Molekularna biologija s genetičkim inženjerstvom

Skripta prema predavanjima i seminarima

ak. god. 2020./2021.

Skripta prati slijed predavanja, gradivo seminara ubačeno je tamo gdje mi se činilo da paše.
Žuto su označena Laucova pitanja za koja kaže da ih voli postavljati na usmenom (usmenom
kojeg nema.. al ok, recimo da su to najbitnije stvari koje treba shvatit i zapamtit).
Ostale boje su tu jer mi se tako htjelo :D
Sretno s učenjem!
1. predavanje: Molekularna biologija u stvaranju novih lijekova
Suvremena medicina pokušava razumjeti patološke procese na molekularnoj razini. Mijenja se
pristup gledanja bolesti - više nije cilj liječiti simptome bolesti, već sam uzrok, provesti
preventivnu terapiju prije prve pojave simtoma (dg na temelju određenih biomarkera) ili nakon
pojave bolesti koristiti reprogramirajuće terapijske metode kojima je cilj vratiti tijelo u
homeostazu tako da se bolest izliječi u akutnoj fazi te se spriječi razvoj kroničnih bolesti.
Farmakogenomika - ispituje ulogu gena koji određuju učinkovitosti i toksičnost lijekova na
pojedinca
Farmakoglikomika - osim gena u obzir uzima utjecaj epigenetike i okoliša (epigenetika proučava
nasljedne varijacije u aktivnosti gena; to se odnosi na promjene u ekspresiji gena, ali ne i na
promjene u DNA lancu)

Biološki lijekovi tvari su napravljene od živih organizama ili njihovih produkata koje se koriste u
prevenciji, dijagnostici ili liječenju bolesti. Uključuju protutijela, hormone, cjepiva i dr. slične
molekule. Većina bioloških lijekova strukturno su glikoproteini kod kojih glikanski dio ima
značajan utjecaj na njezinu farmakokinetiku i farmakodinamiku. Danas tržištem u Europi
dominiraju biološki lijekovi (ne prema količini prodanih lijekova, već prema novčanoj dobiti).
Od rekombinantnih proteina koriste se različiti hormoni (inzulin, GH), lijekovi (EPO, tkivni
aktivator plazminogena - TPA), rekombinantna cjepiva (hepatitis B)… Široka je upotreba
protutijela, danas ih je više od 100 u kliničkim ispitivanjima, tisuće su u pripremi. Sve više se
proučava i genska terapija.

mRNA cjepiva ne sadržavaju Ag, već daju informaciju o Ag. Molekule mRNA uklapaju se u
liposome kako bi im bio omogućen ulazak u naše stanice, u stanici iskorištavaju našu mašineriju
za sintezu Ag za kojeg nose uputu, a zatim naš organizam reagira na taj stvoreni Ag i razvija se
imunost (i stanična i humoralna).
Prva cjepiva s ovom tehnologijom cjepiva su za koronavirus Moderne i BioNTecha. Kod njih je
mRNA dodatno modificirana kako bi bila stabilnija.

Herceptin (Trastuzumab; lijek za rak dojke s povećanom ekspresijom HER2 receptora)

monoklonsko je pt na HER2 receptor (jedan od receptora za epidermalni faktor rasta).
Hercipdin djeluje tako da se specifično veže na HER2 receptore i inaktivira ih čime uništava ne
samo glavni tumor, već i metastaze. Međutim, lijek je djelotvoran tek u 20-30% slučajeva jer je
nužno da je tumor uzrokovan povećanom ekspresijom HER2 receptora, a ne nekim drugim
mehanizmom. Prije liječenja potrebno je genotipizirati tumor! - imunohistokemija, PCR, FISH
Imunogeničnost - prepoznavanje datog lijeka kao stranog Ag u organizmu zbog čega se razvija
imunosna reakcija; može se dogoditi da lijek pri prvoj upotrebi ima očekivano djelovanje, a kod
sekundarne primjene nema zbog pojačanog imunosnog odgovora.
U ranim fazama istraživanja pt su se dobivala iz miševa (lijekove nazivamo mišji -omabi; omab
je nastavak na ime lijeka) i ona su bila izrazito imunogena i stoga vrlo neupotrebljiva. Procesom
humanizacije, zamjenom dijelova mišjih Ig dijelovima humanih Ig, dobiveni su kimerni -ximabi -
svi dijelovi Ig osim onog koji služi za prepoznavanje Ag zamjenjeni su humanom skevencom.
Sljedeći stupanj u razvoju su humanizirani -zumabi - gotovo cijeli Ig grade humane sekvence,
iznimka je slijed od svega nekoliko AK u mjestu za prepoznavanje Ag.
Za imunoglobuline tradicionalno se navodi samo klasa i sublklasa, ali to nije jedina i konačna
podjela. Kod imunoglobulina poznati su različiti alotipovi. Alotipovi IgG predstavljaju različite
varijante IgG koje se razlikuju minimalno, za svega jednu AK u teškom lancu. Oni su se pojavili
kao posljedica nagomilavanja mutacija tijekom evolucije. U primjeni IgG kao lijekova potrebno
je da lijek bude alotipom kompatibilan s pacijentom, u suprotnom lijek je imunogen. Mijenjanje
alotipa nije problem, najveći je pothvat otkriti koji alotip odgovara kojem pojedincu (geografsko
određivanje - razlike u učestalosti alotipova u Europi i Aziji).
Glikolizacija Fc regije mijenja strukturu i funkciju protutijela. Kod imunoglobulina upravo su
glikanski dijelovi odgovorni za vezivanje na Fc receptore (Fc receptor određuje što će se
dogoditi s Ag nakon vezivanja).
Ublituximab prvo je registrirano monoklonsko protutijelo proizvedeno glikoinženjeringom.
Promijenjenom glikozilacijom Rituximaba dobiven je Ublituximab koji ima mnogo jače
djelovanje u odnosu na prethodnika i djeluje pri mnogo manjim dozama (mogućnost
pojeftinjenja lijeka u budućnosti s obzirom na smanjenje potrebne doze).

Antibiotici mogu specifično inhbirati neke bakterijske enzime. Osnovni problem s antibioticima
danas je rezistencija. Izlaganje antibioticima preživjele su samo one bakterije koje su na njih bile
otporne dok su ostale ugibale i tako je postupno čitava vrsta postala rezistetna na određeni
lijek. Kako bi se izbjegao začarani krug “novi antibiotik-rezistencija na njega”, danas se fokus
stavlja na lijekove koji sprječavaju interakciju bakterija i ljudi, koji sprječavaju vezanje bakterija
na naše stanice.

HIV i AIDS: HIV-1 je retrovirus - genetičku info ima pohranjenju u ssRNA koju reverznom
transkriptazom prepisuju u dsDNA koja se onda može replicirati, stvarati RNA, proteine itd. i
formirati nove virusne čestice, ali se ta dsDNA također može integrirati u naš genom. U
trenutku kada se virusna DNA integrira u naš genom ona prestaje biti vidljiva našem
imunosnom sustavu i ondje neometano egzistira, pritajena i do 20 godina.
HIV inficira prvo makrofage, a zatim T limfocite (CD4+) i stanice glatkih mišića. Postoje ljudi koji
se ne mogu zaraziti HIV-om. Oni zbog mutacije u genu imaju defektni CCR5 protein (koreceptor
makrofaga). Ljudi normalno funkcioniraju bez tog koreceptora, on ih ne zakida u obrani od
ikakvih infekcija, samo ih čini rezistentnima na HIV.
HIV ima malo molekularnih meta za th zato što HIV ugl. koristi ljudsku mašineriju za svoj
stanični ciklus. Jedna od meta reverzna je transkriptaza pa prvi lijek za HIV upravo djeluje na
proces prepisivanja virusne RNA u DNA. AZT (azido-dideoksitimidin) djeluje kao inhibtor sinteze
DNA na osnovi RNA kalupa - to znači da će spriječiti sintezu virusne DNA pomoću reverzne
trankriptaze, ali neće narušiti replikaciju humane DNA jer ona za to koristi druge enzime. AZT
stukturno je jednak timidinu, samo umjesto OH skupine na 3’ kraju ima azido skupinu (N3) -
takva baza ne može se normalno vezati u DNA lanac, stoga je sinteza virusne DNA inhibirana.
Problem je što je HIV tijekom vremena razvio rezistenciju na AZT. Danas se zato za liječenje
upotrebljava kombinirana th prilikom koje je virus nesposoban odjednom stvoriti rezistenciju
na sve lijekove pristne u koktelu. Ipak, svi ti lijekovi sprječavaju samo umnažanje virusa - u
liječenih će virus biti neaktivan, ali oni nikada nisu izliječeni i stalno moraju koristiti lijekove.
Prvi lijek kojem je cilj izlječnje HIV-a genetički je rekombinirana Cre-rekombinaza kojom je
moguće iz stanice nekog organizma eliminirati genom HIV-a. Th nije zaživjela jer je gotovo
nemoguće ubaciti dovoljno Cre-rekombinaze i usmjeriti ju tako da uđe u svaku stanicu i od
tamo ukloni genom HIV-a. Ono što će možda dovesti do uspjeha u tom pothvatu je CRISPR-
tehnologija - pomoću malih guide-RNA molekula navodi se CRISPR-nukleaza da ode tamo gdje
ju želimo i da izreže ciljani segment DNA.

Virus gripe: Hemaglutinini (HA) služe za adherenciju na sijalinsku kiselinu na površini naših
stanica. Nazivamo ga hemaglutinininom jer prilikom stavljanja tog čistog proteina u krv dolazi
do aglutinacije Erc. Neuraminidaze (NA) uklanjaju sijalinsku kiselinu i omogućuju oslobađanje
novih virusnih čestica od stanice i njihovo kotrljanje kroz glikokaliks kako bi dospjele do novih
stanica i njih inficirale. Prvi lijekovi za influencu bili su analozi sijalinske kiseline koji su
učinkovito inhibirali neuraminidaze - spriječili su razmnožavanje virusa gripe. To su bili Tamiflu
(=Oseltamivir; tableta u širokoj primjeni) i Relenza (=Zanamavir; inhaliranje u bolnici, primjena
kod težih slučajeva). Unutar godine dana primjene razvila se rezistencija. Međutim, novi sojevi
gripe koji su se pojavili nakon prestanka upotrebe Tamiflua ponovono su osjetljivi na Tamiflu.
Ključno je ne pretjerati s primjenom!
Virus influence ima segmentirani genom što mu omogućava iznimnu vijabilnost. To znači da
onda kada se jedinka inficira s više tipova influence dolazi do stvaranja novih sojeva koji sadrže
različite kombinacije genoma. Iz tog razloga svake godine se rade nova cjepiva prema
najzastupljenijem soju (ali učinkovita samo 40-60%).
Sars-Cov-2: Sars-Cov-2 virus je s lipidnom ovojnicom koja okružuje nukleokapsidu. Ključan
protein ovojnice je spike protein (spike zato što kao koplje strši van iz virusne čestice) koji je
vrlo glikoziliran i veže se na ACE-2 receptor i na taj način ulazi u naše stanice. Njegov je genom
ogroman, ali nije segmentiran pa se mijenja sporije od virusa gripe.
Koronavirusi-α uzrokuju oko 15% običnih sezonskih prehlada. Prije 15ak godina pojavio se prvi
teži oblik koronavirusa, Sars-Cov-1, koji je uzrokovao vrlo teške upale pluća i bio smrtonosan u
velikom postotku oboljelih. Nešto kasnije pojavio se Mers-Cov koji je također bio vrlo
smrtonosan. Sars-Cov-1 i Mers-Cov brzo su nestali jer je širenje bilo ograničeno s obzirom da
nije bilo asimptomatskih nositelja, a simptomatski bolesnici bili su u vrlo teškom stanju zbog
čega nisu hodali uokolo i stavljalo ih se u karantenu.
Nove varijante (ne sojevi! - nedovoljno različiti da bi ih nazivali sojevima) sustavno se prate i
sasvim su očekivana i uobičajena pojava. Danas se sustavnije promatraju: britanska varijanta -
nešto se brže širi, oko 30% brže; južnoafrička varijanta - ima dosta mutacija u spike proteinu pa
se sumnja u učinkovitost cijepljenja; brazilska varijanta - sumnja se da je rezistentna na cjepiva.

Pacijentovo očekivanje znatno utječe na tijek bolesti. Kod ljudi je i do 50% veća šansa izlječenja
kod pacijenata koji vjeruju liječniku i ljekarniku kod terapije. Primjeri: placebo operacije kod
angine pectoris (napravili samo rez i zašili ga, pola ljudi se osjećalo znatno bolje), placebo
propranolol nakon infarkta miokarda (oni koji su redovno uzimali lijek imali 50 posto bolju
učinkovitost u prevenciji ponovnog infarkta od onih koji ga nisu uzimali redovito - redoviti
korisnici oni su koji su vjerovali u djelotvornost lijeka).

Glavna obilježja virusa:

 sitne infektivne čestice
 genom: jedan ili više komada nukleinske kiseline - RNA ili DNA (nikad obje), ss ili ds,
cjelovit ili segmentiran
 (+) RNA djeluje kao mRNA - uspoređujemo je s kodirajućim lancem DNA;
prepisuje se reverznom transkriptazom u DNA koja onda služi kao kalup za
sintezu proteina
 (-) RNA ne može izravno poslužiti za sintezu proteina - uspoređujemo je s
nekodirajućim lancem DNA; prepisuje se u (+) RNA
 nemaju staničnu građu (nema membrane, citosola, organela)
 VIRION - izvanstanični oblik; moguća kristalizacija (mirovanje čak i tisućama godina)
 goli virion - nukleokapsida = nukleinska kiselina (genom) + kapsida (proteinski omotač)
 kapsida - građena od kapsomera (podjedinice nalik podjedinicama u proteinu)
 kapsomera - izgrađena od jednog ili više tipova proteina
 virion s ovojnicom - ovojnica nalik fosfolipidnoj membrani
  ovojnica je dio membrane iz stanice domaćina u koju su ugrađeni glikoproteini
kodirani virusnim genomom
 ovojnica nema fiziološku ulogu membrane (nema endocitoze, nema aktivnog
transporta)
 proteini i glikoproteini ovojnice sudjeluju u prepoznavanju stanice domaćina
 ovisni o domaćinu - nemaju metaboličku aktivnost niti se mogu razmn. bez domaćina
 svi organizmi podložni su napadu virusa: životinje, biljke, gljive, bakterije
 specifičnost prema domaćinima omogućena je komplementarnim
prepoznavanjem proteina ili glikoproteina na virusnoj kapsidi ili ovojnici s
proteinima ili glikoproteinima na površini stanice domaćina
 biljni virusi - manje istraženi (iako je prvi otkriveni virus mozaične bolesti
duhana); inficiraju biljne stanice putem abrazija u staničnom zidu ili putem
nametnika
 virusi glijva - razlikuju se od ostalih virusa jer nemaju izvanstanični oblik
 bakterijski virusi - ideja nove terapije protiv bakterija je liječenje pomoću faga
 životinjski virusi - neki specifično prepoznaju pojedine stanice domaćina (HIV,
influenca), a neki inficiraju mnogo razl. stanica domaćina (virus bjesnoće)
 kultiviranje virusa u labosu vrlo je teško
 fagi se uzgajaju u bakterijskoj kulturi - imamo bakterijsku livadu (film bakterija
preko cijele Petrijevke), na to nasadimo fage i nastane bakterijska livada s
plakovima (čistinama) - mjesta gdje nalazimo fage (litički fagi uništili su bakterije)
 životinjski se virusi uzgajaju u pilećem zametku ili kulturi stanica
 problem je što se virusi prilagođavaju okolišu pa ako uzgajamo viruse u
pilećem embriju on se adaptira pticama pa postaje virus ptica, a ne ljudi
→ potencijalno primjenjivo za cjepivo jer sadrži antigena svojstva, ali više
ne može inficirati ljude

 sinteza dsDNA virusa:

 umnažanje slično normalnoj replikaciji DNA i translaciji proteina u stanici
 u jezgri oba lanca virusne DNA služe kao kalup za replikaciju
 DNA se prepisuje u mRNA u jezgri, a proteini i kapsomere sint. se u citosolu
 kapsomere se vraćaju u jezgru i spontano se udružuju s virusnom DNA
 pr. herpes i papiloma virusi
 sinteza ssDNA virusa:
 enzimi domaćina sintetiziraju novi kompl. lanac DNA koji zajedno s ssDNA virusa
tvori dsDNA
 dsDNA prepisuje se u mRNA itd.
 ssDNA pakira se u nove virione
  pr. parvovirusi (eritem)
 sinteza (+) ssRNA virusa:
 (+) RNA djeluje izravno kao mRNA i upravlja sintezom virusnih proteina
 (-) RNA lanac prepisuje se s (+) RNA pomoću virusne RNA polimeraze - on služi
kao kalup za sintezu (+) ssRNA genoma koji se pakira u nove virione →
prepisivanje RNA u RNA jedinstveno je za viruse!
 pr. poliovirus
 retrovirusi:
 također ssRNA genom, ali ne djeluje izravno kao mRNA
 na kalupu (+) RNA reverzna transkriptaza sintetizira DNA intermedijer
 DNA intermedijer služi kao kalup za sintezu novih (+) RNA molekula - one djeluju
kao mRNA i kao virusni genom za nove virione
 DNA intermedijer može se ugraditi u genom domaćina djelovanjem enzima
integraze - nastaje provirus
 pr. HIV
 sinteza (-) ssRNA virusa:
 (+) RNA sintetizira se pomoću virusnog enzima RNA-ovisne RNA transkriptaze -
ona se otpušta iz kapside prilikom ulaska virusa u stanicu domaćina
 (+) RNA služi kao kalup za sintezu mRNA i kao kalup za sintezu novih kopija (-)
RNA koje se pakiraju u zreli virion
 pr. virus gripe, virus bjesnoće
 sinteza dsRNA:
 (+) lanac služi kao mRNA za sintezu proteina
 jedan od sintetiziranih virusnih proteina karakteristična je RNA polimeraza koja
proizvodi još dsRNA - svaki lanac služi kao kalup za sintezu komplementarnog
lanca
 pr. rotavirus (dijareja)

Latencija životinjskih virusa: Latentni virusi ili provirusi (virus malih boginja, herpes virusi) mogu
ostati godinama u utišanom (dorminantnom) stanju bez izazivanja simptoma infekcije. Ugradnja
u genom domaćina moguća je (HIV - trajni provirus bez mogućnosti indukcije), ali nije obavezna
(lizogeni fagi).

Uloga virusa u nastanku tumora:

Virusi hepatitisa B i C: Trajna proliferacija jetrenih stanica zbog kroničnog oštećenja tkiva i upale
potiče nastanak raka - povećava se rizik od nastanka raka 100 puta. Kod virusa hepatitisa B gen
X utječe na ekspresiju niza staničnih gena i dovodi do poremećaja proliferacije i staničnog
preživljavanja.
SV40 i poliomavirus izazivaju rak u nepermisivnim stanicama: Ne izazivaju rak u stanicama
svojih prirodnih domaćina u kojima se mogu razmnožavati (to su permisivne stanice), ali
izazivaju rak u nepermisivnim stanicama. Ondje se integriraju u genom domaćina, a onda zbog
ekspresije virusnih gena dolazi do transformacije stanica. Proteini ranog područja potiču
replikaciju virusne DNA, ali i gena u stanici domaćinu. Ukoliko dođe do ugradnje u genom
domaćina, proliferacija je trajno potaknuta. On inaktivira tumor-supresore p53 i Rb.
Papilomavirusi: Razlikujemo 60 vrsta, inficiraju epitelne stanice - uzrokuju stvaranje
dobroćudnih promjena (bradavice), ali i karcinom grlića maternice. Rani geni E6 i E7
interferiraju sa staničnom proliferacijom: E6 veže Rb, a E7 potiče razgradnju p53.
Adenovirusi: U nepermisivnom domaćinu izazizvaju tranformaciju (kao SV40 i poliovirus). Rani
geni E1A i E1B interfeiriaju sa staničnom proliferacijom: E1A veže Rb, a E1B veže p53.
Herpesvirusi: Herpesvirusi najsloženiji su životinjski virusi koji uzrokuju tumore kod životinja i
ljudi. Epstein-Barr virus uzrokuje pojavu nekoliko vrsta raka (Burkittov limfom), mehanizam
nastanka raka nedovoljno je razjašnjen zbog složenosti genoma. Za herpesvirus povezan s
Kaposijevim sarkomom značajno je nekoliko virusnih gena koji utječu na staničnu proliferaciju i
preživaljavanje. Jedan od njih djeluje na Rb i p53.
Retrovirusi: Različiti retrovirusi razlikuju se po onkogenim sposobnostima. Rausov sarkomski
virus (RSV) transformira stanice pilećeg embrija, a srodni virus ptičje leukoze (ALV) koji se
replicira u istim stanicama ne uzrokuje transformaciju. Većina retrovirusa nije karcinogena, a
nastanak raka povezan je s mutacijom staničnih gena uzrokovanom integracijom virusnog
genoma. Karcinogeni retrovirusi sadrže onkogene (onkogeni su geni koji uzrokuju nekontrolirani
rast i diobu stanica). Retrovirusni onkogeni nastaju rekombinacijom DNA virusa i domaćina. Oni
su mutirani ili nenormalno eksprimirani oblici staničnih protoonkogena - srodnih gena iz stanica
domaćina (protoonkogeni su stanični regulacijskih geni). Transkripcija virusnog onkogena pod
kontrolom je virusnih promotora i pojačivača, a to je moguće zato što kod rekombinacija dolazi
do delecija ishodnih protoonkogena i nastanka fuzijskih proteina. Također se događaju i
točkaste mutacije.

Viroidi su čestice građene od izrazito male kružne molekule RNA, nemaju kapsidu, za red
veličine manji su od virusa, a uzrokuju bolesti biljaka i gljiva. Njihova RNA doima se linearnom
jer je povezana vodikovim vezama.

Prioni (Prp-ovi) su proteinske infektivne čestice koje se pojavljuju u 2 konformacije - stanična i

prionska konformacija (AK-ski slijed identičan je!). Stanična konformacija smotana je u α-
uzvojnicu, a prionska konformacija ima strukturu β-nabrane ploče. Onda kada dođe do
promjene konformacije iz stanične u prionsku, razvija se bolest. U normalnim okolnostima
stanični proteini i polisaharidi potiču smatanje Prp-a u pravilan stanični oblik. Do pogrešnog
smatanja može doći jedino u slučaju pretjerane ekspresije Prp gena. Kod ljudi Prp može se krivo
smotati samo ako je na položaju 129 AK Met (kod oko 40% ljudi).
Prioni se razmnožavaju tako da se zaopravo ne razmnožavaju. Oni se neće replicirati, ali prionski
Prp inducirat će konformacijsku promjenu normalnog staničnog Prp-a u prionski.
Neki od primjera prionskih bolesti su skrepi bolest ovaca, goveđi spongioformni encefalitis
(bolest “lude krave”). Kod ljudi to je Creutzfeld-Jakobova bolest - dolazi do degeneracije i
gubitka moždane tvari, stvaraju se vakuole koje daju spužvast izgled.

Razlikovati virion od viroida!

2. predavanje: Metode molekularne biologije
Kada govorimo o metodama molekularne biologije ugl. govorimo o metodama koje uključuju
analizu DNA.
Genom je ukupna DNA organizma. Kod virusa genom može biti ss ili ds, DNA ili RNA, a kod svih
staničnih organizama radi se o dsDNA. Veličina genoma u pravilu raste prema višim
organizmima: u haploidnom genomu bakterije imaju oko 3 mil pb, a čovjek 3 mlrd pb (dug oko 1
m). Veličina genoma također je određena potrebom brzine replikacije pa tako kod nekih algi
koje se sporo dijele postoje ogromni genomi koji sadrže mnoštvo gena koji nisu nužni za
opstanak alge, ali joj pomažu npr. u rezistenciji (to su ugl. virusni geni ugrađeni u DNA alge).
Gen je funkcionalna jedinica genoma. To je odsječak DNA koji kodira polipeptid ili molekulu
RNA. Čovjek ima oko 20.000 gena, što nije puno više od ostalih organizama, međutim razlikuje
se način na koji se ti geni koriste (ekspresija gena).
Ekspresija gena proces je nastanka genskog produkta. Sve stanice imaju sve gene, ali oni nisu u
svima (jednako) aktivni.
Središnja dogma molekularne biologije: DNA → RNA → protein (DNA nosi uputu za sintezu
RNA, a RNA nosi uputu za sintezu proteina). Danas je poznato da to nije nužno tako: kod virusa
postoji i prepisivanje RNA u DNA, prepisivanje RNA u RNA, a postoje indikacije i da se uputa na
određeni način šalje od proteina preko RNA do DNA, npr. onda kada se neki protein sintetizira
nefunkcionalan, uputa ide od njega sve do DNA kako bi se inducirao popravak DNA i popravila
uputa za njegovu sintezu.

Razlikujemo 2 tipa analize DNA:

1. Analiza slijeda:
 identifikacija mutacija i polimorfizama (SNP)
 dg nasljednih bolesti
 utvrđivanje prisutnosti strane DNA (je li osoba inficirana, ima li u hrani mikroba
kojih ne bi trebalo biti i sl.)
 određivanje slijeda nukleotida u nekoj DNA (npr. kod novootkrivenih
organizama)
2. Analiza genske ekspresije:
 poremećaji genske ekspresije u bolestima (kod nekih bolesti slijed je normalan,
ali je ekspresija poremećena)
 utjecaj lijekova na gensku ekspresiju (kod osoba s polimorfizmima i mutacijama
određenih gena lijekovi koji kod drugih ne izazivaju promjene mogu izazvati
promjene u genskoj ekspresiji)
 ispitivanje f-je pojedinih gena
ANALIZE SLIJEDA DNA
Važno je načelo da komplementarne molekule DNA i RNA hibridiziraju - ssDNA ili ssRNA koje su
komplementarne u otopini polimeriziraju u ds molekule.

Southern blot
Postupak Southern blot analize:
1. razgradnja DNA restrikcijskih endonukleazama
2. razdvajanje DNA molekula elektroforezom u agaroznom gelu
3. denaturacija (razdvajanje niti DNA) - 0,5M NaOH
4. prijenos DNA (blot) na nitroceluloznu membranu - pasivnom difuzijom ili elektroforetički
5. fiksiranje DNA na membranu - temperatura, UV
6. hibridizacija obilježenom sondom (radioaktivno obilježavanje) - specifično vezanje!
7. detekcija (autiradiografski)
Uzorak prvo treba pokidati restrikcijskim nukleazama kako bi se dobili fragmenti dsDNA.
Elektroforezom na agaroznom gelu fragmenti se razdvoje prema veličini. DNA se denaturira
kako bi se dobili ssDNA fragmenti, oni se prenesu i fiksiraju na membranu kako bi bili pogodni
za daljnju obradu. Zatim se ssDNA hibridiziraju s radioaktivno obilježenim sondama i vrši se
detekcija autoradiografijom.
Zašto se DNA kida na fragmente i zašto fragmente treba razdvojiti elektroforezom? Bez
fragmentiranja i razdvajanja fragmenata vezanje sonde bilo bi nespecifično - ovisilo bi o konc.
sonde: ako bi konc. sonde bila velika, vezala bi se, ali bez specifičnosti, a ako bi konc. sonde bila
malena, do vezanja ne bi došlo. Fragmenti su također potrebni za negativnu kontrolu i da bismo
na poslijetku vidjeli koliko je fragmenata na koje se veže sonda.
Što je negativna kontrola kod Southern blot analize? Svi fragmenti DNA na koje se neće vezati
sonda (u istim konc. DNA i sonde).
Što je pozitivna kontrola kod Southern blot analize? Uzorak za kojeg pouzdano znamo da će se
na njega vezati sonda. Pozitivna kontrola ključna je onda kada eksperiment nije uspio, da znamo
da nismo zabrljali nešto u procesu izvođenja eksperimenta.
Southern blot analiza daje nam odgovor postoji li određeni fragment u uzorku. Međutim, ova
se metoda danas više ne koristi.
PCR (lančana reakcija polimeraze)
PCR metoda djelovala je revolucionarno na analizu DNA. Služi i za umnažanje DNA pa tako u
svega nekoliko sati možemo dobiti mlrd identičnih kopija nekog ciljanog fragmenta DNA što
nam omogućuje brojne analize iz svega nekoliko molekula početnog uzroka.
Za provođenje PCR-a potrebno je:
 izolirana DNA
 dvije specifične početnice (početnica=ishodnica=primer)
 termostabilna polimeraza (Taq) - utemeljena na polimerazi iz prirode iz Thermus
aquaticus, dodatno modificirana, rekombinantno proizvedena u svrhu PCR-a
 smjesa 4 dNTP
 Mg (II) - ima ulogu stabilizacije neg. naboja dNTP -a
 pufer
Tijek PCR-a:
1. denaturacija - zagrijavanje
2. dodavanje primera (u slučaju TaqMan-a dodaje se i Taqman sonda)
3. dodavanje Taq polimeraze i sinteza PCR produkta
4. ponavljanje ciklusa s PCR produktom
Izolirana DNA denaturira se zagrijavanjem kako bi se dobile ssDNA. Dodajemo početnice koje su
komplementarne s 2 fragmenta DNA koji se nalaze uzvodno od ciljnog slijeda (kojeg
umnažamo), svaka se veže na jedan lanac DNA molekule; kada bi promatrali njihov odnos u
dsDNA, one su orjentirane jedna prema drugoj. Nakon vezanja početnica počinje sinteza
komplementarnog lanca pomoću Taq-polimeraze - povezuju se dNTP-ovi i dobivamo
novosintetizirani lanac DNA odnosno PCR produkt. Hlađenjem dolazi do formiranja dvostruke
uzvojnice DNA. Cijeli postupak ponavljamo i dobivamo sve veći broj kopija fragmenta od
interesa.

sinteza DNA uvijek se

odvija u smjeru 5’ → 3’

paziti kod označavanja na

skici - početnica u smjeru
strelice 5’ → 3’ (stavi je na
3’ kraj fragmenta koji služi
kao kalup!!!)
Koliko će biti velik fragment koji se sintetizira na originalnom kalupu DNA (u 1. ciklusu)? Bit će
nedefinirane duljine. Duljinu će odrediti vrijeme trajanja sinteze. Vrijeme trajanja sinteze
određeno je trenutkom u kojem počine sinteza, jer se neće sve početnice vezati u točno istom
trenutku i započeti sintezu (a sinteza završava onda kada dignemo temp. na 95°C i kada dolazi
do denaturacije i razdvajanja niti). → vidi sliku iznad!
U svim drugim ciklusima? Duljina novonastalog lanca određena je duljinom kalupa nastalog u
prvom ciklusu. To znači da je taj lanac, nastao u 2.ciklusu, terminiran početnicom iz 1. ciklusa
(jer sad sinteza novog lanca ide u suprotnom smjeru, a prije početnice iz 1. ciklusa u tom smjeru
nema DNA kalupa). Zbog toga su fragmenti svih drugih ciklusa jednake duljine i omeđeni su
dvjema početnicama (početnicom 1 i početnicom 2).

Dobro je imati na umu da se sve ovo događa u jednoj posudi pa uvijek unutra imamo i
originalne kalupe DNA na kojima se sintetiziraju lanci nedefinirane duljine. Međutim, broj
nedefinirano dugih segmenata tijekom vremena raste linearno, a broj PCR produkata
(omeđenih dvjema početnicama) raste eksponencijalno pa već nakon par prvih ciklusa možemo
reći da je br. nedefinirano dugih segmenata zanemarivo malen naspram br. PCR produkata.

KVANTIFIKACIJA PCR-A:
Kod kvantifikacije prilikom PCR-a polazi se od načela da se tijekom PCR-umnažanja ne mijenjaju
omjeri, već samo dolazi do multiplikacije. Međutim, pouzdana kvantifikacija moguća je samo u
području eksponencijalne amplifikacije. Nakon eksponencijalne faze slijedi linearni rast (jer je
smanjen broj početnica, malo ih je u odnosu na br. PCR produkata) i konačno slijedi faza platoa
(trenutak u kojem su iskorištene sve početnice i količina PCR produkta stagnira). Da bismo mogli
pouzdano odrediti omjere, moramo biti sigurni da se još uvijek nalazimo u fazi eksp. rasta.
Kako znamo da se kod PCR-a nalazimo u eksponencijalnoj fazi? Napravimo analizu u kojoj
odredimo omjere, istu analizu ponovimo nakon nekog vremena i vidimo jesu li omjeri jednaki.
Ako nisu, nismo više u eksponencijalnoj fazi.

Za pouzdanu kvantifikaciju ipak je najbolje koristiti qPCR. Tada si ne moramo postavljati pitanje
koliko je RNA na kraju procesa, već se pitamo koliko je ciklusa potrebno da dođemo do
određenog broja PCR produkata. (u nastavku vidi o qPCR-u)
Interpretacija slike sa serijom
deseterostrukih razrjeđenja: Na slici
su prikazane krivulje uzoraka s
različitim konc. (svaka sljedeća krivulja
prikazuje razrjeđenje od 10x).
Gledamo koliko je PCR ciklusa
potrebno da bi se dostigao ct (cycle
treshold; ciljni br. PCR produkata). Iz
razlike u broju ciklusa zaključujemo o
kojem se broju PCR produkata radi
(možemo uspoređivati sa standardom
poznate količine).

Broj PCR produkata računamo po formuli 2n pri čemu je n=broj ciklusa.

Od tog ukupnog broja molekula unutar reakcijske smjese, 1 DNA ima duljinu originalne DNA (to
je DNA uzorka), n je broj DNA nedefinirane duljine, a (2 n-n-2) je broj DNA duljine gena kojeg
kloniramo.
Ako promatramo pojedinačno ssDNA lance onda u reakijskoj smjesi imamo:
 u 1. ciklusu: 2 lanca originalne duljine i 2 lanca nedefinirane duljine (između duljine
originalne DNA i ciljnog fragmenta)
 u svim ciklusima nakon prvog ciklusa: 2 lanca originalne duljine, 2n lanaca nedefinirane
duljine i preostali lanci dulijne gena od interesa
  npr. dsDNA duga 20kb, umnažamo gen od 500pb, napravljena su 4 ciklusa
 ukupan br. dsDNA kojeg ćemo dobiti je 24 = 16 DNA tj. 32 ssDNA lanaca
 1. ciklus → 2 ss lanca od 20kb, 2 ss lanca nedef. duljine
 2. ciklus → 2 ss lanca od 20 kb, 4 ss lanca nedef. duljine, 2 ss lanca od 500 pb
 3. ciklus → 2 ss lanca od 20 kb, 6 ss lanca nedef. duljine, 6 ss lanaca od 500 pb
 4. ciklus → 2 ss lanca od 20 kb, 8 ss lanaca nedef. duljine, 22 ss lanaca odd
500pb (što je ukupno 1 DNA od 20 kb, 4 DNA nedef. duljine i 11 DNA od 500 pb,
sumarno 16 DNA molekula tj. 32 ss DNA lanca)

Zašto se standardnim PCR-om ne mogu umnožiti fragmenti dulji od 3 kb? Taq polimeraza
NEMA korektivnu aktivnost (ne djeluje 3’→5’ egzonukleazno), ona ne zna popraviti lanac ako
dođe do ugradnje pogrešnog nukleotida pa se u tom slučaju zaustavlja sinteza. Pogreška je 1
krivi nukleotid na 1000.
“Proofreading” polimeraza - ima sposobnost popravljanja krivo sparenih baza, ima korektivnu
aktivnost i omogućuje učinkovitu sintezu dugih fragmenata (duljih od 3 kb). Kao i kod Taq
polimeraze i ove su uzete iz prirode i modificirane.

Multipleks PCR metoda je koja omogućuje istovremenu analizu više segmenata DNA u istom
uzorku. Istovremeno se koristi više parova početnica koje moraju imati slične optimalne
temperature za vezanje, trebaju biti podjednake duljine i GC sastava (kako bi imale sličan
afinitet vezanja). Optimiranje metode stoga je vrlo složeno, ali jednom uspješno optimirane
metode izazito su korisne i informativne - koriste se za jednoznačnu identifikaciju ljudi
(“genetički otisak prsta”), kod testova očinstva, prilikom analiza posmrtnih ostataka i sl.

Identifikacija PCR produkta → elektroforetski vidimo imamo li PCR produkt:

I. identifikacija na agaroznom gelu
 neobilježene početnice
 detekcija etidij-bromidom (danas zamjena manje toksičnim bojama)
 jednostavna oprema (neobilježene početnice)
 razmjerno slaba osjetljivost i razlučivanje, nemoguća kvantifikacija
II. identifikacija fluorescentnih produkata - kapilarna elektroforeza
 početnice obilježene fluorescentnim biljezima
 oprema je vrlo skupa i složena
 osjetljivost i razlučivanje odlično, moguća kvantifikacija
 pogodno za multipleks PCR - i do 30 razl. analiza u jednoj reakciji
TaqMan metoda: https://www.youtube.com/watch?v=fkUDu042xic

qPCR (real time PCR, q od kvantitativni) kontinuirana je analiza PCR produkata koja ne zahtijeva
naknadnu identifikaciju i omogućava pouzdanu kvantifikaciju - eliminirana je tzv. plato-faza
koja se pojavljuje u klasičnim PCR metodama, a u kojoj su iskorištene sve početnice pa je
umnažanje prekinuto iz tog razloga. Nedostaci metode su da je vrlo skupa (50.000 -100.000$
naspram 5.000-10.000 za klasični PCR). Također je ovdje razmjerno ograničena mogućnost
multipleksa.
TaqMan metoda: Uz 2 početnice koristi se i dodatna sonda tzv. TaqMan sonda - to je DNA
fragment koji je na krajevima obilježen s 2 fluorescentne boje - te krajeve nazivamo reporter (5’
kraj) i quencher (3’ kraj). Ta sonda specifično se veže na ssDNA uzorka (koju smo dobili
denaturacijom). Reporter apsorbira zračenje lasera i emitira zračenje valne duljine koja
približno odgovora max. apsorpcije quenchera - dolazi do rezonancijskog prijenosa svjetlosti s
reportera na quencher (FRET - fluorescence resonance energy transfer), kažemo da je
fluorescencija reportera prigušena. Znači, quencher apsorbira zračenje reportera (prigušuje
njegovu emisiju), a zatim fluorescira. Međutim, fluorescencija quenchera nije ona koju mjerimo.
Ta unutarnja sonda podložna je razgradnji specifičnom Taq polimerazom - ona ima 5’→3’
egzonuklazno djelovanje. Znači, kada Taq polimeraza krene sintetizirati komplementarni lanac
DNA i kada naiđe na TaqMan sondu, ona je hidrolizira i pri tom dolazi do razdvanja reportera od
quenchera. Tada je onemogućen FRET pa reporter
! intaktna sonda ne fluorescira
fluorescira. To je fluorescencija koju mjerimo i kojom
! razdvojena sonda fluorescira
kvantificiramo dobivene PCR produkte.
Moguća je primjena u multipleks PCR-u. Svakom fragmentu pridruži se specifična sonda.
Međutim primjena je ograničena zbog ograničenog broja valnih duljina koje možemo koristiti za
očitavanje.
SYBR Green tehnologija: SYBR Green boja fluorescira samo onda kada je se interkalira između 2
nukleotida u dsDNA (ne fluorescira u otopini s denaturiranim DNA). Na taj način fluorescencija
se pojavi onda kada se pojavi dsDNA tj. PCR produkt. Jačina fluorescencije odgovara količini
DNA. Međutim kod ove tehnologije ne možemo biti potpuno sigurni da je dobivena dsDNA PCR
produkt.
Usporedi TaqMan s SYBR Green metodu. TaqMan metoda je specifična, ako imamo
fluoresciranje pouzdano znamo da imamo PCR produkt i znamo koliko ga imamo s obzirom da
je fluorescencija razmjerna količini PCR produkta. Kod SYBR Green metode imamo nespecifično
fluoresciranje, fluorescencija se pojavljuje u prisutstvu bilo koje dsDNA (čak i ako imamo
slučajno sparivanje baza u smjesi ili bilo kakvu drugu sporednu za nas nebitnu dsDNA). Također
kvantifikacija nije precizna jer fluorescencija ne ovisi o količini PCR produkata nego o veličini
DNA molekula (jedna ogromna dsDNA dat će jaku flourescenciju). Ipak nespecifičnost SYBR
Greena može biti korisna: ako istražujemo više različitih polimorfizama, ne trebamo nabavljati
hrpu različitih Taqman sondi nego sva ispitivanja vršimo pomoću te jedne SYBR Green boje što
nam pojednostavljuje istraživanje i čini ga jefitinijim (TaqManice su skupe!).
Koju metodu PCR-a koristimo za određivanje genotipa? qPCR. Određujemo je li prisutan
određeni gen, možemo provjeriti je li prisutan alel A, alel B ili oba alela. Međutim ne možemo
otkriti mutacije ili neke druge gene.
Interpretacija grafa kvantifikacije alela A i alela B?

Aleli A i B označeni su različitim TaqMan sondama tj. bojama. Svaka točkica na grafu predstavlja
jednu osobu podvrgnutu testu. Osobe koje su homozigoti AA fluoresciraju na A=1.0 i B=0.0,
homozigoti BB na A=0.0 i B=1.0, a heterozigoti AB na A=0.5 i B=0.5.
U slučaju da početnica ima slijed koji nije identičan slijedu baza u genu (koja ima nesparene
baze) slabije će se vezati te će doći do njezine manje razgradnje i posljedično do manjeg signala
pa graf neće biti ovoliko savršen. Kod ovakve analize nužno je da se početnice za oba alela vežu
čim sličnijim afinitetom. U suprotnom, ako bi se npr. početnica za alel A vezala s većim
afinitetom nego početnica za alel B, heterozigot bio bi detektiran kao alel A, a u rezultatima ne
bismo imali heterozigotni tip.

Alel-specifične početnice bile su u upotrebi prije qPCR-a, dok još nisu postojale sonde. To su bile
specifične početnice koje na 3’ kraju odgovaraju samo jednom od alela, potpuno su mu
komplementarne. U tom slučaju do stvaranja PCR produkta dolazilo je samo ukoliko je kalup
komplementaran početnici.
Što bi se dogodilo da kod primjene alel-specifične početnice ubacimo u uzorak korektivnu
DNA-polimerazu (“proofreading” polimerazu)? Ona bi popravila alel i ne bismo više mogli
razlikovati “pravi” od “krivog” alela, pretraga više nema smisla.

SSCP (single strand conformational polymorphism)

SSCP analiza temelji se na činjenici da ssDNA iste duljine, a različitih sekvenci putuju različitim
brzinama tijekom denaturirajuće elektroforeze. Razlog je taj što stvaraju različite sekundarne
strukture (one su ovisne o slijedu nukleotida).
1 DNA molekula daje 2 vrpce s obzirom da je ta DNA građena od dviju različitih ssDNA.
Postojanje više od 2 vrpce upućuje na heterozigotni genotip (mutaciju).
Ova metoda danas se više ne upotrebljava rutinski s obzirom da je sekvenciranje postalo lako
dostupno. Ali može biti korisno ako ne želimo sekvencirati čitav genom - možemo sekvencirati
samo segmente kod kojih uočavamo neke abnormalnosti (4 vrpce). To je korisno zato što su svi
ljudi ugl. homozigoti - u velikoj većini svi imaju jednake gene.
Kako je moguće da homozigot, koji ima identične gene na kromosomima, ima dvije vrpce?
Zato što je svaka dsDNA molekula građena od dviju različitih ssDNA.

Sekvenciranje
Sekvenciranje genoma metoda je određivanja slijeda nukleotida na temelju Watson-Crickova
sparivanja baza.
Ima široku primjenu u dijagnostici: prenatalna dg, otkrivanje naslijednih bolesti (npr. cistična
fibroza), tumorski markeri i prognostički faktori, tipizacija mikroba (E. coli, humani papiloma
virusi), zatim za utvrđivanje identiteta i očinstva, u farmakogenomici.
Sangerova dideoksi metoda: Sintetiziramo komplementarni lanac DNA u prisutnosti 4
terminatora (dideoksi nukleotidi) - svaki obilježen svojom fluorescentnom bojom. Terminatori
vezanjem u lanac zaustavljaju sintezu DNA (jer nemaju OH skupinu na 2’ i 3’ C atomu) i u
konačnici dobivamo smjesu svih mogućih duljina lanaca (jer će se terminatori vezati u svim
mogućim kombinacijama). Zatim se ta smjesa razdvoji kapilarnom ili gel elektroforezom, a
detekcija se izvrši pomoću fluorescentnih boja.
Određivanje čitavih slijedova genoma omogućilo je “hypothesis free” (nespecifična) istraživanja
- više se ne moramo pitati je li alel X prisutan, već koji je alel prisutan.
Sekvenciranjem je bioinformatika postala iznimno važna jer se dobivaju ogromne količine
podataka koje je bez adekvatnih sustava i baza podataka nemoguće dobro provjeriti i sortirati.
Sekvenciranje genoma u ožujku 2013. godine koštalo je minimalno 5000$, a od veljače 2020.
široko je dostupno za 800$.
ANALIZA GENSKE EKSPRESIJE
Kod analize genske ekspresije ne zanima nas slijed nukleotida, nego kako se ponašaju ti geni.

Northern (RNA) blot analiza

Northern blot metoda je za analizu RNA molekule, a napravljena je analogno Southern blot-u (i
ime je dobila prema Southern-u; Southern je dobio ime prema znantveniku Edwinu Southernu).
Metoda: RNA se razdvaja elektroforetski, preslikava se na membranu, obilježava specifičnom
sondom i vrši se detekcija.
Razlika od Southern-a je da nema fragmentiranja i nema denaturacije.
Zašto kod Northern blota nije potrebna fragmentacija i denaturacija? Jer je RNA već
fragmentirana i jednolančana.
Što bi se dogodilo da u uzorak za Northern blot dodamo NaOH? Doći će do hidrolize RNA
molekula. DNA su otporne na hidrolizu zbog deoksiriboze, a riboza u RNA bi se hidrolizirala.

RT-PCR (RT od reverzna transkriptaza)

RT-PCR metoda je za analizu molekula mRNA (ekspresije gena). To je metoda kojom iz mRNA
pomoću reverzne transkriptaze dobivamo DNA - nastaje tzv. cDNA (komplementarna DNA); i
nakon toga idemo u normalan PCR proces za umnažanje dobivene DNA.
Reverzna transkriptaza je zapravo RNA-ovisna-DNA-polimeraza koja se od “obične” DNA-
polimeraze I razlikuje po tome što nema egzonukleaznu aktivnost (DNA-polmeraza I ima 5’→3
polimeraznu i 3’→5’ egzonukleaznu aktivnost, ima i 5’→3’ egzonukl. akt. - kod “nick-a“).
Komercijalno dostupna reverzna transkriptaza je M-MLV (moloney Murine Leukemia Virus)
proizvedena u E. coli.
Za kvantifikaciju PCR produkta rabi se usporedba s koamplificiranim standardom: β-aktin ili
GAPDH (gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza) - smatra se da se njihova ekspresija ne mijenja s
promjenom uvjeta u okolini. Za metodu kažemo da je semikvantitativna jer omogućava samo
relativnu usporedbu ekspresije ispitivanog i referentnog gena, a ne daje stvaran br. RNA
molekula.
Kompetitivni RT- PCR: U reakciju se dodaje poznata količina referentne DNA pa se rezultati
mogu izraziti apsolutno - rezultat se izražava u odnosu na ukupnu DNA (RNA), npr. ekspresija je
povećana 5x i sl.
DNA-mikročip tehnologija
Pomoću DNA-mikročipa gledamo koji su se geni promijenili (a ne je li promjenjen gen X!). Čipovi
sadrže ogroman broj udubljenja u kojima su smještene sonde. Gledamo u kojem udubljenju će
uzorak pokazati fluorescenciju, do fluorescencije dolazi ako dođe do vezanja sonde iz udubljenja
na uzorak kojeg ispitujemo.
Služi za otkrivanje novih gena, dijagnostiku, za otkrivanje novih lijekova (farmakogenomika),
koristi se u toksikološkim istraživanjima (toksikogenomika).
Ovdje je također od iznimne važnosti bioinformatika - analiza i sortiranje podataka.

“Nick” translacija
Spontano ili djelovanjem niskih koncentracija DNaze u reakcijskoj smjesi dolazi do loma JEDNOG
lanca dsDNA molekule. DNA-polimeraza I dodaje nove dNTP-ove i razgrađuje lanac 5’→3’
egzonukleaznom aktivnošću čime se ss lom (“nick”) pomiče duž molekule DNA.
Dodatkom jednog radioaktivno obilježenog dNTP-a (obično dATP obilježen radioaktivnim
fosforom 32P ili 33P) nastaje visoko obilježena molekula DNA.
Klenowljev fragment dio je DNA polimeraze I kojem nedostaje fragment s 5’→3’
egzonukleaznom aktivnosti i kojem je 3’→5’ egzonukleazna aktivnost suprimirana reakcijskim
uvjetima. Koristi se kod sekvenciranja Sangerovom dideoksi metodom za obilježavanje DNA
metodom produljenja ishodnice (primer extension, oligolabeling) - denaturacijom dobivamo
ssDNA, na 3’ kraj stavlja se ishodnica na koju se nastavlja sinteza komplementarnog lanca
pomoću Klenowljevog fragmenta. Usput se u lanac ugrađuju obilježeni dATP-ovi i dobiva se
visoko obilježena DNA molekula.

Analiza polimorfizama umnoženih fragmenata DNA:

Postoje mikrosatelitni dijelovi DNA koji se značajno razlikuju od čovjeka do šovjeka. STR (short
tandem repeat = kratka uzastopna ponavljanja) slijedovi su koji su načinjeni od većeg ili manjeg
broja identičnih oligonukleotidnih sekvenci, to su tetranukleotidi koji se ponavljaju više puta. U
tim sekvencama relativno često dolazi do greški pa su to lokusi prema kojima se ljudi razlikuju
(polimorfni su) i karakterizira ih neovisna segregacija (a to je važno da bi se vidjele razlike
između roditelja i djece). CODIS lokusi, ima ih 13, osnova su svih sustava za identifikaciju ljudi.
Klasifikaciju ljudi prema CODIS-u nazivamo “genetičkim otiskom prsta” jer je vjerojatnost da
dvije osobe (koje još nisu u krvnom srodstvu) imaju identičan profil 1 : 2x10 17. U slučaju roditelja
i djece svaki od ovih lokusa jednak je lokusu ili majke ili oca, ali nikada i jednom i drugom.
Kod analize očinstva određuje se vjerojatnost očinstva koja se računa izrazom LR = vjerojatnost
da je otac / vjerojatnost da je netko drugi otac.
3. predavanje: Kloniranje gena i proizvodnja rekombinantnih proteina
Kloniranje je stvaranje identičnog genoma. Rekombinacija je kombiniranje genoma različitih
organizama.
Za kloniranje potrebni su nam:
 fragment DNA (gen) kojeg kloniramo
 vektor - DNA u koju ograđujemo fragment kojeg kloniramo
 enzimi
 stanice domaćina
Osnovni princip kloniranja:
 odabrani odsječak DNA uvodi se u molekulu DNA koja se replicira neovisno o replikaciji
genoma stanice
 rekombinantna (kimerna) molekula DNA unosi se u odgovarajuću stanicu domaćina
(npr. E.coli, Sacchharomyces cerevisae)
 umnažanjem stanica domaćina dobiva se velika količina kloniranog gena
 ukoliko vektor sadrži odgovarajuće kontrolne elemente za sintezu RNA i proteina,
stanica domaćina može prozvesti velike količine RNA i proteina kodiranih kloniranim
genom

Enzimi za molekularno kloniranje:

 restrikcijske endonukleaze
 DNA-ligaza
 druge nukleaze
 metil-transferaze
 polimeraze
 enzimi koji modificiraju krajeve DNA
Nukleaze su enzimi koji kataliziraju hidrolizu fosfodiesterske veze u nukleinskim kiselinama.
Endonukleaze cijepaju fosfodiestersku vezu unutar polinukleotidnog lanca, a egzonukleaze
razlažu jedan po jedan nukleotid od kraja polinukleotidnog lanca.
Ligaze su enzimi koji kataliziraju povezivanje molekula uz nastanak nove kemijske veze.
Transferaze su enzimi koji kataliziraju prijenos funckionalne skupine.
Polimeraze su enzimi za sintezu DNA molekula - nukleotidi se povezuju u polinukleotidni lanac.
Restrikcijske endonukleaze: “molekularne škare” - enzimi koji razgrađuju DNA na točno
određenom mjestu
 podrijetlom su bakterijske - dio su restrikcijsko-modifikacijskog sustava bakterija (štite
bakteriju od ulaska stranog DNA, DNA bakteriofaga!)
 mjesta prepoznavanja - slijedovi 4-8 baza u dsDNA, palindromi
  kidaju oba lanca DNA - nastaju tupi ili ljepljivi krajevi
 tupi krajevi - nastaju ako je došlo do kidanja dsDNA unutar osi simetrije
 ljepljivi krajevi - nastaju ako je kidanje van osi simetrije
 kasnije se lakše povezuju (kod ugradnje u vektor) - jer imamo
komplementarno sparivanje baza koje pomaže DNA-ligazi

 tip I: kidaju DNA > 1000 pb dalje od mjesta prepoznavanja

 tip II: kidaju DNA unutar samog mjesta prepoznavanja → značajne za kloniranje!!!
 tip III: kidaju DNA 24-26 pb nizvodno od mjesta prepoznavanja

 do sada je otkriveno oko 3000 restrikcijskih endonukleaza koje prepoznaju preko 200
različitih slijedova:
 izoshizomeri - prepoznaju isti slijed (ali ne kidaju nužno na istom mjestu)
 izokaudameri - stvaraju iste krajeve (ali ne prepoznaju nužno isti slijed)
 nomenklatura: EcoRI - od Escherichia coli RYI3, 1. izolirana RE
Druge nukleaze:
1. Nukleaza Bal 31 - 3’-egzonukleaza + endonukleaza
 ako je prisutna u većoj konc. skraćuje DNA lanac s obje strane
2. Egzonukleaza III - stvara 5’ istaknute krajeve
3. Egzonukleaza λ - stvara 3’ istaknute krajeve
4. DNaza I - nasumično kida ss i ds DNA
5. Nukleaza S1 - kida isključivo ssDNA (ili RNA)
6. RNaza - kida RNA
Metil-transferaze:
 metiliraju DNA
 sadrže ih mnogi bakterijski sojevi E. coli: metil-transferaze Dam (GA*TC) i Dcm (CC*AGG
i CC*TGG)
 omogućuju bakterijama da su otporne na vlastite RE - jer su mjesta
prepoznavanja metilirana (RE ne može prepoznati metilirane nukleotide!)
 metilacija utječe i na sposobnost transformacije - DNA iz Dam (+) soja teže će
transformirati Dam (-) bakteriju; Dam od DNA adenine methyltransferase
DNA-ligaza:
 popravlja ss lom u okosnici šećer-fosfat između dvaju susjednih nukleotida u DNA
 u molekularnom kloniranju najčešća je DNA ligaza bakteriofaga T4 - T4 DNA-ligaza
 kod molekularnog kloniranja povezuje krajeve DNA nastale razgradnjom restrikcijskih
enzima - lakše se povezuju ljepljivi nego tupi krajevi (komplementarno sparivanje baza)
 optimalna temp. za djelovanje DNA-ligaze je 37°C, ALI pri toj temp.
vodikove veze između ljepljivih krajeva nestabilne su
  ljepljivi krajevi: 3h na 22°C ili 16h na 16°C (moderna verzija je 5 min na
sobnoj temp. u posebnom puferu)
 tupi krajevi: 4-16h na 22°C

Vektori:
Vektori su strukture u koje ugrađujemo DNA koju želimo klonirati, a zatim vektore ugrađujemo
u stanicu domaćina gdje se geni od interesa umnažaju (skupa s vektorima i stanicama
domaćina). Imaju nisku molekulsku masu (2-40 kb) kako bi se u njih moglo ugraditi čim više
DNA, a da se ne preoptereti stanicu domaćina. Imaju ishodište replikacije, selektivni biljeg za
otkrivanje u stanici domaćina (da znamo je li u neku konkretnu stanicu ugrađen vektor ili nije) i
imaju velik br. jedinstvenih restrikcijskih mjesta za ugradnju DNA (obavezno jedinstvena
mjesta jer kad bi postojala 2 ista, došlo bi do otkidanja fragmenta iz vektora).
Vektori se razlikuju prema veličini fragmenata koja se u njih može ugraditi:
 plazmidi - najmanji fragmenti (oko 10 pb)
 bakteriofagi
 kozmidi (hibridni vektori)
 umjetni kromosomi - najviše (kvaščev umjetni kromosom može prihvatiti 250-400kb)

Prirodni plazmidi:
1. Plazmidi za virulenciju - sadrže gene za toksine (kolicin); većina vektora nosi ishodište
replikacije iz plazmida ColE1
2. Konjugacijski plazmidi (F-plazmidi, F od fertility) - kodiraju protein koji se veže za fag
M13
3. Plazmidi za rezistenciju - izvor gena za rezistenciju na antibiotike
ANALIZA USPJEŠNOSTI KLONIRARNJA:
Sve stanice domaćina nisu uspješno primile vektor, a i one koje jesu, nije nužno da se radi o
vektoru koji je rekombinantan. Zato uz to što moramo provjeriti je li do ugradnje uopće došlo,
moramo provjeriti je li ugrađeni vektor rekombinantan ili nije. Tu provjeru uspješnosti
kloniranja moguće je napraviti jednom od sljedećih metoda:
I. elektroforeza: izolira se rekombinantna plazmidna DNA iz stanica domaćina, razgradi se
restrikcijskim enzimima i analiziraju se fragmenti elektroforezom (primjenjivo za sve
vrste vektora!)
II. insercijska selekcija - za vektore s 2 selekcijska biljega (primjer pBR322 plazmida)
III. plavo-bijela selekcija (α-komplementacija) - za vektore s α- fragmentom β-galaktozidaze
(primjer pUC18/19 plazmida)
pBR322 plazmid:
Jedan je od prvih vektora konstruiranih u laboratoriju. Mala
je molekula koja se lako izolira i može primiti 5-10 pB DNA.
Sadrži nekoliko jedinstvenih restrikcijskih mjesta za
kloniranje. Sadrži gene za restenciju na ampicilin (ampr) i
tetraciklin (tetr) - mjesto za rezistenciju na tertaciklin mjesto
je za insercijsku selekciju: prazan plazmid rezistetan je na i na
amp i tet, a rekombinantan samo na amp, zato što se
rekombinacijom kida gen za resitenciju na tet.
prazan plazmid - rezistentan na amp i tetr
rekombinantan plazmid - rezistentan samo na amp

pUC18/19:
Mali visokokopijski plazmid koji se razlikuje u orijantaciji višestrukog mjesta za kloniranje. Sadrži
dio lac-operona koji kodira za α-fragment β-galaktozidaze (α-fragment je na N-terminalnom
dijelu enzima, kodiran je plazmidom, a na C-terminalnom dijelu je ω-fragment, kodiran u
genomu). Ekspresija β-galaktozidaze može se inducirati dodatkom IPTG u medij u kojem rastu
bakterije - u prisutnosti IPTG (induktor), na mediju s X-Gal (supstrat za β-galaktozidazu;
galaktoza vezana na supstituirani indol), bakterija sintetizira oba fragmenta enzima, enzim je
cjelovit, na njega se veže supstrat, dolazi do njegove razgradnje i stvara se plavo obojenje. Kada
plazmid rekombiniramo ugradnjom DNA unutar
lac-operona (mjesto lac-Z gena), dolazi do
inaktivacije N-terminalnog α fragmenta enzima pa
bakterije s rekombinantnim plazmidom nemaju
cjelovit enzim, na njega se ne veže supstrat i ne
dolazi do plavog obojenja, pa su kolonije bijele
boje. Plazmid također sadrži gene za rezist. na
amp - u podlogu se stavlja amp kako bi ubio
bakterije koje uopće nemaju ugrađen plazmid.
prazan plazmid - plave kolonije
rekomb. plazmid - bijele kolonije

Lac-operon: građen od triju gena:

1. Z - za β-galaktozidazu
2. Y - za permeazu
3. A - za transacetilazu
Alolaktoza izomer je laktoze (galaktoza-β(1,6)-glukoza) koji nastaje djelovanjem malih količina
β-galaktozidaze na laktozu.
Alolaktoza djeluje kao INDUKTOR koji se veže na
REPRESOR što dovodi do promjene njegove
konformacije i on više ne može biti vezan za
OPERATOR (O). RNA-polimeraza tada je slobodna
vezati se na PROMOTOR (P) i prepisivati gene iz
lac-operona.
Ako alolaktoze nema, ako nije vezana na
represor, on ima konformaciju u kojoj se može
vezati na operator čime je RNA-polimerazi
blokiran put za transkripciju.
U laboratoriju se umjesto alolaktoze kao induktor
upotrebljava IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid), a
za supstrat beta-galaktozidazi u podlogu stavlja
se X-Gal.

Bakteriofagi:
Bakteriofagi su virusi koji inficiraju bakterije. Bakterijska infekcija zbiva se na 2 moguća načina:
a) Litički ciklus - dovodi do lize stanice (virus razara bakterije prilikom razmnožavanja)
 rekombinantni fag uvodi se u bakterijske stanice, umnaža se u bakteriji, lizira ju i na
bakterijskoj ploči nastaju plakovi - čista područja iz kojih se može izolirati
(rekombinantna) DNA
 ima ga bakteriofagi T4 i λ (λ ima i lizogeni ciklus!)
 litički ciklus detaljnije: fag se prihvaća na površinu bakterije, otpušta lizozim i kontrahira
rep kako bi ubacio NA pod tlakom u bakteriju (tlak je približno jednak tlaku kojim čep
izlazi iz boce vina), u slučajevima kada bakterija nema prikladne restrikcijske nukleze da
razgradi strani genom, mašinerija bakterije prepoznaje DNA faga kao vlastiti, replicira ga,
transkribira i translatira, spontanim udruživanjem kapsomera i enzimskim ubacivanjem
NA u kapsidu formiraju se novi fagi i oni izlaze van iz stanice lizirajući je (fag T4 u 24 min
otpusti 100-200 viriona).
b) Lizogeni ciklus - DNA faga ugrađuje se u genom bakterije i umnaža se skupa s njim
 stvaraju se posebni bakterijski sojevi s novim svojstvima - npr. ekspresijski soj E. coli
BL21 (DE3)
 ima ga bakteriofag λ
 lizogeni ciklus detaljnije: fag se prihvaća na površinu bakterije i unosi NA u bakteriju,
virusni genom odmah se ugrađuje u genom domaćima - nastaje PROFAG (inaktivni fag)
 koji se replicira skupa s genomom domaćina kroz nekoliko generacija, u slučaju kem. i
fiz. indukcije oštećenja DNA može doći do prelaska iz lizogenog u litički ciklus, a onda
dolazi do sinteze dijelova faga, sklapanja virusnih čestica i otpuštanja zrelih viriona
Bakteriofag λ:
Genom je veličine 48,5 kb, ima oko 50 gena - mnogi su uključeni u rekombinaciju i lizogeni ciklus
te stoga nisu nužni za umnažanje faga i litički put. Svi oni su uvjetno rečeno nepotrebni, tj.
mogu se ukloniti i zamijeniti stranom DNA! Ovaj fag pogodan je i za male (0-5 kb) i za velike (10-
20 kb) inserte, u njega je moguće ugraditi do 23kb strane DNA. Znači vadimo van gene za
lizogeni ciklus i na njihovo mjesto prikopčamo fragment kojeg želimo umnožiti.

Litički ciklusa bakteriofaga λ:

DNA bakteriofaga je linearna molekula, smještena je u glavi faga i na krajevima ima cos-mjesta
(cos od cohesive) - to su asimetrični ljepljivi krajevi od 12pb.
Ulaskom genoma u bakteriju, dolazi do cirkularizacije DNA i ona se kao takva nekoliko puta
replicira. Nakon što se cjelovita kružna DNA umnožila nekoliko puta slijedi replikacija
kotrljajućeg kruga - na kalupu
unutarnjeg kruga formira se
dugačka ssDNA s
konkatamernom strukturom
(duga kontinuirana ssDNA koja
sadrži više kopija čitavog
genoma, a kopije su
međusobno odjeljene cos-
mjestima). Na kalupu tog
dugog ssDNA lanca
komplementarno se sintetizira
drugi lanac. U konačnici se
dobiva uzastopce povezana
hrpa kopija genoma, a kopije su međusobno odijeljene cos mjestima. ”Replikacija kotrljajućeg
kruga” zato jer untarnji krug cirkularne DNA izgleda kao da se vrti i na temelju te vrtnje
omogućena je sinteza te dugačke ssDNA. U stvarnosti cirkularna DNA ima oblik grčkog slova
theta, a konkatamerna struktura izgleda kao sigma.
Virusna λ-terminaza zadužena je za kidanje DNA na cos-mjestima. Nakon toga slijedi pakiranje
DNA veličine 37-52kb u virusnu česticu.
Derivati bakteriofaga λ: EMBL3, λgt10, Charon 16A

Kozmidi:
Kozmidi su hibridi plazmida i bakteriofaga λ. To su mali plazmidi koji sadrže cos-mjesta iz faga λ
te plazmidno ishodište replikacije i selekcijski biljeg.
Razgradnjom restrikcijskim enzimima i ugradnjom strane DNA u višestruko mjesto za kloniranje
stvaraju se konkatamerne strukture povezane cos-mjestima. Uz dodatak ekstrakta za pakiranje
in vitro mogu se dobiti virusne čestice koje sadrže rekombinantni kozmid. Virusne čestice
inficiraju bakterijske stanice, a unutar samih bakterijskih stanica kozmidi se ponašaju kao
plazmidi - to znači da neće stvarati plakove u bakterijskoj kulturi (kao što bi to napravio fag), već
će se kozmidi umnažati unutar bakterija i to neovisno o bakterijskom genomu.

Umjetni kromosomi:
Umjetni kromosomi služe za umnažanje velikih fragmenata genoma (koje ne bismo mogli
umnožiti u plazmidima).

P1 umjetni kromosom - PAC (P1 artificial chromosome):

PAC je napravljen na bazi P1 faga. P1 fag najveći je bakteriofag koji napada E. coli, replicira se
kao autonomni izvankromosomski element. PAC može primiti i propagirati inserte veličine do
95 kb. Sadrži pac mjesto - to je slijed nukleotida koji mu omogućuje in vitro izgradnju kapside i
pakiranje u virusne čestice (ako pomiješamo genom od interesa i pac mjesto, stvorit će se
virusna kapsida oko našeg genoma i tako dobivenom česticom moći ćemo inficirati E. coli). Ima
2 loxP mjesta - to su mjesta koja služe za cirkularizaciju pakirane DNA po ulasku u E. coli. Cre-
rekombinaza enzim je koji cirkularizira genom. Cre-rekombinaza nije prirodno dio P1 faga i ne
nalazimo je u PAC-u, potrebne su nam bakterije koje ju sadrže, a to su laboratorijski dobiveni
cre(+) sojevi E. coli. E. coli u prirodi nikako nemaju cre-rekombinazu, to ne bi ni imalo nikakvog
smisla jer cre(+) sojevi omogućavaju umnažanje virusnog genoma u bakteriji, a bakterija nije
luda da bi si sama od sebe to bi priuštila.
Tu su još 2 ishodišta replikacije: ishodište replikacije za mali broj kopija za održavanje
kromosoma u E. coli i ishodište replikacije za veliki broj kopija za proizvodnju DNA.
Selekcijski biljeg gen je za rezistenciju na kanamicin - bakterije koje su uspješno inficirane
fagom rezistentne su na kanamicin (rezistencija je upisana u genom faga).
Postupak je takav da prvo linariziramo PAC genom, u njega insertiramo gene koje želimo,
upakiramo sve u kapsulu (stavimo dobiveni genom u posudu skupa sa smjesom proteina faga
gdje zahvaljujući pac mjestu dolazi do formiranja kapsule oko nukleinske kiseline), sve skupa
ubacimo u cre(+) bakteriju, ondje dođe do cirkularizacije DNA i napravimo niz replikacija.
Zašto genom bakteriofaga mora biti linearan u čestici faga? Cirkularna DNA ne bi mogla ući u
bakteriju, linearna se može provući kroz vrat faga, buši se membrana bakterije i DNA ulazi u
bakterijsku stanicu.
Zašto dolazi do cirkularizacije genoma faga u bakterijskoj stanici? Da bi replikacija bila
neovisna o replikaciji bakterijske DNA.
Zašto su potrebna 2 ishodišta replikacije? Krajnji je cilj proizvesti čim više kopija našeg
kromosoma u kojeg je ugrađen gen od interesa. Da bismo to ostvarili, ne možemo pretrpati
jednu bakteriju ogromnim brojem kopija umjetnog kromosoma zato što bi došlo do
preopterećenja replikacijskog sustava. Potreban je stoga velik broj bakterija u kojima se nalazi
umjerena količina umjetnih kromosoma. Takve se bakterije brže dijele i u konačni produciraju
više klonova. Zbog toga imamo jedno ishodište replikacije koje održava mali broj kopija
kromosoma unutar bakterije i drugo ishodište koje služi za umnažanje ciljnog fragmenta
kromosoma.
Bakterija ima 5 mil nukleotida, umjetni kromosom grubo rečeno 100 000 i bakterija umnaža to
sve jer ne zna što je od toga genomski dio, a što nije. Ako tih 100 000 nukloetida stavimo 100x
dobit ćemo ogroman broj kopija po jednoj bakteriji, ali ta bakterija imala bi toliko prebukiran
replikacijski sustav da bi u konačnici bila iznimno neefikasna.
Što bi se dogodilo da umnažamo u cre(-) bakteriji? Ne bi došlo do cirkularizacije, ne bi došlo do
umnažanja umjetnog kromosoma, jednostavno rečeno ne bi se dogodilo ništa.

Bakterijski umjetni kromosom - BAC (bacterial artificiral chromosome):

Temelj BAC-a je F-plazmid bakterije E. coli. Koristi se za kloniranje većih fragmenata DNA, do
300 kb. To je nisko kopijski vektor koji dolazi u svega 1-2 kopije po stanici kako bi se izbjegla
toksičnost velikih fragmenata strane DNA i rekombinacija s DNA domaćina. BAC sadrži cos
mjesto i lox mjesto koja služe za vezanje λ-terminaze i Cre-rekombinaze. λ-terminaza zadužena
je za rezanje DNA u cos mjestu čime stvara ljepljive krajeve, a Cre-rekombinaza cirkuarizira DNA
po ulasku u bakteriju. Sadrži gene oriS i repE koji kontroliraju replikaciju, gene parA i parB koji
održavaju mali broj kopija BAC-a.
Selekcijski biljeg gen je za rezistenciju na kloramfenikol (CmR).
HindIII i BamHI jedinstvena su mjesta za kloniranje.
T7 i S6 promotori imaju ulogu u proizvodnji RNA.
Na što se odnosi pojam toksičnosti DNA? Ako u bakteriju unesemo preveliku količinu strane
DNA, to će dovesti do smrti bakterije. Nije dobro da je unesena DNA veća od genoma same
bakterije. S obzirom da strana DNA u ogromnim količinama odvodi u smrt, koristi se pojam
toksičnosti, iako DNA nije toksin!
Koje su prednosti upotrebe BAC i PAC bakterijskih sustava? Bakterijski sustavi BAC i PAC
jednostavni su za manipulaciju i učinkoviti za transformaciju (puno veća učinkovitost nego u
slučaju YAC). Nisu kimerni, vrlo su stabilni, nema delecije fragmenata.

Kvaščev umjetni kromosom - YAC (yeast artificial chromosome):

Koristi se za kloniranje vrlo vrlo velikih fragmenata - i do 2 Mb (2 mil. nukleotida). Njegova se
stabilnost povećava s veličinom inserta.
U odsutnosti strane DNA repliciraju se kao plazmidi u E. coli - za to je potrebno ishodište
replikacije. Molekula DNA klonira se u jedinstveno mjesto za kloniranje. YAC s insertom uvodi se
u stanice kvasca gdje se replicira kao eukariotski kromosom - za to treba centromeru i telomere.
YAC je “shuttle vektor” što znači da se može ugraditi u više domaćina - prvo vektore umnožimo
u E. coli, zatim u njih ubacujemo što želimo i kao takve ih ugradimo u kvasac.
YAC znači sadrži kvaščevu centromeru, 2 kvaščeve telomere, ishodište replikacije E. coli,
ishodište replikacije za kvasac (ARS - autonomously replicationg sequence) te selekcijske
biljege za bakteriju i kvasac.
Nedostaci YAC-a:
 40-60% YAC vektora u većini knjižnica su kimere
 oko 40% YAC vektora u većini knjižnica nose delecije
 slaba je učinkovitost transformacije
 teški su za manipulaciju
 nestabilni su
Kimerni fragmenti nastaju uslijed rekombinacije koja je posljedica fragmentiranosti genoma.
Prilikom rekombinacije dolazi do nasumične ligacije. Ona ipak nije totalno nasumična i kaotična
jer YAC ima centromeru i telomere, ali nikada sa sigurnošću ne možemo znati na koji će se način
u konačnici posložiti kromosomi prilikom umnažanja.
Je li kimerni fragment problem? Nije. Zato što od 2 mil nukleotida. koliko može biti ugrađeno u
YAC, velika većina bit će u susjedstvu odgovarajućih nukleotida, a nenormalni će biti samo oni
segmenti gdje se fragmenti spajaju.
Kako prepoznajemo kimeru? Da bismo znali da se radi o kimeri, da je došlo do nasumične, a ne
točne ligacije, cijeli postupak ponavljamo više puta i promatramo isti segment kromosoma na
više primjera kromosoma. Vjerojatnost da je nasumično kidanje rezultiralo spajanjem istih
segmanata na istom mjestu iznimno je mala pa ako uočimo takve jednakosti, možemo biti
poprilično sigurni da je došlo do točnog spajanja.
Nestabilnost je također posljedica rekombinacije. Ako jedna stanica kvasca kvaščev gen za
rezistenciju rekombinacijom preseli na neki drugi kromosom i ako nakon toga izgubi naš
kromosom, ta stanica je manje opterećena od onih kod kojih se nisu dogodile nikakve
promjene. Takva stanica, bez kromosoma kojeg smo ugradili, replicira se brže 10-20% i s
vremenom u potpunosti iz kulture istiskuje druge stanice pa opstaje samo kultura potekla od te
promijenjene stanice. A ta stanica nam je beskorisna.
Kako kvasac zna koji dio treba prebaciti na drugi kromosom? Ne zna. Događa se brdo
rekombinacija, a ako se dogodi ovakva, povoljna za kvasac, ona će se održati (i istisnuti ostale
kvasce iz kulture).

Stanice domaćina za kloniranje gena

Stanice domaćina za kloniranje gena one su stanice u koje se ugrađuje vektor. One se
umnažaju, a skupa s njima umnaža se i vektor i naravno geni od interesa ugrađeni u taj vektor.
Bakterijske domaćinske stanice:
E. coli - najčešće upotrebljivana stanica domaćin za kloniranje gena:
 G (-) štapić, genom 4,6 Mpb, oko 4000 gena
 selekcijski biljezi - geni za rezistenciju na antibiotike
 laboratorijski sojevi (ne koriste se bakterije iz prirode!) - značajan je soj K12 (izoliran
1921. i do danas održava se kao čista kultura)
 nema restikcijsko-modifikacijski sustav → neće razoriti umetnuti fragment
 ima modificiran sustav za rekombinaciju (recA -) → plazmidna DNA neće se
ugraditi u bakterijski genom
 ima mutiranu endonukleazu I → za povećanje br. kopija plazmida
 ima odstranjene gene za toksine i virulenciju (ne može preživjeti izvan labosa)
 danas se najčešće upotrebljavaju varijante soja K12 XL-1 Blue i DH5a
Uvjeti uzgoja:
Tip hranjivog medija odabire se ovisno o proteinu koji se proizvodi. U pravilu se prednost daje
bogatom i kemijski definiranom mediju, onom koji sadrži gotove hranjive tvari, ispred
minimalnog medija koji sadrži prekursore za proizvodnju hranjivih tvari.
 bogati medij: LB (Luria-Bertani), 2xTY, TB (puferiran fosfatnim puferom)
 tripton
 ekstrakt kvasca Auksotrofi su bakterije koje ne
 NaCl mogu same sintetizirati tvari
 pufer (u nekim tipovima) potrebne za njihov rast, potrebni
su bogati mediji za njihov uzgoj.
 kemijski definirani:
Suprotni njima su prototrofi koji se
 fosfatni pufer
mogu uzgojiti na minimalnom
 izvor dušika - amonijev klorid ili amonijev sulfat mediju.
  izvor ugljika - glukoza ili glicerol
 metali u tragovima - Ca, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Se, Zn
 vitamini - biotin, tiamin, folat, riboflavin, niacinamid, PABA, pantotenat,
piridoksin
Uzgoj u tikvici pogodan je za dobivanje proteina za znanstvena istraživanja.
Uzgoj u fermentatoru koristi se za dobivanje vrlo velikih količina proteina - proizvodnja
bioterapeutika i industrijski važnih proteina.
Temperatura - viša T znači bržu proizvodnju proteina zbog bržeg metabolizma, ali ponekad i
smanjenu topljivost te nedovoljno vremena za pravilno smatanje proteina
 prednost se daje nižoj T od 30°C ispred 37°C
Duljina ekspresije - što je dulja ekspresija, to je veća količina dobivenog proteina, ali ponekad i
smanjena topljivost
Količina induktora - više induktora daje veću ekspresiju, ali ponekad i smanjenu topljivost
Starost kulture - rana ili kasna logaritamska faza (ovisno o proteinu kojeg želimo eksprimirati)
Bakterijska citoplazma nije povoljno okružje za stvaranje disulfidnih mostova (u njoj su uvjeti
oksidativni). Stoga se pomoću signalnih sekvenci vrši preusmjeravanje proteina:
 u periplazmatski prostor bakterije - između membrane i stanične stijenke
 izvan stanice - izlučivanje u medij
(osim stvaranja SS mostova, ovo je super i za lakše pročišćavanje proteina)

Krivulja rasta bakterijskih stanica:

Razlikujemo LAG fazu (A),
eksponencijalnu fazu (C) i stacionarnu
fazu (E). Bakterije eksponencijalne faze
koriste se za istraživanja (npr. ekspresiju
pojedinih proteina). Bakterije stacionarne
faze, dobivene nakon 16-18 h rasta,
koriste se na inokulum nove kulture
(uzme se mali dio kulture i stavi u novu
petrijevku).
Iz semi-logaritamskog prikaza odredite generacijsko
vrijeme (vrijeme udvostručenja) za bakterijski soj u 2
različita hranidbena medija. Iz grafa se odredi gdje je
eksponencijalna faza rasta (pravac na semi-
logaritamskom grafu). Na tom pravcu uzmemo dvije
točke koje odgovaraju X broju bakterija i 2X broju
bakterija te očitamo koliko je vremena prošlo da se
broj bakterija udvostručio. U minimalnom mediju
generacijsko vrijeme je 50 min, a u bogatom mediju 30 min. Općenito, produljeno generacijsko
vrijeme znači usporen rast zbog toga jer nešto fali. S jedne strane može se raditi o mediju, a s
druge strane može biti odgovorna i sama bakterijska kolonija. Npr. ako kolonija ima inaktiviran
neki gen koji je esencijalan, usporit će se rast i generacijsko vrijeme bit će duže. Ta se činjenica
može iskoristiti za proučavanje je li neki gen esencijalan ili nije. Također uvijek je veća brzina
udvostručenja u bogatom mediju naspram minimalnog.
Eukariotske stanice domaćini:
Iako su bakterijske stanice (E. coli) jako pogodne za upotrebu u molekularnoj biologiji, određeni
pokusi ne mogu se provesti u njima, već su potrebne složenije stanice - eukariotske stanice.
 kvasci
 stanice insekata u kulturi
 biljne stanice u kulturi
 stanice sisavaca u kulturi
Kvasac Saccharomyces cerevisae:
Radi se o jednostaničnom eukariotskom organizmu koji je jednostavan za uzgoj u laboratoriju -
ima vrijeme diobe 1,5-2h na 30°C. Ima haploidni i diploidni životni ciklus. Diploidnost
omogućuje mutacije esencijalnih gena koji bi bili letalni u haploidnom soju - zbog diploidnosti
njihovi esencijalni geni dolaze u 2 kopije pa inaktivacijom jedne kopije stanica preživaljava (to
nije moguće kod bakterija jer imaju samo po jednu kopiju gena).
Mogu se uzgajati fermentacijom na glukozi ili respiracijom na izvoru ugljika kao što je glicerol ili
etanol (razni alkoholi dolaze u obzir), što nije moguće kod viših eukariota.
Idealni su za studije mitohondrijskih proteina potrebnih za stanično disanje.
Selekcijski biljezi kvasca geni su za proizvodnju pojedinih AK i nukleotida: his3, ura3, trp1, leu2,
ade2. To nisu geni za AK ili nukleotide nego geni za enzime u njihovom biosintetskom putu -
his3 je 3. enzim u biosintetskom putu za histamin i sl.
U laboratorijskim sojevima kvasca geni koji služe kao selekcijski biljezi, i koji su smješteni na
kvaščevim vektorima, u genomu kvasca inaktivirani su.

Animalne kulture (stanice insekata i sisavaca):

Primarne kulture stanica dobivene su izravno iz embrijskih, odraslih ili tumorskih stanica. One
rastu u jednom sloju (kontaktna inhibicija), neke se mogu dijeliti, neke ne (onakve su kakve bi
bile u živom organizmu), najsličnije su ponašanjem živim stanicama (u odnosu na druge
kulture). HUMANI FIBROBLASTI odlični su za uzgoj jer zadržavaju sposobnost dijeljenja, imaju
originalni diploidni kariotip, imaju pogodan stupanj diferenciranosti i dosta vjerno prikazuju in
vivo stanje.
Stanične linije nastaju diferencijacijom i transformacijom primarnih staničnih kultura.
Transformacija je fiziološka adaptacija i ne nastaje zbog mutacija. Neke primarne kulture
spontano prelaze u stanične linije, a druge potičemo kemikalijama (3,4-benzpiren, nitrometil-
urea) ili virusima (RSV). One se ponašaju slično tumorskim stanicama: nema kontaktne
inhibicije, dijele se neograničeno, brže rastu u odonsu na normalne stanice.
Najpoznatiji primjer stanične linije su HeLa stanice - epitelne stanice ljudskog karcinoma
cerviksa.
Kod staničnih linija razlikujemo adherirajuće kulture i stanične suspenzije. Adherirajuće kulture
sadrže stanice adherirane na podlogu, one prianjaju na posuđe u kojem se uzgajaju. Stanice
nisu pravilnog kuglastog oblika. Primjeri su primarne kulture, normalne diploidne stanične linije
i neke tumorske stanične linije. Stanične suspenzije plivaju u mediju u kojem se uzgajaju,
podsjećaju na mikrobne kulture. Uzgajaju se u bocama ili petrijevkama, nekad uz miješanje (ako
je gustoća stanica velika). One imaju pravilan kuglasti oblik. Primjeri su hibridoma stanice, HeLa
stanice, neke tumorske stanične linije.
Uvjeti uzgoja su kontrolirana T, medij, pCO2, vlažnost (kultura ne smije ostati suha). Obavezno
STERILNOST (suha sterilizacija, autoklav, zračenje, filtiranje)! Posuđe mora biti netoksično, po
mogućnosti prozirno. Stalan br. stanica mora se održavati presađivanjem.
Medij za uzgoj razlikuje se za različite stanice. Generalno sastav je sljedeći:
 PBS - fosfatni pufer s dodatkom soli, koristi se za ispiranje stanica prije presađivanja
 RPMI 1640/MEM/DMEM - različiti mediji za različite tipove stanica (ne pamtiti imena :D)
 fetalni goveđi (teleći) albumin (FBS/FCS) - 0-20% serum - dovodi svakakve tvari
stanicama
 faktori rasta
 transferin (Fe)
 lipidi
 inzulin
 različiti proteini - štite od kidanja, vrše detoksikaciju itd.
 problemi seruma: dovodi infektivne čestice (virusi, mikoplazme, prioni), sastav je
slabo definiran i pakiranja se međusobno razlikuju, visok udio proteina otežava
pročišćavanje proteina (problem kod uzgoja rekomb. proteina), skup je
Konfluentnost je mjera gustoće staničnih kultura. Kada kultura dostigne konfluentnost (medij je
pravilno popunjen stanicama), potrebno je presađivanje. Kod adherirajućih stanica prethodno
treba stanice odvojiti od podloge nekom od metoda: tripsinizacijom (djeluje se tripsinom oko 1
min, onda se doda serum da se zaustavi djelovanje tripsina i spriječi razgradnja membranskih
proteina) ili mehaničkim struganjem stanica s podloge (strugalica “ruber policeman”; paziti da
se ne ošteti membrana). Razdvajanje stanica koje se drže zajedno obavlja se raspuhivanjem
(pipetom). Kulture u suspenziji presade se prebacivanjem male količine stanica u svježi medij.
Kod inokacije potrebna je MINIMALNA GUSTOĆA STANICA kako bi se osigurala dovoljna količina
faktora rasta u mediju (faktore rasta luče same stanice). Po tome se ove kulture razlikuju od
mikrobnih jer bi mikrobna kolonija nastala od jedne jedine stanice u pogodnom mediju, a ovdje
se u tom slučaju ne bi dogodilo ništa.
Brojenje stanica radi se hemocitometrom. Na njemu su pristuna 4
velika kvadrata (na slici 1, 2 ,3 i 4). Stanice se nanose na
hemocitometar i bojaju tripanskim modrilom - ono boji samo mrtve
stanice (u žive stanice boja ne ulazi). Broje se samo neobojane
stanice!! Broj stanica po mL medija računa se sljedećim izrazom:
br. stanica/mL = prosječan br. stanica po velikom kvadratu x faktor
razrjeđenja
Metode unosa DNA u stanicu domaćina
Domaćini moraju biti kompetentni - KOMPETENTNE STANICE one su koje su spremne primiti
stranu DNA. Raznim metodama može se povećati kompetentnost odnosno prijemčljivost strane
DNA u stanicu domaćina.
Metode su sljedeće:
 transformacija - unos DNA u bakterije (metoda s CaCl2) i kvasac (metoda s Li-acetatom)
 CaCl2 metoda - čini površinu stanica (+) nabijenom tako da privlači (-) nabijene DNA
 sve se radi na ledu jer pospješuje postupak
 nakon toga slijedi toplinski šok pri čemu DNA ulazi u stanicu
 transdukcija/transfekcija - unos DNA u bakterije pomoću virusa
 konjugacija - prijenos DNA iz jedne bakterije u drugu ili u sferoplaste kvasca pomoću putem
plazmida
 transfekcija/transformacija - unos DNA u animalne stanice - precipitacijom s CaPO4, putem
virusa ili putem liposoma
 liposomi - (+) nabijeni da privlače (-) nabijenu DNA, omogućuju lakši prolazak kroz
staničnu membranu
 elektroporacija - unos DNA (ali i RNA, proteina, boja) primjenom kratkog električnog pulsa,
koristi se za razne stanice - izlaganje električnom šoku (240V) dovodi do stvaranja sitnih
lezija u staničnoj membrani koje omogućavaju ulazak DNA u stanicu
 ovdje je važno stanice isprati sterilnom deioniziranom vodom - inače el. šok reagira s
elektrolitima i dođe do spaljivanja svih stanica

Različite metode transformacije imaju razlilčitu učinkovitost. Metoda s CaCl2 2x je manje

učinkovita od elektroporacije - elektoporacija daje 109-1010 transformanata/µg plazmidne DNA,
a metoda s CaCl2 106-108 transformanata/µg plazmidne DNA.
Učinkovitost transformacije = broj transformanata po 1 µg plazmidne DNA
U labosima je uvijek učinkovitost manja od izračunate! U industriji nešto bolje.

Eukariotski vektori:
Mnogi eukariotski geni izolirani su kloniranjem u E. coli, međutim za različite primjene
genetičkog inženjerstva (proizvodnja proteina u eukariotskim stanicama, kreiranje novih biljaka,
genska th i sl.) potrebni su vektori za ekspresiju gena u različitim vrstama eukariotskih stanica.
Većina eukariotskih vektora su tzv. shuttle vektori (vektori prenositelji) - sadrže ishodišta
replikacije i selekcijske biljege za E.coli i za željenu eukariotsku stanicu. Konstrukcija i analiza
rekombinantne DNA obavlja se u E. coli zbog jednostavnosti i dostupnosti mnogih razvijenih
metoda, a daljnji pokusi i/ili proizvodnja proteina sele lokaciju u eukariotsku stanicu.

Vektori za kloniranje kod biljaka:

Za kloniranje kod biljaka najčešće se koriste virus mozaične bolesti duhana i plazmid Ti (Tumor
inducing) iz bakterije Agrobacterium tumefaciens. Ta bakterija uzrokuje tumore kod biljaka
integracijom 8 gena s plazmida Ti u genom biljke.
Biljni vektori temeljeni na plazmidu Ti NEMAJU gene koji uzrokuju tumor, ali nose gene za
integraciju klonirane DNA u genom biljke. Rekombinantni vektor uvodi se u biljku namakanjem
sjemenki u kulturi Agrobacterium tumefaciens ili se vektor ubacuje u stanice od kojih u kulturi
nastaje cijela biljka.
Selekcijski biljezi omogućuju selekciju samo onih stanica koje nose plazmidnu DNA.
Plazmid Ti:
Plazmid Ti prirodni je plazmid Agrobacterium tumefaciens.
Nosi gene za tumorigenezu (biljni hormoni) i virulenciju - geni
za sintezu i uporabu neobičnih aminokiselina, npr. opina.
T-DNA regija jest regija u plazmidu koja nosi gene za
tumorigenezu. Ona je omeđena ponavljajućim sljedovima
pomoću kojih se nasumično ugrađuje u genom biljke. Ta T-
DNA regija može se zamijeniti stranom DNA i kao takva unijeti
u biljku. Geni za tumorigenezu zamjenjuju se genima proteina
od interesa.

Vektori za stanice sisavaca:

Vektori za stanice sisavaca hibridi su bakterijskih vektora i regulatornih sljedova virusa:
Simian virus 40 (SV40) mali je tumorski DNA virus.
 koristi se za kloniranje malih fragmenata DNA
 uzrokuje prolaznu (transientnu) ekspresiju klonirane DNA
Retrovirus je ssRNA virus koji sadrži gen za reverznu transkriptazu koja sintetizira dsDNA na
kalupu RNA, a ta DNA ugrađuje se u genom domaćina.
 inficira stanice koje se aktivno dijele
Adenovirus je dsDNA virus.
 s vrlo velikom učinkovitošću inficira mnoge tipove stanice s malom vjerojatnosti
uzrokovanja bolesti
 ne mora inficirati samo stranice koje se aktivno dijele

Selekcijski biljezi za stanice sisavaca u kulturi:

AGENS
Blastacidin S
G-418 (geneticin)
MSX (metionin slufoksimin)
MTX (metotreksat)
DJELOVANJE
inhibira sintezu proteina
inhibira sintezu proteina
inhibira sintezu glutamina
inhibira sintezu DNA
GEN BILJEG
blastacidin S deaminaza
neomicin fosfotransferaza
glutamin sintetaza
dihidrolat reduktaza

Proizvodnja rekombinantnih proteina:

Gen se klonira u ekspresijski vektor - koji sadrži kontrolne sljedove za transkripciju (promotor,
nekad i terminator) i translaciju (slijed za vezanje na ribosom).
Ekspresija proteina potakne se dodatkom induktora u već uzgojenu staničnu kulturu. Uz jaki
promotor proizvodnja proteina u stanici domaćina može biti čak i do 30% veća od normalne
(govorimo o “prekomjernoj ekspresiji” → eksprimirani produkt može predstavljati veći udio
ukupnih proteina u stanici).
Važno je da je kolonija umnožena, da sadrži dovoljno velik br. stanica prije dodatka induktora
kako bismo u kratkom vremenskom periodu mogli dobiti veliku količinu rekombinantnog
proteina. Na taj način spriječit ćemo da protein, ako je toksičan, ubije cijelu koloniju, a također
ćemo protein lakšće detektirati onda kada ga je puno.
Rekombinantni proteini važna su za znantvena istraživanja (tzv. proteinska biokemija) - za
provođenje raznih enzimskih testova, proizvodnju pt na određene proteine, određivanje
prostorne strukture proteina, istraživanje interakcija protein-protein… Također su važni za
farmaciju, medicinu i biotehnologiju - proizvodnja rekombinantnih lijekova kao što su hormoni i
faktori rasta.

Domaćinske sustave dijelimo na homologne i heterologne ekspresijske sustave.

Homologni ekspresijski sustav onaj je kod kojeg se protein proizvodi u istom organizmu iz kojeg
potječe. Npr. protein iz E. coli uzgajamo u E. coli.
Heterologni ekspresijski sustav onaj je kod kojeg se protein ne proizvodi u istom organizmu iz
kojeg potječe nego u nekom drugom domaćinu. Npr. protein iz čovjeka proizvodimo u E. coli.
Važni su domaćinski sustavi Escherichia coli (i druge bakterije), Pichia pastoris (i drugi kvasci),
bakulovirusni sustavi, kulture animalnih stanica, kulture biljnog tkiva.
Odabir domaćinskog sustava ovisi o veličini proteina:
 veliki proteini (>100kDa) - eukariotski sustav
 mali proteini (<30kDa) - prokariotski sustav
Osim veličine proteina važna je i priroda proteina:
 obilježavanje proteina - E. coli
 potrebne su posttranslacijske modifikacije - kvasac, bakulovirusi ili dr. eukarioti (nikako
bakterijski sustavi!)
 potrebna je glikozilacija - bakulovirusni sustav ili stanice sisavaca u kulturi
Ekspresijski vektori moraju biti kompatibilni s domaćinskim ekspresijskim sustavom. Nazivamo
ih i translacijskim vektorima i karakterizira ih povećana proizvodnja proteina. Oni sadrže
regulatorne sljedove za transkripciju (promotor, terminator) i translaciju (vezna mjesta za
ribosome). U pravilu radi se o shuttle-vektorima (osim kod homologne proizvodnje).
 promotori = vezna mjesta za vezanje RNA-polimaraze
 JAKI PROMOTORI - omogućavaju povećanu ekspresiju proteina
  METABOLIČKI - reagiraju brzo ovisno o metaboličkim potrebama (kao kod
lac-operona)
 VIRUSNI - daju veliku količinu proteina jer virusi imaju svojstvo brzog
umnažanja u domaćinu pa brzo sintetiziraju svoje proteine za sklapanje
virusne čestice
 arabinozni operon
 promotor iz bakteriofaga T7
 Trc/Tac promotori - hibridi trp i lac promotora
 promotori iz faga λ - PL ili PR
Važni su i sljedovi za pomoćne proteine i afinitetne oznake (affinity tags) - sljedovi za povećanje
topljivosti, lakše pročišćavanje i sl.

Fuzijski protein ugl. nastaje povezivanjem željenog proteina s pomoćnim proteinom. Željeni
protein onaj je kojeg smo umnožili u ekspresijskom sustavu, a pomoćni protein ugl. služi za
optimizaciju ekspresije i pročišćavanje proteina:
 povećava razinu ekspresije ciljnog proteina - obično N-terminalna fuzija
 olakšava pročišćavanje proteina
 poboljšava topljivost protina
Današnji ekspresijski vektori sadrže sljedove za različite pomoćne proteine - GST (glutation
transferaza), MBP (maltoza binding-protein), intein; uz sljedove koje prepoznaju različite
proteaze kako bi se pomoćni protein na posljetku mogao odstraniti (pomoćni proteini veliki su
proteini i uvijek se moraju ukloniti od željenog proteina kako ne bi maskirali njegovu funkciju tj.
djelovanje za koje su namjenjeni).

Afinitetne oznake omogućuju lakše pročišćavanje i/ili detekciju rekombinantnog proteina

protutijelima specifičnim za afinitetnu oznaku (afinitetne kolone). U odnosu na fuzijske proteine
afinitetne oznake puno su manje, građene su od nekoliko AK.
 His-tag - 6-10 histidinskih ostataka za afinitetnu kromatografiju na koloni s niklom
 FLAG epitop DYKDDDK
 c-myc epitop EQKLISEDL
 T7-tag - 11 ostataka
 S-tag - 15 AK
Afinitetne oznake potrebno je razlikovati od selektivnih biljega! Selektivni biljeg omogućuje
razlikovanje rekombiniranih domaćina od onih koji to nisu (ili od onih u koje uopće nije ugrađen
vektor) dok afinitetne oznake pomažu u prepoznavanju proteina od interesa u šumi proteina
koji se eksprimiraju u stanici domaćina. Možemo reći da je selektivni biljeg važan prije
ekspresije, a afinitetna oznaka nakon.
Faktori koji utječu na ekspresiju proteina su ograničenja upotrebe kodona, tip hranjivog medija i
uvjeti ekspresije (temperatura, duljina ekspresije, količina induktora, starost kulture).
Genetički je kod degeneriran - više različitih kodona kodira istu AK:
Različita je učestalost različitih kodona kod različitih organizama za istu AK - imaju različit broj
pojedinih tRNA molekula. Zbog toga je potrebno optimizirati ekspresiju gena s obzirom na
upotrebu kodona (problem je ako umnažamo u E. coli eukariotski gen s puno kodona kojih je u
genomu E. coli malo, E.coli ima malo tRNA za te kodone) - može se promijeniti ishodni
nukleotidni slijed u genu ciljanom mutagenezom ili se mogu upotrijebiti sojevi s vektorima koji
kodiraju rijetke AK.

Ekspresijski sustav T7:

Ekspresijski sustav T7 najsveobuhvatniji je komercijalni ekspresijski sustav. Koristi RNA-
polimerazu iz bakteriofaga T7 integriranu u genom E.coli unutar lizogena DE3. T7 RNA-
polimeraza ne prepoznaje bakterijske promotore, već samo vlastiti T7 promotor - upotreba
vektora s T7 promotorom omogućava kontroliranu sintezu isključivo rekombinantnog proteina.
Ciljni protein može doseći udio i do 50% ukupnih proteina nakon nekoliko sati od indukcije. Za
ovaj sustav dostupan je velik broj ekspresijskih vektora (pET vektori - od
plazmid+expression+T7) i moguća je upotreba velikog broja različitih domaćinskih sojeva.
Na vježbama se upotrebljava pET25b(+) vektor.
 pelB - signalni slijed za usmjeravanje u periplazmatski prostor
 mjesto za prepoznavanje za signalnu peptidazu
 HSV-tag - epitop za monoklonsko pt (Western blot, imunofluorescencija)
 His-tag - slijed od 6 His ostataka za afinitetno pročišćavanje
Za regulaciju ekspresije E.coli sadrži kromosomsku kopiju gena za T7 RNA-polimerazu pod
kontrolom varijante lac-promotora. Soj je lizogen bakteriofaga DE3 - derivat faga λ koji ne
može prijeći u litički ciklus bez faga pomagača. Ciljni gen klonira se u pET vektor pod kontrolu T7
promotra. Proizvodnja T7 RNA-polimeraze inducira se dodatkom IPTG-a u hranjivi medij. S
obzirom da polimeraza prepoznaje isključivo T7 promotor na vektoru, uz dodatak IPTG-a dolazi
do proizvodnje ogromne količine ciljnog proteina.
Toksični proteini mogu se eksprimirati u soju koji sadrži plazmid pLysS ili pLysE koji kodiraju za
lizozim - prirodni inhbitor T7 RNA-polimeraze (ovo je primjer izrazito kontrolirane ekspresije).

Pichia pastoris ekspresijski sustav:

Pichia pastoris danas je najviše korišten kvasac za ekspresiju proteina. Može koristiti metanol
kao jedini izvor ugljika jer sadrži enzim alkohol oksidazu. Sadrži izuzetno jaki promotor za
alkohol oksidazu (AOX promotor) koji omogućava postizanje razine ciljnog proteina do oko 30%
ukupnih proteina (jer je metanol induktor AOX promotora pa dovođenjem metanola
pospješujemo ekspresiju gena koji su pod kontrolom AOX promotora).
P. pastoris često se koristi u kombinaciji s E. coli za proizvodnju proteina. Koriste se shuttle
vektori koji omogućuju propagaciju i u E. coli i u P. pastoris - imaju selektivne biljege i
regulatore transkripcije potrebne za oba organizma (ishodište replikacije ColE1 i selektivni biljeg
KanR za E. coli te AOX promotor, slijed za terminaciju transkripcije TT i selektivni biljeg HIS4 za
kvasac). Kloniranje i manipulacija vrše se u E. coli., a ugradnja u genom i ekspresija proteina u P.
pastoris.
Nakon ugradnje ciljnog gena vektor se mora linearizirati. Linearizirani vektor unosi se u P.
pastoris i ondje se ciljni gen homolognom rekombinacijom ugrađuje u genom kvasca na mjesto
gena za alkohol-oksidazu - to znači da je taj gen ugrađen na mjesto koje je pod kontrolom jakog
AOX promotora. Na taj način, uz dovoljno metanola, ciljni se gen eksprimira u velikoj količini.
Prednosti Pichia sustava: bez rast (8h za proizvodnju proteina), vrlo visok prinos proteina (10-
100 puta više nego u S. cerevisiae), jeftin hranidbeni medij (jednostavni sastojci), niska cijena
uzgoja u fermentatoru, moguća ekspresija velikih proteina (>50kDa), moguća glikozilacija i
odstranjivanje signalnog slijeda, dovoljno šaperona za smatanje problematičnih proteina,
moguća tvroba disulfidnih mostova u citoplazmi.
Pichie koje se koriste u labosu imaju inaktiviran gen koji im inače omogućuje izbacivanje
segmenata strane DNA i sprječava njegovo ugrađivanje u genom.

Bakulovirusni ekspresijski sustav:

Bakulovirus inficira stanice inseakata (gusjenice različitih leptira/moljaca). Tijekom infekcije
virusne su čestice pakirane unutar polihedrona - to su inkluzijska tijela smještena u jezgri
stanica i građena pretežno od polihedrina.
Životni ciklus bakulovirusa ima 3 faze: ranu, srednju i kasnu. Rana faza traje od 0. do 6. sata
nakon infekcije, tada virusna DNA ulazi u jezgru. Srednja faza traje od 6. do 20. sata nakon
infekcije, događa se replikacija virusa, nukleokapside vraćaju se natrag u citoplazmu i pupaju.
Kasna faza nastupa iza 20. sata poslije infekcije. Eksprimira se gen za poliherdin i nastaju
ogromne količine poliherdina - do 50% ukupnih proteina inficirane stanice.
Geni za polihedrin nisu esencijalni geni - polihedroni nužni su za infekciju živih insekata, ali ne i
za održavanje infekcije stanica u kulturi. Pod kontrolom su JAKOG PROMOTORA. Stoga se
virusna DNA može iskoristiti kao ekspresijski vektor za proizvodnju stranih proteina - gen za
polihedrin zamjenjuje se stranom DNA. 36-48h nakon infekcije dobiva se velika količina ciljnog
proteina.
Bakulovirusni genom prevelik je za izravnu manipulaciju pa se ugradnja DNA obavlja
homolognom rekombinacijom putem prijenosnog vektora - on je utemeljen na plazmidu E. coli
koji sadrži promotor gena za polihedrin i ostale regulacijske elemente za translaciju.
Detaljnije protokol je sljedeći: ciljni gen klonira se u prijenosni vektor, rekombinantni prijenosni
vektor umnoži se u E. coli, stanice insekata inficiraju se bakulovirusom, u inficirane stanice ubaci
se rekombinantni prijenosni vektor, identificiraju se stanice u kojima je došlo do homologne
rekombinacije, izolira se rekombinantna virusna DNA, inficiraju se nove insektne stranice
rekombinantnim virusom, sakupe se stanice s velikom količinom proizvedenog proteina 36-48h
nakon infekcije.
Prednosti bakulovirusnog sustava: eukariotsko okruženje omogućuje stvaranje disulfidnih
mostova, eukariotske posttranslacijske modifikacije (naprednu glikozilaciju), izuzetno visok
stupanj ekspresije, kapacitet za velike insercije. Virus je siguran za upotrebu, inficira samo
određene vrste insekata.
Nedostaci: kultura stanica insekata je skupa, bakulovirusni sustav ubija stanicu nakon 4-5 dana
tako da nema mogućnosti kontinuirane proizvodnje, neki se proteini ne smataju pravilno.

Ekspresija proteina u kulturi sisavaca:

Koriste se shuttle vektori koji odgovoraju E. coli i stanicama sisavaca. Ishodište replikacije ugl.
potječe iz životinjskih virusa (SV40). Promotori mogu biti iz životinjskih virusa ili od visoko
eksprimiranih gena sisavaca (najčešće se radi o SV40, CMV, herpes simplex).
Razlikujemo prolaznu i stabilnu transfekciju. Prolazna (transientna) transfekcija uvođenje je
episomalnog ekspresijskog vektora u stanice sisavaca u kulturi za kratkotrajne ekspresijske
pokuse. EPISOMALNO znači da se može replicirati u domaćinu neovisno o replikaciji
domaćinskog genoma. Ekspresijski je sustav shuttle vektor za propagaciju i kloniranje u E. coli te
ekspresiju proteina unutar stanica sisavaca. Učinkovitost transfekcije varira ovisno o staničnoj
liniji i od pokusa do pokusa. Stabilna transfekcija znači ugradnju ekspresijskog vektora koji se
ugrađuje u genom stanice sisavca i replicira se skupa s kromosomom. Ugradnja je nasumična i
može se dogoditi na više mjesta uzastopno. Vektorska struktura može biti utišana strukturom
kromatina pa se ciljni protein uopće ne proizvodi.
Prednosti: omogućuje odlične postranslacijske modifikacije
Nedostaci: prinos proteina je malen, teško je dobiti stabilnu ekspresiju, ograničen je izbor
domaćina, relativno je skupo

Proteinski lijekovi proizvedeni u eukariotskim staničnim kulturama:

Interferoni skupina su peptida s antivirusnim i imunoregulacijskim djelovanjem. Ekspresijom
izoliranog gena za interferon u E. coli moguće je dobiti velike količine interferona (namijenjeno
za biomedicinsku upotrebu). Protokol je sljedeći: iz leukocita izolira se mRNA, reverznom
transkriptazom dobije se cDNA kojom se transformina E.coli. Bakterije se uzgoje i slijedi
ekspresija proteina. Ispita se aktivnost interferona.
Otkriveno je više gena za nekoliko tipova interferona (IFNα, IFNβ i IFNγ). Dijelovi različitih gena
mogu se međusobno kombinirati i tako dati varijante interferona s novim svojstvima. Neke od
hibridnih molekula već danas su na tržištu ili u kliničkoj fazi ispitivanja.
Rekombinantni faktor rasta poboljšana je verzija prirodnog. Prirodni hormon rasta veže se na
vlastiti receptor i na receptor za prolaktin. Kako bi se izbjeglo vezanje na receptor za prolaktin
prilikom tretmana nekih bolesti, ciljanom mutagenezom promijenjene su 2 AK tako da se
protein veže samo na vlastiti receptor.
Rekombinantni inzulin dobiven je dodatkom ili zamjenom aminokiselina čime su proizvedeni
brzodjelujući i dugodjelujući analozi.
Enzimi kao terapeutici - DNaza I i alginat-ligaza: Namijenjeni su za terapiju cistične fibroze. To
je urođena bolest koja nastaje kao posljedica jedne od 500 mogućih mutacija u genu CFTR.
Oboljeli su podložni bakterijskim infekcijama, često Pseudomonasom, a liječenje antibioticima
nije neka sreća jer se ugl. brzo razvija rezistencija. Pluća u cističnoj fibrozi neprohodna su, a
disanje je otežano zbog debelih naslaga mukusa koji sadrži alginat, DNA iz liziranih stanica i
leukocita koji su se akumulirali zbog infekcije.
DNaza I aerosolom dolazi u pluća gdje razgrađuje DNA čime se smanjuje viskoznost u plućima te
je disanje olakšano. Aktin iz liziranih leukocita inhibira DNazu I pa je ciljanom mutagenezom
napravljena DNaza I koja nema aminokiseline za vezanje aktina, a i dalje razgrađuje DNA. Lijek
je odobrila FDA.
Alginat-liaza razgrađuje alginat, polisaharidni polimer iz morskih trava i nekih bakterija, koji u
plućima oboljelih od cistične fibroze nastaje kao produkt Pseudomonasa. Gen za enzim kloniran
je u E. coli. Bakterije su uzgojene na podlozi s alginatom i kalcijem zbog čega je podloga mutna,
no sintezom alginat-liaze alginat se razgrađuje i podloga postaje prozirna. Klonirani gen daje
veliki protein koji se može smanjiti, a da pritom zadrži sposobnost razgradnje bakterijskog
alginata. Ovaj enzim u kombinaciji s DNazom I reducira mukus u plućima pacijenta.
Monoklonska protutijela mogu se proizvesti fuzijom mijeloma stanica (B-stanice koje su
postale tumorske i besmrtne) sa stanicama slezene izolirane iz životinje imunizirane specifičnim
antigenom. Nastale hibridoma stanice ispituju se na proizvodnju monoklonskih pt.
Protutijela su građena od dva teška i dva laka lanca međusobno povezana disulfidnim
mostovima. Imaju varijabilnu i konstantnu regiju, a razgradnjom papainom nastaju fragmenti
Fab i Fc. CDR (complementarity determining region) područje je koje određuje specifičnost pt za
Ag.
Hibridoma stanice rastu sporo i u skupom mediju. Da bismo ih proizveli u E. coli, treba izolirati
mRNA iz B limfocita, sintetizirati cDNA uz reverznu transkriptazu i PCR-om odvojeno umnožiti
lake i teške lance na kalupu cDNA. Zatim se amplificirani produkti razgrađuju pomoću
restrikcijskih endonukleaza i kloniraju u bakteriofagni vektor. U vektor se ugrađuju različiti geni
za H i L lanac. U isti vektor kloniraju se jedan gen za H i jedan gen za L lanac, moguće je klonirati
različite kombinacije lanaca. Bakteriofag nije pogodan za ekspresiju proteina, zato se geni za H i
L lanac izrezuju iz bakteriofagnog vektora i kloniraju u plazmid. Zatim se rekombinantni plazmid
ubacuje u E. coli koja onda proizvede velike količine protutijela. Ta se protutijela kasnije lako
izoliraju i pročišćavaju. (znači bakteriofagni vektor ovdje ne služi za ekspresiju - ona je u E. coli!,
u fagu se događa kloniranje gena za H i L lance)
Bakteriofagi mogu poslužiti za izradu kombinatorijskih knjižnica. Geni za L i H lanac kombiniraju
se u jedan bakteriofagni vektor čija se DNA onda in vitro pakira u virusne čestice. U proteinsku
kapsidu bakteriofaga ugrađuju se brojna različita protutijela koja su izložena na površini virusne
čestice. Specifičnost pojedinog protutijela izloženog na površini faga ispituje se ELISA-om uz
prisutnost jednog ili više antigena.
Protutijela se mogu dodatno modificirati glikoinženjeringom u svrhu veće terapijske efikasnosti.
Primjer monoklonskog pt s modificiranom glikozilacijom je TrasGEX - druga generacija
trastuzumaba s humanim obrascem glikozilacije - snižena je razina fukoze u glikanskom dijelu pt
što omogućuje bolje vezanje za FcγIIIa receptor na NK stanicama.

Nukleinske kiseline kao terapeutici:

Mnoge ljudske bolesti kao rak i upalni procesi izazvani virusima ili parazitima uzrokovane su
povećanom proizvodnjom normalnih proteina. U teoriji mala jednolančana nukleinska kiselina
može hibridizirati sa specifičnim genom ili njegovom mRNA i tako utišati transkripciju ili
translaciju. Oligonukleotid koji se veže za mRNA i blokira translaciju naziva se antisense
(protusmisleni) oligonukleotid. DNA koja transkripcijom daje antisense RNA klonira se u
plazmidni vektor. Na taj način mogu se dobiti velike količine antisense RNA. Ako se antisense
RNA ubaci u stanice koje proizvode povećanu količinu mRNA za ciljni protein, njegova ekspresija
smanjit će se zbog nastanka kompleksa mRNA-antisense RNA.
Protusmisleni DNA i RNA oligonukleotidi mogu se koristiti kao terapeutici, ali su podložni
razgradnji pa se moraju zaštititi kemijskim putem (pojedini nukleotidi modificiraju se tako da
postanu stabilniji), a u tijelo se unose putem liposoma.
Formivirsen prvi je odobreni antisense oligonukleotidni lijek. Koristi se za CMV retinitis. Nakon
razvoja HAART terapije povučen je s tržišta.
Mipomersen koristi se za liječenje homozigotne familijarne hiperkolesterolemije.
Mogu se napraviti i DNA vakcine, dosadašnji pokušaj je DNA vakcina za malariju. T limfociti
prepoznaju stanicu s parazitom malarije te proizvode IFNγ i stimuliraju prezentaciju antigena.
DNA vakcina kodira za imunoprepoznatljiv produkt, epitope antigena parazita malarije koji se
zove TRAP. Unosom tih epitopa, aktiviraju se T limfociti i potiče se imunosni odgovor
prezentacijom antigena.
Do danas su DNA cjepiva korištena samo u veterinarskoj medicini: protiv virusa Zapadnog Nila
za konje i protiv virusa infektivne hematopoetske nekroze za ribe.

Strategije kloniranja
Serijsko kloniranje stvaranje je potpuno nove DNA spajanjem fragmenata iz različitih izvora.
Spajaju se fragmenti jednog gena iz različitih klonova u genskoj knjižnici. Dobiveni geni nemaju
introne. Oni kodiraju proteine s novim svojstvima.
Usmjereno kloniranje koristi se onda kada je potrebno ugraditi stranu DNA u točno određenoj
orijentaciji s obzirom na promotor i sl. To je moguće ostvariti razgradnjom vektora i strane DNA
dvjema restrikcijskim endonukleazama - mali fragment vektora izreže se i odbaci, na vektoru na
2 kraja ostaju ljepljivi krajevi koji se međusobno razlikuju, u tu pukotinu ugradi se strana DNA na
čijim su krajevima komplementarni ljepljivi krajevi. Na taj je način osigurano da se strana DNA
može ugraditi u vektor na samo jedan način.

Načini dobivanja fragmenata DNA:

 mehaničko kidanje (soniciranje)
 razgradnja restrikcijskim enzimima (potpuna i djelomična)
 sintetički put (oligonulkeotidi)
 prevođenje mRNA u cDNA pomoću reverzne transkriptaze
 umnažanje lančanom reakcijom polimeraze
Linkeri (poveznice) komplementarni su oligomeri TUPIH krajeva dobiveni kemijskom sintezom.
Oni se dodaju na krajeve DNA ukoliko fragment nema prikladnih restrikcijskih mjesta. Znači, na
krajeve se dodaju kratki odsječci sa željenim mjestima koje prepoznaju RE.
Adaptori sintetički su oligomeri koji s jedne strane imaju TUPI kraj kojim se adaptor veže na
željenu DNA, a s druge strane LJEPLJIVI kraj koji omogućuje izravno povezivanje s kompatibilnim
ljepljivim krajem vektora (ili neke druge DNA).
Dizajn posebnih početnica (PCR u kloniranju): Na 5 kraj početnice dodaju se kratki odsječci
nekomplementarni kalupu. To su odsječci koji služe kao mjesta prepoznavanja RE ili sljedovi za
lakše pročišćavanje proteina - afinitetne oznake (6xHis tag).
Geni izvjestitelji (reporter genes) regulatorni su elementi ciljanog gena koji omogućavaju
praćenje njegove ekspresije. Geni izvjestitelji i sami su geni i njihov je produkt lako pratiti
unutar organizma odnosno stanice (mjesto, vrijeme, količinu). Kao geni izvjestitelji najčešće se
koriste: β-galaktozidaza, autoflourescentni proteini (GFP - green fluorescent protein, RFP - red
fluorescent protein), luciferaza (luc) , β-glukoronidaza (gusA).
Luciferaza je protein izoliran iz krijesnice Photinus pyralis. To je monomer veličine 65 kDa koji
katalizira ATP-ovisnu oksidativnu dekarboksilaciju luciferina koja emitira žutu svjetlost valne
duljine 560 nm. Kvalitativno se detektira luminometrom, a kvantitativno fotografskim filmom.
β-glukoronidaza (gusA) protein je izoliran iz E. coli. To je tetramer veličine 74 kDa i ima ulogu
hidrolize molekule β-glukoronida pri čemu se stvara plavo obojenje. Tvorba plavog precipitata
posljedica je kidanja bezbojnog supstrata X-Gluc.
GFP protein izoliran je iz meduze Aequorea victoria. Radi se o momomeru veličine 27 kDa koji
nakon apsorpcije svjetlosti od 395 nm emitira zeleno svjetlo valne duljine 508 nm, uz potrošnju
kisika (bioluminiscencija). Luminometrom se kvalitativno detektira prisutnost protiena, a
kvantitativna detekcija obavlja se fotografskim filmom. Ovo nije enzim!
Kvaščev sustav dvaju hibrida (yeast two-hibrid system) - detekcija interakcija protein-protein:
Kvaščev sustav dvaju hibrida koristi se za detekciju interakcija protein-protein. Cijeli sustav
bazira se na transformaciji kvaca dvama vektorima, a u procesu sudjeluju geni reporteri.
U cijeloj priči ključan je gen za β-galaktozidazu, kojeg prirodno nema u kvascu, ali se u ovom
slučaju u njega ugrađuje i to na specefičan način (objašnjeno u nastavku).
β-galaktozidaza enzim je pod kontrolom GAL1-promotora koji za aktivaciju treba transkripcijski
faktor GAL4. GAL4 dvodomenski je protein koji ima domenu koja veže DNA i domenu za
aktivaciju transkripcije. On se veže uzvodno od GAL1-promotora, regija DNA na koju se veže
naziva se UASG (upstreaming activating sequence).

VEKTOR 1 sadrži “gen mamac” (bait gen; kodira bait protein) spojen s jednim segmentom GAL4
gena (gen za domenu koja veže DNA).
VEKTOR 2 sadrži gen koji kodira protein čije međudjelovanje s bait proteinom želimo ispitati i
gen za drugi segment GAL4 (gen za domenu za aktivaciju transkripcije).
Oba vektora ubace se u kvasac, počinju se proizvoditi bait protein i ciljni protein. Ako su oni u
interakciji, fizički se spajaju i time dovode domene GAL4 bliže jednu drugoj, one se spajaju u
cjeloviti GAL4 koji djeluje kao transkripcijski faktor - veže se na UAS G, zatim se na GAL1-
promotor veže DNA-polimeraza i dolazi do prepisivanja gena za beta-galaktozidazu, beta-
galaktozidaza kida bezbojni X-Gal čime dolazi do stvaranja plavo obojenog precipitata.
Umjesto jednog “vektora 2” možemo ubaciti njih mnogo, tako da pokrijemo čitavu gensku
knjižnicu neke vrste i onda gledamo koji su svi mogući proteini koji su u interakciji s bait
proteinom.

Traženje interakcija protein-DNA:

Važno je znati koji sljedovi DNA vežu regulatorne proteina kako bi se mogla razumjeti genska
ekspresija. Tri su osnovne metode istraživanja: delecijska analiza promotora uz fuziju s genom
izvjestiteljem, metoda usporavanja/pomaka u gelu i metoda zaštite DNazom/DNA otisak
stopala.
Delecijska analiza kontrolnih genskih regija: Ciljna kontrolna područja (regulatorne regije)
povezuju se s genom reporterom te se izrađuju delecijski mutanti - brišu se pojedini dijelovi
slijeda (nukleazama ili restrikcijskom razgradnjom). Ako se regulatorni proteini (koje
proučavamo) uspješno vežu na ciljna područja, gen reporter se eksprimira (naravno u prisunosti
odgovarajućeg supstrata - ako je reporter lacZ, trebamo X-Gal). To znači da ispitivani delecijski
mutant i dalje sadrži regulatornu regiju. Uzimamo sljedeći delecijski mutant i potragu radimo
sve dok ne dođemo do slučaja u kojem se gen reporter nije eksprimirao. Tada znamo da je
izbrisana regija regulatorna regija.
Metoda pomaka u gelu temelji se na svojstvu DNA da se sporije kreće u gelu pod utjecajem el.
struje onda kada je u kompleksu s proteinom. Izradi se set restrikcijskih fragmenata ciljne DNA, i
fragmenti se razdvoje u gelu. Kontrolna DNA je DNA bez proteina i ona se kreće brzo u gelu. U
uzorku detektiramo imamo li vezanje proteina na ispitivane DNA u usporedbi s kontrolom.
Na isti se način mogu ispitivati interakcije protein-RNA.
Metoda zaštite DNazom temelji se na činjenici da je dio molekule DNA koji je u kompleksu s
proteinom zaštićen od razgradnje s DNazom I. Ciljni fragment DNA obilježi se radioaktivno i
pomiješa s regulatornim proteinom. Sve se podvrgne ograničenoj razgradnji s DNazom I. Smjesa
dobivenih fragmenata razdvaja se su gelu. U području koje je zaštićeno vezanjem proteina
nema fragmenata DNA - dobivamo “otisak stopala” veznog mjesta unutar molekule DNA (u
prijevodu na gelu nedostaju vrpce koje odgovaraju fragmentima na koje su se vezali proteini;
detekcija se vrši u usporedbi s DNA koja nije bila zaštićena protienima).

Genske knjižnice:
Genske knjižnice zbirke su gena nekog organizma sastavljene od kloniranih fragmenata DNA.
S obzirom da svaki gen ugl. predstavlja vrlo malen dio ukupnog genoma i da se ne može izravno
izlolirati, kada ga želimo pronaći u genskoj knjižnici, moramo pronaći fragment ili fragmente koji
ga sadrže.
Cilj je genskih knjižnica sekvencirati i mapirati čitav genom te izolirati pojedine gene. Zbog toga
se čine knjižnice i s manjim i s vrlo velikim fragmentima genoma, fragmenti su nasumični -
dobivaju se mehaničkim kidanjem i djelomično razgradnjom restrikcijskim endonukleazama.
Također je poželjno imati čim veći broj kopija genoma. Knjižnica mora biti dovoljno velika da s
velikom vjerojatnosti sadrži svaki gen prisutan u genomu. Kada bismo imali samo jedan način
kidanja u jednoj kopiji, neki geni bili bi pokidani.
Veličina inserta određuje veličinu knjižnice. Što je veći fragment, veći udio ishodnog genoma
može se smjestiti u vektor. Broj pojedinačnih rekombinantnih molekula potrebnih za pokrivanje
čitavog genoma unutar genske knjižnice računa se prema formuli:

Genomska knjižnica zbirka je kloniranih fragmenata DNA dobivenih kidanjem ukupne

genomske DNA organizma. Sastavljena je od preklapajućih fragmenata (nasumično
preklapanje), sastav ne ovisi o ishodnom tkivu (nije bitno jesmo li uzeli uzorak iz krvi, mišića ili
nečeg trećeg) i svi su klonovi podjednako učestali (približno je jednak br. svih gena iz cijele
DNA).
cDNA (ekspresijska) knjižnica zbirka je kloniranih cDNA dobivenih reverznom transkripcijom
ukupne mRNA organizma. Ona sadrži samo pojedine gene, eksprimirane u pojedinim tkivima u
pojedinim stadijima razvoja ili kao odgovor na posebne okolnosti u okolišu. Neki su geni prisutni
u više kopija - broj kopija ovisi o ekspresiji gena u pojedinom tkivu. Također treba uzeti u obzir
da se ovdje ne dobivaju cijele sekvence DNA jer mRNA nema introna, već samo egzone.
Za ekspresiju cDNA klonova koriste se ekspresijski vektori i dobivena knjižnica naziva se
eksprijskom knjižnicom.
Kod izrade cDNA knjižnice prvo se iz stanice kemijski izoliraju RNA molekule. Zatim je potrebno
izolirati mRNA molekule koje su brojčano nadjačane od strane rRNA. Napravi se afinitetna
kromatografija - uzme se kolona s oligo(dT) nukleotidima na koje se veže poliA rep, ostale RNA
se eluiraju iz kolone. Na kraju se eluira i sakupi mRNA.
Reverznom transkriptazom prepisuje se mRNA u cDNA molekulu. Zatim RNaza H djelomično
kida hibrid, a preostali dijelovi RNA djeluju kao početnice za sintezu drugog lanca DNA pomoću
DNA-polimeraze. DNA-polimeraza djeluje istovremeno dok RNaza kida RNA.
Pretraživanje genomske knjižnice radi se nekom od sljedećih metoda:
 a) hibridizacija in situ: Replika kolonije bakterija s rekombinantnim plazmidom prenosi se
na membranu (na filter papir), ondje se bakterije liziraju i DNA se denaturira pomoću
lužine. Zatim ubacujemo DNA-sonde koje se hibridiziraju s fragmentom kojeg želimo
naći i detektiramo to vezanje.
b) Southern blot: DNA fragmenti razdvoje se elektroforezom na agarozi, prenesu se na
membranu i hibridiziraju s označenom DNA-sondom. S obzirom da su fragmenti
nasumično pokidani, istu nukleotidni slijed može se naći u više fragmenata. Te
fragmente izdvajamo i dalje analiziramo.
Često se paralelno rade i hibridizacija in situ i Southern blot - hibridizacija će nam dati odgovor
je li se sonda vezala (imamo li određeni gen u genomu kojeg pretražujemo), a Southern blot će
nam reći na koji fragment se vezala sonda. Kod Southerna je problemčić nasumično kidanje
DNA zbog kojeg može doći do kidanja gena od interesa. To se rješava analizom više klonova
pokidanih u više različitih kombinacija čime je osigurano da će cjelovit gen biti prisutan u nekim
od njih.
Zašto se hibridizacija in situ ne radi direktno u petrijevki u kojoj smo uzgojoli bakterije? Zato
što postupak uključuje lizu bakterija, a nije nam u cilju ubiti cijelu koloniju.
Pretraživanje ekspresijske knjižnice obavlja se pomoću specifičnih pt ili hibridizacijom in situ.
Ono omogućuje proizvodnju proteina.

Hodanje duž kromosoma (chromosome walking) metoda je kojom se otkriva na koji su način
poredani geni u genomu. Nasumično dobiveni fragmenti koje nalazimo unutar knjižnice
međusobno se preklapaju. Uzmemo tako jedan fragment i iskoristimo ga kao sondu - gledamo
na što će se sve vezati tj. koji se fragment s njim preklapa. Zatim uzmemo taj preklapajući
fragment i rubni dio njega iskoristimo kao sondu te tražimo preklapanja. Postupno tako
uočavamo sva preklapanja i slažemo gene u genom.
4. predavanje: Organizacija i sekvence staničnih genoma
Gen, genom, središnja dogma molekularne biologije - sve unutar 2. predavanja.

Sekvence staničnih genoma:

Povijest sekvenciranja ljudskog genoma:
U počecima sekvenciranja ljudskog genoma značajne su bile 2 skupine znanstvenika
predvođene Craigom Venterom (Celera Genomics) i Ericom Landerom (International Human
Genome Sequencing Consortium). Skica ljudskog genoma objavljena je 2001. i uključivala je
samo kodirajuće segmente, a precizna mapa objavljena je 2004. godine.
Prve metode sekvenciranja bile su “Shotgun sequencing” i “Ordered Clone Sequencing”.
 “Shotgun sequencing” - Venter
 ukupna DNA kida se mehanički u male preklapajuće fragmente koji se
sekvenciraju pomoću nasumičnih početnica
 višestrukim sekvenciranjem fragmenata pokriva se cijeli genom (minimalno se
radi 10 ponavljanja kako bi se dobila preklapanja)
 sklapanjem preklapajućih sljedova dobivaju se kompletne kromosomske regije
 “Ordered Clone Sequencing” (sekvenciranje uređenih klonova) - Lander
 kromosomi se dijele u manje dijelove (contigs) - ovdje se točno zna gdje je
napravljeno kidanje unutar kromosoma
 radi se organizirano kartiranje dobivenih dijelova - nastala je BAC knjižnica (skup
KONTIG segmenata DNA, tzv. BAC klonovi)
 dobiveni fragmenti kromosoma sekvenciraju se klasičnim metodama i sklapaju u
cjelinu
 nije potrebno višestruko sekvenciranje jer su poznata mjesta kidanja (zabilježena
u BAC knjižnici)
Veličina genoma nije nužno proporcionalna složenosti organizma. U odnosu na ljude mnoge
biljke imaju mnogo mnogo veći genom - pretpostavlja se da im je nužan jer su nepokretne pa
same sebe moraju hraniti. Osim veličine genoma značajan je udio kodirajućeg/nekodirajućeg
dijela genoma. Složeniji organizmi imaju puno veći udio nekodirajućih regija.
Projekt ENCODE imao je za cilj definirati f-je različitih tipova sekvenci u ljudskom genomu.
Znanstvenici su se pitali kako izgleda transkripton (što se sve prepisuje u mRNA), zašto je
genom toliko velik i što kodiraju nekodirajuće sekvence. Otkriveno je da većinski dio genoma
eukariota ne kodira proteine, već je u funkciji regulacije procesa uključenih u sintezu proteina
(ekspresija i sl.)

Veći dio eukaritskih genoma čini nekodirajuća DNA. To su:

  dijelovi eksona koji se ne prevode u protein (untranslated regions = UTRs), na 5’ i 3’
kraju
 introni
 sljedovi za nekodirajuću RNA
 ponavljajući sljedovi DNA - ponavljanja jednostavnih sljedova i transpozoni (DNA
transpozoni i retrotranspozoni)
 razmaknice (spacers)
 pseudogeni

Introni su nekodirajući segmenti DNA koji se nalaze u primarnom RNA transkriptu, a zatim se
posttraskripcijski, a prije translacije, izrezuju kako bi mRNA činili samo egzoni. Introni čine oko
20% ukupne genomske DNA čovjeka (prema novijim istraživanjima možda i 35%).

Udio introna raste sa složenošću organizma. Kod čovjeka prosječan gen sadrži 8 introna (i 9
egzona) od čega intronske sekvence kodira 27.000 pb, a egzonske 2.500 pb od kojih 300 pb
otpada na 5’ neprevedenu regiju, a 800 pb na 3’ neprevedenu regiju, što znači da od čitavog
gena protein kodira samo 1.400 pb.
Za otkriće introna zaslužni su Phillip Sharp i Richar Roberts (Nobel 1993.). Otkrili su ga tako da
su hibridizirali ssDNA i mRNA molekulu čime su uvidjeli da postoje DNA sekvence koje se nisu
hibridizirale što znači da se ne nalaze u RNA molekuli.

Introni kao “nested genes” - kodiraju:

 snoRNA - ima ulogu obrade rRNA
kodirane i nekodirajućom RNA
 miRNA - regulira gensku ekspresiju
 mali broj proteina (kod Drosophile oko 5%, kod čovjeka <1%)
Introni kao regulatorni sljedovi za transkripciju:
 mogu biti udaljeni i do nekoliko stotina kilobaza od gena čiju transkripciju reguliraju
  mogu biti smješteni i neporedno prije početka gena
 mogu biti smješteni unutar introna, ali i unutar nekodirajućeg dijela egzona
Uloga introna u alternativnom prekrajanju (alternative splicing): ovisno o prekrajanju gen može
dati različite krajnje produkte - kod čovjeka prosječno svaki gen daje 6 alernativnih mRNA od
kojih 4 kodiraju proteine.

Nekodirajuća DNA kodira funkcionalne RNA koje ne sudjeluju u sintezi proteina direktno
(direktno - samo mRNA).
 tRNA
 rRNA
 snoRNA - obrada rRNA
 miRNA kontrola translacije i razgradnje mRNA kodirane i intronima
 sprječava već sintetiziranu mRNA da se prevede u protein (represija translacije i
razgradnje mRNA putem RISC-a = RNA-inducedsilencing complex)
 gen se prepisuje u primarni
transkript (pri-miRNA)
 djelovanjem Drosha nukleaze
uklanjaj se određeni sljedovi i
nastaje sekundarni transkript
sa strukturom ukosnice (pre-
miRNA molekula)
 Dicer nukleaza uklanja
terminalnu petlju i nastaje
krajnji produkt (miRNA duplex)
koji se spaja s proteinima u
RISC kompleks
  RISC se preko miRNA veže na mRNA (komplementarno, na 3’ kraj) čime sprječava
translaciju i dovodi do degradacije mRNA
 lncRNA (long non coding RNA): ima ulogu tkivno specifične regulacija genske ekspresije -
npr. inaktivacija X-kromosoma (X-kromosom kodira oko 1000 gena više od Y-
kromosoma, kod žena jedan se X mora utišati kako bi žene i muškarci imali jednak broj
gena)
 one su velike molekule (kodira ih više od 200 nukleotida)
 kodira ih velik broj gena (puno veći broj od onog koji kodira proteine! - očito su
jaaako važne za ukupno funkcioniranje organizma

Ponavljajući sljedovi DNA čine preko 50% DNA sisavaca!

Detektirani su praćenjem kinetike reasocijacije DNA: kod E. coli (ima gene u jednoj kopiji)
reasocijacija se odvija kontinuirano nekom brzinom, a kod goveda došlo je sljedova koji su se
reasocirali brže i sporije - ponavljajući sljedovi, koji imaju više kopija gena, reasociraju se brže.
 Ponavljanje jednostavnih sljedova (simple sequence repeats) - uzastopno ponovljeni
nizovi nekoliko tisuća kopija kratkih sljedova duljine 1-500 nukleotida (kod Drosophile
ACAAACT)
 satelitna DNA - čini oko 10% ukupne DNA, zbog jedinstvenog sastava može se
razdvojiti od ostatka genomske DNA ravnotežnim centrifugiranjem u gradijentu
gustoće CsCl (cezijev klorid) → daje dodatne pruge na krivulji, niže od glavne
pruge
 primjer satelitne DNA su CENTROMERE i TELOMERE
 Transpozoni (jumping genes; Barbara McClintock, Nobel 1983.) - pokretni genetički
elementi koji ne trebaju homologiju za premještanje, 300.000 kopija veličine 80-3.000
pb
 “cut and paste” mehanizam - enzim transpozaza ih izreže s jednog mjesta i
uvede na drugo mjesto, ona stvara LJEPLJIVE krajeve, pukotine se popravljaju
sintezom DNA
 ugl. su utišani (nalaze se u segmentu koji se ne prepisuje), čine oko 3% genoma

transpozon
  Retrotranspozoni: u ljudskoj DNA oko 3.000.000 kopija retrotranspozona - čine oko 40%
genoma
 retrovirusu slični elementi - kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu za
integraciju u kromosomsku DNA (ali se ne mogu pakirati u virusne čestice i širiti s
jedne stranice na drugu)
 premještanje na novo kromosomsko mjesto slično replikaciji retrovirusa
 450.000 odsječaka veličine 2-10kb (8% ukupne DNA)

 LINE (long interspersed elements, visokoponavljajući dugi raspršeni elementi) -

kodiraju RT i integrazu, mehanizam premještanja drugačiji nego kod retrovirusa
 850.000 odsječaka velikiče oko 1kb (oko 21% ukupne DNA)
 SINE (short interspersed elements, kratki raspšeni elementi) - sami NE kodiraju
RT pa je premještanje vjerojatno posredovano enzimima kodiranim drugim
retrotranspozonima
 nastali su reverznom transkripcijom malih RNA (npr. tRNA)
 1,5 mil odsječaka 100-300pb raštrkano po genomu (oko 13% ukupne
DNA)
SINE i LINE mogu uzrokovati mutacije kojima inaktiviraju gene ili mijenjaju njihovu ekspresiju.
Pronađeni su kao uzrok nekoliko nasljednih bolesti (hemofilija, cistična fibroza, mišićna
distrofija, neke nasljedne vrste raka) te nekih nenasljednih vrsta raka.
Mogu imati i pozitivan učinak - pr. je
promjena boja krila moljaca kao evolucijska
prilagodba zagađenju tijekom industrijske
evolucije.
Skupa s LINE mogu se premjestiti dijelovi
stanične DNA čime dolazi do stvaranja
novih kombinacija regulatornih i/ili
kodirajućih sljedova (evolucijsko oblikovanje genoma). Tu je i rekombinacija LINE sljedova čime
dolazi do stvaranja novih gena.
Jednostavni ponavljajući sljedovi smješteni su svi jedni uz druge. Transpozoni i retrotranspozoni
razbacani su svuda po genomu. Kod transpozona svi su međuprodukti DNA (mehanizam cut and
paste), kod retrotranspozona DNA se prepisuje u RNA koja se onda pomoću RT i integraze
ugrađuje na novo mjesto u genomu. Za retrovirusu slične elemente i LINE smatra se da su
potekli od retrovirusa ugrađenih u naš genom.

Pseudogeni predstavljaju kopije gena nastale duplikacijom ili mutacijskom inaktivacijom gena
pretka. Izgledaju kao normalni geni, ali se ne prepisuju - psudogeni su utišani. Oni imaju svoj
ekvivalent koji nije utišan, to su one varijante gena koje su pogodnije za organizam. Čine oko 5%
ukupnog ljudskog genoma.
Prerađeni pseudogeni nastaju integracijom DNA nastale obrnutim prepisivanjem dorađene
mRNA. Oni su ugl. inaktivni. Primjer iznimke su kratke noge kod nekih pasmina pasa.

Organizacija genoma:
DNA je vrlo dugačka molekula - haplodini genom čovjeka ima 3mlrd pb, DNA molekula duga je
oko 1m, sadrži 20 tisuća gena, a zbog slaganja parova baza radi se o razmjerno krutoj molekuli.
S obzirom na duljinu, krutost i činjenicu da jezgra ima promjer svega 5-10 µm, DNA unutar
jezgre mora biti upakirana. Histoni su BAZIČNI (pozitivno nabijeni) poteini koji sudjeluju u
organizaciji DNA molekule. Kompleks između eukariotske DNA i proteina naziva se kromatin.
Osnovna strukturna jedinica kromatina je nukleosom - građen je od po 2 H2A, H2B, H3 i H4
histona koji čine oktamer na kojeg su namotana 2 kruga DNA lanca i tu je još H1 histon koji se
veže na DNA između dva nukleosoma. U nukleosom se ubrajaju i nenamotani dijelovi DNA
(uzima se da nukleosom sadrži 166 pb). Kromatosom obuhvaća samo DNA omotanu oko
histonske jezgre, skupa s H1 histonom (147 pb), a čestica nukleosomske srži je DNA na
histonskoj jezgri bez H1 histona (140 pb).

Organizacija DNA u kromosome vrlo je složena.

Interfazna jezgra građena je od heterokromatina i eukromatina. Heterokromatin je
kondenziraniji oblik kromatina, a tako su organizirani dijelovi genoma koji se ne moraju aktivno
prepisivati - takav je inaktivirani X-kromosom, centromere. telomere. Dijelovi DNA koji se u
interfazi aktivno prepisuju u obliku su manje kondenziranog eukromatina.
Centromera je područje spajanja dviju sestrinskih kromatida.
 kod sisavaca radi se satelitnoj DNA koja čini proširenu regiju
heterokromatina
 čini ju 171 pb koje se uzastopno ponavljaju u regijama dugim i
po milijun pb
 centromerni kromatin - histon CENP-A umjesto histona H3
 na centromerne nukleosome s CENP-A vežu se proteini tvoreći
kinetohoru na koju se vežu niti diobenog vretena
Telomere kao i centromere sadrže ponavljajuće sljedove satelitne DNA.
Važne su kod replikacije krajeva kromosoma - prilikom svake diobe gubi
se dio telomere, a zahvaljujući njihovoj duljini ne dolazi do gubitka nikakvih bitnih gena.
Metafazni kromosomi predstavljaju najveći stupanj kondenzacije kromatina.
5. predavanje: Održavanje i preslagivanje genoma
Replikacija DNA:
Replikacija DNA vrlo je složen proces koji obuhvaća razmatanje dupleksa roditeljske DNA,
razdvajanje dviju niti, potpuno i točno kopiranje svake od roditeljskih niti DNA (svaka je
mutacija ovdje nepovratna - u somatskoj stanici često nema veze ako do nje dođe, najgora
mogućnost je tumor, a u germinativnoj stanici ona se prenosi na novi organizam), pribavljanje
potrebnih količina sva 4 deoksiribonukleotida za sintezu novih niti DNA te pribavljanje
potrebnih količina histona za organizaciju nove DNA u nukleosome i pakiranje u kromosome.
U replikacijskim rašljama sintetiziraju se oba DNA lanca i 5’→3’, i 3’→5’ lanac pri čemu je
sinteza uvijek usmjerena od 5’ prema 3’ kraju!
Zašto se DNA uvijek sintetizira u smjeru 5’→3’?
Sinteza DNA u smjeru 5’→3’ omogućuje da se energija za ugradnju novog nukleotida donese na
novom nukleotidu - jer nukleotidi na 5’ kraju imaju fosfatne skupine (radi se o nukleotid
trifosfatu koji prilikom ugradnje u DNA lanac
otpušta 2 Pi skupine i ostavlje jednu).
Također, smjer sinteze važan je za točnost
replikacije. Naime, dušične baze podliježu
keto-enolnoj tautomeriji. Ako se u DNA
ugradi nukleotid s bazom u pogrešnom
obliku - enolnom obliku, on se mora
hidrolizirati i na njegovo mjesto dolazi
nukleotid s bazom u ispravnom obliku. Znači,
dolazi do hidrolize na 3’ kraju lanca i do
ugradnje novog nukleotida što ne zahtijeva
dovođenje E jer se za izvor E iskoristi novi
nukleotid. Kada bismo uklanjali nukloetide s
5’ kraja i lijepili nove, morali bismo imati
dodatni izvor E.
Baze moraju biti u keto obliku. U 1:1000
slučajeva dođe do prelaska ravnoteže u enolni oblik.
Sinteza DNA počinje kratkom RNA početnicom (koju sintetizira RNA-polimeraza), kod
Okazakijevih fragmenata svaki počinje svojom početicom. Zatim DNA-polimeraza nastavlja
sintezu lanca na RNA-početnici. Ona također uklanja ribonukleotide i zamjenjuje ih
deoksiribonukleotidima te paralelno popravlja pogreške (krivo ugrađene ribonukleotide
zamjenjuje pravim deoksiribonukleotidima). U slučaju Okazakijevih fragmenata nakon DNA-
polimeraze u proces se uključuje DNA-ligaza koja spaja fragmente DNA. Onda slijedi Watson-
Crickovo sparivanje baza - formiraju se 2 ili 3 vodikove veze. Vodikove veze formiraju se tek
onda kada imamo dsDNA konformaciju, prije toga ne jer je velika mogućnost pogreške.
Zašto RNA-početnice u sintezi DNA? DNA-polimeraza zahtjeva početnicu, a RNA-polimeraza ne,
ona sintetizira lanac od početka.
Također, radi se o evulutivnoj prilagodbi kojom se sprječavaju pogreške u replikaciji. Prvi
nukleotidi koji se ugrađuju u lanac su ribonukleotidi i oni su privremeni komadići
novosintetiziranog lanca, kod njihove sinteze vjerojatnost pogreške je velika. Te ribonukleotide
DNA-polimeraza zamjenjuje deoksiribonukleotidima i usput ispravlja pogreške koje su nastale
prilikom prepisivanja.

Helikaza je enzim koji razmata dsDNA (reže ju i razmata, iz dsDNA stvara 2 ssDNA lanca). Kod
vodećeg lanca iza helikaze odmah ide DNA-polimeraza, a kod tromog lanca u replikacijski
proces uključeni su ssDNA proteini koji održavaju ssDNA lanac stabilnim sve dok se ne
 djelovanje telomeraze: https://www.youtube.com/watch?v=2NS0jBPurWQ

sintetiziraju Okazakijevi fragmenti (proteini sprječavaju lomove u ssDNA i sprječavaju da dođe

do formiranja dsDNA fragmenata).
Topoizomeraza enzim je koji uklanja napetost u stukturi koja je nastala zbog razmatanja
uzvojnice. Ona pokida (raspetlja) lanac i ponovno ga spoji.

Eukariotski kromosom linerani su što znači da imaju

krajeve. Na krajevima kromosoma nalaze se telomere
- ponavljanja kratkog slijeda, njih replicira telomeraza.
To je važno zato što se prilikom replikacije ne može
umnožiti krajnji segment roditeljskog lanca na 3’
kraju, on ostane u ss formi jer se ondje ukloni RNA-
početnica. Da bi se spasio taj dio kromosoma, u priču
se upetljala telomeraza.
Telomeraza je reverzna transkriptaza koja replicira
telomere koristeći unutarnji RNA kalup. Ona znači
produljuje roditeljski lanac temeljem tog RNA kalupa
reverznom transkripicijom. Novosintetizirani lanac
DNA zatim se produlji komplementarnim sparivanjem
baza na temelju tog kalupa kojeg je stvorila
telomeraza (sad opet priča s RNA-početnicom, DNA-
polimerazom i DNA-ligazom).
Telomere se u kromosomu cirkulariziraju kako bi
zaštitile kraj kromosoma.
Je li za život eukariotskih stanica nužna reverzna transkriptaza? Da. Za replikaciju telomera
potrebna je telomeraza koja djeluje kao reverzna-transkriptaza (telomere koriste unutarnji RNA
kalup za replikaciju).

3 aktivnosti DNA-polimeraze I:
1) polimerizacija nukleotida u smjeru 5’→3’ - sinteza nove niti DNA
 KOREKTIVNA ULOGA: Pri ugradnji nukleotida brine se da je li ugrađena baza u
pravoj keto-enolnoj formi, pravi oblik je keto. Ako baza nije u keto obliku,
polimeraza kratko vrijeme pričeka da se ravnoteža promijeni, da enol prijeđe u
keton, i tek onda bazu uključuje u lanac. U 1:1000 slučajeva baza se nađe u
pogrešnoj enolnoj formi.
2) hidroliza polinukleotida u smjeru 3’→5’ - egzonukleazna aktinost - kida krivo ugrađen
nukleotid i zamjenjuje ga novim
 3) hidroliza polinukleotida u smjeru 5’→3’ - zamjenjuje RNA-početnicu s DNA slijedom (to
radi kod Okazakijevih fragmenata, na vodećem lancu postojala je samo jedna početnica
na 3’ kraju kalupa i ona je jednostavno otpala, kao i početnica tromog lanca koja se
sintetizirala na samom 3’ kraju kalupa roditeljskog lanca)
Tijekom replikacije učestalost pogreške je 1:10 6 (1 pogrešna baza na milijardu ispravnih).
Metodama opisanim u nastavku pogreška se dodatno smanjuje.

Mehanizmi popravka DNA:

Do oštećenja DNA može doći spontano ili pod djelovanjem različitih agensa. Primjeri su
spontanih oštećenja deaminacija i depurinacija. Kod deaminacije dolazi do prijelaza: C→U ili
A→hipoksantin. Kod depurinacije dolazi do gubitka purinskog mjesta na šećeru, na mjestu
purinske baze je OH skupina. Kod izlaganja UV svjetlu susjedni pirimidini formiraju dimere, npr.
timini u DNA mogu oformiti ciklobutanski prsten (nastaju kovalentne veze, tzv. timinski dimer).
MNNG dovodi do alkiliranja, npr. gvanin prelazi u O6-metilgvanin. Karcinogeni djeluju na razne
načine, npr. može doći do adicije neke velike kemijske skupine na dušičnu bazu.
Oštećenja DNA popravljaju se na više načina:
1) izravni obrat oštećenja
2) popravak izrezivanjem nukleotida (NER = nucleotide excision repair) - oštećeni dio se
izrezuje i ponovno sintetizira
3) SOS odgovor (popravak sklon greškama; translezijska sinteza DNA)
4) rekombinacijski popravak
Izravni obrat oštećenja mehanizam je kojeg koriste prokarioti, viši eukarioti ugl. ga nemaju jer
većina stanica kod njih nema izvor svjetla. Kod prokariota svjetlost je izvor oštećenja, ali se
iskorištava i kao izvor E za popravak istih - mehanizmom kojeg nazivamo fotoreaktivacija.
Pirimidinske baze, koje su zbog izloženosti UV zračenju oformile dimer, vraćaju se izvorno stanje
(fotoreaktivacijski enzim uz prisutnost svjetlosti uklanja dimer).
Drugi je mehanizam izravnog obrata djelovanje alkiltransferaza koje dealkiliraju alkilirane
nukleotide.
NER (nucleotide exscision repair) mehanizam je kojeg posjeduju eukariotske stanice za
popravke - oštećeni dijelovi DNA (kemijski, zračenjem, mutacijama) izrezuju se i ponovno
sintetiziraju.

a) DNA-glikozilaze uklanjaju modificirane baze iz DNA - uklanjaju uracil (nastao deaminacijom

citozina) i hipoksantin (nastao deaminacijom gvanina). Zatim AP-endonukleaza kida
fosfodiestersku vezu, deoksiriboza-fosfodiesteraza kida šećer i fosfat i na posljetku DNA-
polimeraza i ligaza umeću novi nukleotid.

b) Izrezivanje nukleotida mehanizam je kod kojeg se uklanjaju veći segmenti DNA s obje
strane od mjesta oštećenja. Nukleaza prepoznaje oštećenje i na 2 mjesta oko oštećenja
pravi ssDNA lomove. Helikaza razmotava dsDNA kako bi se izrezani dio mogao odvojiti iz
DNA, DNA-polimeraza i ligaza umeću nove nukleotide. RNA virusi koji nemaju dsDNA
nemaju ovakav back-up mehanizam pa su jako podložni promjenama.
Kod SISAVACA izrezivanje nukleotida uključuje brojne proteine koji svi moraju funkcionirati
(u suprotnom je veća vjerojatnost razvoja tumora; mutacije u proteinima za izrezivanje
nukleotida mogu se prenositi na potomtsvo - nasljeđe tumora):
 XPC, XPA, RPA, TFIIH (XPB+XPD) - prepoznaju oštećenja i imaju aktivnost helikaze;
nazivaju se senzorni proteini jer “šeću” po DNA i traže oštećenje
 XPG, XPF/ERCCI - cijepaju DNA i izrezuju oligonukleotide
 na poslijetku DNA-polimeraza i ligaza umeću nove nukleotide
 Oštećenja popravka izrezivanjem uzrok je nasljedne bolesti kseroderma pigmentosum -
osobe su preosjetljive na svjetlo i u njih je 2000x veća učestalost pojavnosti raka kože
(svjetlost oštećuje DNA).

c) Popravak povezan s transkripcijom vezan je uz važnije dijelove genoma koji se prepisuju u

mRNA za sintezu proteina. Triger za mehanizam je blokiranje RNA-polimeraze oštećenjem.
Aktivira se niz proteina jednak kao kod mehanizma popravka izrezivanjem nukleotida.

d) Popravak krivo sparenih baza (“mismatch”) kod

PROKARIOTA temelji se na razlikama u metilaciji starog i
novog lanca. Pretpostavka je da je pogreška
navjerojatnije lokalizirana u novosintetiziranom lancu.
Novosintetizirani lanac nije odmah metiliran pa proteini
koji sudjeluju u popravku pregledavaju DNA i traže
“mismatch” te popravlju DNA u lancu koji nije metiliran,
koji je novi. Proteini uključeni u mehanizam popravka su
MutS, MutL i MutH koji pronalaze grešku i skupa s
helikazom, egzonukleazom te DNA-polimerazom i
ligazom izrezuju pogrešne nukleotide i ubacuju nove.

Kod EUKARIOTA mutacije u genima MLH (mutH) i MSH

(mutS) uzrokuju nasljedni nepolipozni kolorektalni
karcinom koji predstavlja jedno od najuobičajenijih
 nasljednih oboljenja s učestalošću 1:200 osoba i odgovoran je za 15% svih kolorektalnih
karcinoma u SAD-u. Ako postoji u obitelji, preporučuju se redovite kontrole.
Translezijska sinteza DNA (SOS, popravak sklon pogreškama) aktivira se onda kada je DNA jako
oštećena, toliko da se više može se replicirati (da zaustavi replikaciju). Ako se radi o eukariotu,
on tako jako oštećene stanice uništava jer predstavljaju rizik za opstanak. Kod PROKARIOTA
uništenje nije opcija jer ono znači smrt cijelog organizma. Zato prokarioti za vrijeme replikacije
na mjestu lezije (dijelu gdje je DNA jako oštećena) DNA-polimerazom sklonom pogreškama
sintetiziraju DNA na način da u lanac “ubace bilo što”, a ostatak lanca, koji nije oštećen,
repliciraju normalno. Nakon toga lezija se izreže iz roditeljskog lana i izrezani se dio popuni
komplementarno slijedu nastalom DNA-polimerazom sklonom pogreškama.

Ovaj mehanizam smatra se evolucijskom prilagodbom prokariota okolišu - u promjenjenim

uvjetima koji mu ne odgovaraju prokariot mutira što dovodi do pojave mnogih novih varijanti
tog organizma (u koloniji će mnoštvo bakterija dati mnoštvo varijanti mutacija, jer DNA-
polimeraza sklona pogreškama radi pogreške, i one su kod različitih jedinki različite). One kod
kojih su se dogodile pogodone mutacije preživjet će → tako se, između ostalog, razvija
rezistencija na antibiotike.
SOS odgovor induciraju agensi koji oštećuju DNA. ssDNA potiče autolizu LexA proteina koji je
represor recA, uvrA i uvrB gena. SOS odgovor omogućava popravak i onih oštečenja koja
normalno nije moguće popraviti - kada je uništena info s obje niti DNA. SOS odgovor je mutagen
(uzrokuje mutacije)!

Rekombinacijski popravak mehanizam je kod kojeg se oštećena DNA zamjenjuje neoštećenom

molekulom. Znači, u slučaju oštećenja jednog roditeljskog lanca prilikom sinteze novog
komplementarnog lanca na mjestu oštećenja blokira se replikacija i u novosintetiziranom lancu
ostaje pukotina. Na mjesto te pukotine seli se DNA segment iz drugog roditeljskog lanca (ti lanci
su u replikacijskim rašljama) što za posljedicu ostavlja pukotinu u prethodno intaktnom
roditeljskom lancu. Ta se pukotina popunjava djelovanjem polimeraze i ligaze na kalupu
novosintetiziranog lanca.

dsDNA lomovi popravljaju se homolognom rekombinacijom, uputa se uzima sa sestrinske

kromatide ili homolognog kromosoma. Na taj način ne dolazi do gubitka genetske informacije.
Izravni obrat oštećenja i NER sprječavaju gubitak genetske informacije. Popravci sprječavaju da
oštećenja prijeđu u mutaciju. Potrebno je razlikovati mutaciju od kemijskog oštećenja - mutacija
nije kemijski prepoznatljiva. Rekombinacija je popravak bez pogreške.
Apoptoza je programirana stanična smrt koju mogu uzrokovati različiti agenski koji oštećuju
stanicu. Značajna DNA oštećenja također uzrokuju apoptozu i ona je jedan od osnovnih
kontrolnih mehanizama kod VIŠESTANIČNIH ORGANIZAMA.

Rekombinacija DNA:
Rekombinacija DNA uključuje homolognu rekombinaciju i preslagivanje gena.
Homologna rekombinacija - NE mijenja se sadržaj genoma:
 rekombinacijski popravak DNA (opisan kod mehanizama popravka DNA)
 rekombinacija homolognih kromosoma u mejozi
Preslagivanje gena:
 mjesno-specifična rekombinacija - nije nužna potpuna homologija sljedova
(preslagivanje imunoglobulinskih gena)
 transpozicija (posredovana DNA intermedijarima) i retrotranspozicija (RNA
intermedijari)
 amplifikacija gena - od jednog gena nastaje više njegovih kopija
Homologna rekombinacija: - homologni kromosomi u mejozi
Proces započinje stvaranjem Hollidayeve veze - kod jednog kromosoma dolazi do stvaranja ds
loma i razgradnje oba lanca tako da nastanu ss ljepljivi krajevi koji ulaze u drugu molekulu i
dolazi do komplementarnog sparivanja baza i formiranja Hollidayeve veze. Ranije se mislilo da
se Hollidayeva veza formira tako da nastaju ss lomovi u oba kromosoma i da oni ulaze u
homolognu molekulu gdje se sparuju s komplementarnim neprekinutim lancem. Hollidayeva
veza, ovisno o njenoj orijentaciji, može se razriješiti na 2 načina i dovesti do 2 različita ishoda:
 aberantna rekombinacija - samo mali komadić DNA prelazi na drugu molekulu
 crossing-over - svaki kromosom je kombinacija roditeljskih kromosoma
Enzim RecA veže ssDNA i dsDNA te stvara kompleks među njima, katalizira izmjenu lanaca i
dovodi do stvaranja heterodupleksa. Hollydayeve veza razrješuje se tako što ju RuvA
prepoznaje, zatim RuvA i RuvB upravljaju migracijom mjesta na kojem su ukriženi lanci DNA i
konačno Ruv C razrješuje vezu kidanjem ukriženih lanaca. Nakon toga prekinuti se lanci
ponovno spajaju.
Preslagivanje DNA:
a) mjesno specifična rekombinacija: prototip je ugradnja bakteriofaga λ u genom E.coli.
Integracija je rezultat rekombinacije između specifičnih sljedova u bakteriofagu λ i
genomu E. coli nazvanih attP i attB (att = attachment), to su zapravo jednake sekvence.
Enzim integraza uvodi ds lomove i katalizira rekombinaciju, a attP i attB stvaraju ljepljive
krajeve.
Drugi primjeri mjesno-specifične rekombinacije su geni za imunoglobuline i varijabilna
područja receptora za T-stanice (za razliku od pt, kod receptora za T-stanice nije
pronađena somatska mutageneza).

Kako u našem genomu generirati pt za milijune Ag? HIPERVARIJABILNE REGIJE kodirane

su s V, D, J i C genima kod teških lanaca, kod lakih lanaca s V i D i C genima. V, D i J geni
građeni su od više kodirajućih sljedova međusobno odijeljenih RSS (rekombinationi
signal sequence) sljedovima. Kodirajući sljedovi mogu se kombinirati na sve moguće
načine pomoću mjesno-specifične rekombinacije, pri tom u konačnici u svakom Ig-skom
lancu bit će po jedna kodirajuća regija pojedinog gena. Mjesno specifičnu rekombinaciju
gena za imunoglobuline kataliziraju specifični proteini RAG1 i RAG2 koji uvode ds
lomove u DNA između RSS slijeda i kodirajućeg slijeda za pojedini V, D, J alel te zatim
spajaju kodirajuće sljedove nehomolognim spajanjem pri čemu nastaju sve moguće
kombinacije gena, i još je pri tom spajanju moguć gubitak ili dodatak nukleotida. Kod
teških lanaca prvo se rekombinacijski spajaju D i J, a zatim se DJ spaja s V te im se
pridružuje C. Kod lakih lanaca spajaju se V i D i pridružuje im se C. Tako nastaju B-stanice
 koje nose uputu za sintezu razno-raznih varijanti imunoglobulina. (ovo se događa
tijekom ranog razvoja)
Nakon što osoba dođe u kontakt s Ag dolazi i do somatske mutageneze pt zbog koje je
ukupni repertoar pt bitno veći od 11 mlrd koliko ih može nastati rekombinacijama
postojećih gena. Primjer je AID (aktivacijom inducirana deaminaza) - dolazi do
deaminacije citozina u uracil → taj uracil dovest će do ds lomova koji će rezultirati
popravljanjem DNA-polimerazom sklonom pogreškama. (hipervarijabilne regije
mijenjaju se brzinom od 10-3 promjena po nukleotidu po generaciji što je više nego
milijun puta brže od brzine spontanih mutacija u drugim genima)
Važno je spomenuti i mikroevoluciju pt - B limfociti čija pt čvršće vežu Ag brže se dijele -
s vremenom pt sve čvršće vežu Ag tj. postaju sve bolja. IgM uvijek ima manje
pojedinačne konstante vezanja, ali to nadoknađuje pentamernom strukturom.
Tu je i rekombinacija promjene klase - radi se o združivanju presloženih područja s
različitim konstantnim regijama pri čemu nastaju pt s različitim f-jama.

b) transpozicija (DNA-transpozoni): Transpozoni su pokretni genetički elementi koji ne

trebaju homologiju za premještanje. DNA-transpozoni kodiraju za transpozazu, a gen je
omeđen kratkim obrnutim ponavljanjem. To su mjesta djelovanja transpozaze.
Transpozaza uvodi stepenasti lom u ciljanu DNA i cijepa na krajevima obrnutih
ponavljajućih sljedova transpozona. Ona nije specifična za sljedove ciljne DNA pa je
moguće premještanje bilo gdje u genomu. Jednolančani krajevi ciljne DNA i transpozon
spajaju se i pukotina se popravlja. Kao obližnje mjesto ugradnje ostaje kratko
ponavljanje ciljnog slijeda DNA s obje strane transpozona. Transpozon se premješta bez
replikacije.
Možemo reći da dijelovi DNA skoče s jednog mjesta na drugi. Te sekvence omeđene su
ciljnim sekvencama. Za ugradnju ne trebaju homologiju što znači da se mogu ugraditi
bilo gdje u genomu. Problem nastaje jedino ako se ugrade unutar nekog drugog gena, ali
to se u pravilu ne događa.

retrottranspozicija (posredovana RNA-intermedijerima, čini većinu transpozona) -

mnogo složenija od transpozicije i uključuje replikaciju transpozona, mehanizam je nalik
ugradnji retrovirusnog genoma u genom domaćina. Kod retrovirusa DNA kopija RNA
molekule nastaje uz reverznu transkriptazu. Ta molekula DNA na oba kraja ima
ponavljanja od nekoliko stotina nukleotida i ona se zovu duga terminalna ponavljanja
(LTR). LTR nastaju duplikacijom onih mjesta na RNA virusa za koja se vežu početnice
kako bi započele sintezu DNA. DNA retrovirusa ugrađuje se u kromosom pomoću
integraze koja uvodi stepenasti rez u ciljnu DNA, virusna DNA povezuje se s ciljnom
DNA, pukotine se zatvaraju i ugrađeni provirus ostaje omeđen ponavljanjem slijeda
ciljen DNA.
 retrovirusu slični elementi - imaju LTR na oba kraja i kodiraju reverznu
transkriptazu i integrazu
  LINE - nemaju LTR, ali kodiraju za reverznu transkriptazu i endonukleazu
potrebnu za premještanje; na 3’ krajevima nalaze se sljedovi bogati adeninom i
omeđeni kratkim umnoženim sljedovima ciljne DNA, a nastali su reverznom
transkripcijom poli-A repova na mRNA (pri tom su početnice bile prekinuti
krajevi kromosomske DNA nastali cijepanjem nukleazom, a reverzna
transkriptaza započela je reverznu transkripciju unutar poli-A repa)
 SINE - ne kodiraju vlastite reverzne transkriptaze; na 3’ krajevima sljedovi su
bogati adeninom i omeđeni kratkim umnoženim sljedovima ciljne DNA, a nastali
su reverznom transkripcijom malih RNA uključenih u transport proteina (tRNA)
 dorađeni pseudogeni - nastaju integracijom DNA nastale obrnutim
prepisivanjem dorađene mRNA; oni završavaju slijedom koji je bogat adeninom
(poli-A rep) i nemaju introne

Transpozicija na nasumična mjesta u genomu nije korisna za stanicu jer se tim procesom
induciraju mutacije, ali mutacije u konačnici mogu biti korisne.

c) amplifikacija gena povećan je broj kopija gena unutar stanice. Višestruke kopije
određenih područja nastaju više puta ponovljenom replikacijom DNA. Umnoženi sljedovi
mogu biti prisutni kao ekstrakromosomske molekule ili kao niz ponavljajućih sljedova
unutar kromosoma. U svakom slučaju dovode do povećane ekspresije umnoženog gena.
Kod ljudi je iznimno rijetka pojava amplificiranih gena - nalazimo ih kod tumorskih
stanica. Karakteristični su za žabe koje amplificiraju gen za rRNA u oocitama zbog
povećane potrebe za proizvodnjom proteina.
Mutageneza
Mutageneza je proces nastanka mutacija.
Mutacija je promjena u redosljedu nukleotida. Razlikujemo ju od oštećenja DNA koja su nastala
npr. djelovanjem kemijskih tvari ili zračenjem, a koja ne mijenjaju slijed nego način povezivanja,
konformaciju i sl. Nakon oštećenja često slijedi mutacija, ali ta dva pojma potrebno je
razlikovati. Mutacije možemo podijeliti na točkaste - jednostruke i višestruke, delecije i
insercije.

Nasumična mutageneza podrazumijeva izazivanje mutacija u DNA, ali bez ciljanja na neki
specifičan dio DNA, do mutacija može doći bilo gdje. Tehnike uvođenja nasumičnih mutacija su
kemijska mutageneza (npr. hidroksilaminom), upotreba bakterijskog soja mutatora, npr. S.
typhimurium - nema mogućnost popravka pogrešaka DNA i korištenje transpozona
(nehomologna rekombinacija).
Bakterijski transpozoni često su smješteni na plazmidima i često već u sebi imaju gene za
rezistenciju na antibiotike koji se mogu iskoristiti kao SELEKCIJSKI BILJEZI. Njihova je
karakteristika mogućnost ugradnje nasumično u genom (nehomologna rekombinacija).
Razlikujemo inserciju transpozona in vivo i in vitro. Insercija transpozona in vivo je
TRANSFORMACIJA - bakterije svojom mašinerijom (enzim transpozaza) ugrađuju transpozon u
svoj genom. Insercija transpozona in vitro radi se tako da se u epruveti pomiješa ciljna DNA i
transpozon, doda se transpozaza da se dogodi ugradnja i dolazi do transformacije. Osnovna je
razlika što u in vitro uvjetima sami moramo osigurati transpozazu. Ovdje pod pojmom
transpozona ne mislimo na one iz ljudskog genoma!, već na bakterijske transpozone.
Nasumičnost je istovremeno prednost i nedostatak. Prednost je u tome što za mutagenezu nije
potrebno ništa pretpostavljati, nije potrebno znati ništa o ciljnoj molekuli DNA. Nedostatak je
taj što ne znamo što ćemo na kraju dobiti, ne možemo mutirati određene dijelove DNA, može
se dogoditi da mutacija koju dobijemo bude fenotipski neprimjetna, moguće je da dođe do
mutacije važnih funkcionalnih mjesta (ori, MSC, selekcijski biljezi i sl.), moguće su višestruke
mutacije. Također je teška selekcija i odabir zanimljivih mutacija.

Ciljana mutageneza način je uvođenja ciljanih mutacija u DNA. Može se raditi upotrebom
sintetičkih oligonukleotida koji sadrže mutacije, PCR tehnikom, uvođenjem delecija pomoću
restrikcijskih endonukleaza ili upotrebom egzonukleaza te homolognom rekombinacijom.
“Zamjena kasete”, tj. zamjena dijela gena sintetičkim fragmentom DNA koji sadrži mutacije,
metoda kod koje se dio DNA izrezuje restrikcijskim enzimom i na to mjesto se DNA-ligazom
uvodi sintetički fragment DNA koji sadrži željenu mutaciju.
Uvođenje delecija ENDONUKLEAZAMA moguće je onda kada imamo prikladne enzime i mjesta
koja možemo slijepiti. Metoda podrazumijeva kidanje segmenta DNA restrikcijskom
endonukleazom i ponovno povezivanje DNA-ligazom. Delecija EGZONUKLEAZOM znači
postupno uklanjanje jednog po jednog nukleotida počevši s kraja DNA molekule. Problem
metode je taj što ne znamo koliko će nukleotida “pojesti” naša egzonukleaza.
Ciljana mutageneta uz oligonukleotid najčešća je metoda ciljane mutageneze. To je metoda
kojom se mogu raditi supstitucije, insercije malog br. nukleotida i delecije. Imamo ssDNA
plazmida (dobivenu u labosu). Stavimo ju u epruvetu skupa s ssDNA oligonukleotidima i DNA-
polimerazom. Taj ssDNA oligonukleotid ima krajeve koji su komplementarni plazmidnoj ssDNA,
a u sredini su smješteni slijedovi koji će uzrokovati mutacije. Krajnji komplentarni slijedovi
omogućuju vezanje na plazmidnu DNA.
Kada želimo napraviti SUPSTITUCIJU koristimo oligonukleotid koji u svom središtu ima ugrađene
nukleotide nekomplementarne plazmidnoj DNA, a krajevi su komplementarni pa dolazi do
povezivanja. Npr. umjesto T u oligonukleotid ugrađen je C. Nakon ugradnje takve DNA u
stanicu, dolazi do popravaka DNA pri čemu će se dio plazmida vratiti u originalnu strukturu -
izbacit će se C i ubaciti T, a dio će biti mutiran - zadržat će se T, a u originalnom DNA lancu
plazmida A će se zamijeniti s G. (vidi sliku i bit će ti jasnije :D)
Kod INSERCIJE unutar oligonukleotida nalazi se
niz nukleotida koji ne odgovara plazmidnoj
ssDNA, a krajevi odgovaraju (komplementarni
su). Unutar stanice DNA-polimeraza popuni
rupu komplementarnim sparivanjem baza. Kod
dijela plazmida insert će otpasti.
Kod DELECIJE ugradi se oligonukleotid kojem fali
nekoliko nukleotida, plazmidna DNA tako ima
slijed nukleotida koji nema s čim povezati,
formira se petlja i ona otpada. Kod dijela
plazmida popunit će se rupa komplementarnim
sparivanjem baza (ako ima raspoloživih
nukleotida.
Rezultat ciljane mutageneze je mješavima potpuno mutiranih, potpuno nemutiranih plazmida i
hibrida (hibridi opstaju onda kada mehanizmi popravka nisu uspjeli inetvenirati).
Kako poboljšati učinkovitost, kako dobiti veći broj mutanata? Koristiti specijalne sojeve
bakterija koji nemaju mehanizme popravka krivo sparenih baza u DNA. Dodatno je dobro
upotrijebiti restrikcijske endonukleaze koje prepoznaju metiliranu DNA - one kidaju hibride i
plazmide divljeg tipa, a ostat će samo mutirani plazmidi. Najbolja je opcija PCR-mutageneza.
PCR-mutageneza metoda je koja učinkovito umnaža mutirane plazmide, rješava se hibrida i
divljih plazmida. Razlikujemo metode s 2 i s 4 početnice. Valja upamtiti da PCR reakciji prethodi
denaturacija kojom se plazmidi razdvajaju u ssDNA lance koji onda služe kao kalupi.
PCR-mutageneza - metoda s 2 početnice: Radi se o mutagenezi cijelog plazmida pomoću dvije
mutagene početnice. Mutirani oblik plazmida umnaža se PCR-om uz dvije mutagene početnice i
proofreading termostabilnu DNA-polimerazu. Hibridi i plazmidi divljeg tipa uklanjaju se
restrikcijskom endonukleazom DpnI koja kida metiliranu DNA. U slučaju hibrida denaturacija
koja prethodi PCR-u razdvaja mutiranu i plazmidnu DNA, plazmidna je metilirana i ona se kida, a
na mutiranoj (koja nije metilirana) sintetizira se komplementarni lanac PCR-om i ona može ući u
daljnje krugove PCR-a te se dalje umnažati kao potpuno mutirani plazmid. Kod plazmida divljeg
tipa sudbina oba lanca je kidanje endonukleazom. PCR-mutageneza ima učinkovitost >80%.

mutirani lanac ssDNA

divlji tip lanca ssDNA

PCR-mutageneza - metoda s 4 početnice: U 1. PCR reakciji koristimo jednu početnicu s

mutacijom, drugu bez mutacije. Nakon određenog broja ciklusa umnožili smo fragment koji
sadrži mutaciju. U 2. PCR reakciji koristimo opet jednu početnicu s mutacijom, a drugu bez, ali
fragment koji dobivamo pomaknut je u odnosu na prvu PCR reakciju (svejedno sadrži
mutaciju!). U trećoj PCR reakciji produkti prve i
druge reakcije postaju početnice koje se povežu
na dijelu na kojem se preklapaju te se
sintetiziraju komplementarni lanci prema
kalupu tih dugačkih početnica (parcijalni
produkti iz 1. i 2. PCR reakcije služe i kao
početnice i kao kalupi). Dodaju se i 2 obične
početnice bez mutacija s početka, dakle one
koje su išle u 1. i 2. reakciju, te se fragment
dobiven u 3. trećoj reakciji umnaža.
Inaktivacija gena insercijskom mutagenezom metoda je kod koje se ciljni gen izolira, umnoži i
klonira u vektor. Zatim se kaseta (kaseta je selekcijski biljeg za kvasac) s genom za rezistenciju
na antibiotik ugrađuje u jedinstveno restrikcijsko mjesto unutar ciljnog genoma. Nakon toga
slijedi inaktivacija genomske kopije gena homolognom rekombinacijom. Regije koje kodiraju za
isti gen homologne su regije i među njima dolazi do rekombinacije tako da inaktivirani gen ulazi
u genom. Nakon toga moguće je selektirati kolonije koje pokazuju rezistenciju na antibiotik.
Kod upotrebe E. coli treba biti oprezan u odabiru soja s obziroma da su mnogim sojevima
uklonjeni elementi za homolognu rekombinaciju.
Kod S. cerevisiae homologna rekombinacija može biti iznimno učinkovita, uz upotrebu
prikladnih kaseta.
6. predavanje: Regulacija genske ekspresije (epigenetika i male RNA)ss
Gen, genom, središnja dogma → sve unutar 2. predavanja
Različita tkiva u različitoj mjeri eksprimiraju različite gene.
RNA molekule koje sudjeluju u ekspresiji gena:
 mRNA (glasnička) - prenosi informaciju za biosintezu proteina u citoplazmu
 velik br. različitih molekula, u malom br. kopija
 tRNA (transportna) - služi kao ADAPTOR u prevođenju genetičkog koda (prevodi info u
protein, nemoj reći da je transporter!)
 40 različitih, velik br. kopija
 rRNA (ribosomska) - strukturna komponenta ribosoma, ima katalitičku ulogu u
biosintezi proteina
 dvije (provjeriti!!), čine oko 80% ukupne mase RNA u stanici
 male molekule RNA: snRNA (small nuclear), miRNA (micro), dsRNA (double stranded),
siRNA (short interfering)…
Sve RNA nastaju na DNA kalupu pomoću RNA-polimeraze. Znači za sintezu RNA nužno je imati
kalup (dsDNA kalup je preferirani, ali može poslužiti i ssDNA; RNA i RNA/DNA hibridi NE mogu),
aktivirane preteče (ATP, GTP, CTP, UTP) i dvovalentni kationi Mg2+ i Mn2+ za stabilizaciju
negativnih fosfatnih skupina.
Transkripcija je prepisivanje DNA u RNA. Dvije glavne karakteristike koje ju razlikuju od
replikacije su te da je lokalna - obuhvaća dio genoma i zahtijeva signal za početak i kraj sinteze
RNA (“signal tu ćeš počet i tu ćeš završit”) i asimetrična - prepisuje se samo NEKODIRAJUĆI
lanac. Novonastala RNA jednaka je kodirajućem (smislenom) lancu, a komplementarna kalupu.
Razlike od kodirajućeg su U umjesto T i ribonukleotidi umjesto deoksiribonukleotida.
Promotor je signal za početak transkripcije. Slijed nukleotida u svim promotorima nije identičan,
ali postoje određene sličnosti na osnovu kojih je modeliran usuglašeni slijed (consensus
sequence). Gotovo svi promotori od usuglašenog se slijeda razlikuju u svega jednom ili dva
nukleotida.
 promotor kod PROKARIOTA: -35 regija (TTGACA) i Pribnowljev slog (TATAAT) na lokaciji -10)
 promotor kod EUKARIOTA: CAAT-slog (GGNCAATCT) na lokaciji -75, koji nije uvijek prisutan i
TATA-slog ili Hognesov slog (TATAAA) na lokaciji -25
(početak DNA koji se prepisuje u RNA na mjestu je +1, a -35 znači broj nukleotida uzvodno
od gena koji se prepisuje)
Što je po strukturi promotor? DNA.
Regulacija ekspresije gena kod PROKARIOTA:
Operon je naziv za organizacijsku jedinicu prokariotskih gena. Jedan operon nosi više gena koji
ugl. kodiraju skup proteina koji je aktivan u istom metaboličkom procesu.
Lac-operon sadrži gene za razgradnju laktoze:
beta-galaktozidazu (Z-gen), permeazu (Y-gen) i
transacetilazu (A-gen).
I-gen nije pod kontrolom promotora, on kodira
represor.
Bez induktora (laktoze) represor je vezan na
operator i spriječena je trankripcija.
Kada ima laktoze, laktoza se veže na represor, on
mijenja konformaciju i ne može se vezati na
operator (mala konformacijska promjena veznog
mjesta za laktozu izaziva veliku konformacijsku
promjenu veznog mjesta za operator na DNA),
RNA-polimeraza slobodno prepisuje gene iz
operona.
Zašto se u labosu koristi IPTG kao induktor? Zato
što je učinkovitiji induktor od laktoze. Laktozu bi
bakterija pojela, a IPTG ne.

Neki operatori nalaze se na više mjesta u genomu te sudjeluju u regulaciji više različitih gena.

Objasniti lac-operon, laktozu i glukozu.

Neki operatori ne djeluju samo po principu 0/1, već su finije regulirani, npr. bakterija može
birati želi li iskorištavati laktozu - ona to NE želi ako u okolišu ima glukozu koja je iskoristivija.
CAP (catabolyte activator protein) je protein koji u kompleksu s cAMP-om povećava inicijaciju
transkripcije lac-operona za 50x. cAMP je bakterijski “hormon gladi” - bakterija ga sintetizira
kada je gladna. On se veže na CAP, a CAP-cAMP kompleks veže se na DNA, pored mjesta na
kojeg se može vezati RNA-polimeraza za prepisivanje lac-operona, čime stvara dodatnu točku
interakcije RNA-polimeraze (ona će se čvršće vezati). Znači, sad se RNA-polimeraza veže i s DNA
i s CAP proteinom i kreće trankripcija lac-operona.
Lac-operon u prisutnosti laktoze uvijek je otvoren (neblokiran), ali u slučaju kada nema cAMP-a,
kada bakterija nije gladna jer si pribavlja energiju iz glukoze, ekspresija mu je puno puno manja.
CAP je tada, kada nema cAMP-a, vezan na gene za metabolizam Glu.
Regulacija ekspresije gena kod EUKARIOTA:
Eukariotski genomi mnogo su složeniji od prokariotskih, stoga traže razrađenije mehanizme
regulacije.
Kako se sve može regulirati ekspresija gena kod eukariota?
Inicijacija ekpresije regulirana je pomoću transkripcijskih faktora, pojačivača, steroidnih
hormona… Osim inicijacije ekspresije u regulaciju ekspresije uključeni su dodatni čimbenici:
organizacija kromatina, dorada mRNA, stabilnost mRNA, regulacija na razini translacije, dorada
proteina, stabilnost i poluživot proteina, smještaj unutar stanice ili organizma.

INICIJACIJA EKSPRESIJE:
Transkripcijski faktori (TF) djeluju kao multiproteinski kompleksi. Interakcije između proteina
ključne su za aktivaciju i represiju transkripcije.
Eukariotski promotori sadrže vezna mjesta za više TF. Mjesto vezanja TF može se odrediti
imunoprecipitacijom kromatina - stanice se obrade formaldehidom tako da on umreži proteine
i DNA pa TF ostaju vezani na dio DNA kao u normalnoj stanici (TF su fiksirani na kromatin).
Zatim se izolira kromatin i pokida se sonikacijom u fragmente od 500pb. Slijedi
imunoprecipitacija protutijelima na određeni TF. Pt se veže na TF i prikupljaju se kompleksi
kromatin-pt. Veze umrežene formaldehidom se kidaju, DNA se pročisti i otkrije se koji fragmenti
DNA sadržavaju vezna mjesta za pojedini TF.
Pojačivači (enhancers) sljedovi su DNA koji potiču gensku ekspresiju povećavajući aktivnost
promotora pomoću vezivanja određenih TF. Oni nisu nužno u slijedu blizu gena na kojeg djeluju,
ali u 3D strukturi jesu (DNA stvara omče) - mogu biti
udaljeni i tisućama nukleotida od mjesta početka
transkripcije i mogu biti smješteni kako uzvodno tako i
nizvodno u slijedu. Znači, TF veže se na pojačivač koji se
prostorno nalazi u blizini gena čija se ekspresija pojačava.
On ulazi u interakciju s proteinima koji su u kompleksu s
RNA-polimerazom i posrednikom na promotoru.

Steroidni hormoni i srodne molekule (hormoni štitnjače, estrogen, testosteron) imaju

sposobnost prolaska kroz staničnu membranu nakon čega se vežu na receptore koji se zatim
vežu na DNA. Vezanjem na receptor dolazi do promjene konformacije receptora tako da se on
može vezati na DNA i na taj način promijeniti ekspresiju specifičnih gena.
Receptori hormona imaju DNA-veznu i ligand-veznu domenu. Oni se na DNA vežu kao dimeri i
time potiču vezanje koaktivatora ili korepresora čime se modificira kompleks inicijacije
transkripcije.

Steroidni receptori meta su brojih lijekova koji mogu djelovati kao agonisti (vezanje lijeka na
receptor potiče ekspresiju gena) ili antagonisti (kompetitivni inhibitori hormona koji se vežu na
isto mjesto na receptoru, ali svojom strukturom sprječavaju promjenu konformacije receptora i
onemugućuju vezanje koreceptora čime je f-ja receptora blokirana).

REGULACIJA EKSPRESIJE KROZ REGULACIJU STRUKTURE KROMATINA

Kromatin dolazi u 2 strukturne forme: eukromatin, koji je relativno dekondenzirani dio
kromatina u interfazi staničnog ciklusa i u takvom su obliku geni koji se aktivno prepisuju, te
heterokromatin koji je uvijek jako kondenziran i kroz stanični ciklus ne mijenja stupanj
kondenzacije, ugl. se radi o ponavljajućoj DNA. Transkripcijski aktivni geni ostaju vezani na
histone i pakirani u nukleosome.
Namotana DNA prepreka je transkripciji jer je pristup transkripcijskim faktorima i RNA-
polimerazi otežan, stoga se kromatin mora remodelirati. Tri su načina remodeliranja
kromatina: modifikacija histona, remodeliranje nukleosoma i združivanje nehistonskih proteina
s nukleosomima.
Modifikacije histona obavljaju specifični enzimi i u procesu u konačnici dolazi do promjene
strukture kromatina odnosno do promjene u ekspresiji gena.
Histoni iz oktamerne jezgre imaju dvije domene:
I. domena histonskog namatanja (histonski žlijeb) - omotava DNA oko srži nukleosomske
čestice i sudjeluje u interakcijama s drugim histonima
II. N-terminalni rep - varijabilni i nestrukturirani dio histona koji se pruža izvan
nukleosoma; u ovoj domeni prevladavaju Arg i Lys (bazične AK)
 modifikacije histona ugl. se događaju na N-terminalnom repu (jer je histonski
žlijeb namjenjen namatanju DNA i to se u pravilu ne mijenja).
Moguće kovalentne modifikacije histonskog repa su acetilacija
(Lys), fosforilacija (Arg), metilacija (Lys i Arg), ubikvitinizacija (Lys) i
poliADP-ribozilacija. One dovode do modifikacije histona što
dovodi do promjene u strukturi kromatina i rezultira genskom
aktivacijom ili genskim utišavanjem. Histonski kod termin je koji
označava raspored modifikacija na N-repovima histona koje
rezultiraju promjenom ekspresije gena (a bez promjene genetičke
upute).
Kovalentne modifikacije obavljaju visokospecifični enzimi koji modificiraju točno određene AK.
a) acetilacija - (+) naboj lizina prelazi u (0) čime se smanjuje afinitet za vezanje DNA (koja je
negativno nabijena) → povećava se pristupačnost kromatina proteinima koji se vežu na DNA
tj. olakšano je vezanje transkripcijskih faktora; acetil-lizin također prepoznaju i neki
specifični proteini koji reguliraju transkripciju
 HAT (histon-acetil-transferaza) - acetilira histone (djeluje AKTIVACIJSKI)
 HDAC (histon-deacetilaza) - uklanja acetilnu skupinu (djeluje utišavanjem ekspresije)
b) metilacija - enzim histon-metiltransferaza (dio korespresora, kod čovjeka protein SUV39H1)
metilira lizin koji kao takav postaje vezno mjesto za proteine koji induciraju kondenzaciju
kromatina (HP1 protein) u heterokromatin (UTIŠAVANJE gena)
Transkripcijski aktivni kromatin - na histonu H3: acetiliranje Lys9 i Lys14, metiliranje Lys4,
fosforiliranje Ser10.
Transkripcijski utišani kromatin - na histonu H3: deacetilacija Lys9, metiliranje Lys5 i Lys9.
Modifikacije histonskih repova reguliraju jedna drugu tvoreći različite uzorke histonskih
modifikacija povezane s transkripcijskom aktivnošću. Uzorci histonskih modifikacija osiguravaju
stabilan regulatorni kod za transkripcijsku aktivnost kromatina. Pa tako fosforilacija Ser10 potiče
acetilaciju Lys14, a inhibira metilaciju Lys9 (aktivacija), a metilacija Lys14 dovodi do inhibicije
metilacije Lys9 (aktivacija) i obratno (utišavanje).
Modifikacije histona ujedno su i mehanizam epigenetičkog nasljeđivanja odnosno prijenosa
informacije koja nije zapisana u DNA. Histoni H3 i H4 slučajno se raspodjeljuju na jedan od dva
sestrinska lanca tijekom replikacije, a histoni H2A i H2B u kompeticiji su s novonastalim
histonima za ulazak u kompleks s H3-H4. Nasljeđivanje roditeljskih H3-H4 tetramera omogućuje
nasljeđivanje istih modifikacija koje je imala roditeljska DNA jer modificirani histoni upravljaju
sličnim modifikacijama novosintetiziranih histona. Tako se održava postojeći obrazac histonske
modifikacije.
Kromatinska epigenetika ima utjecaj na inaktivaciju X-kromosoma, gensko utiskivanje
(imprinting), razvojno reprogramiranje staničnih linija, plastičnost stanica u diobi te je uključena
u razvoj raznih bolesti (rak), starenje, odgovor organizma na stres u okolišu… Npr. važno je što
majka jede dok je trudna jer na taj način prenosi info o količini hrane (energije) u okolišu. Ako je
u okolišu puno E, jedinka mora biti velika i snažna kako bi se istaknula naspram ostalih jedinki
(alfa položaj). Ako je u okolišu malo E, jedinka mora biti malena i otporna kako bi preživjela.

Remodeliranje nukleosoma: Zbog dinamičke interakcije s DNA većina nukleosoma nije strogo
pozicionirana. Nukleosomi mijenjaju pozicioniranje i to obavljaju nukleosomni remodelirajući
faktori - proteinski kompleksi koji koriste energiju hidrolize ATP-a za mijenjanje kontakata
između DNA i histona (pri tom ne dolazi do uklanjanja modifikacija s histona). Položaj
nukleosoma diktira koji je dio DNA podložan vezanju transkripcijskih faktora.
Tri su mehanizma kojima se pozicioniraju i remodeliraju nukleosomi:
 pomicanje histonskih oktamera duž DNA molekule (kao kotrljanje)
 kompletni prijenos histonskog oktamera s jedne na drugu molekulu DNA (kao da ga
otkinemo i stavimo negdje drugdje)
 konformacijske promjene u nukleosomu

Združivanje nehistonskih proteina s nukleosomima transkripcijski aktivnih gena: Nehistonski

proteini (HMG proteini - high mobility group) vežu se za specifične sljedove DNA - za histone ili
za enzime replikacijske i transkripcijske mašinerije i određuju koji će se gen prepisivati.

REGULACIJA EKSPRESIJE MODIFIKACIJOM DNA - metilacija CpG otoka: Radi se o metiliranju

citozina - dodaje se metilna skupina na 5C atom citozina. Ta metilna skupina ne interferira s
replikacijom i transkripcijom jer se ne mijenja struktura vodikovih veza.
Hipometilacija povezana je s aktivacijom gena, prisutna je u promotorskim regijama, aktivnim
genima i “housekeeping” genima.
Hipermetilacija povezana je s genskom supresijom, ona potiče promjene informacije u utišanim
regijama - važno za embrionalni razvoj - kod većine gena eksprimirani su i majčin i očev alel, ali
postoji mali broj utisnutih gena čija ekspresija ovisi o tome jesu li nasljeđeni od majke ili oca pa
se tako jedan alel prepisuje, a drugi je neaktivan.
Metilacija DNA simetrična je na oba lanca (zato CpG otoci!) i ima svojstvo održavanja nakon
replikacije DNA jer enzimi specifično metiliraju CpG otočiće na lancima-kćerima. Također se
propagira tj. zadržava u generacijama - metilirani geni u roditeljskoj stanici bit će metilirani i u
stanicama potomaka.
Hipermetilacija vezana je uz česte mutacije jer deaminacijom 5-metilcitozina nastaje timin (a ne
citozin) pa sustav ne može prepoznati koja je baza bila točna. Time je omogućena mutageneza u
heterokromatinu u kojem je inače i dozvoljen veći broj mutacija jer se ti geni ne prepisuju, a
mutacijom možda nastane neka pozitivna promjena. Za 5-metilcitozin kažemo da je MUTAGEN.

REGULACIJA EKSPRESIJE NEKODIRAJUĆIM RNA - siRNA i miRNA: Kratke dsRNA mogu utjecati na
ekspresiju gena na više načina: one izazivaju degradaciju homologne mRNA putem RNA
interferencije, one inhibiraju translaciju, one induciraju modifikacije histona koje dovode do
kondenzacije kromatina i nastanka heterokromatina.
siRNA udružuje se s RITS kompleksom (RITS = RNA inducirano transkripcijsko utišavanje) i oni
se skupa sparuju s mRNA transkriptom što dovodi do metilacije Lys9 na histonu H3 i
kondenzaicije u heterokromatin.
Nekodirajuće RNA dovode i do inaktivacije X-kromosoma. S obzirom da ženke imaju 2, a
muškarci 1 X kromosom, a X kromosom nosi više gena od Y kromosoma, kod ženki se određeni
geni moraju utišati - prevode se u heterokromatin. To se događa tako da nekodirajuća RNA
nastala ekspresijom Xist ostaje na neaktivnom X kromosomu i privlači proteine koji utišavaju
transkripciju i prevode X kromosom u heterokromatin.
7. predavanje: Stanična membrana i matriks
Stanična membrana izolira citoplazmu i posreduje u interakcijama između stanice i okoliša.
Građena je od lipida i proteina. Lipidi su temeljni strukturni elementi, a proteini su zaduženi za
obavljanje specifičnih f-ja kao što su transport i međustanično prepoznavanje. Membrana je
viskozna tekućina, mekana i savitljiva zbog nezasičenih masnih kiselina koje otežavaju gusto
pakiranje fosfolipida. Membrane su prekrivene OGROMNOM KOLIČINOM GLIKOKONJUGATA.

Lipidi:
Lipidi su osnova strukture membrane. Karakterizira ih hidrofobni i hidrofilni dio zbog čega
stvaraju dvosloje. Osnovni fosfolipidi su fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin i
sfingomijelin. Asimetrično su raspoređeni u vanjskom i unutarnjem sloju membrane. Vanjski sloj
čine fosfatidilkolin i sfingomijelin, a unutarnji fosfatidiletanolamin i fosfatidilserin koji imaju (-)
nabijene polarne glave zbog čega je unutarnji sloj membrane negativno nabijen.
Fosfatidilinozitol također je smješten u unutarnjem sloju membranu, on ima ulogu u endocitozi,
stvaranju međustaničnih veza i staničnoj signalizaciji.
Glikolipidi smješteni su u vanjskom sloju.
Kolesterol je steroidna molekula koja se ugrađuje u dvosloj. Pri visokim T ograničava pokretanje
lanaca fosfolipida pa čini membranu manje fluidnom, a pri niskim T onemogućuje povezivanje
lanaca masnih kiselina, sprječava smrzavanje i održava membranu fluidnom.
Membrana nije homogena - u njoj postoje regije koje nazivamo lipidne splavi (lipid rafts). To su
male polukrute domene, visoko uređene funkcionalne jedinice membrane, građene pretežno
od kolesterola i sfingolipida, a u kojima se nakupljaju proteini vezani za membranu GPI sidrima i
drugi proteini uključeni u signalizaciju i endocitozu. Lipidne splavi možemo zamisliti kao otoke u
membrani gdje svaki otok ima svoj sastav (lipide, proteine) i obavlja određeni proces.
U membrani se gubi faktor volumena, to znači da brzina reakcija koje se odvijaju u membrani
ovisi o fluidnosti membrane, a ne o koncentraciji (jer je konc. funkcija volumena). Zato su u
membrani mogući procesi koji u otopini ne bi bili mogući jer su koncentracije raznih tvari
previše male da bi u otopini bile signifikantne. Osim fluidnosti važan je i sadržaj proteina u
membrani koji su ugl. zaduženi za obavljanje procesa u membrani, a važan mehanizam kojim se
regulira aktivnost membranskih proteina je odcjepljenje proteina s membrane.

Proteini:
Membranski proteini obavljaju većinu f-ja u membrani. Ugl. se radi o peptidoglikanima u
kojima je ugljikohidratni dio mnogo mnogo veći od proteinskog i on ima ulogu “fine-tuninga” -
sam protein djeluje po principu 0/1 (radi ili ne radi), a glikan mu daje princip rada termostata,
finu prilagodbu djelovanja. Proteini mogu biti integrirani u lipidni dvosloj, mogu biti kovalentno
vezani na lipide ili glikolipide (lipidna sidra), mogu biti vezani za membranu preko GPI sidra ili
mogu prolazi kroz membranu (transmembranski proteini).
Integralni proteini nalaze se jednim svojim dijelom unutar dvosloja, prolaze kroz hidrofobni dio i
u tom dijelu oni su građeni od hidrofobnih AK, a drugi dio njih strše izvan membrane i građen je
od hidrofilnih AK.
Za potrebe istraživanja, da bi ih se oslobodilo iz membrane, potrebno je koristiti detergente.
Detergenti hidrofobnim krajem istiskuju membranske lipide i vežu se na hidrofobni dio
integralnih proteina (denaturiraju hidrofobni dio) tako da nastane kompleks detergent-protein
koji je topljiv u vodi. Važno je da detergent nije prejak, da nema prejako polarnu skupinu koja bi
denaturirala i hidrofilni dio proteina. Ne koristi se SDS - “on denaturira i vraga i boga”.
Transmembranski proteini skupina su integralnih proteina i oni imaju dio kojim prolaze kroz
dvosloj i dijelove koji strše izvan membrane s njene obje strane. Transmembranski dio ugl. je α-
uzvojnica građena od 20-25 hidrofobnih AK.
Proteini koji imaju jako puno unutarmembranskih segmenata, u kojima se očito nešto bitno
događa u membranu, još uvijek su dosta neistraženi jer je na njih teško djelovati detergentima.
Periferni proteini indirektno su pridruženi membrani preko protein-protein interakcija (vezani
su na integralne proteine) i imaju sposobnost disocijacije od membrane pod utjecajem polarnih
reagensa kao što je promjena pH ili konc. soli. Oni nisu uronjeni u hidrofobni dio membrane pa
su topljivi u vodenim puferima.
Proteini usidreni (gliko)lipidima u membranu - Neki su proteni usidreni u membranu pomoću
GPI sidra (glikozilfosfatidilinozitolna sidra). GPI sidra su glikolipidi na koje su vezani glikoproteini
na površini stanice. Moguće je i da se na proteine posttranslacijski dodaju lipidi - miristinska ili
palmitinska kiselina, te se onda ti proteini preko tih lipida vežu na dvosloj. To su proteini s
unutarnje strane membrane koji imaju ulogu u prijenosu signala od receptora na površini
stanice do ciljnih molekula u unutrašnjosti stanice. Ovi proteini u pravilu imaju trenutak u
funkciji u kojem se odvajaju od membrane i taj se trenutak iskorištava za izolaciju kod
istraživanja.

Proteini se unutar membrane mogu gibati. Većinu membranskih proteina odlikuje LATERALNA
MOBILNOST - gibanje po membrani lijevo-desno. Eksperiment kojim je to dokazano uključivao
je fuziju stanice čovjeka i miša pri čemu je na svakoj od tih stanica bio obilježen po 1
membranski protein. Hibridna stanica nakon fuzije sadržavala je humani protein na jednoj
polovici i mišji na drugoj. 40 minuta inkubacije proteini su bili jednoliko raspoređeni preko cijele
stanice. Prebacivanje proteina s unutarnje na vanjsku stranu membrane mnogo je rjeđe od
lateralne mobilnosti.
Neki pak proteini uopće nemaju sposobnost gibanja po membranu - mogu biti povezani s
citoskeletom, ograničeni vezama s drugim membranskim protienima na susjednim stanicama ili
s proteinima izvanstaničnog matriksa.
Neke stanice visoko su specijalizirane i njihove različite strane sadrže različite proteine koji
obavljaju svoje specifične funkcije zbog čega ne dolazi do izmjene proteina između tih strana.
Primjer takvih stanica su epitelne stanice crijeva. One imaju apikalnu i bazolateralnu stranu.
 apikalna strana (prema lumenu) - prekrivena je mikrovilima i specijalizirana za
apsorpciju hranjivih tvari
 bazolateralna strana (prema vezivnom tkivu i krvnim žilama) - specijalizirana je za
posredovanje u transportu apsorbiranih tvari u cirkulaciju
Da bi se spriječila pokretljivost proteina po membrani stanice, susjedne su stanice povezane
ČVRSTIM SPOJEVIMA koji zatvaraju prostor između stanica i priječe se gibanju proteina s jedne
strane na drugu. To ne znači da su proteini u membrani skroz nepomični - oni se mogu gibati
unutar svoje DOMENE, ali ne mogu se premještati iz jedne domene u drugu.

Glikokaliks:
Glikokaliks ugljikohidratni je pokrov stanice kojeg čine oligosaharidi glikolipida i glikozilirani
transmembranski proteini. Njemu je uloga zaštita površine stanice od ionskog i mehaničkog
stresa, stvara prepreku mikrobima te sudjeluje u staničnim interakcijama.
Primjer interakcija stanica preko glikokaliksa je adhezija leukocita na endotel krvnih žila kako bi
leukociti napustili krvotok i došli u tkivo zahvaćeno upalom. U procesu sudjeluju selektini
(proteini koji prepoznaju ugljikohidrate). Selektin E endotela i selektin P trombocita vežu se s
oligosaharidima leukocita, a selektin L leukocita prepoznaje oligosaharide na endotelu. L
selektin također prepoznaje promjene na leukocitima u području upale što im služi kao signal
da sve veći broj leukocita krene migrirati prema mjestu upale.

Transport kroz membranu:

PASIVNI TRANSPORT - bez utroška energije (niz gradijent)
Pasivna difuzija transport je kojim se male relativno hidrofobne molekule (plinovi O2 i CO2) i
male polarne nenabijene molekule (H2O, EtOH) otapaju u fosfolipidnom dvosloju i difundiraju
niz koncentracijski gradijent.
Olakšana difuzija transport je molekula koje se ne otapaju u lipidnom dvosluju niz
koncentracijski gradijent pomoću specifičnog transportera. Na taj način prenose se polarne i
nabijene molekule kao što su UH, AK, nukleotidi i ioni. Transporteri mogu biti proteinski nosači i
proteini kanali.
 a) proteini nosači s jedne strane membrane vežu molekulu koju će prenijeti kroz
membranu, a to za posljedicu ima konformacijsku promjenu zbog koje dolazi do
otpuštanja te molekule s druge strane membrane.
Pr. je transport glukoze GLUT transporterima (bazolateralna membrana epitelnih
stanica crijeva): GLUT transporteri imaju 12 transmembranskih α-uzvojnica (tipična
građa mnogih proteina nosača) i mogu postojati u 2 konformacije. Jedna je stanje u
kojem vezno mjesto za Glu gleda u enterocit i veže Glu, a to za posljedicu ima
konformacijsku promjenu kojom vezno mjesto za Glu počinje gledati van. Tada se Glu
otpušta van iz stanice i odmah ulazi u metabolički put, fosforilira se, tako da konc. Glu
ondje ostane niska tj. da se zadrži gradijent koncentracije. Inzulin djeluje kao signal
“glukozu treba unijeti u stanicu”. Mehanizam djelovanja je poticanje vezikula s GLUT
prijenosnicima da se fuzioniraju s membranom i izađu na njenu površinu. Ovo je primjer
kako stanična lokalizacija regulira aktivnost proteina.

b) proteinski kanali oblikuju otvorene pore kroz koje male molekule odgovarajuće veličine i
naboja slobodno prolaze, oni omogućuju selektivni prolaz specifičnih molekula, “strašno
su specifični!”
Pr. su akvaporini za prijenos vode - puno brži prijenos nego pasivnom difuzijom.
Pr. su kanali za neurotransmitere u neuronu - transport je izrazito brz, a sami kanali
imaju regulirano otvaranje/zatvaranje (nisu stalno otvoreni) - regulirano vratnicama koje
se otvaraju na poticaj koji je u ovom slučaju vezanje neurotransmitera (kažemo da su ovi
kanali kanali receptori). Znači neurotransmiter veže se na receptor na postsinaptičkoj
membrani i to dovodi do otvaranja kanala receptora, neurotransmiter ulazi u živčanu
stanicu iz koje se luči u sinapsu, ali ovaj put pod utjecajem akcijskog potencijala, i
ponovno se događa cijeli proces. Signalizacija u živčanom sustavu kompleksna je i
podrazumijeva usklađenu aktivnost kanala koji se otvaraju/zatvaraju pod utjecajem
promjene akcijskog potencijala i dodatno moduliraju količinom receptora, ali i samih
neurotransmitera.
 kanali za ACETILKOLIN funkcioniraju na ovaj način, a značajno je da se na
nikotinske receptore za acetilkolin može vezati i NIKOTIN pa on zadržava kanale
otvorenima što mijenja prijenos signala u mozgu - organizam se navikava na
prisutnost nikotina i jednom naviknut organizam u odsutsvu nikotina ne
funkcionira, oslabljen je prijenos signala i zato je po prestanku pušenja potrebno
razdoblje odvikavanja kako bi se organizam ponovno naviknuo na funkcioniranje
bez vanjskih modulatora

AKTIVNI TRANSPORT - uz utrošak energije (suprotno gradijentu)

ABC transporteri velika su obitelj proteina koja ima visokokonzervirane domene koje vežu ATP i
iskorištavaju ga kao izvor E za transport različitih molekula u jednom smjeru.
Pr. kod eukariota su MDR transporteri (multidrug resistance) koji iznose brojne citostatike iz
tumorskih stanica.
Ionske crpke prenose ione kroz membranu uz utrošak ATP-a. One su zadužene za održavanje
velike razlike u konc. iona unutar i izvan stanice tj. održavanje ionskog gradijenta. Taj ionski
gradijent pohranjuje energiju koja onda omogućuje aktivni transport brojnih molekula - npr. Glu
ulazi u epitel crijeva aktivnim transportom koji koristi E gradijenta Na.
Na/K ATPaza? Ima ulogu održavanja ionskog gradijenta - ona crpi Na+ van iz stanice, a K+ u
stanicu, a za to koristi energiju dobivenu hidrolizom ATP-a. Za hidrolizu ATP-a nužno je da
postoje i Na i K. Ona u unutrašnjosti ima 3 vezna mjesta za Na+, a s vanjske strane ima 2 vezna
mjesta za K+. Mehanizam djelovanja je sljedeći: s unutarnje strane stanice dolazi do vezanja 3
iona Na+ i do hidrolize ATP-a, Pi se veže na kanal, i pri tom se mijenja konformacija crpke. Tu
konformaciju karakterizira smanjenje afiniteta za vezanje Na+ i povećanje afiniteta za vezanje
K+ zbog čega Na+ sada difundira u izvanstanični prostor, a 2 iona K+ vežu se na receptore.
Vezanje K+ djeluje kao triger za otpuštanje Pi i vraćanje konformacije crpke u početnu
konformaciju. Vezna mjesta za vezanje K+ smanjuju afinitet vezanja i K+ se otpušta u stanicu, a
vezna mjesta za Na+ povećavaju afinitet, Na+ se veže u unutrašnjosti i ciklus se nastavlja.
Na/K ATP-aza djeluje neovisno o gradijentu iona, dapače radi suprotno gradijentu i povećava
već veliku razliku u koncentracijama iona unutar i izvan stanice. Cilj joj je stvoriti ogroman ionski
gradijent unutar kojeg će se pohraniti energija koja će se kasnije moći iskoristiti za transport.
 unutar stanice: [Na+] = 10 mM, [K+] = 140 mM
 izvan stanice: [Na+] = 145 mM, [K+] = 5 mM
 membranski potencijal mirovanja približno -60 mV

Transport ionskim gradijentom ne troši izravno ATP već iskorištava ionski gradijent (koji je
istinabog nastao utroškom ATP-a).
Pr. je simport Glu-Na (apikalna membrana endotela crijeva) - protein prijenosnik mijenja
konformaciju ovisno o tome jesu li vezani 2Na+ i Glu ili nisu. Kada se 2 iona Na+ i Glu vežu u
lumenu crijeva, konformacija se promijeni i oni se izbace u unutrašnjost stanice. Tada je
prijenosnik prazan i vraća se u početnu konformaciju u kojoj može vezati natrij i Glu iz lumena. S
obzirom da je gradijent Na+ ogroman, gotovo sva Glu uspješno će se unijeti iz crijeva. Simport
Glu-Na objašnjenje je zašto u energetskim pićima osim Glu postoji i sol.

Kako se transportira glukoze iz crijeva u cirkulaciju? Apikalna membrana epitelnih stanica

crijeva - kotransport s natrijem putem gradijenta natrija, bazolateralna membrana epitelnih
stanica crijeva - GLUT prijenosnici, olakšanom difuzijom, niz gradijent koncentracije.
Endocitoza proces je unosa makromolekula i čestica iz okoline na način da odsječak membrane
pupa dok ne nastane vezikula koja će zaokružiti željeni materijal i unijeti ga u stanicu. Sve
eukariotske stanice stvaraju male vezikule kojima upijaju tekućinu i makromolekule i to je
proces kojeg nazivamo pinocitoza (stanično napajanje). Na isti način, ali pomoću nešto većih
vezikula, specijalizirane stanice proždiru velike čestice (bakterije, stanični debris i intaktne
stanice) procesom koji nazivamo fagocitoza. Stanice sa sposobnošću fagocitoze nazivamo
fagocitima (to su makrofagi i neutrofili). U slučaju fagocitoze najprije dolazi do vezanja čestica
na receptore, zatim se pseudopodiji produljuju i zaokružuju česticu čime stvore vezikulu koju
nazivamo fagosom. Fagosom se unutar fagocita stapa s lizosomom u fagolizosom unutar kojeg
se pojedeni materijal razgrađuje.
ENDOCITOZA POSREDOVANA RECEPTOROM vrsta je pinocitoze koja omogućuje selektivan
unos makromolekula (stanica odabire koju će hranu iz okoliša unijeti ovisno o tome kakve su
njezine potrebe). Makromolekule vežu se na
svoje receptore koji su koncentrirani u
određenim regijama membrane, a koje se
nazivaju klatrinom obložene jažice. Pomoću
DINAMINA jažice pupaju i nastaju klatrinom
obložene vezikule koje sadrže receptore i vezane
ligande. Vezikule unutar stanice gube klatrinski
omotač i stapaju se s ranim endosomima pri
čemu nastaje odjeljak za sortiranje u kojem
dolazi do zakiseljavanja pa receptor disocira od
liganda. Receptor se vraća na membranu
pomoću transportne vezikule, a ligand ostaje u
endosomu. Endosom sazrijeva u kasni endosom
koji se može stopiti s vezikulama GA koje
sadrže enzime za razgradnju - stapanjem
vezikule GA i kasnog endosoma nastaje
lizosom u kojem se konačno razgrađuje
uneseni ligand. Ako se pitamo što je
klatrinom, on se reciklira - ide ponovno na
membranu tvoriti jažice.
Pr. je unos kolesterola. Kolesterol se u
cirkulaciji prenosi u obliku lipoproteina (LDL
čestica) koji se vežu na specifične
membranske receptrore - klatrinom obložene
jažice i endocitozom ulaze u stanicu. Cijeli
mehanizam unosa, razgradnje i recikliranja
receptora opisan je gore.
Kod bolesti koju nazivamo obiteljska hiperkolesterolemija došlo je do mutacije u
internalizacijskom signalu receptora za LDL, to znači da se LDL veže na receptore, ali ne ulazi u
stanicu. To za posljedicu ima nisku konc. kolesterola u stanici, a veliku u krvotoku.
Internalizacijski put termin je za niz radnji koje se moraju odviti unutar stanice da bi se u nju
uspješno unio u ovom slučaju kolesterol. Kod ove mutacije, radi se o mutaciji u citoplazmatskoj
domeni koja veže proteine adaptere koji pak vežu klatrin i omogućuju povezivanje klatrina u
karakterističnu loptastu strukturu. S obzirom da to nije moguće, LDL vezan na receptore neće se
moći unijeti u stanicu.
Stalnim recikliranjem receptora na staničnu površinu dolazi do stalne internalizacije liganda i
membrane tako da se u sat vremena internalizira oko 50% cijele membrane! Međutim to ne
znači da je svih tih 50% membrane zamijeni novosintetiziranom membranom, na
novosintetizirani dio otpada oko 5% stanične površine, dok je ostatak membrane nastao
recikliranjem internaliziranih dijelova.

Prazne sinaptičke vezikule također se obnavljaju u klatrinom obloženim vezikulama koje se

nakon stapanja s endosomom regeneriraju pupanjem od endosoma, a prilikom pupanja u njima
se akumuliraju novi neurotransmiteri.

Za razliku od ranije spomenutih receptora koji se recikliraju, neki se RAZGRAĐUJU.

Pr. su receptori za faktore rasta. Njihovom razgradnjom omogućeno je regulacijsko smanjenje
broja receptora.

TRANSCITOZA proces je prijenosa proteina

receptora s jedne na drugu stranu membrane
polariziranih stanica (kao što su stanice endotela
crijeva koje imaju različit sastav i obavljaju
različite funkcije na svojoj bazolateralnoj i
apikalnoj strani). Svi se proteini sintetizirani u stanici primarno šalju na bazolateralnu stranu
membrane, a različiti mehanizmi dorade onda upućuju protein s bazolateralne na apikalnu
stranu - oni se endocitozom selektivno transportiraju preko ranog endosoma do apikalne
membrane.
Izvanstanični matriks:
Izvanstanični matriks ispunjava prostor između stanica i povezuje ih u tkivo, a građen je od
proteina i polisaharida.
Kolagen je glavni strukturni protein izvanstaničnog matriksa. Građom je uska čvrsta trostruka
uzvojnica kod koje su 3 polipeptidna lanca zamotana jedna oko drugih poput užeta. Polipeptidni
lanci bogati su slijedovima glicin-prolin-hidroksiprolin koji stabiliziraju konformaciju uzvojnice
(to su male AK). Hidroksiprolin nastaje hidroksilacijom prolina enzimom prolil-hidroksilaza
kojem je za aktivnost potreban vitamin C. U slučaju nedostatka vitamina C javlja se skorbut -
manifestira se lezijama kože s krvarenjima i slabljenjem vezivnog tkiva. Uz kolagenu je često
prisutan i hidroksilizin.
Prokolagen topljiva je molekula koja nastaje u stanicama. Kolagenska vlakanca pravilno su
poredane trostruke uzvojnice koje nastaju u izvanstaničnom matriksu od prokolagena, a
kolagenska vlakna nastaju udruživanjem kolagenskih vlakanaca pomoću kovalentnih veza koje
se formiraju između lizina i hidroksilizina.
Glikozaminoglikani (GAG) polisaharidi su koji stvaraju gelastu strukturu izvanstaničnog matriksa
(u kojeg su onda uklopljeni proteini). Građeni su od ponavljajućih disaharidnih jedinica u kojima
je jedan šećer N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin. Imaju (-) naboj i vežu vodu pa
stvaraju hidrirane gelove koji pružaju mehaničku potporu matriksu. GAG-ovi se vežu na razne
sržne proteine i tako stvaraju proteoglikane. Također imaju signalnu ulogu - služe kao vezna
mjesta za određene regulatorne molekule i sudjeluju u staničnoj adheziji.
Integrini su porodica transmembranskih proteina koji povezuju stanicu s izvanstaničnim
matriksom. Građeni su od 2 podjedinice. Sudjeluju u stvaranju dvije vrste spojeva s matriksom,
a to su hemidezmosomi i povezivanje fokalnom adhezijom.
Hemidezmosomi specijalizirana su dodirna mjesta epitelnih stanica u kojima integrini stupaju u
interakcije s intermedijarnim vlaknima i pričvršćuju epitelnu stanicu na bazalnu membranu.
Fokalna adhezija veza je kod koje integrini vežu aktin i pričvršćuju stanice za matriks. To mogu
biti stabilne ili promjenjive interakcije, ovisno o tome kreću li se stanice ili ne. Ako se stanice
kreću, prilikom kretanja stari fokalni kompleksi slabe, a novi se formiraju - primjer je kotrljanje
leukocita prema mjestu upale. Nakon povezivanja selektina i oligosaharida na endotelu, nastaju
stabilnije interakcije između leukocitnih integrina i međustaničnih adhezijskih molekula (ICAM)
iz Ig superporodice.
Čvrsti spojevi (tight junctions) važni su za f-ju slojeva epitelnih stanica, oni služe kao zaprijeke
između odjeljaka, npr. između lumena crijeva i vezivnog tkiva te između apikalne i bazolateralne
strane stanica. To je najčvršći poznati spoj među susjednim stanicama. Nastaje pomoću mreže
proteinskih lanaca oko cijelog oboda stanice.
Tijesni spojevi (gap junctions) izravna su veza imeđu citoplazmi susjednih stanica. To su zapravo
otvoreni kanali kroz staničnu membranu koji čine slobodan prolaz za male molekule i ione, a
blokiraju prolaz proteinima i nukleinskim kiselinama. Građeni su od transmembranskih proteina
koneksina koji forme konekson - cilindar s porom u središtu. Koneksoni dviju susjednih stanica
međusobno se približavaju i spajaju. Ovi prolazi (njima prolaze signalne molekule poput Ca2+ i
cAMP-a) važni su za usklađeno djelovanje stanica, udruženu metaboličku aktivnost i električni
odgovor podraženih stanica, a pronalazimo ih u epitelnim stanicama, endotelnim stanicama,
stanicama srčanog mišića i glatkih mišića.
8. predavanje: Funkcijska genomika, bioinformatika i sistemska biologija
Genomika proučava genom, funkcijska genomika proučava funkciju genoma, sistamska biologija
proučava biološke sustav, a bioinformatika je područje koje koristi računalne tehnologije za
analizu bioloških podataka, dakle povezuje računalne znanosti i bioznanosti. Stvaraju se baze
podataka koje se koriste kako bi mnoštvo informacija bilo kategorizirano i lako dostupno svima
u znanosti, one se popunjavaju istraživanjima, ali se isto tako i one same mogu koristiti za
istraživanja - analiziraju se već poznati podaci pohranjeni u bazama i iz njih se izvode zaključci.
U biološke informacije ubrajaju se nukleotidni sljedovi, proteinski sljedovi, prostorne strukture i
skice, mapirani geni, dijagrami i prateća literatura. Sve te informacije potrebno je grupirati, to
može biti prema sličnosti ili kontekstu. Grupiranjem prema sličnosti (sekvenci ili f-jama)
dobivena su evolucijska stabla iz kojih se višestrukim sravnjivanjem nukleotidnih sljedova daju
uočiti konsenzusni sljedovi. Kada se podaci grupiraju prema kontekstu tu se misli na grupiranje
prema sudjelovanju u istom signalnom putu, prema vezanju istog liganda i sl.
Prva baza slijedova bio je Atlas proteinskih sekvenci i struktura (Margaret Dayhoff, 1965.) koji je
sadržavao podatke o svega 8 proteina i bio u papirnatom obliku. Dayhoff ne samo što je
napravila prvu bazu nego je i predvidjela da će s vremenom baze podataka postati neophodne.
Baze podataka nukleotidnih sljedova sadrže sve otkrivene nukleotidne sljedove, to su npr.
ENA, DDBJ i GenBank. Baze podataka proteinskih sljedova su npr. SwissProt, TrEMBL i PIR koje
su spojene u UniProt. Bibliografske baze podataka služe za pretraživanje znanstvene literature,
odnosno članaka u znanstvenim časopisima. Za biomedicinu najznačajnija je baza PubMed.
INSDC (international nucleotide sequence database collaboration) nukleotidna je baza
podataka i kolaboracija je koju čine ENA (Europa), NCBI (Amerika) i DDBJ (Japan). Međusobno
izmjenjuju podatke, svi su podaci dostupni svima i dospjevaju u bazu podataka već prije
objavljivanja istih u vidu zdravstvenog rada. Whole Genome Shotgun projekt daje iznimno velik
priljev podataka u gen-bank.
UniProt je baza podataka proteinskih slijedova. Ovdje su u suradnji SwissPROT, TrEMBL i PIR.
SwissPROT radi detaljna istraživanja, eksperimantalno provjerava podatke, potvrđuje 3D
strukture, funkcije i sl. TrEMBL (translated EMBL) je baza podataka koja sadrži sve gene EMBL-a
prevedene u proteine. EMBL je prvo ime za ENA-u. TrEMBL daje ogromnu količinu podataka, ali
oni nisu toliko relevantni kao oni od SwissPROTA jer se ne provjeravaju eksperimentalno.
PubMed je bibliografska baza podataka koja služi za pretraživanje znanstvene literature.
Smještena je u NCBI-u u Americi. Ima više od 30 mil. unosa, ima slobodne neke knjige i
udžbenike (ugl starija izdanja, ali mogu biti korisna).
Kliničke baze sadrže baze mutacija i baze polimorfizama. Polimorfizmi su varijacije među
nesrodnim ljudima. Nesrodni ljudi razlikuju se u jednom nukleotidu na svakih 1000 baza, a
najčešće su to promjene u jednom nukleotidu pa se ti polimorfizmi zovu polimorfizmi jednog
nukleotida (SNP). Otkrivaju se istraživanjima na tisućama ljudi. Učestalost polimorfizama iznosi
preko 0.5% u populaciji.
The Human Gene Mutation Database je klinička baza podataka koja je otvorena za fakultete
dok farmaceutske industrije plaćaju pristup.
Strukturne baze sadrže prostorne strukture proteina dobivene kristalografijom X-zraka i NMR-
om, a korisne su za strukturnu klasifikaciju i određivanje homologije među proteinima.
Integrirane baze sadrže pregled informacija iz drugih baza te poveznice na dodatne informacije.
To su npr. Ensembl (povezuje sve podatke o ljudskom genomu i genomima drugih eukariota) i
GeneCards (sadrži podatke o pojedinim genima).
Ensembl povezuje sve podatke o ljuskom genomu i genomima drugih sisavaca.
GeneCards sadrži podatke o pojedinim genima, radi se o bazi podataka ljudskih gena. Kaže
profa da je odlično polazište za seminar o nekom proteinu.
ExPASY je još jedna značajna integrirana baza podataka. Potječe sa švicarskog instituta za
bioinformatiku kao i SwissPROT. Obuhvaća mnogo baza podataka i alate za pretraživanje istih.
Izrazito je korisna u početku istraživanja jer u njoj možemo pronaći sve već otkrivene
informacije o predmetu našeg istraživanja. Ovoj bazi prethodile su Amos-ove www-stranice -
Amos je ručno sakupljao internetske stranice koje sadrže važne podatke.
BLAST je algoritam i program za usporedbu informacija o primarnim biološkim sekvencama,
poput aminokiselinskih sekvenci proteina ili nukleotida DNA i / ili RNA sekvenci.

Sistemska biologija disciplina je koja teži razumijevanju integriranih dinamičkih ponašanja

složenih bioloških sustava i procesa te udružuje sveobuhvatne biološke pokuse s kvantitativnom
analizom i razvojem modela za stanične procese. Iz toga su proizašle proteomika, sistemski
probiri genske funkcije, istraživanje regulacije genske ekspresije i analiza varijacija među
pojedincima. Jedna od metoda koju koristi sistemska biologija je RNAi u kojoj se koristi
dvolančana RNA koju kida enzim Dicer na kratke dvolančane oligonukleotide koje zovemo short
interfering RNA (siRNA). Oni se vežu s RISC i lanci siRNA se razdvajaju, a lanac siRNA koji je
komplementaran mRNA usmjerava kompleks RISC prema toj mRNA tako da je RISC može
razgraditi. Ova metoda korištena je u identifikaciji gena esencijalnih za život.
Još jedna metoda je DNA mikročip tehnologija koja se koristi za mjerenje razine ekspresije gena,
otkrivanje novih gena, otkrivanje lijekova, dijagnostiku i toksikološka istraživanja.

GWAS (genome-wide association studies, cjelogenomske asocijacijske studije) su istraživanja

koja koriste SNP-ove za identifikaciju gena povezanih s određenom bolešću. Pritom se
pregledava 500 tisuća čestih SNP-ova.
9. predavanje: Transgenične biljke i životinje
GMO (genetički modificirani organizam) - organizam u kojem je učinjena genetička promjena
metodama genetičkog inženjerstva, koristi se i za biljke i za životnje
Transgenični organizam - organizam koji nosi slijed DNA koji inače nije prirodno prisutan u
njegovom genomu
Transgen - ciljni gen uključen u stvaranje trangeničnog organizma
GMO podrazumijeva izbacivanje gena, manje mutacije u genima, modifikaciju već prisutnih
gena (in vivo promjene genoma pomoću enzima) kakve se potencijalno mogu dogoditi i same
od sebe. Diskutira se gdje je granica - kada organizam počinjemo smatrati genetski
modificiranim.

TRANSGENIČNE BILJKE:
U metode poboljšavanja svojstava biljaka ubrajaju se križanje, mutageneza i transformacija.
 križanje - dobivanje novih poboljšanih varijanti biljaka, križati se mogu dvije jedinke istih ili
srodnih vrsta
 NE uključuje metode genetičkog inženjerstva - dobivene varijante nisu GMO
 pr. pšenica x raž → tritikala (ima bolji prinos i sadržaj proteina u odnosu na
roditeljske vrste)
 mutageneza - proces stvaranja mutacija u genu - kemikalijama ili zračenjem; NE uključuje
unos transgena (izmjenjuju se već pristutni geni)
 događa se i sama po sebi prirodi, genomi biljaka vrlo su promjenjivi
 dobivene varijante namjernim izazivanjem mutacija za sad se ne smatraju GMO
 postavlja se pitanje razlikuje li se mutageneza koja je inducirana od mutageneze u
prirodi, mora se proučiti kako metageneza biljaka utječe na ljude; razmatra se bi li se
neke biljke dobivene mutagenezom trebale smatrati GMO
 pšenica (oktaploid) i banane (triploidi) koje danas poznajemo dobivene su
određenim postupcima koji nisu klasificirani kao GMO, ali su na njima vršene
promjene - koje bi se možda dogodile u prirodi, a možda i ne bi - treba li ih smatrati
genetski modificarnim organizmima?
 transformacija - postupak unošenja gena iz druge vrste (organizmi se definitivno svrstavaju
u skupinu GMO)

Koraci u stvaranju transgeničnih biljaka:

Prvo je potrebno klonirati gen od interesa u odgovarajući vektor (najčešće korišteni su virus
mozaične bolesti duhana i Ti-plazmid iz Agrobacterium tumefaciens) čime se dobiva
rekombinantna DNA. Ona se unosi u biljku. Zatim se selektiraju transformanti i iz njih se čitava
biljka razvija prvo u laboratoriju, a zatim izvan laboratorija. Biljka može izaći na tržište tek onda
kada je ispitana i u laboratoriju i izvan njega.
Plazmid-Ti jedan je od najznačajnijih vektora za stvaranje transgeničnih biljaka. Prirodni je
plazmid bakterije Agrobacteium tumefaciens. On nosi gene za tumorigenezu, virulanciju te
sintezu i uporabu opina (derivata neobičnih AK). T-DNA je regija s genima za tumorigenezu,
koja uzrokuje tumore u biljkama. Ona je omeđena PONAVLJAJUĆIM SLIJEDOVIMA pomoću kojih
se nasumično (nehomolognom rekombinacijom) ugrađuje u genom biljke. T-DNA regija je koja
se može zamijeniti stranom DNA za unos u biljku, a ponavljajući sljedovi se zadržavaju radi
ugradnje.
Za unos DNA u biljku može se koristiti infekcija bakterijom A. tumefaciens, elektroporacija
protoplasta (uz PEG i liposome) ili biolistika (genski pištolj, genski top).
 infekcija bakterijom A. tumefaciens - podrazumijeva infekciju biljnih stanica bakterijom
u čiji je plazmid ugrađen gen od interesa, iz tih se stanica zatim razvije cijela biljka
 elektroporacija protoplasta: (protoplast je biljna stanica bez stijenke, sferoplast je
kvasac bez stijenke)
 radi se o kratkom impulsu kojim se DNA natjera u stanicu
 LIPOSOM - nositelj DNA, omogućuje ulazak u jezgru (fuzija s jezgrinom
ovojnicom)
 PEG (polietilen glikol) - djeluje kao surfaktant (smanjuje površinsku napetost)
 biolistika (genski pištolj, genski top) - DNA se istaloži na sitne čestice zlata ili volframa i
onda se te čestice ispucavaju u biljne stanice
Ugradnja rekombinantne DNA može ići u cijelu biljku ili u segment biljke kao što je list (pomoću
A. tumefaciens),a može ići i u protoplast (elektroporacijom ili biolistikom).
U slučaju ugradnje u cijelu biljku biljka sama prenese infekciju duž cijele biljke. U slučaju
ugradnje u list prvo se razvija kalus - amorfna nakupina nediferenciranih biljnih stanica iz kojih
se pomoću biljnih hormona i uz dovoljno nutrijenata razvija čitava biljka. U slučaju protoplasta
također najprije slijedi razvoj kalusa, a zatim cijele biljke. Biljke imaju svojstvo dediferencijacije
što znači da iz potpuno diferencirane stanice (kao što je stanica lista) uz dodatak biljnih
hormona i nutrijenata može doći do promjene eksresije gena na način da se prvo razviju
dediferencirane stanice koje se onda postupno diferenciraju u različite stanice, s različitom
ekspresijom gena, koje oformljavaju različite dijelove biljke tj. u konačnici cijelu biljku.
Za vrijeme ispitivanja izvan laboratorija (testiranja u polju) radi se brdo testova i provjera. Ako je
utvrđeno da je biljka sigurna za korištenje, ona se plasira na tržište. Najtestiranija i
najispitivanija hrana na tržištu je genetski modificirana transgenična hrana! - provodi se puno
više testova nego u slučaju križanja i mutageneze.
Ciljevi stvaranja transgeničnih biljaka: povećati prinos usjeva, poboljšati toleranciju na abiotički
stres (visoke T, visok intenzitet sunčeve svjetlosti, suša, vlaga, slanost tla itd.), poboljšati
toleranciju na biotički stres (razviti otpornost na štetnike, herbicide i bolesti), poboljšati hranjivu
vrijednost namirnica, odgoditi propadanje hrane, sniziti cijenu hrane, proizvesti jestive vakcine,
proizvesti sekunadarne metabolite i biološke lijekove.
Biljke otporne na štetnike: Transgen je Bt-toksin - protein iz bakterije Bacillus thuringiensis. On
se još od 1920ih upotrebljava kao bionsekticid u obliku spreja i uobičajeno se upotrebljava u
ekološkom uzgoju. U prirodnom obliku ubija insekte iz redova Lepidoptera (leptiri, moljci),
Dipthera (muhe) i Coleoptera (koršnjaši). Kod GM biljaka gen za Bt toksin ugrađen je u biljku i to
se radi o specifičnoj varijanti Bt toksina koja je štetna za određene razvojne stadije pojedinih
štetnika, ovisno o tome što je kojoj biljci potrebno.
Pr. je kukuruz otporan na insekte koji ima transgen za δ-Bt-toksin koji ubija kukuruzne moljce
(Ostrinia nubialis i Helicoverpa zea). Gusjenice moljaca uđu u kukuruz i biljka ih ubije. Super je
što tako modificiran kukuruz ne ubija sve insekte na području na kojem je posađen, već samo
one za njega opasne (očuvanje bioraznolikosti).
Biljke otporne na herbicide (glifozat): Glifozat (N-fosfonometil-glicin) jedan je od najkorištenijih
herbicida. Transgenične biljke otporne na njega sadrže transgen za modificiranu EPSP-sintazu
(fosfinotricin-N-acetil-transferazu) - bakterijski enzim. Usjevi s ovom modifikacijom na tržištu su
poznati kao “Roundup ready” usjevi. Normalne biljke osjetljive su na glifozat jer on inhibira
njihovu EPSP-sintazu i one stoga ne mogu sintetizirati aromatske AK što u konačnici dovodi do
smrti stanice. Transgenične biljke, koje sadrže bakterijsku EPSP-sintazu, otporne su na glifozat i
normalno mogu stvarati aromatske AK što omogućuje normalan razvoj biljke.
Monsanto priča ide odatle da oni prodaju i glifozat i sjeme za “roundup ready” usjeve. Također
prema nekim tvrdnjama glifozat se smatra karcinogenim, međutim zasad to nije dokazano.
Biljke otporne na viruse (potivirusi): Potivirusi uzrokuju štetu na usjevima papaja, lubenica i
tikvica. Za otpornost ugrađuje se transgen - protein virusnog omotača. Protein se proizvodu u
biljci i aktivira zaštitne mehanizme zbog kojih biljka postaje otporna na virus → imunizacija
biljke, kao cijepljenje kod ljudi - ne izaziva se bolest, već djeluje antigeno i potiče imunosni
odgovor.
Zlatna riža s genima za biosintetski put β-karotena:
β-karoten prekursor je vitamina A prirodno prisutan u nekim biljkama (ne i u riži). Nedostatak
vitamina A dovodi do sljepoće i drugih poremećaja. S obzirom da je problem manjka vit. A ugl.
vezan uz siromašne zemlje u kojima se
prehrana temelji na riži, a gdje uzimanje
dodataka prehrani nije moguće, kao
rješenje problema proizvedena je GM riža
koja sadrži sve enzime biosintetskog
puta β-karotena. Prva varijanta zlatne riže sadržavala je transgene iz sunovrata (narcise) i
Erwiniae uredovore.
Iz sunovrata dodani su geni za fitoen-sintazu i likopen-β-ciklazu. Iz bakterije Erwinia uredovora
dodan je jedinstveni gen za 2 enzima fitoen-desaturazu i ξ-karoten-desaturazu.
Ta varijanta zlatne riže nije stvarala dostatnu količinu β-karotena stoga su znanstvenici nastali
istraživanja i osmislili Zlatnu rižu 2. Druga varijanta zlatne riže umjesto fitoen-sintaze iz
sunovrata sadrži enzim iz kukuruza koji znatno povećava sintezu β-karotena. FDA je odobrila
zlatnu rižu 2 za hranu 2018. godine.
Rajčica koja dulje ostaje svježa (Flavr Savr rajčica): Poligalakturonaza odgovorna je za
sazrijevanje i truljenje. sintezu U ovu rajčicu ubačen je protusmisleni sintetički gen za
poligalakturonazu - gen za sintezu antisense mRNA koja se komplementarno sparuje sa
smislenom mRNA, stvara se dupleks koji se ne može prevesti u poligalakturonazu zbog čega je
odgođeno sazrijevanje i truljenje. Prva varijanta Flavr Savr rajčice izbačena je iz upotrebe zbog
velike sklonosti bolestima. Danas se istom tehnologijom pokušava djelovati na druge enzime
zrenja.
Jabuka i krumpir otporni na smeđenje: Transgen je protusmisleni sintetički gen za katekolazu
(polifenol-oksidazu) koji dovodi do utišavanja ekspresije gena. Enzim katekolaza nalazi se u
mitohondrijima i plastidima, rezanjem dolazi u kontakt sa supstratima u citoplazmi pa nastaju
crveni benzokinoni koji inhibiraju rast mikroorganizama i štite plod od truljenja, a u neenzimskoj
reakciji benzokinoni reagiraju stvarajući melanin koji uzrokuje smeđenje.
Biljke kao jestive vakcine: Jestive biljne vakcine još su u ranim fazama istraživanja! Ideja je
iskoristiti biljke kao jeftine, sigurne i učinkovite sustave za uzimanje vakcina. One bi iz
probavnog sustava razgradnjom i apsorpcijom dospjele u krvotok.
U duhanu se može ekspremirati površinski Ag Streptococcusa mutansa koji je uključen u
stvaranje karijesa. Konzumacija duhana u tom bi slučaju mogla dovesti do stimulacije
imunosnog odgovora u mukozi usne šupljine i spriječiti nastanjivanje bakterija.
Druge ideje su površinski Ag herpes virusa B u duhanu, glikoprotein virusa bjesnoće u rajčici, Ag
HBV-a u salati, podjedinica kolera toksina u krumpiru.
Prva uspješna klinička studija jestivih vakcina na ljudima bio je transgenični krumpir s
podjedinicom toksina E.coli.
Terapijski rekombinantni proteini proizvedeni u biljkama:
Prvi odobreni rekomb. protein proizveden u biljci (biološki lijek) je enzim glukocerebrozidaza
proizveden u stanicama mrkve. Koristi se za liječenje Gaucherove bolesti (bolest nakupljanja
sfingolipida zbog deficita enzima za njihovu razgradnju; u tkivnim makrofagima nakupljaju se
lipidi). Proizvodi se u bioreaktorima - veliki spremnici od nehrđajućeg čelika u kojima se
održavaju strogo sterilni uvjeti. Danas su češće u upotrebi jednokratne vrećice za proizvodnju
koje se bacaju nakon svake upotrebe što je ubrzalo proizvodnju jer nema zaustavljanja zbog
sterilizacije iza svakog kruga uspješne proizvodnje.
U fazi kliničkih studija su CaroRX - rekombinantno pt na S. mutans i Merispace - rekombinantna
želučana lipaza sisavaca.
Transgenične biljke u pripremi: pšenica otporna na pepelnicu i s manjim udjelom glutena,
krumpir s modificiranim sastavom škroba, riža otporna na bolesti i s modificiranom građom
klasa, banana otporna na patogene gljivice, limun otporan na patogene viruse.
TRANSGENIČNE ŽIVOTINJE:
Za stvaranje transgeničnih životinja značajan je embrionalni razvoj. Nakon oplodnje zaključno s
8erostaničnim embrijem sve stanice imaju sposobnost tvorbe bilo kojeg tipa stanica i iz njih se
može razviti cijeli organizam, te stanice nazivamo TOTIPOTENTNIMA, a to znači da iz svake od
tih 8 stanica možemo razviti po jedan cijeli organizam tj. možemo dobiti 8 klonova. U kasnijim
razvojnim stadijima embrija razvija se blastocista građena od trofoektoderma (vanjski sloj
stanica blastociste) i embrijskih matičnih stanica (u unutrašnjosti blastociste) koje su
PLURIPOTENTNE što znači da imaju sposobnost tvorbe svih tipova stanica (ali se iz jedne
sponatno ne može razviti čitav organizam). Odrasle matične stanice su malobrojne
nediferencirane stanice unutar diferenciranih stanica ili tkiva koje su sposobne sazrjeti u neke
specijalizirane tipove stanica, za njih kažemo da su MULTIPOTENTNE. Primjer multipotentnih
stanica su hematopoetska matična stanica, matične stanice strome koštane srži, moždane
matične stanice. Umbilikalne matične stanice izolirane su iz umbilikalne vene po rođenju.
Embrijske matične stanice pluripotentne su matične stanice koje potječu iz unutrašnje mase
blastociste. Moguće ih je uzgajati u kulturi, njima manipulirati i ponovno ih vratiti u blastocistu
gdje one pridonose rastu svih dijelova embrija.
Za istraživanja najviše se koriste mišje embrijske stanice. One se u kulturama održavaju u
nediferenciranom stanju na sloju stanica hranilica (feeder layer) uz dodatak inhibicijskog
faktora leukemije (leukemia inhibitory factor, LIF). Na taj način moguće ih je dugo održavati u
kulturi, one ne pokazuju znakove starenja i mogu se stvarati u neograničenim količinama. Bez
LIF-a spontano diferenciraju u sve stanične tipove, a uz hormone i faktore rasta stvaraju se
specifične stanične linije.
Transgenične životinje služe nam za identifikaciju i razumijevanje uloge pojedinih gena (knock
out, knock in, mutageneza), razumijevanje kontrole genske ekspresije, proučavanje bolesti
(životinje mogu biti modeli bolesti), genetičko obilježavanje organizama i za proizvodnju
biofarmaceutika (tzv. pharm animals - npr. proizvodnja inzulina u kravljem mlijeku).
Knock-out je inaktivacija gena u genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena
mutiranom varijantom (postojeći se gen inaktivira).
Knock-in je uvođenje nove funkcije u genom (ubacuje se gen kojeg prije nije bilo u genomu).
Kod transgeničnih životinja strani (vanjski) gen treba se stabilno uvesti u organizam. Cilj je da
sve stanice u organizmu sadrže strani gen i da je genetička promjena nasljedna.
Stvaranje transgena: DNA slijed željenog
gena izolira se, obično se radi o cDNA.
Genu se dodaju regulatorni elementi koji
osiguravaju ispravno procesiranje RNA i
ekspresiju u određenom tkivu/organizmu.
Uvođenje transgena: Za uvođenje transgena u ciljnu stanicu koriste se izravna i retrovirusna
transfekcija embrijskih matičnih stanica i njihovo uvođenje u blastocistu, retroviralna infekcija
ranih embrija, izravno mikroinjektiranje DNA u oocite, prijenos putem spermija, elektroporacija
i biolistika ili elektrofuzija.
a) Mikroinjektiranje - otopina DNA injektira se u rani embrij ili u gamete
 kod miša injektiranje u muški pronukleus nakon oplodnje, ali prije fuzije (muški
pronukleus je veći pa je injektiranje lakše)
 injektiranje se obavlja Pasteurovom pipetom
b) Elektroporacija - namakanje stanica u mediju koji sadrži otopinu DNA, zatim izlaganje
električnom šoku (240V) koji dovodi do stvaranja sitnih lezija u staničnoj membrani koje
omogućavaju ulazak DNA u stanicu
c) Elektrofuzija:
 DONORSKA STANICA - često stanica kvasca koja nosi kvaščev rekombinantni
kromosom, sama stanica ima ulogu prijenosa transgena u STANICU SISAVCA
 blagim električnim pulsom donorska stanica i stanica sisavca spajaju se (prirodni
kromosomi kvasca pritom se gube)
Integracija transgena u genom ugl. je nasumična (NASUMIČNA UGRADNJA), endogeni enzimi za
popravak DNA stvaraju prekide u genomskoj DNA kako bi došlo do ugradnje. HOMOLOGNA
REKOMBINACIJA proces je specifične ugradnje transgena na ciljano mjesto i vrlo je rijedak
događaj (kod unosa transgena pomoću vektora događa se u <2% svih integracijskih slučajeva).
Za homolognu rekombinaciju potrebno je da se transgen ugrađuje u DNA na mjesto omeđeno
homolognim sljedovima i da se jednaki sljedovi nalaze na vektoru u kojeg transgen unosimo.
Nakon ugradnje transgena potrebno je utvrditi u kojim je stanicama došlo do homologne
rekombinacije - u kojim je stanicama na pravilno mjesto ugrađen pravilan transgen.
Na proces možemo utjecati i tako da transgen integriramo kao konkatamer (više uzastopno
povezanih transgena).
Pr. ugradnja gena za rezistenciju na neomicin, dodaje se i gen za timidilat kinazu: Na DNA
molekulama postoje homologni sljedovi unutar kojih su smješteni određeni geni. Na endogenoj
DNA između homolognih sljedova nalazi se endogeni gen, a na vektoru između homolognih
sljedova smješen je promotor i gen za rezistenciju na neomicin. Izvan tih homolognih sljedova
na vektoru smješten je gen za timidilat-kinazu. Timidilad-kinaza enzim je koji fosforilira
ganciklovir koji se kao takav ugrađuje u DNA zbog čega stanica umire. Kada se dogodi
homologna rekombinacija na ispravnom mjestu, gen za neomicin s promotorom ugrađuje se u
ciljnu DNA i stanica preživljava. U slučaju kada dođe do nasumične ugradnje uz gen za
rezistenciju na neomicin i promotor ugrađuje se i gen za timidilat kinazu - stanice u kojima je
došlo do nehomologne rekombinacije u mediju s ganciklovirom umiru.
Ako se DNA unese u jednu stanicu 8-staničnog embrija ili u nekoliko EMS u blastocisti doći će do
nastanka mozaične životinje - KIMERE (samo su neke stanice modificirane). Želimo li povećati
vjerojatnost da sve stanice sadrže transgen, DNA uvodimo u stanice germinacijske linije - u
oocitu, spermij ili zigotu. Kako bi se dobio homozigotni transgenični soj životinje prvo se u
uterus implantiraju transformirane blastociste ili jajne stanice. Potomstvo se testira na
prisutnost željenog gena - uoče se heterozigotne jedinke. Križanjem heterozigotnih jedinki
odbivaju se homozigoti.

Veliki miševi prvi su primjer transgeničnih životinja. Kod njih je visoko eksprimiran gen za
hormon rasta. Transgen je pod kontrolom metalotioneinskog promotora.
Transgenične životinje kao modeli bolesti: Životinja izbora je miš. Nastao je onkomiš, model za
tumor dojke, zatim za rak prostate, miš s Alzheimerovom bolesti te miš s teškim kombiniranim
sindromom imunodeficijencije.
Pastrve: U slučaju pastrvi ekspresija hormona rasta nije jednako učinkovita kod divlje i domaće
vrste. Divlja pastrva uspješno je modificrana, a domaća nije (transgenčna nije ništa veća od
normalne). To znači da transgen neće uvijek biti eksprimiran.
Kod transgeničnih riba problem je bijeg iz uzgajališta i križanje s divljim tipom ribe. Ne zna se
ima li transgenična riba prednost u parenju, ali zna se da je nesposobnija za život u divljini,
stoga njezina pojava može negativno utjecati na normalnu populaciju. Rješenje tog problema je
uzgoj sterilne ribe ili uzgoj u bazenima iz kojih je bijeg u divljinu onemogućen.
Transgenične životnje kao izvori terapijskih proteina: 2009. FDA je odobrila lijek Atryn -
antitrombin III proizveden u mlijeku koza (prvi odobreni lijek proizveden u transgeničnoj
životinji). Jedna transgenična koza može godišnje proizvesti istu količinu antitrombina kao 90
000 donacija krvi.
2014. odobren je Ruconest - ljudska rekombinantna C1-esteraza dobivena u mlijeku
transgeničnog kunića. Koristi se za liječenje naslijednog angioedema.

Ovdje postoji niz problema: varijabilnost genske ekspresije, različiti sisavci koji stvaraju različite
posttranslacijske modifikacije. Osim toga dugo je vremena potrebno za dobivanje odrasle
životinje od transgeničnog embrija. Mikroinjektiranje je slabo učinkovito, stoga se prešlo na
metodu prijenosa jezgre koja se koristi za kloniranje životinja.

GloFish prva je transgenična životinja koja je namjenjena da bude kućni ljubimac. Ona
eksprimira fluorescentni protein. U Japanu od nje rade i sushi.
10. predavanje: Stanična komunikacija i prilagodba - posttranslacijske
modifikacije u regulaciji staničnih procesa
Glikozilacija strukturna je posttranslacijska modifikacija koja značajno pridonosi strukturi i
funkciji proteina i podrazumijeva pripajanje glikana proteinu.
Glikani predstavljaju jedan od četiri temeljna gradivna elementa svake stanice (uz nukleinske
kiseline, proteine i lipide). Oni prekrivaju membrane svih stanica i suprotno slikama membrana
koje pronalazimo u udžbenicima, koje prikazuju glikane malenim dodacima na lipidni dvosloj,
glikani zapravo čine debeli sloj, mnogo deblji od lipida. Zbog toga velika većina interakcija na
površini stanice uključuje glikane. Oni mogu služiti kao kamuflaža (virusi se omotaju u glikane
jednake glikanima naših stanica) ili kao barijera („sprječavaju ulaz barbara“), mjesta su
prepoznavanja u međustaničnim interakcijama, služe za vezanje hormona, toksina, virusa i
drugih patogena. Osim membranskih proteina i izvanstanični proteini uglavnom su glikozilirani.
Glikoproteini pojavili su se relativno kasno u evoluciji, ali su glikanske strukture visoko očuvane
(zadržale su jednaku strukturu tijekom vremena).
OST (oligosaharil transferaza) integralni je dio ribosomskog kompleksa u endoplazmatskom
retikulumu.

Glikani su građeni komplicirano, imaju ogromne razgranate strukture. Oni ne funkcioniraju kao
skup monosaharida, već su organizirani u glikanske blokove kojih je više od 2000 različitih, a
međusobno se povezuju u raznim kombinacijama s mnogim grananjima.
Alternativna glikozilacija značajno povećava kompleksnost proteoma, glikoproteom nekoliko je
redova veličina kompleksniji od proteoma - same polipeptide gradi 20 AK, linearni su (za 3D
strukturu može se reći da je relativno kompleksna), a glikoproteine gradi više od 2000 različitih
glikana koji se kovalentno se povezuje s polipeptidnim okosnicama proteina.
Na 20.000 gena dobije se 100.000 proteina i 10-100 mil različitih glikoproteina.

Tijekom evolucije oligosaharidi vezani na proteine davali su proteinima sve veći broj funkcija
odnosno modulirali su njihovu aktivnost. Kompleksnost ljudskog organizma naspram ostalih
određena je većim dijelom glikozilacijom (a ne povećanjem genoma).

Različita tkiva imaju različite glikozilacijske profile, a glikozilacija se mijenja i ovisno o

fiziološkom stanju stanice. Ona utječe na ekresiju gena, možemo reći da djeluje kao termostat -
fino podešava ekspresiju (suprotno npr. fosforilaciji koja djeluje na principu 0/1).
 pr: svježa (nativna) T-stanica i aktivirana T-stanica imaju različitu strukturu glikana - kod
aktivirane T-stanice glikanski dio promijeni se tako da postaje signal za promjenu
funkcije stanice → dolazi do aktivacije proteina koji su zaduženi za ubijanje mikroba
(povećava se ekspresija gena za te proteine)
Glikani nisu izravno određeni genima, njih kodira složena dinamička mreža više stotina gena, a
utjecaj osim gena ima i okoliš (to proučava epigenetika).
Inter-individualne razlike u glikozilaciji proteina jako su velike. Tri generacije križanja dovoljne
su da stvore značajne razlike u glikomu IgG-a miša. To je posljedica alelnog preslagivanja, a ne
promjena u genima. Kada se na to doda epigenetički utjecaj, dobije se ogromna varijabilnost u
glikanskoj strukturi zbog čega se jedinka od jedinke razlikuje. SVI LJUDI NISU JEDNAKI!
Učinkovita stratifikacija pacijenata temelj je personalizirane medicine. Grubo rečeno, samo 1/5
populacije ragira na neku specifičnu terapiju, ostali ne (za neke je moguća i štetnost iste). Kod
stratificiranog pristupa biomarkerima se ljude svrstava u skupine, a za svaku se skupinu
molekularnim testovima otkriva optimalna terapija. Takav pristup donio bi revoluciju u medicini
jer se odgovarajuća terapija više ne bi tražila metodom pokušaja i pogreške nego bi se odmah
djelovalo najboljom mogućom opcijom za pojedinca.

Biološki lijekovi počinju dominirati tržištem lijekova (u smislu novca, a ne količine prodanih
lijekova). Većina bioloških lijekova su glikoproteini kod kojih glikanski dio molekule ima značajan
utjecaj na farmakokinetiku i farmakodinamiku. To znači da farmacija s kemije prelazi na
biokemiju i molekularnu biologiju.

Imunoglobulin G:
IgG najzastupljeniji je imunoglobulin u tijelu, uključen je u uklanjanje stranih tijela iz našeg
organizma, građen je od Fc i Fab regije, Fc regija je ona koja se glikozilira (radi se o N-
glikozilaciji). 31 je mogući glikan za molekulu IgG-a, a svaki pojedini IgG sadrži 2 od tih 31. Fc
glikozilacija značajno mijenja strukturu i funkciju protutijela. Temeljem glikozilacije IgG-ovi bit
će upućeni na različite Fc receptore, neki od tih receptora potaknut će upalu, drugi će pak
djelovati protuupalno.
 galaktozilirani IgG aktivira komplement putem manoza-vezajućeg proteina.
 sijalinizirani IgG potiče protuupani odgovor
 IgG bez sržne fukoze inducira vezanje na Fc receptor NK stanice - kada se u stanici
umnaža virus, dio proteina virusa ugradi se u membranu stanice i to djeluje kao alert za
Ig da aktivira NK stanice da pojedu inficiranu stanicu

Monoklonska protutijela dobivena glikoinženjeringom iznimno su korisna u liječenju.

Ublituximab - glikoinženjeringom modificirana verzija RITUXIMABA ima puno veću aktivnost od
Rituximaba. Oba djeluju tako da se vežu na CD20 receptor B stanica i induciraju ubijanje NK
stanicama. Ublituximab NEMA sržnu fukozu i stoga inducira snažniji imunosni odgovor putem
NK stanica.

Repertoar monosaharida uključenih u glikokonjugate ograničen je: glukoza, galaktoza, N-

acetilglukozamin, N-acetilgalaktozamin, manoza, ksiloza (svi su D-šećeri), L-fukoza i N-
acetilneuraminska kiselina (sijalinska kiselina). Gotovo svi kemijski su vrlo slični.
Raznolikost glikana posljedica je slaganja monosaharida u različite slijedove, ona potječe od
glikozidnih veza (položaj veze), anomerne konfiguracije (α i β) i grananja (broj i mjesto).

Oligosaharidi su na proteine vezani N- ili O- glikozidnom vezom.

N-vezani glikani nastaju vezanjem oligosaharida koji na svojem reducirajućem kraju lanca imaju
N-acetilglukozamin koji je svojim ugljikom na položaju C1 vezan na asparagin polipeptidnog
lanca u slijedu Asn-X-Ser/Thr.
O-vezani glikani nastaju vezanjem C1 atoma šećera na reducirajućem kraju lanca s
hidroksiaminokiselinom (Ser ili Thr) polipeptidnog lanca. Ovdje šećer može biti monosaharid ili
oligosaharid, a na reducirajućem kraju često se nalazi N-acetilgalaktozamin.

Biosinteza N-glikoziliranih proteina započinje u

ER. Ondje se oligosaharidi vežu na lipidni nosač
i prenose na protein u nastajanju -
oligosaharidi se vežu na protein kotranslacijski.
Procesiranje glikana odvija se u GA. Glikozilirani
produkti pakiraju se i prenose do konačnog
odredišta.

Zajednička preteča svih N-vezanih

oligosaharida je Glc3Man9GlcNAc2 i ona se
formira na lipidnom nosaču dolikol-pirofosfatu
najprije na citosolnoj strani ER, a zatim na
luminalnoj strani ER. Na citoplazmatskoj strani
ER stvara se oligosaharid GlcNAc2Man5. On se
prenosi u lumen ER i tamo se nadograđuje do
do GlcNAc2Man9Glc3. Da bi se monosaharidi
ugradili u glikan, oni moraju biti aktivirani. Za
vrijeme sinteze u citoplazmi radi se o
nukleotidom aktiviranim šećerima - to su
parovi nukleotida i šećera. Prilikom ugradnje
šećera u oligosaharid tj. formiranja glikozidne
veze šećer-šećer koristi se energija koja potječe
iz hidrolize fosfodiesterske veze kojom je
aktivirani šećer vezan na nukleotid. U lumenu
ER šećeri su aktivirani dolikol-fosfatom: dolikol
fosfat (Glc/Man) i dolikol pirofosfat (GlcNAc).

Oligosaharil-transferaza enzim je koji prenosi

kompletan oligosaharid s dolikol-pirofosfata na
rastući polipeptid. Taj prijenos događa se
kotranslacijski.
Zašto nije moguća nukleotidima aktivirana sinteza za velike šećere? Šećeri veći od
GlcNAc2Man5 ne mogu proći kroz membranu i izaći van iz stanice - to će obaviti pomoću
vezikula endoplazmatskog retikuluma. Da nema ER-a velike šećerne strukture morale bi se
sintetizirati u izvanstaničnom prostoru što je problem zbog ogromnog volumena u kojem je
teško ukoncentrirati šećerne nukleotide. Zbog toga su se pojavili lipidom aktivirani šećeri.
Arhebakterije su baš na taj način stvarale velike šećere, one nemaju ER i one tu sintezu
obavljaju vani. Evolucijski se zatim stvorio ER, koji posljedično ima sastav sličan sastavu vanjskog
okoliša, i složeniji organizmi sintezu složenih šećera obavljaju u njemu. Od arhebakterija do
čovjeka zadržana je sinteza pomoću lipidom aktiviranih šećera, iako u ER-u nema potrebe za
lipidima, ali to je tijek evolucije. Arhebakterije počele su glikozilirati proteine vanjske membrane
kako bi se maskirale i sakrile od opasnosti iz okoliša.

Kalneksin i kalretikulin sudjeluju u kontroli smatanja glikoproteina. Oni prepoznaju zavšetak

oligosaharida na kojem su 3 glukoze. Prilikom foldanja proteina s njega se polagano odvajaju te
3 glukoze i daju mu vrijeme da se foldanje odvije pravilno (da nastane pravilna stabilna
konformacija proteina). Kalneksin i kalretikulin vežu se na podljednju od tih glukoza, na proteine
koji su nedovoljno ili nepravilno smotani, i onemogućavaju njeno uklanjanje α-glukozidazom II.
Na taj način protein se zadržava u ER-u sve dok se ne smota onka kako treba (ili razgradi ako ne
valja).

Krajnji oblik glikoproteini poprimaju u GA. Ondje se ponekad glikani uklanjaju sve do preteče na
koju se stavljaju novi glikani. Ovo je opet proces koji nema smisla, ovdje s energetske strane
nema smisla, ali evolucijski se dogradnja u GA pojavila vremenski kasnije od dorade u ER, a ER
glikozilacija nije mogla samo tako nestati.

U procesu biosinteze oligosaharidnih struktura uključen je velik broj (>300) glikozidaza i

glikoziltransferaza koje specifično kataliziraju pojedine korake.
Ogranci oligomatoznog tipa sadrže samo MANOZU. Takve organke nalazimo većinom kod nižih
eukariota (jednostaničnih). Njihova biosinteza završava u ER. Imaju HEPTASAHARIDNU JEZGRU.
Ogranke prepoznaje specifični lektin MBL (mannose binding lectin).
Glikoproteini složenog tipa imaju krajnje ogranke manoze zamjenjene drugim
monosaharidima. Takve oligosaharide većinom nalazimo kod viših eukariota. α-manozidaza
kida prve 4 manoze, zatim N-acetilglukozamin-transferaza I prenosi GlcNAc u UDP-GlcNAc na
1→3 granu što je nužni preduvjet za uklanjanje daljnje dvije manoze i nastanak složenog
(kompleksnog) oligosaharida. Njihova građa uključuje TRIMANOZNU JEZGRU i „antene“ -
antene mogu biti bilo što.
Oligosaharidi hibridnog tipa imaju dio strukture kao oligomanozni, a dio kao složeni
oligosaharidi.

Biosinteza O-vezanih šećera odvija se Golgijevom

aparatu. Na prethodno foldanom proteinu u GA
gradi se glikan, dodaje se jedan po jedan šećer.
Ugradnja se odvija bez preteče.
Osnova (core) O-vezanih šećera raznolikija je od
osnove N- vezanih šećera. I onda se na neku od
osnovnih struktura može nadograditi sve i svašta
pa se u konačnici dobije jako raznolik spektar
glikana.

Glikani mucinskog tipa kod viših eukariota javljaju

se samostalno ili kao klasteri. Osiguravaju
platformu za dodavanje histo-krvnih antigena ili
polilaktozaminoglikana. Prema klasifikaciji postoji
8 tipova mucinskih jezgri.

ZP3 protein zone pelucide sudjeluje u prepoznavanju spermija i jajne stanice. To znači da su
glikani (glikoproteini) temelj nemogućnosti križanja različitih vrsta (supervažno kod riba da se ne
bi oplodila jajašaca druge vrste), a također imaju važnu ulogu u evoluciji - evolucijom nastaju
nove vrste koje se međusobno ne mogu razmnožavati, već samo između jedinki svoje vrste.

Interakcija selektina i glikoproteina ključna je za usmjeravanje limfocita u procesu upale. Upala

je znak da se u tkivu umnaža mikrob. Endotelne stanice u tom slučaju ispoljavaju glikane koji su
znak uzbune. Limfociti imaju selektine koji se vežu na te glikane, na glikanima se usporavaju,
vežu se na proteine i izlaze iz krvožilnog sustava u upalno tkivo u kojem djeluju.

GWAS (genome-wide-association study) mogu se iskoristiti za mapiranje gena uključenih u

glikozilaciju. Prva GWAS humanog glikoma identificirala je HNF1A kao glavnog regulatora
fukozilacije proteina plazme (Lauc i suradnici). Otkriveno je da mutacije u HNF1A uzrokuju
MODY (maturity onset diabetes of the young), epigenetičko utišavanje HNF1A povezano je s
promjenama u N-glikozilaciji proteina plazme. Robustni biomarker HNF1A-MODY bolesti je
količina glikana (DG9-indeks). Preko glikoma plazmatskih proteina moguće je predvidjeti
dijabetes tipa 2 kod nekih pojedinaca, promjene glikoma vidljive su i nekoliko godina prije
ikakvih simtoma bolesti i pojave hiperglikemije.

Starenjem se mijenja IgG glikom i može se koristiti kao odličan biomarker za određivanje
kronološke i biološke dobi. Biološka dob vezana je uz zdrav odnosno nezdrav stil života.

Kod SARS-CoV-2 virusa SPIKE glikoprotein smješten na ovojnici virusa veže se na ACE2 receptore
domaćina, ali to vezanje nije određeno proteinom, nego glikanskim dijelom. Protein jest nužan
za vezanje, ali glikani su ti koji određuju kako će se vezati, s kolikim afinitetom. Oni su ti koji se
razlikuju od osobe do osobe i zato pojedinci različito reagiraju na virus. Također, svaka osoba
koja se zarazi s virusom napravit će brdo kopija virusa i iako se radi o kopijama, one neće biti
identične, razlikovat će se po glikanskoj strukturi, a tijelo će se morati boriti protiv svih njih.
Naravno bit će učinkovitije kod slabijih verzija, a manje učinkovito kod invazivnijih i otpornijih
koje će se onda dulje zadržati u organizmu i umnožiti. Zato s vremenom nastaju sve opasnije
verzije virusa.
11. predavanje: Stanična signalizacija
Interakcija organizma i okoline posredovana je signalima. Svi živi organizmi primaju signale iz
okoline i odgovor na te signale odašilju u okolinu. Posebno je važno i kompleksno signaliziranje
kod višestaničnih organizama jer je ono nužno za koordinaciju bioloških procesa. Svi signalni
putevi fino su usklađeni, a tijekom puta prijenosa signali se pojačavaju: jedna molekula na
površini stanice aktivira jedan receptor, enzimi na taj podražaj reagiraju prevođenjem više
supstrata u produkte, ti produkti su ugl. enzimi koji onda opet uzimaju više supstrata i prevode
ih produkt itd. Znači, kod stanične signalizacije radi se o multiplikaciji signala putem kaskade u
koju su uključeni enzimi. Signalni putevi kontrolirani su reverzibilnim procesima. Npr. kod
fosforilacije i defosforilacije djeluju fosforilaze (fosforiliraju) i fosfataze (uklanjaju fosfatnu
skupinu). Fosforilacija može djelovati aktivacijski i deaktivacijski na enzim.
Poremećaj u samo jednoj komponenti kaskade može izazvati patofiziološki poremećaj.

Signalne molekule i njihovi receptori:

Signalne molekule međusobno se jako razlikuju strukturom i funkcijom. Svaka od njih ima svoj
specifičan receptor. Interakcija signalnih molekula izrazito je fino regulirana - često par
molekula u kombinaciji prenosi određeni signal i različit omjer tih molekula može značiti
različitu poruku, često je različita količina receptora za istu signalnu molekulu smještena na
različitim stanicama čime je uvjetovana različita signalizacija u istom okolišu (s istim signalnim
molekulama).

Signaliziranje izlučenim molekulama:

 endokrino (hormoni) - signalna molekula putuje cirkulacijom do receptora
 parakrino (neurotransmiteri, NO, CO, eikozanoidi) - signalna molekula jedne stanice ide
na receptor neke druge stanice
 autokrino (neki faktori rasta) - signalna molekula stanice veže se na receptor te iste
stanice

Vrste signalnih molekula:

1. steroidni hormoni
2. dušikov oksid i ugljikov monoksid
3. neurotransmiteri
4. peptidni hormoni i faktori rasta
5. eikozanoidi
6. biljni hormoni

Steroidni hormoni male su hidrofobne molekule koje kroz staničnu membranu relativno lako
prolaze difuzijom što znači da djelovanje ispoljavaju unutar stanice (a ne djeluju na površinske
receptore). Sintetiziraju se iz kolesterola. Primjeri su testosteron, estrogen, progesteron,
kortizol i aldosteron, tireoidni hormon, vitamin D3, retinoična kiselina.
Prolaskom u stanicu steroidni se hormoni vežu za unutarstanične receptore - superporodica
receptora u jezgri. Kod tih receptora ugl. se radi o transkripcijskim faktorima koji su građeni od
3 domene: domena za vezanje liganda, domena za vezanje DNA i domena za aktivaciju
transkripcije. Vezanje liganda (steroidnog hormona) na transkripcijske faktore nadzire njihovu
funkciju aktivacije ili represije ciljnih gena - znači steroidni hormoni i slične molekule izravno
nadziru gensku ekspresiju (ovdje nema nikakve kaskade!).
Djelovanje estrogena: Estrogen difundira kroz membranu, vezanjem estrogena na inaktivni
estrogenski receptor dolazi do njegove aktivacije - receptor se odlobađa od Hsp90 i oformljava
dimer, dimer se skupa s koaktivatorom, koji ima HAT aktivnost (histon acetil transferaza), veže
na DNA i potiče transkripciju. HAT uzrokuje odmatanje histona kako bi se čitav kompleks mogao
vezati na DNA i djelovati aktivacijski na transkripciju.
Djelovanje tireoidnog hormona: Receptor za tireoidni hormon vezan je za DNA i u aktivnom i u
neaktivnom stanju. U neaktivnom stanju on djeluje represorski, a na njega je vezan korepresor s
HDAC aktivnošću (histon-deacetilaza). Vezanjem tireoidnog hormona na receptor dolazi do
promjene konformacije receptora, umjesto HDAC veže se koaktivator s HAT aktivnošću i dolazi
do aktivacije transkripcije.

Dušikov oksid i ugljikov monoksid

NO i CO male su molekule topljive u membranama - kroz membranu prolaze difuzijom. To su
nestabilne kratkoživuće molekule (t1/2 je nekoliko sekundi) koje imaju lokalne učinke.
NO glavna je PARAKRINA signalna molekula
živčanog, imunološkog i cirkulacijskog sustava.
Nastaje iz arginina, a sintezu katalizira NOS (nitric
oxid synthase). Djeluje kao aktivator gvanil-ciklaze
vežući se na hem-skupinu u njenom aktivnom
mjestu, inducira stvaranje cGMP koji djeluje kao
drugi glasnik ILI se veže na cisteinske ostatke,
uzrokuje nitrozilaciju, i mijenja aktivnost ciljnih
proteina. NO djeluje kao dilatator krvnih žila: neurotransmiter ACETILKOLIN potiče sintezu NO u
endotelnim stanicama krvnih žila (nitroglicerin se pretvara u NO), NO difundira u susjedne
mišićne stanice gdje potiče gvanil-ciklazu na stvaranje cGMP što uzrokuje relaksaciju mišićnih
stanica i dilataciju krvnih žila. To u konačnici povećava protok prema srcu.
CO signalna je molekula u živčanom sustavu. Kao i NO, djeluje kao aktivator gvanil-ciklaze i
posrednik je u dilataciji krvnih žila. Njegova je sinteza također potaknuta neurotransmiterima.

Neurotransmiteri hidrofilne su molekule - vežu se na receptore na membrani. To su glasnici koji

prenose signale između živčanih stanica ili od živčanih stanica do drugih vrsta stanica. Signal za
otpuštanje neurotransmitera je pristizanje akcijskog potencijala na živčani završetak.
Neurotransmiteri tada difundiraju kroz sinaptičku pukotinu i vežu se na receptore. Receptori
nekih neurotransmitera povezani su s G-proteinima koji povezuju receptore na staničnoj
površini s različitim unutarstaničnim odgovorima. Receptori mogu biti nalik onima za hormone
(adrenalin), a mnogi su ionski kanali. U slučaju kanala vezanjem neurotransmitera na receptor
dolazi do promjene konformacije kanala, on propušta neurotransmiter u unutrašnjost stanice i
tako se prenosi signal. U velikoj većini neurotransmiter se veže nekovalentnim vezama na
receptor.
Neurotransmiteri: acetilkolin, glicin, glutamat, GABA, dopamin, noradrenalin, adrenalin,
serotonin, histamin.
Peptidni hormoni i faktori rasta:

Eikozanoidi lipidne su signalne molekule koje djeluju putem površinskih receptora. Brzo se
razgrađuju pa djeluju lokalno, u autokrinim ili parakrinim signalnim putevima. Sudjeluju u
procesima agregacije trombocita, upale i kontrakcije glatkih mišića.
Eikozanoidi uključuju prostaglandine, prostaciklin, tromboksane i leukotriene. Oni se
sintetiziraju iz arahidonske kiseline koja nastaje hidrolizom fosfolipida djelovanjem fosfolipaze
A2.

Biljni hormoni imaju ulogu nadzora rasta i razvoj biljaka. Reagiraju na utjecaje okoliša (svjetlost,
infekcije). Auksini reguliraju rast, diferencijaciju i diobu. Giberelini reguliraju izduživanje
stabljike, etilen dozrijevanje voća, citokinini diobu stanice, a apscizinska kiselina započinjanje
razdoblja mirovanja. Ova skupina molekula je ogromna i vrlo složena i s njom se (na sreću hihi)
ne stignemo baviti.

Stanični površinski receptori:

1. receptori povezani s G-proteinima
2. receptorske protein-tirozin-kinaze
3. receptori za citokine (i nereceptorske protein-tirozin-kinaze)
4. receptori povezani s drugim enzimskim aktivnostima
Receptori povezani s G-proteinima prenose signale do unutrašnjih ciljeva putem proteina koji
vežu gvanin-nukleotid (G-proteina). Ima više od 1000 receptora povezanih s G-proteinima, svi
su strukturno i funkcijski slični, građeni su od 7 transmembranskih α-uzvojnica i imaju
izvanstaničnu i unutarstaničnu komponentu. G-protein građen je od tri podjedinice (α, β i γ). U
NEAKTIVNOM OBLIKU G-protein je cjelovit, na skupu su sve 3 podjedinice i u kompleksu su
GDP-om. Tek onda kada se veže signalna molekula na receptor, G-protein i receptor počinju
međudjelovati - G-protein spregnut je s receptorom s unutrašnje strane membrane (nije
kovalentno vezan, ali oni osjećaju jedan drugoga). Dolazi do izmjene nukleotida na G-proteinu,
GDP se odvaja, a GTP se veže (ne događa se fosforilacija nego zamjena!). Slijedi AKTIVACIJA G-
proteina - otkida se α podjedinica. Aktivirani G-protein, tj. α-podjedinica skupa s GTP-om,
prenosi signal do unutarstaničnog cilja koji može biti enzim ili ionski kanal. Aktivnost α-
podjedinice zavšava hidrolizom GTP-a, inaktiviana α-podjedinica s GDP-om ponovno se spaja s β
i γ podjedinicom.
G-protein otrkiven je 70ih tijekom istraživanja hormona koji nadziru sintezu cAMP-a. Utvrđeno
je da je nužan za hormonsku stimulaciju adenilat-ciklaze jer se α-podjedinica veže na adenilat
ciklazu i potiče konverziju ATP→cAMP.

Receptorske protein-tirozin-kinaze skupina su receptora koja je povezana s unutarstaničnim

enzimima koji djeluju kao tirozin kinaze (fosforiliraju tirozinske bočne ogranke). Građeni su od
izvanstanične domene na N-kraju na koju se veže ligand, transmembranske α-uzvojnice i
citosolne domene na C-kraju koja ima protein-kinaznu aktivnost (ugl. se radi o jednom
polipeptidnom lancu, iznimka su inzulinski i slični mu receptori koji imaju 2 polipeptidna lanca).
Ljudski genom kodira 58 receptorskih protein-tirozin-kinaza. To su receptori za faktore rasta
(nadziru rast i diferencijaciju stanica) - RGF (epidermalni faktor rasta), NGF (faktor rasta živaca),
PDGF (trombocitni faktor rasta); i inzulin.
Vezanje signalne molekule na izvanstaniču domenu potiče DIMERIZACIJU dva receptora: neki
faktori rasta (PDGF, NGF) su monodimeri i kao takvi potiču dimerizaciju, a monomerni faktori
rasta (EGF) potiču konformacijske promjene koje dovode do interakcije receptora i dimerizacije.
Dimerizacija potiče AUTOFOSFORILACIJU - uzajamnu fosforilaciju dvaju polipeptidnih lanaca
receptora. Fosforilacija Tyr unutar katalitičke domene povećava aktivnost tirozin-kinaze, a
fosforilacija Tyr izvan katalitičke domene oblikuje specifično mjesto za vezanje dodatnih
proteina koji prenose unutarstanične signale nizvodno od aktiviranih receptora.

Nizvodne signalne molukule povezane s receptorskim protein-tirozin-kinazama: s receptorskim

protein-tirozin-kinazama povezane su pomoću proteinskih domena koje vežu specifične peptide
koji sadržavaju FOSFOTIROZIN:
 SH2-domene (Src homology 2)
 PTB-domene (phosphotyrosine-binding)
Povezivanje proteina koji sadrže SH2 ili PTB domenu s aktiviranim receptorskim protein-tirozin-
kinazama potiče njihovu lokalizaciju uz membranu, povezivanje s drugim proteinima, njihovu
fosforilaciju i enzimsku aktivnost.

Receptori za citokine i nereceptorske protein-tirozin-kinaze skupina su receptora koji sami

NEMAJU tirozin-kinaznu aktivnost (ne mogu se fosforilirati), već su spregnuti s unutarstaničnim
protein-tirozin-kinazama. Građeni su izvanstanične domene na N-kraju, transmembranske α-
uzvojnice i citosolne domene na C-kraju.

Vezanje liganda potiče dimerizaciju receptora i dovodi do aktivacije pridruženih nereceptorskih

protein-tirozin-kinaza što je posljedica uzajamne fosforilacije. Zatim aktivirane kinaze
fosforiliraju Tyr ostatke receptora i oblikuju fosfotirozinska vezna mjesta za nizvodne signalne
molekule.
Superporodicu receptora za citokine čine IL-2 (citokin), eritropoetin, hormon rasta.
Janus-kinaze (JAK kinaze) porodica su kinaza (4 srodna člana porodice) koje su povezane s
receptorima za citokine. Njihova je uloga povezivanje citokinskih receptora s tirozinskom
fosforilacijom unutarstaničnih ciljeva.
Porodica Src (9 srodnih članova) ima ulogu u signaliziranju nizvodno od citokinskih receptora,
receptorskih protein-tirozin-kinaza, antigenskih receptora na B i T limfocitima, integrinskih
receptora...

Receptori povezani s drugim enzimskim aktivnostima:

a) Protein-tirozin-fosfataze - uklanjaju fosfatnu skupinu s fosfotirozinskih ostataka
 održavaju ravnotežu djelovanju protein-tirozin-kinaza
 česti imaju negativnu nadzornu ulogu (jer završavaju signale koji su bili započeti
fosforilacijom tirozina)
 neki su receptori na staničnoj površini s pozitivnom ulogom u staničnom
signaliziranju
 pr. CD45 (T i B limfociti) - nakon podražaja antigenom CD45 defosforilira
specifični fosfotirozin koji inače koči enzimsku aktivnost pripadnika porodice Src
(defosforilacija potiče aktivnost Src)
b) Protein-serin/treonin-kinaze - fosforiliraju Ser ili Thr ostatke na svojim supstratima
 vezanje liganda potiče povezivanje dvaju različitih polipetidnih lanaca koji
pripadaju porodici TGFβ-receptora (receptori za transformirajući faktor rasta β)
s kinaznom aktivnošću, oni se uzajamno fosforiliraju
 aktivirani TGFβ-receptori fosforiliraju pripadnike porodice transkripcijskih
faktora SMAD koji se sele u jezgru i potiču ekspresiju ciljnih gena
c) Receptorske gvanil-ciklaze - receptori čije citosolne domene imaju aktinost gvanil-
ciklaze (kataliziraju stvaranje cGMPI)
 građeni su od izvanstanične domene na N-kraju za vezanje liganda, citosolne
domene na C-kraju s gvanil-ciklaznom aktivnošću i transmembranske α-izvojnice

Putevi unutarstaničnog prijenosa signala:

Signali se s površinskih receptora prenose na unutarstanične ciljne enzime koji su izravno ili
neizravno povezani s G-proteinima. Unutarstanični ciljni enzimi su u biti nizvodni signalni
elementi koji prenose i pojačavaju signal koji je započeo vezanjem liganda. Ciljevi
unutarstaničnih signalnih puteva često uključuju transkripcijske faktore koji nadziru ekspresiju
gena.
 1. Put cAMP: drugi glasnici i fosforilacija proteina
2. cGMP
3. Fosfolipidi i Ca2+
4. Ras, Raf i signalni put MAP-kinaze
5. Signalni put JAK/STAT
Signalni putevi unutar stanice su kao podzemna željeznica u Tokyju - međusobno se isprepliću,
djeluju jedni na druge, promjene u jednom uzrokuju promjene u drugima. Teško ih je
proučavati i teško ih je razgraničiti - problematična primjena u proizvodnji lijekova (lijekovi
inhibitori signalnog puta često uzrokuju nuspojave jer djeluju i na druge signalne puteve,
ponekad uopće ni ne djeluju jer se pronađe alternativni put prijenosa signala). S lijekovima
najbolje je ciljati na interakciju receptor-ligand tj. pokušati djelovati čim uzvodnije u signalnom
putu.
Put cAMP - drugi glasnici i fosforilacija proteina: cAMP molekula je koja djeluje kao drugi
glasnik, nastaje iz ATP-a djelovanjem adenil-ciklaze, a razgrađuje se do AMP-a djelovanjem
cAMP-fosfodiesteraze. Receptor za adrenalin povezan je s adenil-ciklazom putem G-proteina
čija aktivirana α-podjedinica potiče aktivnost enzima. Regulira aktivaciju protein-kinaza A (naziv
za protein-kinaze ovisne o cAMP-u). Inaktivni oblik enzima je tetramer građen od 2 regulacijske
i 2 katalitičke podjedinice. cAMP veže se na regulacijske podjedinice čime potiče odvajanje
katalitičkih jedinica koje time postaju enzimski aktivne i imaju sposobnost fosforilacije Ser
ostataka na ciljnim enzimima. Ovaj signalni put je aktivacijski, a aktivacija je jako obilna i brza
zahvaljujući multipliciranju signala (puno cAMP-a, dolazi do rasapa signala).
Regulacija metabolizma glikogena protein-kinazom A: Protein-kinaza A fosforilira glikogen-
sintazu i fosforilaza-kinazu. Ta fosforilacija koči glikogen sintazu, a potiče fosforilaza-kinazu.
Fosforilaza-kinaza tada fosforilira i aktivira glikogen-fosforilazu, a onda ona katalizira razgradnju
glikogena do glukoza-fosfata. Protein kinaza A s jedne strane preko inaktivacije glikogen-sintaze
blokira sintezu glikogena, a preko aktivacije fosforilaza-kinaze potiče razgradnju glikogena.
cAMP kao regulator genske ekspresije: Neki geni u promotorskoj regiji sadrže elemente
odgovora na cAMP, tzv. CRE regije (cAMP response elements). Katalitička podjedinica protein-
kinaze A prenosi signal s povrišine, premješta se u jezgru i fosforilira transkripcijski faktor CREB
(cAMP response element binding protein). Znači TF CREB veže se na CRE na DNA molekuli kada
je aktiviran fosforilacijom i on potiče transkripciju gena koji su pod nadzorom CRE elementa.
Imaju ulogu u proliferaciji, preživljavanju i diferencijaciji stanica.
Sustav kinaza/fosfataza: Kinaze djeluju fosforilacijski i u pravilu u aktivatori. Fosfataze
defosforiliraju i ugl. djeluju kao inhibitori, prekidaju učinak kinaza. Fosfataze mogu biti
transmembranske ili citosolne, uklanjaju fosfatnu skupinu s Tyr ili Ser/Thr.

Put cGMP: cGMP molekula je koja djeluje kao drugi glasnik, nastaje iz GTP-a djelovanjem gvanil-
ciklaze, a razgrađuje se do GMP-a djelovanjem cGMP-fosfodiesteraze. Gvanil-ciklazu aktiviraju
NO, CO, peptidni ligandi… Djelovanje cGMP-a posredovano je protein kinazom ovisnom o
cGMP-u. cGMP djeluje kao nadzornik ionskih kanala i drugih ciljnih proteina.
Uloga cGMP u procesu vida: RODOPSIN je fotoreceptor i povezan je s G-proteinom. Uslijed
apsorpcije svjetla i izomerizacije cis-retinala u trans-retinal događa se konformacijska promjena
koja potiče aktivaciju G-proteina TRANSDUCINA. α-podjedinica transducina potiče aktivnost
cGMP-fosfodiesteraze zbog čega dolazi do snižavanja unutarstanične razine cGMP-a.
Osjet mirisa: Dolazi do izravnog djelovanja cGMP-a na ionske kanale u staničnoj membrani zbog
čega dolazi do unutarstanične raznie cGMP-a.

Fosfolipidi i Ca2+: Radi se o drugim glasnicima koji potječu od fosfatidil-inozitol-4,5-bifosfata

(PIP2) - inozitol s tri fosfatne skupine od kojih je na jednu vezana masna kiselina. Neki hormoni i
faktori rasta potiču HIDROLIZU PIP2 putem FOSFOLIPAZE C na diacil-glicerol i inozitol-1,4,5-
trifosfat (IP3). Diacil-glicerol aktivira protein-Ser/Thr kinaze porodice protein-kinaza C koje
imaju važnu ulogu u kontroli staničnog rasta i razvoja, a IP3 potiče porast unutarstanične konc.
Ca2+ iona.
FOSFOLIPAZA C β (PLC-β) ima G-protein domenu, nju stimuliraju G-proteini.
FOSFOLIPAZA C γ (PLC-γ) ima SH2-domenu koja posreduje njeno povezivanje s aktiviranim
receptorskim protein-tirozin-kinazama.
IP3 polarni je glasnik koji se otpušta u citosol i potiče otpuštanje Ca2+ iz ER. On se veže na
receptore koji su Ca2+ kanali regulirani ligandom, Ca2+ ioni se otuštaju u citosol i njihova visoka
razina (1,0 µM) uzrokuje aktivaciju protein-kinaza i protein-fosfataza. Za tu aktivaciju značajan
je KALMODULIN koji kompleksira s Ca2+ kada ga je u stanici puno (mora ga biti više od 0,1µM) i
onda se taj kompleks kalmodulin-Ca2+ veže na ciljne enzime - kinazu lakog lanca miozina
(uzrokuje aktin-miozinsku kontrakciju) i CaM-kinaze (one su metabolički enzimi, ionski kanali i
transkripcijski faktori - CREB). Visok unutarstanični Ca2+ također potiče ulazak izvanstaničnog
Ca2+ što služi za produženje signala i ponovno punjenje spremnika Ca2+ u ER. Taj ulazak Ca2+ iz
izvanstaničnog prostora posredovan je RAJANODINSKIM RECEPTORIMA, to su kanali regulirani
naponom - važno za prijenos impulsa iz živčane stanice na mišić, za mišićnu kontrakciju.
Normalna niska razina Ca2+ (0,1 µM) u stanici održava se djelovanjem Ca2+ crpki koje Ca2+
prenose van iz stanice i u ER.
PIP3 (fosfatidil-inozitol-3,4,5- trifosfat) drugi je glasnik koji nastaje fosforilacijom PIP2 (na
položaju 3’ pomoću fosfatidil-inozitol (PI) -3-kinaze; jedan oblik PI-3-kinaze aktivira se pomoću
G-proteina, drugi pomoću SH2 domena). PIP3 djeluje na protein-Ser/Thr-kinazu aktivacijski, a to
je važno za preživljavanje stanice.
Ras, Raf i signalni put MAP-kinaze:
MAP-kinaze (mitogen-activated protein kinases) enzimi su iz porodice protein-Ser/Thr-kinaza
koje se aktiviraju u odgovoru na faktore rasta i druge signalne molekule. MAP-kinaze ubikvitarni
su regulatori staničnog rasta i diferencijacije, a čitav signalni put kaskada je evolucijski očuvanih
protein-kinaza ključnih u prijenosu signala u eukariotskim stanicama. Postoje 3 tipa MAP-
kinaza: ERK (extracelular signal-regulated kinase), JNK (C-Jun N-terminal kinase) i p38
(posljednje 2 sudjeluju u odgovoru na upalne citokine i stanični stres).
ERK je ključna MAP-kinaza za prijenos proliferacijskog signala. Njeno djelovanje potiču faktori
rasta koji djeluju preko protein-tirozin-kinaze ili receptora povezanih s G-proteinima (faktori
rasta vežu se na receptor). Kaskada je u nastavku posredovana Ras-proteinom koji kad je
aktiviran veže GTP i na njih se još veže Raf (protein-Ser/Thr-kinaza). Raf fosforilira i aktivira MEK
protein kinazu - ona je dvojno specifična kinaza (MAP-kinaza/ERK-kinaza - fosforilira i Tyr i Thr
ostatke koji su međusobno udaljeni za 1 AK). MEK fosforilira i aktivira ERK koji onda fosforilira
protein kinaze i transkripcijske faktore.
Ras-proteini su onkogeni proteini tumorskih virusa koji uzrokuju sarkome kod štakora (rat
sarcoma virus). Aktivni su kad je na njih vezan GTP i tada potiču proliferaciju, a inaktivni kad je
vezan GDP. Kod mutiranih Ras-proteina uvijek je vezan GTP, stanica zbog toga ima stalni signal
za proliferaciju i dolazi do pojave tumora. U normalnim stanicama za inaktivaciju Ras-a su
zaduženi proteini koji aktiviraju GTPazu. Oni hidroliziraju GTP do GDP-a (kod mutiranog gena ras
inhibirana je hidroliza GTP-a). Za aktivaciju je zadužen Grb2 koji se putem SH2 domene veže na
fosforiliranu citoplazmatsku domenu aktiviranog receptora. Na Grb2 u mirovanju vezan je Sos
koji se sada približava membrani i potiče izmjenu GDP za GTP na Ras-u. Ras tada stupa u
interakciju s protein-Ser/Thr-kinazom Raf. Raf se aktivira fosforilacijom pomoću protein-tirozin-
kinaza i protein-Ser/Thr-kinaza.
ERK ima ulogu fosforilacije ciljnih proteina tj. drugih protein-kinaza, a u nekim slučajevima
aktivirani ERK ulazi u jezgru i fosforilira transkripcijske faktore. Ti geni u promotorskoj regiji
imaju sljedove koje nazivamo elementi odgovora na serum (SRF od serum response elements) i
na njih se vežu kompleksi transkripcijskih faktora i Elk-1. ERK fosforilira i aktivira Elk-1 što
omogućuje izravnu vezu između Elk-1 i SRF te dolazi do transkripcije neposredno ranih gena.
Mnogi neposredno rani geni kodiraju proteine koji su transkripcijski faktori i koji utječu na
ekspresiju brojnih nizvodnih gena (geni sekundarnog odgovora).

Scaffold (konstrukcijski) proteini djeluju kao organizatori signalnih puteva MAP-kinaza.

Konstrukcijski protein JIP-1 organizira MAP-kinazu JNK i njezine uzvodne aktivatore MLK i MKK7
u signalnu kasetu.
Signalni put JAK/STAT izravna je veza između protein-tirozin-kinaza i transkripcijskih faktora.
STAT proteini (signal transducers and activators of transcription) su u stvari transkripcijski
faktori. U stanicama u mirovanju STAT su inaktivni i smješteni u citoplazmi. Aktivacija citokinskih
receptora privlači STAT proteine koji se vežu za fosfotirozine u citoplazmatskim domenama
receptora i dolazi do fosforilacije STAT-a. Fosforilacija se vrši pomoću JAK-a (nereceptorska
protein-tirozin-kinaza). Dolazi do dimerizacije STAT-a i on se premješta u jezgru gdje aktivira
transkripciju ciljnih gena.

Prijenos signala i citoskelet:

Integrini su glavni receptori za prianjanje stanica na izvanstaničnu tvar i aktivatori su
unutarstaničnih signalnih puteva. Integrini su interakciji s izvanstaničnom tvari preko kratkih
citoplazmatskih domena integrina i nereceptorskih protein-tirozin-kinaze FAK (focal adhesion
kinase). Kad se ostvari ta interakcija, tirozin u FAK-u se autofosforilira i kao takav ima vezna
mjesta za signalne molekule s SH2-domenama.
Aktinski citoskelet određuje stanični oblik i pokretljivost. Ključnu ulogu u nadzoru nad
organizacijom aktinskog citoskeleta imaju mali proteini koji vežu GTP: Rhp, Rac, Cdc42.

Razvoj i diferencijacija stanica:

Za razvoj i diferencijaju stanica najvažniji je signalni put receptorske
tirozin-kinaze/Ras/Raf/Erk. Tu su još signalni putevi Hedgehog i Wnt koji su važni za
embrionalni razvoj - određivanje staničnih vrsta, oblikovanje udova, razvoj živčanog sustava.
Notch signalni put značajan je za proliferaciju i diferencijaciju u svim faza razvoja organizma.

Regulacija apoptoze:
Apoptoza je normalan, fiziološki oblik stanične smrti. Opstanak stanica ovisi o faktorima rasta ili
o kontaktu sa susjednim stanicama/izvanstaničnim tvarima. Programirana stanična smrt se
nadzire pomoću integrirane aktivnosti različitih signalnih puteva, od kojih neki djeluju tako da
potiču staničnu smrt, a neki potiču stanično preživljavanje.
Kaspaze (porodica cisteinski proteza - Cis je u aktivnom centru) su regulatori apoptoze, kidaju
peptidnu vezu iza Asp, kidaju ciljne stanične proteine i uzrokuju apoptozu. Kaspaze se
sintetiziraju kao inaktivne preteče, a aktiviraju se djelovanjem drugih kaspaza. Kaspaze se
aktiviraju onda kada se na njih veže Apaf-1. Njihovu aktivnost koče IAP (inhibitors od apoptosis
proteins) i neki članovi porodice Bcl-2.
Stanični receptor Fas potiče apoptozu izravnom aktivacijom kaspaze - ligand je građen o tri
polipeptidna lanca pa uzrokuje trimerizaciju receptora. Na taj receptor vezana je kaspaza 8
preko adapterske molekule od koje se kaspaza 8 odvaja uslijed trimerizacije. Ona uzrokuje
aktivaciju nizvodnih kaspaza i dovodi do stanične smrti.
Druga opcija aktivacije apoptoze je putem TNF faktora koji aktiviraju specifične receptore i
izravno potiču apoptozu.
Stanično preživljavanje je zapravo kočenje apoptoze. Da bi stanica živjela ona mora imati signal
„živa“, u suprotnom umire apoptozom. Signalni put odgovoran za preživljavanje pokreće se
enzimom PI-3-kinazom, a u proces je uključen signalni put Ras/Raf/Erk.
12. predavanje: Stanični ciklus
Stanični ciklus naziv je za sve molekularne procese koji utječu na staničnu diobu. Za stanični
ciklus važne su protein-kinaze i molekule koje sudjeluju u njihovoj regulaciji (citokini, inhibitori
kinaza i sl.) te faktori rasta - signalne molekule koje dolaze izvana i daju podatke o potrebama
cijelog organizma te prema tome koordiniraju rast i diobu pojedinih stanica.

Stanični ciklus može se podijeliti u 2 faze: mitozu i interfazu. U eukariotskih stanica mitoza
zauzima oko 5% života stanice (traje oko 1h), a na interfazu otpada oko 95% vremena. Interfazu
možemo podijeliti u 3 dijela: G1 (gap-1) faza - između mitoze i inicijacije replikacije DNA, tada
stanice živi i raste, faza traje 11h, S faza - događa se replikacija (sinteza) DNA, traje 8h, G2 (gap-
2) faza - stanica nastavlja rasti i sintetizira proteine potrebne za mitozu, traje 4h. Ovakva
raspodjela vremena i faze staničnog ciklusa vrijede za stanice koje se kontinuirano dijele!
Diferencijacijom neke stanice gube sposobnosti daljnjeg dijeljenja i ulaze trajno u G0 fazu.
Primjer su NEURONI. Kod nekih stanica moguće je inicirati izlazak iz G 0 faze odnosno inducirati
ih da se ponovno dijele. Primjer takvih stanica su FIBROBLASTI, JETRENE, PLUĆNE i BUBREŽNE
STANICE. U odnosu na druge stanice njihov je stanični ciklus produljen i do godinu dana.
Jajna stanica dijeli se puno brže od očekivanog - njena je interfaza znatno kraća nego kod
drugih stanica. Općenito, skraćenje staničnog ciklusa uvijek ide na uštrb interfaze tj. staničnog
rasta. To znači da dolazi do umnažanja DNA, ali ne i ukupnog V stanice pa je u slučaju jajne
stanice nastala blastula tek malo veća od zigote. Kod jajne stanice takvo ubrzano dijeljenje
moguće je jer ona ima veliku zalihu nukleotida, histona i enzima za mitozu. Kod tumorskih
stanica takvo ubrzanje ne događa se nikad jer oni nemaju uskladištene količine za mitozu
potrebnih molekula.
Kako se sve to istraživalo? U podlozi na kojoj se uzgajaju stanice
nalazi se radioaktivni timidin, on se ugrađuje samo u one stanice
koje repliciraju DNA, znači u stanice koje su u S fazi. Ako su stanice
radioaktivni timidin ugradile na kraju S faze, trebat će im 4h da se
pojave prve radioaktivno obilježene stanice u mitozi - to znači da
G2 faza traje 4h.
Količina DNA mijenja se tijekom staničnog ciklusa pa se faze
ciklusa mogu odrediti protočnom citometrijom. Somatske stanice
u G1 fazi DIPLOIDNE su, tijekom S faze polako raste količina DNA
da bi na kraju S faze stanica bila TETRAPLOIDNA. Dovršetkom
citokineze somatske se stanice vraćaju u DIPLOIDNO stanje.
Najveći br. stanica nalazi nalazi se u G1 fazi, mali br. su S fazi i
nešto veći u G2 fazi.

Kako stanica zna treba li se dijeliti?

Jednostanični organizmi (npr. kvasci) imaju START TOČKU - to je kontrolna točka u G1 fazi
staničnog ciklusa tj. molekularni događaj nakon kojeg je stanica nepovratno ušla u diobu. Da bi
došlo do START-a potrebno je da u okolišu ima dovoljno hranjivih tvari, da stanica ima dovoljan
volumen i da su prisutni faktori parenja.
Jednostaničnim organizmima cilj je čim više se dijeliti i razmnožavati.
Višestanični eukarioti START imaju zamjenjen RESTRIKCIJSKOM TOČKOM u kasnoj G1 fazi
ciklusa koja onemogućuje diobu i upućuje stanicu u G 0 fazu. Da bi stanica nastavila razvoj, izašla
iz mirovanja i da bi se zaista dogodila dioba, potrebno je da u okolini postoje faktori rasta (ovdje
hranjive tvari nisu dovoljan uvjet za diobu).
Neke stanice restrikcijsku točku u kojoj se zaustavlja stanični ciklus imaju u G2 fazi, pr. su oocite.
Oocite ostaju zadržane u G2 fazi godinama i ulaze u M fazu na hormonski stimulans. Cilj je
vjerojatno očuvati DNA - bolje je umnažanje DNA obaviti u mladom organizmu.
Višestanični organizmi imaju cilj preživjeti, a ne se razmnožavati i to je razlog zbog kojeg
restrikcijska točka upućuje stanicu u mirovanje.

Kontrolne točke u staničnom ciklusu: Postoje 4 kontrolne

točke u staničnom ciklusu.
 u G1 i S fazi - provjerava se je li DNA oštećena - “ne
replicirati oštećenu stanicu!”
 u G2 fazi - provjerava se je li replicirana čitava DNA
i ima li oštećenja - “ne ući u M dok se ne podijeli
cjelokupna DNA i to samo jednom, i uz popravljena
sva oštećenja!”
 u M fazi - provjerava se jesu li kromosomi pravilno
raspoređeni u diobenom vretenu, obje stanice
kćeri moraju dobiti sve kromosome - “ne
dovršavati mitozu ako su kromosomi nepravilno
poredani!”

Senzorni proteini za oštećenu DNA zaduženi su za zastoj u G1, S i G2 fazi.

Oni klize po DNA i traže strukturne aberacije, one vide kemijske promjene
u DNA, ali ne vide mutacije! Kemijske promjene u DNA aktiviraju ATM i
ATR - to su kinaze koje fosforliraju nizvodne kinaze Chk1 i Chk2. Chk1 i
Chk2 također djeluju fosforilacijski.
ATM i Chk2 fosforiliraju p53. p53 nazivamo čuvarom genoma.
Fosforilacijom postataje stabilan i aktivan, djeluje kao TRANSKRIPCIJSKI
FAKTOR koji povećava ekspresiju gena koji su
zaduženi za zaustavljanje staničnog ciklusa.
p53 često je mutiran u tumorima koji zbog
toga svojim stanicama kćerima predaju
oštećenu DNA.

ORC (origin of replication complex) i MCM (faktori dopuštanja)

proteini su koji tvore komplekse koji omogućuju početak replikacije
tijekom S faze. MCM vežu se na ishodište replikacije u S fazi preko ORC-a, potiču replikaciju i
uklanjaju se odmah nakon incijacije te se više ne veže na ORC do kraja sljedeće G1 faze. Na taj
je način osigurano da se cjelokupna DNA replicira samo jednom.
Kako su otkrivene molekule koje reguliraju stanični ciklus? Korištena su 3 tipa eksperimenta.
1. Mutacije osjetljive na T - kvasci mutanti cdc28 S. cerevisae: Ovi mutanti osjetljiivi su na
temperaturu. Na povoljnoj T repliciraju se normalno, a na nepovoljnoj T dolazi do blokiranja
replikacije u točki START. Na ovaj način pronađeni su molekularni “okidači” staničnog
ciklusa.
2. Eksperimenti na jajnim stanicama: Jajna stanica treba progesteron da iz G2 faze ode u M.
Utvrđeno je da do M može doći i injektiranjem malenog dijela citoplazme iz oocite koja je
već u M fazi. To znači da postoji određeni citoplazmatski faktor koji je zadužen za aktivaciju
mitoze. Taj citoplazmatski faktor nazvan je MPF (maturation promoting factor).
3. Eksperimenti temeljeni na pretpostavci da se konc. nekih proteina u stanici mijenjaju
periodički - blastule vodozemca: Eksperimentnom je dokazano da ako se u blastuli
vodozemca zaustavi sinteza proteina, doći će do izostanka ulaska u M fazu. To znači da
neposredno prije M faze stanica treba dodatnu sintezu proteina. Te proteine koji se
periodički nakupljaju i razgrađuju tijekom staničnog ciklusa nazvalo su ciklinima.

Prolaz kroz pojedine točke ciklusa reguliran je specifičnom

kombinacijom članova porodice ciklina i protein kinaza te
molekulama koje na njih dodatno djeluju.
mitotički ciklini: Clb1, Clb2, Clb3 i Clb4
G1 ciklini: Cln1, Cln2 i Cln3
ciklini tipa B: Clb5 i Clb6
srodne protein-kinaze: Cdk – Cdc-2
Četiri su temeljna molekularna mehanizma regulacije
aktivnosti kinaza ovisnih o ciklinima (Cdk):
 dimerizacija Cdk s određenim ciklinom
 aktivacija fosforilacijom treonina na položaju 160 koju
izvodi CAK (kinaza koja aktivira Cdk)
 inhibicija fosforilacijom na treoninu 14 i tirozinu 15
 stvaranje veze s nekim od inhibitora Cdk (CKI); različiti CKI
inhibiraju različite Cdk
Regulacija prolaska kroz G1 kontrolnu točku:
Ciklin D nužan je za izlazak iz restrikcijske točke G1, on uklanja represore za transkripciju gena
S-faze. Sinteza ciklina D traje onoliko dugo koliko je prisutan faktor rasta. Faktor rasta djeluje na
sintezu ciklina D preko Ras/Raf/ERK kaskade. Ciklin D uklanja represor tj. cijepa represorski
kompleks Rb-E2F - miče Rb s E2F podjedinice, E2F se veže na DNA i dolazi do transkripcije.
Mutacije ovog signalnog puta induciraju nastanak tumora (radi se o mutacijama gena za
represorski kompleks Rb-E2F).
Osim što je progresija kroz stanični ciklus u G1 fazi inhibirana represorskim kompleksom, tu je i
dodatna inhibicija putem proteina p53 koji djeluje kao aktivator gena p21. p21 ima dvostruko
djelovanje: direktno inhibira Cdk i veže se na podjedinicu DNA-polimeraze δ i zaustavlja
replikaciju.

Regulacija prolaska kroz G2 kontrolnu točku:

Neaktivni senzorni proteini ATR i ATM drže neaktivnima kinaze Chk 1 Chk2 koje zato nisu u
stanju inaktivirati Cdc25 protein-fosfatazu, stoga stanica napreduje kroz G2 fazu. Kada su pak
senzorni proteini aktivni, oni aktiviraju nizvodne kinaze koje inaktiviraju Cdc25 i stanica se
zaustavlja u G2.

Dioba stanice sastoji se od 4 koordinirana procesa:

 stanični rast (život)
 replikacija DNA
 podjela kromosoma na stanice kćeri
 podjela staničnog materijala - citokineza
Nakon prolaska kroz sve kontrolne točke stanica se može podijeliti. Dolazi do kondenzacije
kromosoma (PROFAZA), formiranja diobenog vretena (KASNA PROFAZA), učvršćivanja
kromatida za diobeno vreteno (PROMETAFAZA), provjere pravilnosti rasporeda kromosoma u
ekvatorijalnoj ravnini i pucanja kinetohora (METAFAZA), raspodjele podijeljenih kromosoma u
ekvatorijalnoj ravnini (ANAFAZA) te citokineze i formiranja jezgara stanica kćeri (TELOFAZA).
MPF dimer je ciklina B i protein-kinaze Cdc2.
Tijekom staničnog ciklusa dolazi do niza promjena u tom dimeru:
 S faza - sintetizira se ciklin B, stvara se dimer ciklinB/Cdc2 i događa se fosforilacija (na Cdc2)
 profaza - kompleks se defosforilira i pri tom se fosforiliraju ciljni proteini (nužni za mitozu)
 metafaza - ciklin B se razgrađuje
MPF dimer važan je u napredovanju do metafaze, ima 4 funkcije: kondenzacija kromatina
(fosforilira kondenzin), raspad jezgrine ovojnice (fosforilira lamin), fragmentacija GA i ER
(fosforilira Gm i T30), formiranje diobenog vretena (uzrokuje nestabilnost mikrotubula).
Za superkondenzaciju kromosoma važan je Cdc2 koji fosforilira
histon H1, ali to nije jedino što sudjeluju u kondenzacijskom
procesu (međutim on je još uvijek dosta nepoznat).
Veze između sestrinskih kromatida održavaju kohezini vežući se
na DNA tijekom S faze. Kako stanica ulazi u M fazu, kohezine
zamjenjuju kondenzini u svim dijelovima OSIM centromere.
Interfazni mikrotubuli zamjenjuju se velikim brojem kratkih
mikrotubula koji izlaze iz podijeljenih i polarno položenih centrosoma.
Nakon formiranja diobenog vretena inicira se anafaza i dovršetak mitoze. Kompleks koji potiče
anafazu ima 2 puta djelovanja. Kod prvog puta kompleks potiče razgradnju sekurina, slijedi
aktivacija separaze, razgradnja kohezina Soc1 i na kraju separacija sestrinskih kromatida te
početak anafaze. Drugi put djelovanja kompleksa potiče razgradnju ciklina B što dovodi do
inaktivacije MPF-a i na kraju dolazi do izlaska iz mitoze i citokineze.
Nepravilnosti u segregaciji kromosoma uobičajene su u tumorskim stanicama. Smatra se da bi
upravo takve nepravilnosti mogle imati ključnu ulogu u razvoju mnogih tumora.
Posljednja faza stanične diobe je citokineza. Stvara se kontraktilni prsten i stanica se postupno
cijepa na dvije stanice.

Mejoza je dioba diploidnih roditeljskih stanica kojom nastaju haploidne gamete. Sastoji se od
dvije uzastopne diobe - mejoza I i mejoza II. Prva mejotička dioba inducira se nakon S faze u
kojoj je stanica postala TETRAPLOIDNA. Tada se sparuju homologni kromosomi koji se potom
dijele na dvije stanice koje su onda DIPLOIDNE. U drugoj mejotičkoj diobi dijele se kromatide
svakog kromosoma na dvije krajnje stanice koje su HAPLOIDNE. U konačnici mejozom iz jedne
stanice dobivamo 4 stanice koje sadrže polovičnu količinu ukupne DNA.
Mejoza I razlikuje se od mitoze po tome što u njoj dolazi do homolognog sljubljivanja
kromosoma i rekombinacije putem crossing overa. Mejoza II jednaka je mitozi, jedino što joj ne
prethodi S faza.
Kada govorimo o mejozi I njenu profazu možemo podijeliti u podfaze, a one su leptoten,
zigoten,pahiten,diploten i dijakineza.
Ključni je korak mejoze sljubljivanje homolognih kromosoma. To sljubljivanje događa se za
vrijeme profaze I i omogućuje crossing over tijekom kojeg se događa rekombinacija roditeljskih
kromatida. Preciznije, homologni kromosomi počinju se sljubljivati prije nego što je dovršena
njihova kondenzacija (vjerojatno se prepoznaju po slijedu nukleotida), a rekombinacija je
dovršena tijekom pahitena kada se kromosomi drže zajedno samo na mjestima crossing-overa
pomoću hijazmi. Tijekom anafaze I razdvajaju se hijazme, a homologni kromosomi završavaju
na suprotnim stranama.
Regulacija mejoze oocite: Oocita raste i zaustavlja se u diplotenu profaze I. Hormonskom
stimulacijom dolazi do dovršetka mejoze I. Nastavlja se stanični ciklus i onda slijedi novi zastoj,
sada u metafazi II. Nastavak staničnog ciklusa pokreće se oplodnjom, a ako oplodnje nema,
stanica umire u metafazi II. Mehanizam zaustavljanja mejotičke diobe oocite ide preko MEK-
ERK- Rsk kaskade kojom se sintetizira ciklin B i kompleks koji potiče anafazu (koji sprječava
razgradnju ciklina B). Mehanizam dovršavanja mejoze II ide nakon što se unutar jajne stanice
nađu očev i majčin pronukleus, pronukleusima se razgrade ovojnice i dođe do spajanja majčinog
i očevog DNA u kromosome.
Neke stanice u diferenciranom obliku u potpunosti gube sposobnost proliferacije. Za njih ugl.
postoji germinativna stanična loza (matične stanice, stem cells) iz koje se stalno formiraju nove
stanice istog tipa. Razlikuju se pluripotentne i multipotentne matične stanice. Pluripotentne su
manje diferencirane i daju veći spektar različitih stanica, dok su multipotentne diferenciranije.
Primjer multipotentne je hematopoetska matična stanica, a pluripotentne embrijska matična
stanica. Embrijske matične stanice koriste se u terapijskom kloniranju.
13. predavanje: Stanična smrt i stanična obnova
Da bi višestanični organizam pravilno funkcionirao, potrebno je da uklanjanje i obnova stanica
budu usklađeni.
Apoptoza je proces kojim se uklanjaju stanice koje su dotrajale ili oštećene. U embrionalnom
razvoju apoptoza osigurava pravilno uobličenje organizma. Prilikom apoptoze dolazi do
kondenzacije kromatina, fragmentiranja DNA, fragmentiranja jezgre u sve manje dijelove i u
konačnici raspad stanice. Apoptotičke stanice imaju DNA fragmente koji odgovaraju
višekratinicima 200 pb, što odgovara veličini nukleosoma.
Makrofagi su zaduženi za fagocitozu apoptoznih stanica. “Pojedi me” signal je fosfatidil-serin
na površini stanica u apoptozi (u normalnim stanicama on je na citosolnoj strani membrane, a u
apoptozi dospijeva van).
Geni za apoptozu identificirani su u Caenorhabditis elegans - to je oblić i on je modelni
organizam za istraživanje. U svom razvoju ima 1090 stanica, na kraju životnog vijeka ima ih 900 i
nešto. Pokusi su uključivali kemijsku mutagenezu i gledalo se koje su mutacije utjecale na
apoptozu. Stanice u apoptozi mogu se uočiti pod mikroskopom. Utvrđeno je da mutacije u
genima Ced3, Ced4 i Ced9 dovode do inhibicije apoptoze. Ced3 gen je za KASPAZU, Ced4 za
protein koji djeluje kao AKTIVATOR Ced3 kaspaze, a Ced9 kao INHIBITOR Ced4.
Kod sisavaca analozi ova 3 proteina su mnogobrojne inicijatorske i efektorske kaspaze, Apaf-1
(homolog Ced4, znači AKTIVATOR kaspaza) i porodica Bcl2 proteina (homolozi Ced9, znači
INHIBITORI Apaf-1).
Kaspaze su proteaze koje imaju Cys u svom aktivnom mjestu i one kidaju polipeptid iza Asp. Po
tome su dobile ime - C od cistein, ASP od apsaragin. One se sintetiziraju u obliku inaktivnih
preteča, a do aktivacije dolazi proteolitičkim kidanjem putem drugih kaspaza.
Inicijatorske kaspaze one su koje se aktiviraju putem signala za apoptozu i djeluju aktivacijski
na drugi kaspaze.
Efektorske kaspaze one su koje se aktiviraju inicijatorskim i njihova je uloga izvršenje apoptoze.
One fragmentiraju DNA, fragmentiraju jezgru, uzrokuju nabiranje membrane, fragmentiraju GA
i u konačnici fragmentiraju stanice.
Za primarnu aktivaciju kaspaza potreban je apoptosom na kojeg mora biti vezan citokrom C.
Pod normalno citokrom C smješten je u mitohondriju, a kada se veže na apoptosom, aktivira
kaspazu-9 koja je inicijatorska kaspaza, ona uzrokuje aktivaciju kaspaze-3 koja je efektorska
kaspaza i stanica odlazi u apoptozu.
Bcl-2 porodicu čine regulatorni proteini apoptoze. Otkriveni su kao proteini koji imaju ulogu u
nastanku raka i zato su imenovani tako kako jesu (prema B-cell-lymphoma).
Antiapoptotički su Bcl-2 i Bcl-xL. Oni imaju 4 BH domene (Bcl Homology) - BH1,BH2, BH3 i BH4 i
to su evulucijski očuvani slijedovi.
Proapoptotički višedomenski su Bax i Bak. Imaju 3 BH domene - BH1-BH3. Normalno se nalaze
u membrani mitohondrija, a kada se aktiviraju omogućuju prolaz citokroma C u citosol. Znači
bax aktiviran signalom smrti postaje aktivan i kao takav propušta citokrom C u citosol gdje se
on veže u kompleks s inicijatorskom kaspazom-9 i Apaf-1 u strukturu koju nazivamo
apoptosom. Pri tom dolazi do aktivacije inicijatorske kaspaze 9 koja pak djeluje aktivacijski na
efektorsku kaspazu 3.
Proapoptotički samo-BH3 su Bid, Bad, Noxa, PUMA i Bim. Oni imaju samo jednu BH3 domenu.
O njima ovisi ishod apoptoze.
Regulacijske interakcije između članova Bcl-2 porodice:
a) normalna stanica: antiapoptotički i višedomenski vezani su skupa u kompleks, samo-BH3 je
u inaktivnom obliku
b) stanica u apoptozi: signal stanične smrti aktivira samo-BH3 protein, on se veže na
antiapoptotički pa dolazi do otkidanja višedomenskog iz kompleksa s antiapoptotičkim i on
postaje aktivan → inducira apoptozu
IAP proteni (inhibitors of apoptosis protein) također su regulatori kaspaza. Djeluju kao
inhibitori kaspaza ili ih ubikvitiniraju te tako dovode do njihove razgradnje u proteosomu. Vrlo
su važni kod Drosophile melanogaster jer ona za razliku od sisavaca ne sintetizira kaspaze u
obliku inaktivnih preteča. Kod sisavaca IAP proteini otpuštaju se uz citokrom C uslijed
permeabilizacije mitohondrija Bak/Bax-om.
Signalni putovi koji reguliraju apoptozu dijele se na intrinzičke i ekstrinzičke.
Intrinzički su svi oni signali koji potječu iz same stanice kao npr. oštećenja DNA ili manjak
faktora rasta te infekcija stanice virusom (može biti i ekstrinzički). Oni uzrokuju otpuštanje
citokroma C iz mitohondrija te aktivaciju kaspaze-9.
Ekstrinzički su sve izvanstanične molekule koje djeluju kao signali smrti. Sam put počinje
vezanjem polipeptida iz porodice TNF na receptore koji potiču staničnu smrt. Izravno se odatle
aktivira inicijatorska kaspaza-8.
Intrinzički signalni putovi:
Oštećenje DNA vrlo je opasno jer može dovesti do razvoja raka i zato je ono jedan od glavnih
okidača stanične smrti. Ako je DNA oštećena dolazi do zaustavljanja staničnog ciklusa, to
zaustavljanje posredovano je s p53. Znači, oštećena DNA inicira put Chk2 da fosforilira p53, tako
aktiviran p53 djeluje kao transkripcijski faktor za sintezu proteina koji su zaduženi za
zaustavljanje staničnog ciklusa. Između ostalih, transkribira se i gen za p21 protein koji djeluje
inhibirajući Cdk2/ciklinE pa dolazi do zaustavljanja ciklusa u G1 fazi. Sada stanica, ovisno o
stupnju oštećenja, ide u apoptozu ili se ciklus reverzibilno zaustavlja i slijedi popravak DNA. Do
apoptoze dolazi onda kada p53 aktivira transkripciju PUMA i Noxa (skupina samo-BH3
proteina), oni aktiviraju Bax i Bak i stanica odlazi u apoptozu. p53 mutiran je u preko 50%
tumora.
Faktori rasta nužni su za odašiljanje signala preživljavanja, bez njih stanice odlaze u apoptozu jer
su na taj način programirane. Oni djeluju tako da se vežu na receotore, uzrokuju njihovu
dimerizaciju i pokreću kaskadu reakcija:
PI3K fosforilira PIP2 tako da nastaje PIP3 koji aktivira protein-serin/treonin-kinazu Akt.
Akt fosforilira proteine koji reguliraju apoptozu, npr. Bad (samo-BH3 protein) i time stvara
vezno mjesto za šaperone 14-3-3 koji uklanjaju Bad. Bad mogu fosforilirati i druge protein-
kinaze iz drugih signalnih puteva potaknutih faktorima rasta, kao što je Ras/Raf/MEK/ERK.
Akt djeluje i na transkripcijski faktor FOXO tako što ga fosforilira pa nastaje vezno mjesto za 14-
3-3 koji ga uklanja. Kad nema signalizacije faktorima rasta, FOXO se otpušta s 14-3-3 i prebacuje
u jezgru gdje stimulira transkripciju proapoptotičkih gena kao što je Bim (samo-BH3 protein).
Akt fosforilira i GSK-3 i time regulira transkripcijske faktore p53 i NF-κB, a GSK-3 i mTOR
reguliraju translaciju Mcl-1 proteina (antiapoptotički član Bcl-2).
Ekstrinzički signalni putovi:
TNF faktor i srodni faktori građeni su od 3 jednaka lanca koji vezanjem na receptor potiču
njegovu trimerizaciju. Citoplazmatski dio receptora veže adaptorske molekule koje zatim
aktiviraju kaspazu-8. Ona je inicijatorska kaspaza koja aktivira efektorske kaspaze.
U nekim stanicama aktivacija kaspaze-8 i nakon toga aktivacija kaspaze-3 i kaspaze-7 dovoljna
je za pokretanje apoptoze.
U nekim stanicama potrebna je AMPLIFIKACIJA signala. U tom slučaju kaspaza pokida samo-
BH3 protein Bid koji se time aktivira i dovodi do oslobađanja citokroma C i aktivacije kaspaze-9.
→ dolazi do udruživanja intrinzičkog i ekstrinzičkog puta!

Alternativni put programirane stanične smrti je autofagija, a još jedan mehanizam uklanjanja
stanica je i nekroza, međutim tu se ne radi o programiranoj smrti.

Proliferacija diferenciranih stanica:

Većina diferenciranih stanica obnavlja se iz matičnih stanica.
Neke diferencirane stanice zadržavaju sposobnost proliferacije (izlaze iz G 0 i idu u proliferaciju):
 fibroblasti - ranjavanje dovodi do otpuštanja PDGF
 endotelne stanice koje oblažu krvne žile - nedostatak O2 uzrokuje otpuštanje VEGH
 stanice glatkog mišića koje tvore stijenke većih krvnih žila - stimulirane su faktorom rasta
 epitelne stanice nekih unutarnjih organa
 stanice jetre
Odrasle matične stanice malobrojne su nediferencirane stanice unutar diferenciranih stanica ili
tkiva i one imaju sposobnost diferenciranja u glavne specijalizirane tipove tog tkiva. Kažemo da
su MULTIPOTENTNE (daju ograničen broj stanica). Osim hematopoetske matične stanice tu su
još matične stanice strome KS i moždane matične stanice, pronađene su i u koži, perifernoj krvi,
krvnim žilama i jetri. Jedna je zanimljivost da stanice folikula kose i matične stanice žlijezda
lojnica (koje okružuju foliku) mogu preuzeti ulogu jedna od druge.
Umbilikalne matične stanice izliraju se iz umbilikalne vene po rođenju.

Matične stanice žive u okružju koje im omogućuje zadržavanje funkcije. One su smještene
unutar džepa koji čine potporne stanice (pravilna potpora omogućuje ispravno orijentiranu
diobu). Diobom dolazi do nastanka jedne matične stanice i jedne stanice koja će se diferencirati.
To je regulirano signalnim putovima Wnt, TGF-β, Hedgehog i Notch.

Transplantacija hematopoetskih matičnih stanica obavlja se ugl. poslije izlaganja kemoterapiji i

zračenju za eliminaciju endogenih tumorskih stanica. Tim tretmanima cilja se na sve stanice
koje se dijele, a osim tumorskih bivaju pogođene i stanice kose, kože i krvi. U tom slučaju prije
kemoterapije vade se matične stanice iz pacijenta i po završetku terapije one se implantiraju u
pacijenta te se ponovno uspostavlja njegov hematopoetski sustav. U slučajevima krvnih tumora
(leukemija i limfoma) koriste se donorske matične stanice.

Tkivno inženjerstvo metoda je uzgoja tkiva kože na 2D podlozi s fibroblastima. Izoliraju se

epidermalne matične stanice, one propagiraju u kulturi i združuju se sa zamjenskom dermom tj.
rešetkom fibroblasta. Tako uzgojena koža upotrebljava se u slučajevima teških opeklina.
Moguć je i uzgoj kosti odnosno regeneracija 3D tkiva. Izoliraju se skeletne matične stanice i one
propagiraju u kulturi. Združuju se s 3D rešetkom - česticama hidroksiapatita/trikalcijevog
fosfata. Tako uzgojene kosti mogu se iskoristiti za unos na mjesta ozljede.

In vitro uzgoj organa još uvijek je u slučajevima složenih organa proces pun nepoznanica. Radi
se o tome da su organi građeni od više vrsta tkiva - postavlja se pitanje je li potrebno više
različitih vrsta matičnih stanica. Drugo je pitanje kako u kulturi matične stanice potaknuti na
ispravnu diferencijaju. Problem je napraviti ispravnu rešetku koja je nužna za to da dobijemo
točan oblik i dimenzije organa (potrebna je izrada 3D rešetki). Također je teško prokrviti organe
(potrebna je in vitro angiogeneza).
Danas su uspješno uzgojene ROŽNICA i MJEHUR.

Embrijske matične stanice potječu iz unutrašnje mase blastoiste, to su matične stanice nakon
faze od 8 stanica. One su PLURIOPOTENTNE što znači mogu stvoriti bilo koji tip stanica (ali ne
mogu stvoriti cijeli organizam). Njih se može uzgajati u kulturi, moguće je njima manipulirati i
ponovno ih vratiti u blastocistu gdje doprinose u rastu svih dijelova embrija.
TOTIPOTENTNE stanice su one do faze od 8 stanica i one su sposobne stvoriti bilo koji tip
stanica i čitav organizam.
EMS u kulturi se održavaju u nediferenciranom stanju na sloju stanica hranilica uz dodatak
inhibicijskog faktora leukemije (LIF). U kulturi se mogu održavati u dugim vremenskim
periodima, mogu stvoriti neograničenu količinu stanica, ne pokazuju zakove starenja ili
senecencije. U odsutnosti LIF spontano diferenciraju u različite stanične tipove.

Kloniranje sisavaca:
Biotehnologija kloniranja sisavaca može biti: cijepanje embrija, partenogeneza i prijenos jezgre.
Cijepanje embrija najranija je metoda kloniranja cijelog organizma. Prvi put učinjena je na
morskim ježincima 1885. pomoću vlasi kose kojom je pocijepan embrij i što je za rezultat dalo 2
jednaka ježinca. To je moguće zahvaljujući totipotentnosti stanica embrija do faze od 8 stanica -
to znači da je iz jednog embrija izolacijom blastomera potencijalno moguće dobiti 8 klonova.
Partenogeneza je metoda kod koje se diploidne prekursorske stanice (koje bi trebale ući u
mejozu i postati oocite) induciraju mehanički, električki ili kemijski da postanu slične oplođenim
oocitama. Ta je metoda moguća jedino kod ženki za dobivanje ženskog potomstva. Kod sisavaca
još uvijek nije uspješno izvedena i još uvijek se istražuje. Problem je što dolazi do abnormalne
diferencijacije zbog koje embrij ne preživljava. Međutim, ovom metodom uspješno su dobivene
EMS.
Prijenos jezgre danas je najčešće korištena metoda. Odvija se u 2 koraka: enukleacija i prijenos
jezgre iz organizma kojeg želimo klonirati. Enukleacija proces je uklanjanja jezgre iz zrele
neoplođene jajne stanice (ili jajne stanice u G 0 fazi) čime nastaje citoplast. PRIJENOS JEZGRE iz
organizma kojeg želimo klonirati u citoplast može se napraviti na 2 načina: elektrofuzijom i
mikroinjekcijom jezgre u citoplazmu.

Ovca Dolly prvi je sisavac kloniran iz odraslog. Korištena je metoda prijenosa jezgre. Prije nego
što je pokus dovršen, učinjeno je čak 277 pokušaja. Rođena je srpnju 1996. na Roslin Institute u
Škotskoj. Uginula je 2003. od progresivne bolesti pluća sa 6 godina, dok normalne ovce dožive
12 godina - Dolly je klon ovce koja u vrijeme uzimanja jezgre imala 6 godina, možemo reći da
jezgre pamte starost i prenose je na klonove.
Kloniranje sisavaca omogućava propagaciju ugroženih vrsta. 2001. godine rođeno je prvo
mladunče klon goveda gaur (Noah). 2012. klonirana je ugrožena vrsta kašmirske koze.

Razvoj i uspješnost kloniranja:

Današnja tehnika koloniranja u biti je vrlo neučinkovita, većina embrija umire prije ili tijekom
implantacije, uspješnost iznosi 1-3%.
Klonirane životinje često trpe tzv. “large offspring sindome” - klon i placeta su neuobičajeno
veliki. Nadalje, klonirano potomstvo često ima neobjašnjive respiratorne probleme ili probleme
u cirkulaciji koji uzrokuju preranu smrt. Imaju oslabljen imunosni sustav koji ponekad potpuno
otkazuje. S obzirom da potječu od odraslih stanica klonovi brže stare, u ranoj dobi razvijaju
bolesti povezane sa starijom životnom dobi (npr. artirits). Vrlo mali broj klonova doživi odraslo
doba.
1998. kolinirane su koze metodom prijenosa jezgre somatske stanice, a prijenos jezgre
napravljen je iz fetalnih somatskih stanica oocite. One su doživjele normalnu životnu dob i bile
zdrave.
Terapijskim kloniranjem iz tkivno specifičnih stanica dobivaju se klonovi tih stanica koji se
mogu implantirati u donora. Odlično je jer nam daje stanice koje specifično odgovaraju
pacijentu. Problem je mala učinkovitost kloniranja, ali i etička pitanja jer je za uzgoj ovakvih
stanica potrebno manipulirati matičnim stanicama.
Reprodukcijsko kloniranje nosi još veće etičke probleme od terapijskog.

Razna su etička pitanja vezana uz kloniranje i znanstvenici pokušavaju pronaći načine na koje bi
cijeli proces bio prihvatljiviji od strane zajednice. Umjesto embrijskih matičnih stanica mogu se
koristiti odrasle matične stanice, međutim one nikako ne mogu u potpunosti zamijeniti
embrijske s obzirom da imaju ograničen razvojni potencijal.
EMBRIJSKE MS ODRASLE MS
neograničen životni vijek i neograničene
ograničen razvojni potencijal
zalihe
gubitak sposobnosti proliferacije i
visok kapacitet adaptivne promjene diferencijacije nakon nekog vremena u
kulturi
potencijal za razvoj malignih bolesti lake za održavanje u kulturi
upitan etički i legalni status etički status manje problematičan

Inducirane pluripotentne matične stanice (iPS cells) dobivene su reprogramiranjem

diferenciranih odraslih stanica. Kod reprogramiranja utišani su geni karakteristični za određeni
tip stanice i aktivirani su geni koji održavaju pluripotentnost.
2006. godine Shinya Yamanaka otkrio je da su samo 4 transkripcijska faktora dovoljna za
reprogramiranje somatskih stanica u iPS! Ti transkripcijski faktori su Oct4, Oct2, Klf4 i c-Myc i
oni omogućuju da se baš svaka somatska stanica prevede u iPS. Neke stanice same po sebi već
imaju eksprimiran neki od gena za te transkripcijske faktore.
iPS mogu se stvarati na više načina. Jedan način uključuje unos gena za TF u stanicu pomoću
retrovirusnih vektora koji se ugrađuju u genom. Kod te metode problem je to što može doći do
mutacija u genomu prilikom ugradnje retrovirusa. Druge metode manje su invazivne i one
uključuju unos kratkoživućih mRNA za TF, unos malih molekula koje induciraju ekspresiju TF ili
unos već gotovih TF. Za to se koriste neintegrabilni vektori koji ne idu u jezgru, nego se
zadržavaju u citoplazmi.
Postupak traje 3 tjedna. Nakon 8. dana događa se “point of no-return”. Nakon 15. dana stanica
će sigurno postati iPS. Između je “Area 51” nazvana tako jer se prilikom imenovanja nije znalo
što se u tom razdoblju događa.
iPs stanice ponašaju se slično stanicama raka, imaju potencijal da se iskoriste za istraživanja s
ciljem liječenja i prevencije raka. Općenito njihov najveći značaj leži u terapiji raznih bolesti.
2011. započeta je prva klinička studija koja koristi iPS, radi se o tretmanu ozljede leđne
moždine. Studija još uvijek traje. U tijeku su i pretkliničke studije za terapiju dijabetesa, za sad je
uspješno izliječen kod miševa. 2015. započela je faza II kliničke studije CHART-1 kod koje se
upotrebljavaju za liječenje uznapredovalog kroničnog ishemijskog zatajenja srca - stanice su
reprogramirane u stanice srca i vraćene u pacijentovo srce nakon čega je uočena obnova
oštećenog tkiva.

2015. godine odobrena je prva terapija matičnim stanicama (klasične matične stanice) za
medicinsku upotrebu u Europi - Holoclar. Koristi se za liječenje LSCD (limbal stem cell
defficiency) uzrokovane fizičkim ili kemijskim oštećenjima oka. Iz pacijentove rožnice uzimaju se
matične stanice, umnažaju se in vitro i vraćaju natrag.
14. predavanje: Rak
Normalne žive stanice konstantno dobivaju signal da žive. Stanice raka nastavljaju živjeti i onda
kada im ne dolaze signali za život - one nekontrolirano rastu, dijele se i šire po čitavom
organizmu i pri tom ometaju normalne funkcije zdravih stanica. Za stanice raka karakteristični
su poremećaji u aktivnosti mnogih proteina koji imaju ulogu u staničnoj signalizaciji, regulaciji
staničnog ciklusa i kontroli stanične smrti što onda dovodi to njihove nekontrolirane
proliferacije.
Tumor se definira kao svaka nenormalna proliferacija stanica u organizmu. Može biti benigni i
maligni. Benigni tumori ostaju ograničeni na mjesto na kojem su nastali, ne šire se na okolna
tkiva niti u udaljene dijelove organizma. Oni kao da rastu prema unutra i masa im se povećava
kako rastu, najagresivnije stanice su unutra, nema prodiranja u okolna tkiva i lako ih je kiruški
odstraniti. Maligni tumori mogu se širiti na okolna tkiva ili u udaljene dijelove organizma putem
krvožilnog ili limfatičkog sustava. Oni rastu prema vani, najagresivnije stanice su na površini i
zato lako urastaju u okolna tkiva i šire se u udaljena tkiva, stoga ih je teško kiruški ukloniti (teško
je razgraničiti dokle rak seže). Pojam raka odnosi se isključivo na maligne tumore.
Rak može nastati kao posljedica poremećaja proliferacije bilo koje stanice u tijelu i zato postoji
više od stotinu vrsta raka. Metastaze su nakupine tumorskih stanica u udaljenim tkivima, one su
tkivno podudarne s primarno nastalim tumorom, a ne tkivom u kojem su smještene, npr.
metastaze plućnog raka u mozgu histološki odgovaraju plućima, a ne mozgu. Neke vrste tumora
imaju preferencije metastaziranja pa se tako npr. rak iz pluća širi u mozak i kosti, a rak dojke u
limfne čvorove (kod terapije raka dojke često se vade i limfni čvorovi radi prevencije).
I benigni i maligni tumori klasificiraju se prema vrsti stanica ili tkivu iz kojeg nastaju. Zloćudni se
mogu podijeliti na karcinome, sarkome te leukemije i limfome. Karcinomi su zloćudne bolesti
epitelnih stanica (na njih otpada 90% svih rakova). Sarkomi su solidni tumori vezivnih tkiva -
mišića, kostiju i hrskavica (vrlo su rijetki u ljudi). Leukemije i limfomi zloćudne su bolesti
hematopoetskih stanica i stanica imunosnog sustava (oni čine 7% svih rakova).
Najučestalije vrste rakova su rak prostate kod muškaraca i rak dojke kod žena. Dalje slijede rak
pluća i kolona. Rak s najvećom smrtnosti je rak pluća.

Nastanak raka proces je koji se sastoji od više koraka tijekom kojih stanice zbog niza
progresivnih promjena postaju zloćudne. Starenje i način života (pušenje, prehrana, izlaganje
suncu, pesticidi…) dovode do nakupljanja mutacija. Učestalost raka raste sa životnom dobi.
Nastanak raka možemo slikovito opisati kao avionsku nesreću, jedna anomalija neće dovesti do
problema, ali ako dođe do nakupljanja anomalija, doći će i do negativnog ishoda. Kod raka,
znači, jedna mutacija u jednoj stanici nije problem, nju imunosni sustav u pravilu uklanja.
Međutim, onda kada ta mutirana stanice uspije opstati u organizmu, ona je sklona daljnjim
mutacijama i ako se takva ponovno mutirana stanica opet ne ukloni, ona može ponovno
mutirati itd. Ovdje govorimo o kumulaciji oštećenja unutar stanice.
Klonalnost je temeljno svojstvo tumora, a ono podrazumijeva to da sve stanice tumora nastaju
iz jedne jedine stanice (one u kojoj su se kumulirala oštećenja)! Ipak, to ne znači da su konačna i
početna stanica tumora jednake.
Svaka mutirana stanica ima veći potrencijal za stvaranje nove mutacije i svaka novomutirana
stanica potentnija je (moćnija u preživljavanju, postaje dominantna populacija u tumoru) - to
nazivamo klonska selekcija.

Karcinogeni su tvari koje uzrokuju rak. One oštećuju DNA i induciraju mutacije. To može biti UV
zračenje, karcinogene tvari iz duhanskog dima, aflatoksin iz plijesni žitarica, virusi poput HPV-a…
Promotori tumora ne uzokuju mutacije nego pridonose nastanku raka stimulirajući proliferaciju
stanica. Oni uzrokuju povećanje br. dioba. Npr. forbol esteri stimuliraju proliferaciju aktivirajući
protein kinazu C, estrogeni stimuliraju proliferaciju stanica endometrija (opasnost je
nadomjesna hormonska terapija u menopauzi).

Svojstva stanica raka:

 gubitak inhibicije proliferacije ovisne o gustoći stanica
 autokrina stimulacija rasta (nisu ovisne o faktorima rasta iz okoliša)
 smanjena adhezivnost (osim u slučaju metastaziranja, tada je adhezivnost izrazito
visoka)
 gubitak kontaktne inhibicije (“ne poštuju osobni prostor”, rastu jedne preko drugih,
neuredno i u više slojeva)
 lučenje proteaza (razgradnja izvanstaničnog matriksa za lakši prodor kroz bazalne
membrane radi širenja)
 angiogeneza - stvaranje novih krvnih žila koje su propusnije od normalnih (angiogeneza
je nužna za opskrbu tumora s 0 2 i hranjivim tvarima, propusnost je važna za
metastaziranje)
 poremećaji diferencijacije (pr. su leukemijske stanice koje ne sazrijevaju, a svejedno
imaju sposobnost dijeljenja)
 izbjegavanje apoptoze (ne trebaju faktore rasta za preživljavanje, česte su mutacije u
kontrolnim točkama iz kojih bi se stanice odvele u apoptozu)

Uloga virusa u nastanku raka:

Virusi hepatitisa uzrokuju kronične infekcije jetre povećavaju stopu nastanka raka za 100 puta.
Te infekcije razaraju hepatocite zbog čega je povećano i ubrzano stvaranje novih što rezulatira
povećanjem vjerojanosti za nastajanje mutacija. Kod HCV jaka upala izazvana kroničnom
infekcijom potiče nastanak raka, a kod HBV odgovoran je gen X koji se ugrađuje genom te
utječe na ekpresiju niza staničnih gena i dovodi do poremećaja u proliferaciji i staničnom
preživljavanju.
SV40 i poliomavirus ne izaziva rak u PERMISIVNIM STANICAMA (stanice koje su prirodni
domaćini), “one se daju virusu” i umiru nekrozom. U NEPERMISIVNIM STANICAMA uzrokuju
rak. Ondje se integriraju u genom domaćina i transformiraju stanice zbog ekspresije virusnih
gena. Ta ugradnja je moguća jer virusni genom ima sekvence koje odgovaraju našem genomu
(genomu sisavaca, ali i ptica). Vjerojatno su virusi dobili gene od nas (a ne mi od njih) i malo ih
evolucijski prilagodili sebi, a ugradnja u genom domaćina smatra se evolucijskom pogreškom
jer, iako je domaćinu napravila štetu, ona virusu ne radi ništa dobro, čini ih blokiranima -
onemogućuje im replikaciju).
Proteini ranog područja potiču replikaciju virusne DNA, ali i gena u stanici domaćinu - ako dođe
do ugradnje u genom domaćina, dolazi do trajne proliferacije. T-antigen veže i inaktivira tumor-
supresore p53 i Rb.
Papilomaviruse čini porodica 60 različitih virusa koji uzrokuju infekcije epitelnih stanica -
dobroćudne promjene (bradavice, kondilome), ali i karcinom grlića maternice. Rani geni E6 i E7 i
još neki “bad-guys” izravno uzrokuju rak grlića maternice: E6 veže Rb, a E7 potiče razgradnju
p53.
Adenovirusi u NEPERMISIVNIM STANICAMA domaćina izazivaju transformaciju (kao SV40 i
polio). Rani geni E1A i E1B interferiraju sa staničnom proliferacijom: E1A veže Rb, a E2B veže
p53.
Herpesvirusi najsloženiji su životinjski virusi koji uzrokuju tumore kod životinja i ljudi. Oni su
povezani s nastankom određenih tumora, ali ugl. ne izravno i mehanizam nastanka raka često
nije razjašnjen. EBV povezan je s nekoliko vrsta raka, jedan od njih je Burkittov limfom.
Mehanizam nastanka limfoma nije razjašnjen zbog složenosti genoma. Herpesvirus povezan s
Kaposijevim sarkomom najčešće se veže uz AIDS kod kojeg su mutirani CD4(+) limfociti pa je
poremećen imunosni odgovor za uklanjanje onoga što ne valja. Nekoliko gena virusa utječe na
staničnu proliferaciju i preživljavanje, jedan od njih djeluje na Rb i p53.
Retrovirusi ugl. nisu kancerogeni, ali neki jesu i oni sadrže ONKOGENE (gene koji mogu dovesti
do transformcije stanica, ali virusu nisu nužno potrebni za replikaciju). Različiti retrovirusi
razlikuju se po onkogenim svojstvima, npr. RSV (Rausov sarkomski virus) transformira
fibroblaste pilećeg embrija, dok srodan ALV (virus ptičje leukoze) koji se replicira u istim
stanicama ne uzrokuje transformaciju. Kod RSV-a onkogen zaslužan za transformaciju je src
[sark].
RETROVIRUSNI ONKOGENI potječu od gena stanica domaćina. PROTOONKOGENI su normalni
stanični geni od kojih su nastali retrovirusni onkogeni i to se radi o regulacijskim staničnim
genima koji kodiraju proteine koji sudjeluju u putevima prijenosa signala i kontroliraju
proliferaciju stanica. Znači, onkogeni su mutirani ili nenormalno eksprimirani oblici staničnog
protoonkogena.
Retrovirusni onkogen i protoonkogen mogu se razlikovati na razne načine. Kao prvo,
transkripcija virusnog onkogena pod nadzorom je virusnog promotora i pojačivača te je zato
puno jača. Nadalje, onkogeni kodiraju strukturno i funkcionalno poremećene proteine. To mogu
biti fuzijski proteini s delecijama regulacijskih dijelova (npr. kod onkogena raf), točkaste
mutacije koje dovode do promjene aminokiseline pa dolazi do poremećaja regulacije aktivnosti
proteina (npr. kod onkogena ras).

Tumori koji nisu inducirani virusima mogu sadržavati STANIČNE ONKOGENE koji su nastali
mutacijma ili prestrojavanjem DNA tijekom nastanka raka. Prvi otkriveni ljudski onkogen
homologan je s rasH u Harveyevom sarkomskom virusu. Najčešći onkogeni u ljudskim tumorima
su iz porodice ras, to su rasH, rasN i rasK, a odgovorni su za 20% svih slučajeva raka, 50% raka
debelog crijeva i 25% slučajeva raka pluća.
Protoonkogen ras prisutan je u normalnim stanicama, a onkogen ras nije, njega nalazimo u
stanicama raka. Od protoonkogena onkogen ras razlikuje se po zamjenama određenih
aminokiselina (točkaste mutacije), a za tu promjenu odgovorni su kemijski karcinogeni. Mutirani
je ras konstitutivno aktivan (veže GTP), zadržava se non-stop u aktivnoj konformaciji, jer GAP
(protein koji aktivira GTPazu) ne djeluje na mutirani RAS.
c-myc onkogen nastaje kromosomskom translokacijom djelića kromosoma 8 na jedan od lokusa
gena za imunoglobuline na 2., 14. ili 22. kromosomu (protooknkogen nalazi se na mjestu loma u
kromosomu 8). Njega pronalazimo u stanicama ljudskog Burkittovog limfoma i mišjeg
plazmocitoma.
Onkogen abl nastaje translokacijom protoonkogena abl s kromosoma 9 na komosom 22 i
povezuje se s KML-om. Fuzijom abl gena s bcr genom na 22. kromosomu dobiva se fuzijski
bcr/abl gen čija ekspresija dovodi do poremećaja regulacije aktivnosti abl-protein-tirozin-kinaze
i utječe na transformaciju stanica.
Amplifikacija onkogena mehanizam je aktivacije onkogena koji dovodi do pojačane ekspresije
tog gena. Ona dovodi do bržeg rasta i nastanka zloćudnog tumora. N-myc onkogen pronalazimo
u neuroblastomima (dječju tumori izgrađeni od embrionalnih živčanih stanica, vrlo agresivni i
brzorastući). Onkogen erbB-2 kodira receptorsku protein-tirozin-kinazu. Amplifikacija erbB-2
povezana je s progresijom karcinoma dojke i jajnika.

Sveukupno ima oko 100 virusnih i staničnih onkogena koji mogu dovesti do nenormalnog
ponašanja zloćudnih stanica. Neki protoonkogeni kodiraju proteine koji reguliraju proliferaciju
normalnih stanica. Njihova pojačana ekspresija ili aktivnost dovodi do nekontrolirane
proliferacije. Drugi pak onkogeni dovode do poremećaja diferencijacije i izbjegavanja apoptoze.
Faktori rasta mogu postati onkogeni u slučaju poremećene ekspresije kad tumorske stanice
same izlučuju faktor rasta i reagiraju na njega.
Puno onkogena kodira receptore za faktore rasta, većinom protein-tirozin-kinaze. Česte su
promjene u domenama koje vežu faktor rasta pa receptor postaje onkogen. Npr. u nekim
leukemijama receptor za PDGF postaje onkogen zbog translokacije pri čemu nastaje fuzijski
protein Tel/PDGFR. Kod normalnog receptora za PDGF receptor se dimerizira u prisutnosti
PDGF-a. Kod receptora građenog od fuzijskog proteina normalna inzvanstanična domena
receptora za PDGF zamijenjena je AK-skim slijedom s N-kraja transkripcijskog faktora Tel. Tako
stvoren slijed sadržava uzvojnica-omča-uzvojnica dimerizacijsku domenu koja dimerizira i u
odsutnosti PDGF-a što dovodi do stalne aktivnosti onkogenske protein-kinaze (kao i kod src i
abl).
Onkogeno djelovanje nekih transkripcijskih faktora posljedica je inhibicije diferencijacije.
Hormoni štitnjače i retinoična kiselina potiču diferencijaciju različitih vrsta stanica. Njihovi
mutirani receptori (ErbA za hormone štitnjače i PML/RARα za retinoičnu kiselinu) su onkogeni
za ljudsku akutnu promijelocitnu leukemiju. Budući da je sazrijevanje stanica onemogućeno,
one se zaustavljaju u fazi proliferacije. Ovu vrstu leukemije može se liječiti visokim dozama
retinoične kiseline zato da se prevlada učinak PML/RARα onkogenog receptora.
Tumor supresori normalno inhibiraju staničnu proliferaciju i nastanak tumora, a u mnogim su
tumorima nestali ili su inaktivirani. Inaktivacijom tumor supresorskih gena gube se negativni
regulacijski proteini, a to dovodi do razvoja raka. Primjer je mutacija Rb gena kod
retinoblastoma. Bolest je rijetka jer je potrebno da Rb gen u obje kopije bude nenormalan.
Nešto se češće javlja naslijedni retinoblastom u djece koja su od jednog roditelja već naslijedila
defektnu kopiju gena pa se somatski mutira druga kopija. Kod sporadičnog retinoblastoma
somatski se moraju mutirati obje kopije gena. Rb nestaje ili je inaktivan i u nekim tipovima raku
mjehura, dojke i pluća, a može biti i meta onkogenih proteina tumorskih virusa SV40,
adenovirusa i ljudskih papilomavirusa.
Inače normalan Rb djeluje kao negativni regulator tumorogeneze. On zaustavlja stanični cuklus
u G1 točki jer veže transkripcijski faktor E2F i sprječava sintezu proteina potrebnih za staničnu
diobu. Da bi se stanični ciklus nastavio potrebni su komplesi Cdk4,6/ciklinD koji inaktiviraju Rb
fosforilacijom i omogućuju prolaz kroz restrikcijsku točku. Zato za Rb možemo reći da je tumor-
supresor, a za cikln D1 i Cdk4 da su onkogeni.
Tumor-supresorski gen je i p53. Njegova je uloga regulacija napredovanja staničnog ciklusa.
Oštećenje DNA inducira p53 koji aktivira transkripciju p21 - sintetizira se inhibitor Cdk proteina.
p21 inhibira sve Cdl/ciklin komplekse tj. zaustavlja napredovanje staničnog ciklusa. Inhibira
replikaciju DNA vezanjem PCNA (jezgreni antigen stanica u proliferaciji). Stanični ciklus
zaustavlja se kako bi se mogle popraviti mutacije. U slučaju nedostatka p53 stanice su
podložnije mutacijama. p53 neaktivan je u 50% svih slučajeva raka (limfomi, leukoemije,
sarkomi, tumori mozga, karcinom dojke, kolona, pluća). S obzirom da je p53 nužan za apoptozu
izazvanu oštećenjem DNA, tumorske stanice kod kojih je on mutiran otporne su na
kemoterapiju.
PTEN je fosfataza lipida koja defosforilira PIP3 i na taj način se suprotstavlja djelovanju PI3
kinaze i Akt. Inaktivacijom ili gubitkom PTEN-a, povećava se razina PIP3, aktivnost Akt i stanica
preživljava. Često je mutiran kod raka pluća, prostate i melanoma.
BRCA1 i BRCA2 stabilizirajući su geni koji održavaju integritet genoma, a njihova inaktivacija
dovodi do učestalih mutacija onkogena i tumor supresorskih gena. Mutacije u njima uzrokuju
naslijedni rak dojke - nasljeđivanje od majke.
U puno tumora prisutni su i poremećaji u ekspresiji miRNA. Njihova ekspresija je značajno
smanjena pa se smatra da puno miRNA djeluju kao tumor supresori. Takva je npr. let-7 miRNA
koja smanjuje ekspresiju onkogena rasK i c-myc. Ipak, neke miRNA mogu djelovati i kao
onkogeni.

Tumorigeneza je stupnjevit proces kod kojeg se normalne stanice postupno pretvaraju u

tumorske. Nužno je da dođe do mutacija koje uzrokuju i aktivaciju onkogena i inhibiciju tumor-
supresora. Zbog nakupljenja genskih oštećenja dolazi do povećanja proliferacije i preživljavanja.
Kod RAKA KOLONA najčešće su mutirani geni s 4 različita djelovanja: ras ili raf onkogeni koji
djeluju u putu ERK, tumor-supresori ili onkogeni puta Wnt (ACP), tumor-supresori signalnog
lanca TGF-β i p53.

Kod raka najveći je značaj u prevenciji! Pažnjom na stil života i održavanjem psihofizičkog
zdravlja osoba svjesno smanjuje broj mutacija. Važna je i rana dijagnostika, u premalignoj fazi.
Danas se teži ka tome da se otkriju genetski poremećaji koji su povezani s većom sklonosti
nastanka bolesti. U dijagnostici važni su specifični markeri. Molekularna analiza onkogena i
tumor-supresorskih gena daje korisne podatke za dijagnosticiranje bolesti i praćenje uspješnosti
terapije, npr. translokacija abl gena u KML detektira se PCR-om. Zahvaljujući napretku
molekularne biologije danas se tumori klasificiraju molekularno temeljem profila ekspresije
pojedinih gena. Za to se mogu koristiti DNA mikročipovi kojima se analizira sveukupna
ekspresija gena u stanicama raka. Kod liječenja raka cilj je koristiti lijekove sa selektivnim
djelovanjem, koji djeluju na tumorske stanice, ali ne i na one zdrave. Nažalost većina lijekova u
primjeni danas djeluje tako da oštećuju DNA ili sprječava replikaciju DNA i stoga su štetni i za
normalne stanice. Ipak, u novije vrijeme pojavili su se i neki visoko selektivni lijekovi: za
promijelocitnu leukemiju kombinacija citostatika i visokih konc. retinoične kiseline (cilja se na
fuzirani gen za receptor retinoične kiseline i gena PML), za rak dojke monoklonsko pt naspram
izvanstanične domene koje sprječava proliferaciju tumoskih stanica (cilja se na pojačanu
ekspresiju gena erbB2), za KML imatinib ili Gleevec (cilja se na Philadelphia kromosom). Za
dobru terapiju prije svega je važno poznavati mehanizam nastanka i proliferaciju raka - “bez
mehanizma uzalud vam trud svirači”.
15. predavanje: Genska terapija
Genska terapija podrazumijeva prijenos terapijskog gena u oboljelo tkivo ili organizam. Geni se
mogu transplantirati (kod delecija), korigirati (ispravljaju se mutacije), može se regulirati
ekspresija ciljnog gena (povećanje ekspresije ili supresija), može se ciljano uništiti pojedine
stanice unosom gena ubojice.
Ovim metodama mogu se liječiti npr. teška kombinirana imunodeficijencija (SCID), hemofilija
(nedostaje faktor VIII ili IX), cistična fibroza, rak, neurološke bolesti, kardiovaskularne bolesti
(ateroskleroza), autoimune bolesti i infektivne bolesti (AIDS, hepatitis B).
Problem genske terapije je taj što je kratkotrajna, teško je postići dugotrajan učinak bez
integracije ciljnog gena u genom. Nadalje, dolazi do aktivacije imunosnog odgovora što reducira
učinkovitost i onemogućuje višestruku primjenu terapije. Problemi s virusnim vektorima su to
što su toksični, mogu uzrokovati imunosni i upalni odgovor te postoji mogućnost povratka
sposobnosti izazivanja bolesti. Osim toga, mnoge bolesti su višegenske bolesti, izazvane su
učinkom više gena pa ih je teško liječiti na ovaj način.
Genska terapija može biti in vivo ili ex vivo. Genskom terapijom in vivo tretiramo cijeli
organizam. Ova metoda najčešće je neuspješna. Genetički materijal unosi se izravno u tijelo
pacijenta. To je nasumičan proces i mala je mogućnost kontrole. Ovakva vrsta terapije
primjenjuje se za terapiju bolesti tkiva koja se ne mogu uzgajati in vitro. Ex vivo terapija znači da
uzimamo stanice organizma, promijenimo ih, a potom izoliramo promijenjene stanice pa ih
vratimo u organizam, dakle to je autologna transplantacija s promijenjenim stanicama. Ovakva
vrsta terapije je kontroliran proces u kojem postoji selekcija stanica s transgenom te je
prikladna za bolesti koje pogađaju hematopoetski sustav, odnosno krv.

Terapeutski konstrukti DNA mogu se unositi u stanice unosom gole DNA, a tu spada upotreba
igle i šprice, biolistike i liposoma, zatim postoji unos DNA putem bioloških vektora pri čemu se
najčešće radi o retrovirusima i adenovirusima.
Unos gole DNA može se odvijati upotrebom igle i šprice. To se koristi kod terapije tumorskog
tkiva. Sljedeća mogućnost je korištenje genskog pištolja, tzv. BIOLISTIKA. Još jedna mogućnost je
upotreba LIPOSOMA koji dopremaju terapijsku DNA do ciljnog tkiva intravaskularnim,
intratrahealnim, intraperitonealnim ili intrakolonskim putem.
Unos gole DNA općenito provodi se intramuskularno ili intravaskularno, omogućena je
produžena in vivo ekspresija niskog stupnja, metode su jeftine i jednostavne, ali nisu
univerzalne i rijetko kad djeluju. Pristup je zapravo najuspješniji kod primjene DNA vakcina u
terapiji raka jer se njima povećava postojeći imunosni odgovor ili se potiče imunosni odgovor
prema neprepoznatom ili slabo antigenom tumoru.
Biolistika je metoda kod koje se plazmidna DNA taloži na čestice zlata ili volframa promjera 1-3
µm i dolazi do okidanja tih čestica iz genskog pištolja pod tlakom He ili visokim naponom.
Metoda je korisna u tretiranju mišićne distrofije.
Duchennova mišićna distrofija je X-vezana recesivna bolest koju karakterizira odsutnost
distrofina. To dovodi do oslabljenih mišića i gubitka mišićne mase te povećanja vezivnog tkiva u
mišićima. Najprije budu zahvaćeni mišići udova i trupa, a konačno se mogu javiti srčana aritmija
i otkazivanje srca. Uobičajeno je da problemi s plućima dovode do smrtnog ishoda u rasponu od
10. do 20. godine života. Distrofin je membranski protein skeletnih mišića koji povezuje
unutarstanični citoskelet i aktinske filamente s izvanstaničnim matriksom. U tome sudjeluju i
laminin te sarkoglikani. Cijeli taj kompleks stabilizira membranu. Moguć je i nedostatak drugih
komponenti što također dovodi do mišićne distrofije.
Problem je što su gen za distrofin i mRNA preveliki za unos putem vektora. Međutim, distrofin
zadržava dio funkcije i onda kada mu nedostaje velik dio gena. Takav nepotpuni distrofin
uzrokuje Beckerov fenotip koji je ipak blaži od DMD. Ovaj lijek, skraćeni gen za distrofin, je u
prvoj fazi kliničkih studija. Pritom je uočeno da injekcije plazmida s genom za distrofin ne
uzrokuju imunosne reakcije ni negativne učinke.

Liposomi nastaju spontanom agregacijom lipidnih molekula u vodenom okruženju. Kationski

liposomi vežu negativno nabijenu DNA te je time štite od razgradnje. Lipofektin i lipofektamin
služe i za transfekciju stanica u kulturi. Nedostatak liposoma je njihovo brzo uklanjanje iz
cirkulacije putem makrofaga iz jetre. Dodatkom površinskih liganada kao što su
monosijalogangliozidi, polioksietileni, kolesterol i glukuronska kiselina smanjuje se degradacija
liposoma i produljuje njihov poluživot.
Kokleati su višeslojni liposomi koji preživljavaju višestruke fuzije s membranom i u GI traktu pa
su prikladni za oralnu primjenu. Mogu se lako i dugotrajno pohraniti kao liofilizirani prah na
sobnoj temperaturi.
Imunoliposomi koriste se za aktivno usmjeravanje DNA. Na površini nose specifična protutijela,
npr. protutijela na unutarstanični miozin koja usmjeravaju liposome na područja miokarda
zahvaćena infarktom ili protutijela na tumorske antigene koji ih usmjeravaju na stanice tumora.
I bez posebnog usmjeravanja liposomi mogu djelovati kao tumor-specifične vezikule jer lakše
ulaze u krvne žile s oštećenim endotelom, a to je tipično za tumorska tkiva. Koriste se i za
liječenje cistične fibroze.
Cistična fibroza česta je bolest kod bijelaca (1 na 2000 rođenih). Dolazi do defekta u CFTR genu
(7. kromosom, 27 egzona, 1480 AK) što uzrokuje nepravilno provođenje natrija i klorida u
epitelnim stanicama mnogih organa pa tako znojne žlijezde izlučuju previše slanog sekreta, u
probavnom sustavu nastupa opstipacija, enzimi gušterače ne mogu napustiti žlijezdu pa je
oštećuju zbog čega se proizvodi manje inzulina i nastaje dijabetes te nastaje gusti sekret u
plućima što povećava osjetljivost na infekcije i uzrokuje stalni kašalj. Mukus pluća često
kolonizira Pseudomonas što dovodi do stalne aktivacije neutrofila i oštećenja plućnog tkiva.
Nemogućnost disanja dovodi do smrti u najvećem broju slučajeva. Nakon smrti pluća ne
kolabiraju jer su puna sekreta.
CFTR je ogroman gen i protein u kojem su moguće brojne različite mutacije što onda dovodi do
promjena u fenotipu. Najčešća je delecija F508 zbog koje nastaje nepotpuno smotani oblik CFTR
genskog produkta koji je osjetljiv na razgradnju proteazama (rapidno se degradira prije ulaska u
GA). Kao genska terapija osmišljen je tretman liposomima u obliku intranazalnog spreja. Takva
terapija međutim donosi samo privremeno olakšanje i to samo kod 20% pacijenata. Dobro je da
nema imunosne reakcije na terapiju i da je i mjesečna primjena također uzrokovala poboljšanje.

Prednosti liposoma su to što su jeftiniji od virusnih vektora, ne izazivaju imunosni odgovor te su

prikladni za dopremu DNA u pluća putem aerosola tijekom liječenja cistične fibroze.
Nedostaci su to što nisu prikladni za liječenje mnogih bolesti, potrebno je 100-1000 puta više
DNA da bi se postigla ista učinkovitost kao kod virusnih vektora jer nema mehanizma ugradnje
DNA u genom.

Virusni vektori za gensku terapiju:

Unos putem bioloških vektora obavlja se pomoću modificiranih virusa koji se ne mogu replicirati
u domaćinu. To je trenutno najučinkovitija metoda za gensku terapiju. Retrovirusi su dsRNA
virusi (npr. HIV, Moloneyev mišji virus leukemije – MoMLV, RSV – Rousov sarkomski virus) i
koriste se u terapiji SCID. Adenovirusi su dsDNA virusi, uzrokuju respiratorne, intestinalne
infekcije i infekcije oka kod ljudi, a koriste se u terapiji OTC. Adeno-pridruženi virusi su ssDNA
virusi koji se mogu ugraditi u specifično mjesto unutar kromosoma 19. Herpes simplex su
dsDNA virusi koji napadaju specifične tipove stanica, npr. neurone.

Poželjna svojstva vektora su da su prisutni u visokom titru (više od 108 čestica/mL), mogu se
proizvoditi lako i reproducibilno. Moguće je stabilno i precizno uvođenje transgena koji će se
kontrolirano eksprimirati. Nema indukcije imunosnog sustava i vektori su specifični za pojedine
vrste stanica.

Optimiranje retrovirusa za gensku terapiju odnosi se na ulazak retrovirusa u ciljnu stanicu i

ugradnju retrovirusnog genoma u kromosom. Što se tiče ulaska retrovirusa u ciljnu stanicu,
postoje dvije vrste retrovirusa. To su ekotropni koji inficiraju samo mišje stanice jer za ulaz
koriste receptore kojih nema na ljudskim stanicama te amfotropni koji inficiraju većinu stanica
sisavaca (npr. MoMLV). Amfotropni virusi prikladni su za testiranje na miševima prije testiranja
na ljudima. Oni ulaze u stanicu putem natrij-ovisnih fosfatnih transportera koji su prisutni na
svim stanicama osim na hematopoetskim matičnim stanicama.
Retrovirusi: Što se tiče ugradnje retrovirusnog genoma u kromosom, on ne može proći kroz
jezgrinu membranu ako je ona cjelovita kao kod stanica koje se ne dijele. Kod stanica koje se
dijele dolazi do kidanja jezgrine ovojnice pa virusni genom može ući u jezgru. Ovo svojstvo
koristi se u terapiji raka. Unatoč ovom ograničenju, retrovirusi najčešće su korišteni vektori, no
potrebne su modifikacije. (Npr. lentivirusi nemaju ta ograničenja, ali ipak postoji strah od
izazivanja bolesti jer se lako reaktiviraju.)
Modifikacija retrovirusa za gensku terapiju izvedena je tako da provirusni ekspresijski
konstrukt sadrži mutaciju u mjestu za pakiranje tako da proizvodi sve komponente za pakiranje,
no ne može se sam pakirati. Drugi, eksperimentalni vektor sadrži ciljni gen i mjesto za pakiranje
tako da virioni inficiraju ciljnu stanicu, virusni genom ugrađuje se u kromosom i eksprimira gen
od interesa, no ne može se replicirati jer stanica ne sadrži gene gag, pol i env (strukturni
proteini koji su potrebni za pakiranje). Kotransfekcijom nastaju svi potrebni strukturni proteini
iz provirusa, ali jedina genomska RNA koja se pakira potječe iz defektnih virusnih čestica.
Problem je što se ovi virusi mogu rekombinirati na način da nastaje virus koji može inficirati
čovjeka i uzrokovati bolest.
Moguća je i modifikacija retrovirusne ovojnice tako da nastanu virusne čestice koje imaju
specifične proteine unutar virusne ovojnice. Ti proteini mogu omogućiti infekciju što većeg
broja različitih tipova stanica pri čemu su receptori fosfolipidne komponente membrane, takav
je npr. G protein vezikularnog virusa stomatitisa, ili mogu omogućiti infekciju specifičnih tipova
stanica. To su ligandi specifični za pojedini tip stanica, npr. protein heregulin iz porodice EGF
koji se veže na HER-2 i HER-4 receptore koji su pojačano eksprimirani u stanicama raka dojke, ili
jednolančana protutijela vezana na Env protein u retrovirusnoj ovojnici.
SCID je teška kombinirana imunodeficijencija, tzv. bubble disease. Tako se zove jer oboljela
djeca moraju živjeti u mjehuru, u sterilnim uvjetima. U suprotnom se odmah inficiraju i
obolijevaju. Bolest je uzrokovana nedostatkom adenozin-deaminaze (oblik ADA-SCID) što
dovodi do nakupljanja metabolita adenozina u krvi koji ubijaju T limfocite, a time se uništava
imunitet.
X-SCID je oblik u kojem nastaje mutacija u genu za receptor IL-2, -4, -7, -9 i -15. To je teži oblik
od ADA-SCID jer nedostaju T i B limfociti i NK stanice.
Terapija je život u sterilnim uvjetima i transplantacija histokompatibilne koštane srži, no to je
dugoročno neuspješno jer T limfociti normalno umiru. Druga mogućnost je terapija zamjenom
enzima kad se daju tjedne injekcije PEG-ADA, no to je skupo i također ima samo privremeni
efekt. Dozu treba pažljivo odrediti jer višak ADA dovodi do hemolitičke anemije. Genska
terapija obuhvaća izolaciju i uzgoj T limfocita u kulturi, moraju se stimulirati na proliferaciju
pomoću IL-2 i zatim se tretiraju s MoMLV-ADA. Potreban je višestruki tretman jer T limfociti žive
6 do 12 mjeseci. Ovim načinom dobivena je djelomična ekspresija ADA, a uz to je potreban
kontinuirani tretman s PEG-ADA.
Genska terapija X-SCID uključuje izolaciju matičnih stanica koštane srži koje se inficiraju
retrovirusom i vrate natrag.
Pozitivni učinci su to da djeca koja su primila terapiju više ne moraju živjeti u sterilnim uvjetima,
imaju normalan broj T limfocita (i CD4 i CD8) te su pokazali odgovor na imunizaciju protiv
dječjih bolesti, proizvode T limfocite i protutijela te nema potrebe za periodičkim infuzijama Ig.
Negativni učinak je leukemija (klonalna proliferacija T stanica) koja se razvila kod trojice dječaka
jer se korektivni gen ugradio pored gena lmo2, a to je protoonkogen, transkripcijski faktor koji
je potreban za razvoj svih hematopoetskih linija te sudjeluje u kontroli staničnog ciklusa i može
potaknuti razvoj raka ako se eksprimira u krivo vrijeme. Gen se dakle ugradio u matične stanice,
a izabrane su one koje su se brzo dijelile što je samo po sebi potencijal za razvoj raka.
Za buduća istraživanja potrebne su mjere opreza: smanjenje broja promijenjenih matičnih
stanica koje se unose u organizam te provjera mjesta ugradnje korektivnog gena. Preporučeno
je također da se koriste bolji vektori u kombinaciji s kemoterapijom. Blaga kemoterapija prije
genske terapije omogućuje bolji napredak popravljenim stanicama, posebice kod liječenja ADA-
SCID. Kod upotrebe modificiranih retrovirusnih i lentivirusnih vektora treba eksprimirati
korektivni gen putem unutarnjeg staničnog promotora, a ne putem virusnog promotora. Ovi
postupci smanjili su učestalost leukemije u odnosu na početne pokušaje.
Strimvelis je ex vivo genska terapija za ADA-SCID odobrena za djecu bez prikladnog donora
hematopoetskih matičnih stanica. Odobrena je od EMA-e 2016. HMS izoliraju se iz pacijenta,
izdvajaju se samo one s CD34 antigenom, uzgajaju u citokinima i faktorima rasta u kulturi te se
pomoću γ-retrovirusa vraćaju u pacijenta uz kemoterapiju koja ubija postojeće HMS (busulfan ili
melfan).
Nova eksperimentalna terpija X-SCID u travnju 2019. dala je pozitivni rezlutat kliničke studije
na osmero djece (Memphis, SAD). Izmijenjeni virus HIV-a korišten je kao vektor za dopremu
gena IL2RG u matične stanice koštane srži uz prethodno kondicioniranje niskim dozama
busulfana.

Adenovirusi su virusi bez ovojnice, postoji 40 serotipova i većinom uzrokuju respiratorne

infekcije. Kao vektori najčešće se koriste virusi iz podskupine C, serotip 2 ili 5. Na svojoj površini
imaju 12 niti poput antena za prihvaćanje na površinu stanice. Inficiraju stanice u diobi i u
mirovanju te stvaraju veliki broj kopija, 1012 čestica/mL.
Problemi s adenovirusima su to što nema integracije u genom domaćina, a ekspresija gena je
prolazna jer imunosni sustav uklanja virusne čestice. Potrebna je dugotrajna i učestala
primjena, postoji povećan rizik od rekombinacije s divljim tipom virusa te je moguć upalni i
imunosni odgovor.
Moguće modifikacije adenovirusa su delecija E1A gena što onemogućuje širenje virusa,
uklanjanje većine virusnih proteina da bi se smanjila imunogeničnost virusa, uklanjanje većine
virusnih proteina koji bi mogli biti homologni s divljim tipom da bi se spriječila rekombinacija te
proizvodnja visokog titra virusa u specifičnim staničnim linijama uz čestice virusa pomagača da
bi se spriječilo pakiranje unutar organizma.
Virus se prihvaća na stanice domaćina pomoću proteina CAR (Coxsackie Adenovirus Receptor) i
internalizira se pomoću integrina. Stanice koje su meta genske terapije moraju imati jako
eksprimiran CAR. Stanice s nešto nižom ekspresijom CAR proteina su skeletni i glatki mišići
(mišićna distrofija), endotelne stanice (kardiovaskularne bolesti), epitel dišnih puteva (cistična
fibroza), hematopoetske stanice, većina stanica raka - u njih adenovirusi nisu najbolja opcija.
Dodatna otegotna okolnost je da stanice koje nisu meta genske terapije, a imaju eksprimiran
CAR također unose virus i na taj način smanjuju njegov titar pa onda i učinkovitost.
Tkivna specifičnost adenovirusa može se poboljšati npr. ekspresijom terapeutskog gena pod
kontrolom tkivno-specifičnog promotora. Iako će se dogoditi infekcija svih stanica, ciljni gen
eksprimirat će se samo u ciljnim stanicama. Sljedeća mogućnost je stimulacija ciljnih stanica na
ekspresiju prikladnih integrina koji će omogućiti ulazak virusa u stanice, npr. tretman s
inhibitorom histon-deacetilaze povećava ekspresiju αVβ3 i time povećava ekspresiju
terapeutskog gena. Osim toga, CAR je važan za međustaničnu adheziju. Prekidom adhezije CAR
postaje dostupniji virusu pa je unos virusa olakšan. Zbog tog razloga je i prijenos virusa u
oštećeno tkivo učinkovitije, npr. kod raka.
OTC je nedostatak ornitin-transkarbamoilaze, to je X-vezani metabolički poremećaj. OTC je
ključni enzim u ciklusu uree, a nedostatak dovodi do nakupljanja amonijaka u krvi. Osim što je
toksičan, amonijak uzrokuje povraćanje, nemogućnost uzimanja mesa, progresivnu letargiju i
komu. Klasično se liječi niskoproteinskom dijetom. Jedan pacijent primio je adenovirusni vektor
s OTC genom u portalnu venu, no 4 dana nakon početka primanja terapije nastupila je smrt
zbog višestrukog otkazivanja organa zbog iznimno jakog imunosnog odgovora na adenovirusni
nosač. Osim tog problema moguća je i rekombinacija s divljim tipom sličnog virusa.

Kad je riječ o istraživanjima genske terapije raka, većina ih se fokusira na imunoterapiju. Ostali
pristupi su unos tumor-supresorskog gena i suicidalna genska terapija.
Suicidalna genska terapija odnosi se na virusni vektor koji nosi gen za enzim. Taj vektor
unosimo u tumorsku stanicu gdje se enzim eksprimira. Zatim dajemo prolijek koji je supstrat
enzima. Enzim ga metabolizira i prevodi u toksični produkt koji uzrokuje smrt stanice. Dakle,
potreban je tumor-specifični promotor i gen za aktivaciju lijeka. Primjer je konverzija
ganciklovira putem timidilat kinaze (TK) iz HSV (herpes simplex) koja dovodi do smrti stanice.
Strategije gena ubojica su transkripcijska i transdukcijska strategija. Transkripcijska strategija
koristi regulatorne sljedove koji su pretjerano eksprimirani u stanicama raka, npr. ERBB2 u raku
dojke i tirozinazni promotor u melanomu i koristi ih za transkripciju i translaciju gena ubojice.
Druga je transdukcijska strategija u kojoj se vektor koji konstitutivno eksprimira gen ubojicu
dovodi u sve stanice koje se aktivno dijele. To se koristi npr. u uklanjanju glioma stanica
naspram susjednih stanica živčanog sustava koje se ne dijele.
Imlygic je lijek za melanom i radi se o genetički modificiranom virusu herpes simplex 1 koji se
injektira izravno u tumor. Umnaža se u stanicama raka dok ih ne ubije. Virus napada samo
stanice raka, ne i zdrave stanice. Također privlači stanični imunosni odgovor koji pomaže u
borbi protiv raka.
Eksperimentalna terapija CTL019 (Tisagenlecleucel) upotrebljena je na Nori Šitum oboljeloj od
ALL-a (terapija se koristi za ALL, non-Hodgkinov limfom i KLL - B limfociti su stanice raka, a
protiv njih se ne bori nitko jer T limfociti ne mogu prepoznati vlastite B limfocite kao opasne).
Kod terapije uzimaju se iz krvi pacijenta T limfociti i izmijene se genskom terapijom tako da
napadaju i uklanjaju stanie raka. Modifikacija T limfocita obavlja se pomoću izmijenjenog virusa
HIV-a s genomom za kimerni receptor koji veže CD19 antigen na stanicama raka B limfocita.
Radi se o ex vivo tipu terapije. Do 2014. tretirano je 27 pacijenata (22 djece i 5 odraslih), 24 je
ušlo u remisiju, a 18 je u remisiji ostalo. Kod 6 se bolest ponovno javila. 2017. FDA je odobrila
terapiju i to je prva odobrena CAR-T cell therapy (Chimeric Antigen Receptor).

Liječenje AIDS-a: Pacijent s AIDS-om i akutnom mijeloičnom leukemijom liječen je

transplantacijom hematopoetskih matičnih stanica, a donor je bio homozigot s CCR5-Δ32
mutacijom. Dobitkom tog gena onemogućeno je vezanje HIV-a na T limfocite. Došlo je do
povlačenja HIV-a, pacijent je prestao uzimati antiretroviralnu terapiju i postao je prva osoba
izliječena od AIDS-a - Timothy Ray Brown, 2011. („Berlinski pacijent“). 2019. došlo je izvješće o
drugom izliječenom od AIDS-a, radi se o „Londonskom pacijentu“, on je uz AIDS obolio od
Hodginovog limfoma i provedena je slična transplantacija kao i u prethodnom slučaju.
Glybera je lijek za liječenje nedostatka lipoprotein lipaze. To je prva odobrena genska terapija
u SAD-u i Europi (uniQuore). Nedostatak enzima dovodi do nemogućnosti uklanjanja
hilomikrona i teškog pankreatitisa. U terapiji se koriste adeno-pridruženi virusni vektor serotipa
1 koji sadrži zdravu kopiju gena. Za liječenje je dovoljan jednokratni intramuskularni tretman.
Ovo je najskuplji lijek na svijetu, a odobrava se pacijentima koji ne pokazuju poboljšanje uz
prilagođenu dijetu. 2017. godine unoQore nije obnovio autorizaciju lijeka jer za njega nije bilo
tržišta - (iz)liječen je samo jedan pacijent.
Luxturna je prva odobrena genska terapija in vivo i prva odobrena genska terapija za liječenje
naslijedne bolesti. Radi se o terapiji za Leberovu kongenitalnu amaurozu i rinitis pigmentozu.
Radi se o adeno-asociranom virusnom vektoru sertipa 2 (AAV2) s genom RPE65 (enzim retinoid
izomerohidrolaza). Prvi pacijent primio je terapiju 2018. Do potpunog izlječenja ne dolazi, ali se
vid znatno poboljšava.
Novija terapija za istu bolest, ali drugi oblik objavljena je u obliku kliničke studije u ožujku 2020.
To je prva studija koja uključuje uređivanje genoma unutar tijelu pacijenta pomoću sustava
CRISPR-Cas. Terapija se koristi za liječenje Leberove kongenitalne amauroze (oblik T10) koja je
posljedica defektnog gena CEP290.
Terapija za Leberovu kongenitalnu amaurozu ipak nije prva studija koja se provodila unutar
tijela pacijenta (je prva u vidu CRISPR-Cas tehnologije). Prva klinička studija koja uključuje
uređivanje genoma u tijelu pacijenta provedena je u veljači 2019. Proteinskim inženjerstvom
načinjena je umjetna restrikcijska endonukleaza - enzim ZNF. Domena koja veže DNA ima motiv
s Zn-prstima. Domena koja kida DNA iz restrikcijske endonukleaze Fok1 kida nespecifično 9 nt
nizvodno od mjesta prepoznavanja u drugom lancu DNA. Ona uvodi ds lom i povećava lokalnu
homolognu rekombinaciju. Koristi se za liječenje Hunterovog sindroma kod kojeg dolazi do
akumulacije heparan i dermatan sulfata zbog nedostatka enzima idunorat-2-sulfataze.
Zolgensma je prva genska terapija namjenjena za pedijatrijske pacijente sa spinalnom
mišićnom distrofijom koji imaju manjak gena SMN1. Radi se o jednokratnoj terapiji zamjene
gena pomoću intravenozne formulacije. Lijek je svibnju 2019. odobrila FDA i radi se o
najskupljem lijeku ikad proizvedenom (2.125.000 am. dolara).
Zynteglo je jednokratna ex vivo terapija zamjene gena namjenjena za liječenje β-talasemije kod
pacijenata starijih od 12 godina koji nemaju prikladnog donora za transplantaciju. Radi se o
izolaciji hematopoetskih matičnih stanica iz pacijanata, izdvajanju CD34+ stanica i njihovoj
modifikaciji virusnim vektorom s genom za βA-T87Q-globin te ponovnom unosu modificiranih
stanica u pacijenta.