiết CHCl3

H2SO4 2 % (5 ml  2 lần)
Định tính bằng thuốc thử chung
Dịch chiết nước acid Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

NH4OH đậm đặc  pH 10 Chiết bằng CHCl3 (10 ml x 2 –3 lần)

Dịch chiết CHCl3 Định tính bằng phương pháp sắc ký

Bốc hơi tới cắn khô

Cắn alkaloid base Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Ghi chú: Dung môi hữu cơ cho chiết xuất có thể dùng CHCl3 hoặc CH2Cl2 (DCM)
3.2. Chiết bằng nước acid (Phương pháp 2)

Bột dược liệu (2-5 g)

2
20 ml dung dịch H2SO4 2 %
Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20 ml)

Dịch chiết nước acid

NH4OH đậm đặc  pH = 10

CHCl3 10 ml x 2 lần
Định tính bằng sắc ký
Dịch chiết CHCl3 Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

H2SO4 2 % (5 ml x 2 lần)
Định tính bằng thuốc thử chung
Dịch chiết nước acid Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu
3.3. Chiết bằng cồn acid (Phương pháp 3)

3 Bột dược liệu (2-5 g)

20-30 ml cồn có 5 % acid (sulfuric, hydrocloric, acetic)

Đun hồi lưu/BM 10 phút, lọc.

Dịch chiết cồn acid

Trung hoà đến pH 5-6 (nếu cần)

Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn
Hoà tan cắn trong nước nóng (10 ml x 2 lần), lọc.

Dịch chiết nước acid

NH4OH đậm đặc  pH 10

Chiết bằng 10 ml CHCl3
Định tính bằng phương pháp sắc ký
Dịch chiết CHCl3 Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Chiết với dd H2SO4 2% (5 ml x 2)

Định tính bằng thuốc thử chung

Dịch chiết nước acid Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Ghi chú: Có thể chiết bằng cồn thay vì dùng cồn acid nhưng sau khi bay hơi cồn (bước 2) thì phải
hòa tan bằng nước acid (H2SO4, HCl…) 2% và tiếp tục thực hiện bước 3 như trong sơ đồ trên.
3.4. Chiết bằng cất kéo theo hơi nước (Phương pháp 4)

Dược liệu (10 g)

4
Kiềm hóa bằng NaOH 10%
Cất lôi cuốn theo hơi nước
Hứng vào bình có chứa sẵn 5 ml H2SO4 10%

Định tính bằng thuốc thử chung

Dịch cất (50ml) Định tính với thuốc thử đặc hiệu

Kiềm hoá bằng NaOH tới pH =10

Chiết bằng CHCl3 (2 x 10 ml)

Dịch CHCl3

Bay hơi CHCl3

Cắn alkaloid Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Ghi chú: Quy trình này chỉ áp dụng cho các alkaloid có khả năng cất kéo theo hơi nước như nicotin,
spartein, arecolin…
 BÀI 12
KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID
Mục tiêu học tập
Sau khi thực hành bài “Kiểm nghiệm dược liệu chứa alkaloid”, sinh viên phải:
- Trình bày được các nội dung cần thực hiện để kiểm nghiệm một dược liệu chứa alkaloid.
- Kiểm nghiệm được các dược liệu: Mã tiền, Canh ki na, Cà độc dược, Trà, Vàng đắng.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Để kiểm định một dược liệu nói chung và dược liệu chứa alkaloid nói riêng người ta thường
thực hiện các nội dung sau:
- Khảo sát các đặc điểm cảm quan (hình dạng, thể chất, màu sắc và mùi vị).
- Kiểm định về mặt thực vật học và vi học (các đặc điểm giải phẫu, mô học).
- Kiểm định độ tinh khiết: độ ẩm, độ tro, tạp cơ học, dư lượng thuốc trừ sâu v.v…
- Kiểm định hóa học: định tính, định lượng các nhóm hoạt chất có trong dược liệu.
Ngoài ra, có những trường hợp người ta còn đòi hỏi kiểm định về mặt sinh học (tác dụng sinh
lý, xác định sự nhiễm nấm, khuẩn, côn trùng).
Mỗi loại dược liệu đều có các thành phần cấu tạo (giải phẫu hay hoá học) đặc trưng. Dựa vào
các điểm đặc trưng này, người ta có thể nhận diện chúng trong mẫu kiểm nghiệm để xác
nhận, đánh giá chất lượng của dược liệu và phát hiện sự giả mạo.
Trong kiểm định dược liệu chứa alkaloid về mặt hóa học, ngoài việc sử dụng các thuốc thử
chung của alkaloid để định tính, trong một số trường hợp, người ta còn có thể sử dụng những
phản ứng chuyên biệt (còn gọi là phản ứng với các thuốc thử đặc hiệu; thường là các phản
ứng màu) để phát hiện sự có mặt của một alkaloid hoặc một nhóm alkaloid đặc trưng của một
dược liệu.
Ví dụ: các phản ứng thalleioquin, erythroquinin… để phát hiện quinin, phản ứng
Vitali-Morin để phát hiện hyoscyamin, scopolamin v.v…
Các phản ứng với thuốc thử đặc hiệu, tuỳ theo phản ứng, có thể thực hiện trên cắn alkaloid,
trong dung môi hữu cơ hay trong dung dịch nước.
Nhiều phản ứng cho sản phẩm màu kém bền và chuyển nhanh từ màu này sang màu khác, vì
thế phải quan sát màu ngay khi cho thuốc thử.

II. THỰC HÀNH

1. Nguyên vật liệu thí nghiệm

1.1. Hóa chất-dung môi

- Acid sulfuric đậm đặc và 0,5% - Nước brom
- Acid nitric đậm đặc, acid hydrocloric đđ - Kali bicromat tinh thể
- Amoniac đậm đặc - Dung dịch kali ferocyanid 10%
- Dung dịch KOH 5% trong methanol (TT) - Cloroform/ dicloromethan, aceton
1.2. Dược liệu
- Mã tiền (Semen Strychnii) là hạt của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica L., Loganiaceae).
- Canh ki na (Cortex Cinchonae) là vỏ thân, vỏ rễ của một số loài Canh ki na (Cinchona
spp., Rubiaceae).
- Cà độc dược là lá (Folium Daturae), hoa (Flos Daturae) hay hạt (Semen Daturae) của cây
Cà độc dược (Datura metel L., Solanaceae).
- Trà (Folium Camelliae) là lá của cây Trà (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, Theaceae).
- Vàng đắng (Caulis Coscinii fenestrati) là thân của cây Vàng đắng (Coscinium fenestratum
(Gaertn.) Colebr., Menispermaceae).
2. Thực nghiệm
2.1. Kiểm nghiệm Hạt Mã tiền (Semen Strychnii)
Bộ phận dùng là hạt của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica L., Loganiaceae)
2.1.1. Bột dược liệu
Bột màu vàng xám nhạt, không mùi, vị rất đắng. Quan sát dưới kính hiển vi thấy:
- Lông che chở đơn bào dài, mảnh, rời hay dính thành bó, nguyên hay gãy thành nhiều đoạn
có dạng hình que, gốc lông phình to, có màng dày.
- Đám tế bào vỏ hạt gồm những tế bào rất nhỏ có màng dày, có ống trao đổi.
- Mảnh nội nhũ là những tế bào lớn, nhiều cạnh, màng hoá sừng dày trong suốt, có nhân rõ.
-

Mã tiền (Hạt)
1. Đoạn lông che chở bị gãy
2. Đám tế bào vỏ hạt
3. Mảnh nội nhũ
4. Tế bào vỏ hạt có mang lông
2.1.2. Chiết xuất:
Chiết 3 g bột dược liệu theo Phương pháp 3 (chiết bằng cồn hoặc cồn acid).

Bột Mã tiền (3 g)

30 ml cồn có 5 % acid acetic (hoặc acid sulfuric, hydrocloric,)

Đun trên bếp cách thủy 5 phút, lọc vào chén sứ.

Dịch chiết cồn acid

Trung hoà đến pH 6 (nếu sử dụng H2SO4)
Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến còn 1/5 thể tích
Thêm 20 ml nước, đun trên BM (khuấy kỹ) để nguội, lọc lọc.

Dịch chiết nước acid

NH4OH đậm đặc → pH 10

Chiết bằng CHCl3 x 2 lần (20, 10 ml)
Chia vào 2 chén sứ để định tính
Dịch chiết CHCl3 strychnin và brucin

Chiết với dd H2SO4 1-2 % (5 ml x 2)

Dịch chiết acid Định tính với thuốc thử chung

2.1.3. Định tính

a. Định tính với thuốc thử chung
Lấy 1/2 lượng dịch CHCl3 (hoặc CH2Cl2) vào bình gạn và lắc với nước acid sulfuric 1-2 % (5
ml × 2 lần). Tách lấy lớp nước acid (lớp trên) chia vào 5 ống nghiệm, mỗi ống 1-2 ml dịch
chiết nước acid. Cho riêng rẽ vào mỗi ống nghiệm 1-3 giọt thuốc thử lần lượt là Bouchardat,
Valse-Mayer, Dragendorff, Bertrand và Hager. Lắc đều, quan sát và nhận định kết quả. Nếu
cần có thể cho thêm 1-2 giọt thuốc thử nữa.
Nhận định kết quả:
(-) : Dung dịch vẫn trong
(+) : Dung dịch đục mờ nhưng không lắng xuống
(++) : Dung dịch đục, có tủa lắng xuống sau vài phút
(+++) : Có tủa lắng xuống ngay. Dung dịch đục khi thêm giọt thuốc thử thứ 2
(++++) : Có tủa nhiều
b. Định tính bằng các phản ứng đặc hiệu
Cho dịch CHCl3 (hoặc CH2Cl2) còn lại vào 1 bình nón khô, thêm một ít Na2SO4 khan, lắc đều,
nếu thấy dịch CHCl3 (hoặc CH2Cl2) trong là được. Gạn dịch CHCl3 (hoặc CH2Cl2) vào 2 chén
sứ, cô cách thủy tới cắn khô.
Định tính strychnin: Nhỏ vào chén sứ thứ nhất 1 giọt H2SO4 đậm đặc ở vị trí cắn alakloid, thả
vào chén một vài hạt K2Cr2O7 (bên cạnh giọt H2SO4). Dùng đũa kéo hạt tinh thể K2Cr2O7
ngang qua giọt acid lên thành chén sứ, vết kéo sẽ có vệt màu tím rồi chuyển sang hồng vàng
và biến thành nâu đen.
Định tính brucin: Nhỏ một giọt HNO3 đđ vào cắn trên chén 2 sẽ có màu đỏ cam.
2.2. Kiểm nghiệm lá trà Folium Camelliae
Dược liệu là lá của cây Trà (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze = Thea chinensis L., Theaceae)
2.2.1. Bột dược liệu:
Bột màu xanh lục hay lục nâu, mùi trà. Quan sát dưới kinh hiển vi thấy:
- Mảnh biểu bì dưới mang lỗ khí
- Mảnh biểu bì trên gồm những tế bào xếp khá đều đặn
- Thể cứng có hình dạng thay đổi, vách dày có khoang trao đổi.
- Lông che chở đơn bào dài và nhọn.
- Tinh thể calci oxalat hình cầu gai.

Trà (Lá)
1. Mảnh biểu bì mang lỗ khí
2. Thể cứng (cương thể)
3. Lông che chở đơn bào
4. Mảnh biểu bì trên
5. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
6. Mạch vạch

2.2.2. Chiết xuất

a. Chiết bằng dung môi:
Bột Trà (5 g)

50 ml nước sôi
Đun BM 15 phút, lọc vào bình gạn

Dịch chiết nước

Lắc với CHCl3, (10 ml x 2), gạn lấy lớp dưới, chia làm 2 phần

½ Dịch CHCl3 (A) Định tính caffein bằng phản ứng Murexid

Lấy 1/2 lượng dịch CHCl3 còn lại, cô cắn,

Hòa cắn trong acid H2SO4 2 %, lọc
Lắc với H SO 1-2% (5 ml x 2 lần)

Dịch acid (B) Định tính bằng thuốc thử chung

b. Chiết cafein bằng phương pháp thăng hoa:

Cân khoảng 10 g bột lá Trà vào một chén sứ, kiềm hoá bằng nước vôi trong cho vừa đủ ẩm,
để yên 30 phút. Đun nóng trên bếp cách cát và dùng đũa thuỷ tinh đảo đều cho bay hơi hết hơi
nước (hết khói trắng đục).
Khi đã hết hơi nước, đậy lên chén một phễu thủy tinh bên trong có các tua giấy nhỏ rủ xuống
từ cuống phễu và tiếp tục đun đều cho tới khi hết khói trắng (không đun quá mạnh làm dược
liệu cháy cho khói xanh).
Để nguội, lấy phễu ra và gạt những tinh thể cafein (dạng hình kim mảnh bám vào các tua
giấy) vào một chén sứ khác và làm định tính bằng phản ứng Murexid như trên.
2.2.3. Định tính:
a. Định tính với thuốc thử chung:
Thực hiện như phần 2.1.a. với dịch chiết acid.
b. Định tính bằng các phản ứng đặc hiệu
Phản ứng Murexid: Dịch CHCl3 (hoặc CH2Cl2) (A) được làm khan với một ít Na2SO4 khan
trong 1 bình nón khô rồi cho vào một chén sứ nhỏ. Bốc hơi dịch CHCl3 (hoặc CH2Cl2) trên
bếp cách thuỷ đến cắn khô. Nhỏ lên cắn 3 giọt HCl đậm đặc và 2 giọt H2O2 đậm đặc, tráng
đều. Bốc hơi hỗn hợp này trên bếp cách thuỷ trong tủ hốt đến cắn khô. Thêm vào cắn vài giọt
NH4OH đđ. sẽ xuất hiện màu đỏ tím.
2.3. Kiểm nghiệm Vàng đắng (Caulis Coscinii fenestrati)
Bộ phận dùng là thân cây Vàng đắng (Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.,
Menispermaceae).
2.3.1. Bột dược liệu:
Bột có màu vàng, không mùi, vị đắng. Quan sát dưới kinh hiển vi thấy:
- Mảnh bần tế bào hình chữ nhật, vách dày, xếp đồng tâm và xuyên tâm.
- Sợi (có loại vách dày, có loại vách mỏng)
- Sợi vách mỏng có chứa nhiều hạt tinh bột.
- Khối nhựa vô định hình, màu vàng.
- Đám tế bào mô cứng hình chữ nhật hay hình nhiều cạnh có vách dày, có ống trao đổi.
- Mảnh mạch điểm
- Hạt tinh bột hình nhiều cạnh có vách dày, có tễ là hình chấm hay hình sao.
- Mảnh mô mềm tế bào hình chữ nhật, vách mỏng, xếp xen kẽ.

1 Vàng đắng (Thân)

4
3
1. Mảnh bần tế
2. Sợi (có loại vách dày, có loại vách mỏng)
3. Sợi vách mỏng có chứa nhiều hạt tinh bột.
2 4. Khối nhựa
5
7 5. Đám tế bào mô cứng
6. Mảnh mạch điểm
8
7. Hạt tinh bột
6
8. Mảnh mô mềm

2.3.2. Chiết xuất:

Cho vào 1 bình nón 50 ml 0,5 g bột Vàng đắng và 20 ml dung dịch acid sulfuric 0,5 %. Đun
 nóng trên bếp cách thủy trong vài phút. Lọc qua giấy lọc, lấy dịch chiết acid để làm các phản
ứng định tính với thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu.
2.3.3. Định tính
a. Định tính với thuốc thử chung:
Thực hiện như phần 2.1b. với dịch chiết acid.
b. Định tính berberin trong Vàng đắng:
Cho vào 1 ống nghiệm 3-4 ml dịch chiết nước acid trên và nhỏ vào từng giọt nước Javel, lắc
nhẹ, dung dịch sẽ có màu đỏ máu. Nếu cho thừa nước Javel thì màu đỏ này sẽ biến mất.
2.4. Kiểm nghiệm Cà độc dược (Folium et Semen Daturae) Bộ phận khác nhau:
1. Lá
Bộ phận dùng là lá hay hạt của cây Cà độc dược (Datura metel L., Solanaceae) 2. Hoa
2.4.1. Bột dược liệu (Lá cà độc dược) 3. Hạt
-> Hoa có hàm lượng cao nhất
Bột màu xanh lục hay lục nâu. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: nhưng chiết xuất bằng lá và hạt
vì hoa sinh khối của nó thấp
- Mảnh biểu bì mang lỗ khí. - Mảnh mô mềm hình giậu.
nhưng trong định tính thì thường
- Lông che chở đa bào có eo thắt - Lông tiết chân đơn bào, đầu đa bào dùng hoa
- Tinh thể calci oxalat hình cầu gai - Mảnh mạch

Cà độc dược (lá)

1. Lông che chở đa bào có eo thắt hoặc không
2. Lông tiết đầu đa bào (rất ít) Alkaloid:
3. Mảnh biểu bì mang lỗ khí 1. Scopolamin -> pKa: 7.5 - 7.7
2. Hyoscyamin -> pKa > 9
4. Tinh thể Calci oxalat Chuyển thành Atropin khi pKa > 10.2
5. Mảnh mạch vạch Tan trong dung môi hữu cơ kém pc
ở dạng base, nước acid, cồn, cồn acid

2.4.2. Chiết xuất Kiềm hoá để đưa hết về dạng base

Chiết theo Phương pháp 1 (chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm). Na2CO3 làm ẩm
để dược liệu
Lấy 5 g hoa (hoặc 10 g lá) Cà độc dược cho vào chén sứ, kiềm hoá bằng 5 ml dd. Na2CO3 5%, trương nở, dung
Sử dụng thêm để yên 15 phút (thỉnh thoảng đảo nhẹ) cho bột tương đối khô tơi và chuyển toàn bột bột vào môi dễ thấm vào
H2SO4 để loại bình nón nút mài. Chiết bằng CHCl3 (hoặc CH2Cl2) 2 lần (30, 10 ml) (nếu chiết alkaloid trong tế bào -> chiết
tạp phân cực lá thì lượng dung môi tăng gấp đôi), lắc kỹ khoảng 10 phút (thỉnh thoảng mở nắp), lọc qua được nhiều hơn
bằng CHCl3 bông vào bình gạn, lắc với nước acid H2SO4 2 % (10 ml  2 lần), gạn lấy dịch acid (lớp trên),
chia làm 2 phần. Lắc phân bố dịch CHCl3 với H2SO4 thì alkaloid dạng base chuyển sang muối tan trong nước
2.4.3. Định tính Loại bỏ lớp Chloroform lấy dịch acid vì lớp acid trên do tỉ trọng bé hơn Chloroform
Lắc phân bố 2 lần để chiết được nhiều hơn
a. Định tính với thuốc thử chung: Alkaloid phải ở dạng muối tan vì:
1. Thuốc thử alkaloid kém bền trong môi trường kiềm
Thực hiện như phần 2.1b. với 1 phần dịch chiết acid. 2. Alkaloid không tạo tủa trong môi trường trung tính hoặc
b. Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu acid yếu
3. Lẫn ít tạp
Phần dịch acid còn lại được kiềm hoá bằng Na2CO3 5 % đến pH 10, chiết alkaloid base bằng

Khi cho vào cắn 5 giọt HNO3 đậm đặc, acid sẽ cắt đứt liên kết ester trong phân tử alkaloid tạo tropic acid và tropine base
Tropic acid khi tác dụng với acid HNO3 đậm đặc thì vòng thơm của tropic acid được gắn một nhóm NO2 vào vị trí para. Ngoài ra, nhóm
NO2 cũng gắn vào vòng thơm trên phân tử alkaloid sinh ra 4-nitroatropin. Các hợp chất nitro này có màu vàng.
Hoà tan cắn của các hợp chất nitro với acetone sau đó tác dụng với KOH 5% CH3OH. Cả 2 hợp chất nitro này đều cho màu tím đặc trưng
khi tác dụng với kiềm mạnh, do tạo ra những anion mesomeri bền vững.
 CHCl3 (hoặc CH2Cl2) (10 ml  2 lần). Làm khan dịch CHCl3 bằng Na2SO4 khan, cho vào
chén sứ, bốc hơi đến cắn khô Thuỷ phân giải phóng acid tropic
Phản ứng Phản ứng Vitali-Morin: Thêm vào cắn 5 giọt HNO3 đậm đặc rồi đun trên bếp cách thủy đến
dùng để định cắn khô (làm trong tủ hốt).
Màu tím hoa cà khá bền trong aceton
tính acid Để nguội, thêm vào chén 3-5 ml aceton, 2-3 giọt KOH 5 % trong MeOH, lắc đều, sẽ xuất hiện
tropic màu tím (hoặc màu tím hoa cà) không bền.
2.5. Kiểm nghiệm Canh ki na
Bộ phận dùng là vỏ thân một số loài Canh ki na (Cinchona spp., Rubiaceae).
2.5.1. Bột dược liệu Hợp chất alkaloid quinine
Bột màu vàng đỏ hay nâu đỏ, vị đắng. Quan sát dưới kính hiển vi thấy:
- Sợi thuôn dài, hơi nhọn ở hai đầu, thành rất dày, có ống trao đổi.
- Mảnh bần màu nâu nhạt.
- Mảnh mô mềm chứa tinh thể calci oxalat.
- Hạt tinh bột rất nhỏ.

Canh ki na (vỏ thân)

1. Mảnh bần
2. Mảnh mô mềm
3. Sợi có vách dày
4. Đám tinh thể calci oxalat dạng cát
5. Khối màu

2.5.2. Chiết xuất

Phương pháp 1: Cho 1 g bột Canh ki na vào bình nón nút mài 100 ml, làm ẩm vừa đủ bằng
dung dịch NaOH 10 % (nhỏ từng giọt NaOH 10 %, dùng đũa trộn đều cho đến khi dược liệu
Chiết với dung chuyển màu nhưng vẫn còn tơi xốp), để yên 15 phút, thêm vào bình nón 30 ml CH2Cl2 (hoặc
môi hữu cơ CHCl3), đậy nắp và lắc đều trong 15 phút; gạn và lọc lấy dịch chiết CH2Cl2 (hoặc CHCl3) cho
vào bình lắng gạn đã có sẵn 10 ml H2SO4 0,5 %. Lắc kỹ và gạn lấy lớp dịch acid (dịch A, lớp
trên) làm các phản ứng định tính.
Chú ý:
- Có thể chiết alkaloid trong vỏ Canh ki na 2 lần, mỗi lần 30 ml với dung môi như trên.
- Phần dịch CH2Cl2 (hoặc CHCl3) sau khi chiết với acid sulfuric nên giữ lại và có thể chiết tiếp với
acid sulfuric 0,5% để làm phản ứng trong trường hợp thiếu dịch acid.
Phương pháp 2: Cho 1 g bột Canh ki na vào bình nón 100 ml, chiết bằng cách đun nóng trên
bếp cách thủy (10 phút) với 30 ml dung dịch H2SO4 5 %, lọc lấy dịch acid vào 1 bình gạn. Để
nguội, kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch NaOH 10 % đến pH 10, lắc với CH2Cl2 (20 ml × 2
lần), gạn lấy dịch CH2Cl2 (lớp dưới). Cho dịch CH2Cl2 vào 1 bình gạn, lắc với H2SO4 0,5 %
(10 ml x 2 lần). Tách lấy lớp dịch acid (dịch A, lớp trên) làm các phản ứng định tính với
thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu.
2.5.3. Định tính
a. Định tính với thuốc thử chung
Thực hiện như phần 2.1.b. với dung dịch A.
b. Định tính bằng các phản ứng đặc hiệu
- Sự phát quang của muối quinin
Nguyên tắc: Dung dịch muối quinin với acid có oxy sẽ cho huỳnh quang xanh dưới ánh sáng
tử ngoại. Sự hiện diện của các acid không có oxy sẽ làm mất huỳnh quang này.
Lấy 1 ml dịch A pha loãng với 5 ml nước cất trong một ống nghiệm lớn. Soi dưới đèn UV
365 nm hay ánh sáng mặt trời, quan sát huỳnh quang theo hướng vuông góc với phương của
ánh sáng tới. Ghi nhận màu sắc huỳnh quang. Chia dịch chiết trong ống nghiệm làm 2, một
ống cho thêm 1 giọt HCl 10 %, quan sát huỳnh quang 2 ống. Mất huỳnh quang xanh khi cho acid
- Phản ứng Thalleioquin Xanh
Cho 2 ml dịch A (lấy bằng pipette) vào ống nghiệm, thêm từng giọt nước brom bão hòa mới
pha (làm trong tủ hốt), lắc đều, thêm cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt thì ngưng.
Thêm tiếp 1 ml NH4OH đậm đặc (cho một lần và thật nhanh) sẽ có màu xanh lục đến xanh
ngọc.
- Phản ứng Erythroquinin Đỏ
Cho 2 ml dịch A (lấy bằng pipette) và 1 ml CHCl3 vào 1 ống nghiệm, thêm từng giọt nước
brom bão hòa mới pha (làm trong tủ hốt), lắc nhẹ chỉ để dung dịch brom tan vào lớp dịch A
phía trên, thêm nước brom bão hòa cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt thì ngưng. Thêm
tiếp 2-3 giọt kali ferocyanid 10 %, lắc nhẹ. Thêm nhanh 2-3 giọt NH4OH đậm đặc, bịt miệng
ống nghiệm và lắc theo chiều thẳng đứng (Yêu cầu thao tác nhanh). Dung dịch sẽ có màu
hồng, lớp CHCl3 bên dưới sẽ có màu đỏ bền.
- Thử nghiệm Grahé:
Cho khoảng 0,5 g bột Canh ki na (mịn, khô) vào một ống nghiệm lớn và khô. Đun nóng trên
đèn cồn sẽ thấy khói màu đỏ tím bốc lên. Để nguội, hơi này sẽ ngưng tụ lại thành những giọt
màu tím.
2.6. Định tính alkaloid trong thuốc lá Nicotin có N ion nên có tính chất như thế nào? Chiết xuất bằng cách nào?
Lấy 10 g lá Thuốc lá, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10 %, nạp vào bình chiết và chiết bằng
cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (Phương pháp 4), hứng dịch cất bằng 1 bình nón có chứa sẵn 5
ml acid sulfuric 5 %. Lấy dịch nước acid làm phản ứng với thuốc thử chung như phần 2.1.b.

III. GỢI Ý THẢO LUẬN, CÂU HỎI

1. Ý nghĩa của việc làm ẩm dược liệu với một lượng vừa đủ kiềm khi chiết alkaloid base
bằng các dung môi hữu cơ kém phân cực?
2. Các giai đoạn nào cần chú ý khi thực hiện phản ứng Thalleioquin, Erythroquinin?
3. Giải thích phản ứng định tính berberin ở phần 2.5.b?