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第十三章 DNA的复制和修复
第十三章 DNA的复制和修复
第十三章 DNA的复制和修复
生 物 体 的 遗 传 信 息 储 存 在 DNA 中 , 并 通 过 DNA 的 复 制
由 亲 代 传 给 子 代 。 在 子 代 的 生 长 发 育 中 遗 传 信 息 自 DNA
转 录 给 RNA , 然 后 翻 译 成 蛋 白 质 以 执 行 各 种 生 命 功 能 ,
使 后 代 表 现 出 与 亲 代 相 似 的 遗 传 性 状 。
1958 年 , F.Crick 提 出 中 心 法 则 :
( 1 ) 以 原 DNA 分 子 为 模 板 , 合 成 出 相 同 DNA 分 子 的 过
程 。
( 2 ) 以 某 一 段 DNA 分 子 为 模 板 , 合 成 出 与 其 序 列 对
应 的 RNA 分 子 的 过 程 。
( 3 ) 以 mRNA 为 模 板 , 根 据 三 联 密 码 规 则 , 合 成 对 应
蛋 白 质 的 过 程 。
中 心 法 则 揭 示 了 生 物 体 内 遗 传 信 息 的 传 递 方 向 。
图
DNA 生 物 合 成 有 两 种 方 式 : DNA 复 制 和 反 转 录
DNA 体 内 复 制 涉 及 : 原 核 、 真 核 生 物 的 染 色 体 、 细 菌
质 粒 ( 环 状 , 双 链 ) 、 真 核 细 胞 器 DNA ( 线 粒 体 、 叶 绿
体 ) 、 病 毒 ( 双 链 , 环 状 )
DNA 的 体 外 复 制 : 分 子 克 隆 。
1
第 1 节 DNA 的 复 制
1 、 DNA 半 保 留 复 制
测 DNA 可 能 按 照 半 保 留 机 制 进 行 自 我 复 制 。
在 复 制 过 程 中 , 首 先 亲 代 双 链 解 开 , 然 后 每 条 链 作
为 模 板 , 在 其 上 合 成 互 补 的 子 代 链 , 结 果 新 形 成 的 两
个 子 代 DNA 与 亲 代 DNA 分 子 的 碱 基 顺 序 完 全 一 样 , 而 且
每 个 子 代 DNA 分 子 中 有 一 条 链 完 全 来 自 亲 代 DNA , 另 一
条 是 新 合 成 的 。
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1958 年 , Meselson 和 Stahl 用 N 标 记 E.coli. DNA , 证 明 了 DNA 的
复 制 是 半 保 留 复 制 。
1963 年 , Cairns 用 放 射 自 显 影 法 , 在 显 微 镜 下 首 次 观 察
到 完 整 的 正 在 复 制 的 E. coli. 染 色 体 DNA 。
P323 图 19-3
3
H- 脱 氧 胸 苷 标 记 E.coli. DNA , 经 过 将 近 两 代 时 间 , 用 溶
菌 酶 消 化 细 胞 壁 , 将 E.coli. DNA 转 至 膜 上 , 干 燥 , 压 感 光
胶 片 , 3H 放 出 β 粒 子 , 还 原 银 , 在 光 学 显 微 镜 下 观 察 。
用 这 种 方 法 证 明 了 大 肠 杆 菌 染 色 体 DNA 是 一 个 环 状 分 子 ,
并 以 半 保 留 的 形 式 进 行 复 制 。
DNA 的 半 保 留 复 制 可 以 说 明 DNA 在 代 谢 上 的 稳 定 性 。
经 过 多 代 复 制 , DNA 的 多 核 苷 酸 链 仍 可 以 保 持 完 整 , 并
存 在 于 后 代 而 不 被 分 解 掉 。
2
2、 复 制 起 点、 单 位 和 方 向
DNA 的 复 制 是 在 起 始 阶 段 进 行 控 制 的 , 一 旦 复 制 起 始 ,
它 就 会 继 续 下 去 直 到 整 个 复 制 子 完 成 复 制 。
1、 复 制 起 点
复 制 起 点 是 以 一 条 链 为 模 板 起 始 DNA 合 成 的 一 段 序 列 。
有 时 , 两 条 链 的 复 制 起 点 并 不 总 是 在 同 一 点 上 ( 如 D 环
复 制 ) 。
在 一 个 完 整 的 细 胞 周 期 中 , 每 一 个 复 制 起 点 只 使 用
一 次 , 完 成 一 次 复 制 过 程 。
多 数 生 物 的 复 制 起 点 , 都 是 DNA 呼 吸 作 用 强 烈 ( 甲 醛
变 性 实 验 ) 的 区 段 , 即 经 常 开 放 的 区 段 , 富 含 A.T 。
★ 环 状 DNA 复 制 起 点 的 确 定 方 法
P325 图 19-6
★ 复 制 起 点 的 克 隆 和 功 能 分 析 — — 重 组 质 粒 转 化 法
大 肠 杆 菌 的 复 制 起 点 oriC 区 1Kb 的 重 组 质 粒 在 转 化 子 中
的 复 制 行 为 与 其 染 色 体 一 样 , 受 到 严 密 控 制 , 每 个 细
胞 只 有 1-2 个 拷 贝 , 用 核 酸 外 切 酶 缩 短 oriC 克 隆 片 段 的 大
小 , 最 后 得 到 245bp 的 基 本 功 能 区 , 携 带 它 的 质 粒 依 然 能
够 自 我 复 制 , 拷 贝 数 可 以 增 加 到 20 以 上 , 这 说 明 发 动
复 制 的 序 列 在 245bp 的 基 本 功 能 区 , 而 决 定 拷 贝 数 的 序 列
在 基 本 功 能 区 之 外 和 1Kb 之 间 。
鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 的 起 点 位 于 一 段 296bp 的 DNA 片 段 上 ,
与 大 肠 杆 菌 的 复 制 起 始 区 有 86% 同 源 性 , 而 且 有 些 亲 缘
关 系 较 远 的 细 菌 , 其 复 制 起 点 在 大 肠 杆 菌 中 亦 能 起 作
用 。 因 此 , 复 制 起 始 区 的 结 构 可 能 是 很 保 守 的 。
起 始 序 列 含 有 一 系 列 对 称 的 反 向 重 复 和 某 些 短 的 成
簇 的 保 守 序 列 。
3
2、 复 制 单 位
复 制 子 (Replicon) : Genome 能 独 立 进 行 复 制 的 单 位 , 每 个 复
制 子 都 含 有 一 个 复 制 起 点 。
原 核 生 物 的 染 色 体 和 质 粒 、 真 核 生 物 的 细 胞 器 DNA 都
是 环 状 双 链 分 子 , 它 们 都 是 单 复 制 子 , 都 在 一 个 固 定
的 起 点 开 始 复 制 , 复 制 方 向 大 多 数 是 双 向 的 , 少 数 是
单 向 复 制 。 多 数 是 对 称 复 制 , 少 数 是 不 对 称 复 制 ( 一
条 链 复 制 后 才 进 行 另 一 条 链 的 复 制 ) 。
环 状 DNA 的 复 制 眼 象 θ , 称 θ 形 复 制 。
真 核 生 物 的 染 色 体 DNA 是 线 形 双 链 分 子 , 含 有 许 多 复
制 起 点 , 因 此 是 多 复 制 子 , 每 个 复 制 子 约 有 100-200Kbp 。
病 毒 DNA 多 种 多 样 , 环 状 或 线 形 , 双 链 或 单 链 , 但 都
是 单 复 制 子 。
3、 复 制 方 向
定 点 起 始 , 复 制 方 向 大 多 数 是 双 向 的 ( 等 速 进 行 或
异 速 进 行 ) , 形 成 两 个 复 制 叉 , 少 数 是 单 向 复 制 , 形
成 一 个 复 制 叉 。
★ 用 放 射 自 显 影 实 验 判 断 DNA 的 复 制 方 向 及 速 度
低 放 射 性 3H- 脱氧胸苷
高 放 射 性 3H- 脱 氧 胸 苷
a. 单 向
b. 双向等速 三种结果图形
c. 双 向 异 速
复 制 后 , 不 再 开 始 新 的 复 制 过 程 , 而 在 25℃ 时 复 制 功 又
能 能 恢 复 。
4
4 、 DNA 的 几 种 复 制 方 式
( 1 ) 、 直 线 双 向 复 制
单 点 , 双 向 , T7
多 点 , 双 向 , 真 核 染 色 体 DNA
( 2 ) 、 θ 型 复 制 : 环 状 双 链 DNA , 单 向 或 双 向 ( E
.coli. )
( 3 ) 、 滚 环 复 制 : 环 状 单 链 DNA , Φx174
( 4 ) 、 D 环 复 制 : 线 粒 体 、 叶 绿 体 DNA
( 5 ) 、 多 复 制 叉 复 制 :
第 一 轮 复 制 尚 未 完 成 , 复 制 起 点 就 开 始 第 二 轮 的 复
制 。
在 E.coli. 富 营 养 时 , 可 采 取 多 复 制 叉 复 制 方 式 。 E.coli.
3 、 与 DNA 复 制 有 关 的 酶 及 蛋 白 质 因 子
目 前 已 发 现 30 多 种 酶 及 蛋 白 质 因 子 参 与 DNA 复 制
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( 1 ) DNA 的 聚 合 反 应 和 聚 合 酶
DNA 生 物 合 成 5 ,
→ 3 ,
, 化 学 合 成 3 ,
→ 5 ,
1 、 DNA 聚 合 反 应 必 备 的 条 件
⑴ DNA 聚 合 酶
⑵ DNA 模 板 ( 反 转 录 时 用 RNA 模 板 )
⑶ 引物 (DNA 、 RNA 或 蛋 白 质 )
⑷ 4 种 dNTP
⑸ Mg2+
2、 聚 合 反 应 过 程 及 特 点
总 反 应 式 :
n1dATP DNA pol . dAMP
在 链 的 延 长 过 程 中 , 链 的 游 离 3 ,
- 羟 基 , 对 进 入 的 脱
氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 α 磷 原 子 发 生 亲 核 攻 击 , 生 成 3 ,
.5 , -
磷 酸 二 酯 键 , 并 脱 下 焦 磷 酸 。
DNA 聚 合 酶 的 反 应 特 点 :
⑴ 以 4 种 dNTP 为 底 物
⑵ 反 应 需 要 接 受 模 板 的 指 导 , 不 能 催 化 游 离 的 dNTP 的
聚 合 。
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⑶ 反 应 需 有 引 物 3 ,
- 羟 基 存 在
⑷ 链 生 长 方 向 5 ,
→ 3 ,
⑸ 产 物 DNA 的 性 质 与 模 板 相 同
3 、 由 DNA 聚 合 酶 催 化 的 几 种 DNA 聚 合 类 型
P331 图 19-12
( 1 ) 发 荚 环 结 构 : 加 入 单 链 DNA 作 为 模 板 和 引 物 , 3
'
羟 基 端 回 折 成 引 物 链 。
( 2 ) 末 端 延 伸 聚 合 : 加 入 双 链 DNA 作 为 模 板 和 引 物 ,
3’ 末 端 突 出 作 为 模 板 。
( 3 ) 分 枝 型 和 切 口 平 移 型 聚 合 : 加 入 双 链 DNA , 聚
合 发 生 在 切 口 或 末 端 单 链 区 。
( 4 ) 环 形 聚 合 : 加 入 带 引 物 的 环 形 DNA 作 为 模 板 。
4 、 E.coli DNA 聚 合 酶
个 DNA pol.Ⅰ
催 化 活 性 :
5 ,
→ 3 ,
聚合活性
3 ,
→ 5 ,
外切活性
5 ,
→ 3 ,
外切活性
7
用 蛋 白 水 解 酶 将 DNA pol.Ⅰ 部 分 水 解 可 得 :
大 片 段 ( Klenow ) , 75Kd , 活 性 : 5 ,
→ 3 ,
聚 合 活 性 、
3 ,
→ 5 ,
外 切 活 性 。
小 片 段 , 36Kd , 活 性 : 5 ,
→ 3 ,
外 切 活 性 ( 只 作 用 于
双 链 DNA 的 碱 基 配 对 部 分 , 切 除 修 复 ) 。
Klenow 片 段 的 用 途 :
a 补 齐 DNA 3 ,
隐 缩 未 端
b. 标 记 DNA 片 段 未 端
c . cDNA 合 成 第 二 链
d . d DNA 测 序
单 体 酶 , 分 子 量 120Kd
催 化 活 性 : 5 ,
→ 3 ,
聚 合 ( 活 性 很 低 )
3 ,
→ 5 ,
外 切
可 能 在 DNA 的 修 复 中 起 某 中 作 用 。
寡 聚 酶 , 全 酶 由 10 种 共 22 个 亚 基 组 成 , α 、 ε 和 θ
三 种 亚 基 组 成 核 心 酶 。
P334 表 10-3
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DNA pol.Ⅲ 是 合 成 新 链 DNA 主 要 的 酶 , 又 称 复 制 酶 (Replicase)
Pol.Ⅲ 的 5 ,
→ 3 ,
外 切 酶 活 性 只 作 用 于 单 链 DNA 。
★DNA 聚 合 酶 有 6 个 结 合 位 点
⑴ 模 板 DNA 结 合 位 点
⑵ 引 物 结 合 位 点
⑶ 引 物 3 ,
-OH 位 点 、 反 应 位 点
⑷ 底 物 dNTP 结 合 位 点
⑸5 ,
→ 3 ,
外切位点 (pol.Ⅱ 没 有 )
⑹3 ,
→ 5 ,
外切位点 ( 校 正 )
5 、 真 核 生 物 DNA 聚 合 酶
真 核 DNA 聚 合 酶 一 般 不 具 备 外 切 活 力 , 可 能 由 另 外 的
酶 在 DNA 复 制 中 起 校 正 功 能 。
核 DNA 复 制 酶 。
⑵ DNA 聚 合 酶 β , 主 要 在 DNA 损 伤 的 修 复 中 起 作 用 。
⑶ DNA 聚 合 酶 γ , 从 线 粒 体 得 到 , 可 能 与 线 粒 体 DNA
的 复 制 有 关 。
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⑷ DNA 聚 合 酶 δ , 特 点 : 有 3 ,
→ 5 ,
外 切 活 力 。
( 2 ) 引 物 酶 或 RNA 聚 合 酶 ( 引 发 酶 )
要 用 引 物 , RNA 聚 合 酶 不 需 要 引 物 ? )
P338
⑴ 从 模 板 复 制 最 初 几 个 核 酸 时 , 碱 基 堆 集 力 和 氢 键
都 较 弱 , 易 发 生 错 配
⑵ 新 复 制 的 最 初 几 个 核 苷 酸 , 没 有 与 模 板 形 成 稳 定
双 链 , DNA 聚 合 酶 的 5 , → 3 , 校 对 功 能 难 发 挥 作 用 。
(3 ) 解 螺 旋 酶
大 肠 杆 菌 的 解 螺 旋 酶 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 与 rep 蛋 白 共 同 作 用 ,
将 DNA 两 条 链 解 开 。
解 螺 旋 酶 I 、 II 、 III 沿 着 模 板 链 的 5’→3’ 方 向 随 着 复 制 叉
的 前 进 而 移 动 , 而 rep 蛋 白 则 在 另 一 条 模 板 链 上 沿 3’→5’ 方
向 移 动 。
( 4 ) DNA 旋 转 酶
属 DNA 拓 扑 异 构 酶 Ⅱ , 可 引 入 负 超 螺 旋 , 消 除 复 制 叉
前 进 时 带 来 的 扭 曲 张 力 。
拓 扑 异 构 酶 分 两 类 : I 和 II , 广 泛 存 在 于 原 核 生 物 和
真 核 生 物 。
拓 扑 异 构 酶 I 使 DNA 的 一 条 链 发 生 断 裂 和 再 连 接 , 反
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应 无 须 供 给 能 量 , 主 要 集 中 在 活 性 转 录 区 , 与 转 录 有
关 。
拓 扑 异 构 酶 Ⅱ 使 DNA 的 两 条 链 同 时 断 裂 和 再 连 接 , 当
它 引 入 超 螺 旋 时 需 要 由 ATP 供 给 能 量 。 分 布 在 染 色 质 骨
架 蛋 白 和 核 基 质 部 , 与 复 制 有 关 。
( 5 ) 单 链 DNA 结 合 蛋 白 ( SSB )
复 制 叉 上 的 解 螺 旋 酶 , 沿 双 链 DNA 前 进 , 产 生 单 链 区 ,
大 量 的 单 链 DNA 结 合 蛋 白 与 单 链 区 结 合 , 阻 止 复 性 和 保
护 单 链 DNA 不 被 核 酸 酶 降 解 。
( 6 ) DNA 连 接 酶 ( ligase )
连 接 双 链 DNA 上 的 切 口 。
大 肠 杆 菌 连 接 酶 只 能 在 模 板 上 连 接 DNA 缺 口 。 T4DNA
ligase 即 可 连 接 粘 性 末 端 的 DNA , 又 可 连 接 平 齐 末 端 的 双
链 DNA 。
( 7 ) DNA 复 制 的 拓 扑 结 构
P338-339
4 、 DNA 的 半 不 连 续 复 制
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DNA 聚 合 酶 催 化 的 方 向 是 5 ,
→ 3 ,
。
前 导 链 :
滞 后 链 :
1968 年 , 发 现 冈 崎 片 段 。 长 度 :
细 菌 : 1Kb-2Kb , 相 当 于 一 个 顺 反 子 的 大 小 。
真 核 : 100-200bp , 约 等 于 一 个 核 小 体 DNA 的 长 度 。
5 、 DNA 复 制 过 程 ( E.coli. )
P342 图 19-17 大 肠 杆 菌 的 复 制 体 结 构 示 意 图
1、 复 制 的 起 始
引 发 : 当 DNA 的 双 螺 旋 解 开 后 , 合 成 RNA 引 物 的 过 程 。
引 发 体 : 引 物 合 成 酶 与 各 种 蛋 白 质 因 子
( dnaB 、 dnaC 、 n 、 n ' n ' ' I ) 构 成 的 复 合 体 , 负 责 RNA
引 物 的 合 成 。
引 发 体 沿 着 模 板 链 5’→3’ 方 向 移 动 ( 与 冈 崎 片 段 合 成 的
方 向 正 好 相 反 , 而 与 复 制 叉 移 动 的 方 向 相 同 ) , 移 到
一 定 位 置 上 即 可 引 发 RNA 引 物 的 合 成 。
( 近 5 ,
端 处 ) , 四 组 9 bp 重 复 序 列 ( 另 一 端 处 ) 。
大 肠 杆 菌 复 制 原 点 起 始 复 制 所 需 蛋 白 质 :
DNaA 在 原 点 处 打 开 双 螺 旋
DNaB 使 DNA 解 旋
DNaC DNaB 结 合 在 原 点 所 需
Hu 刺 激 起 始
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引 物 酶 ( DNaG) 合成 RNA 引 物
SSB 结 合 单 链 DNA
旋转酶 松驰 DNA 扭 曲 应 力
20 个 DnaA 结 合 在 四 组 9bp 重 复 区 , 形 成 起 始 复 合 物 ,
DNA 环 绕 此 复 合 物 。
三 组 13bp 重 复 区 依 次 变 性 , 产 生 开 放 型 复 合 物 。
DnaB ( 在 DnaC 协 助 下 ) 与 开 放 复 合 物 结 合 , 进 一 步 解
链 。
2 、 DNA 链 的 延 长 反 应
前 导 链 只 需 要 一 个 RNA 引 物 , 后 随 链 的 每 一 个 冈 崎 片
复 制 体 : 在 DNA 合 成 的 生 长 点 ( 既 复 制 叉 上 ) 分 布 着
许 多 与 复 制 有 关 的 酶 和 辅 助 因 子 , 它 们 在 DNA 的 模 板 链
形 成 离 散 的 复 合 物 , 彼 此 配 合 进 行 高 度 精 确 的 复 制 ,
称 为 复 制 体 。
复 制 体 沿 着 复 制 叉 方 向 前 进 就 合 成 DNA 。
3 、 RNA 引 物 的 切 除 及 缺 口 补 齐
DNA polⅠ 的 5 ,
→ 3 ,
外 切 活 力 , 切 除 RNA 引 物 。
DNApolⅠ 的 5 ,
→ 3 ,
合 成 活 性 补 齐 缺 口 。
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4 、 DNA 切 口 的 连 接
5 、 DNA 合 成 的 终 止
环 状 DNA 、 线 性 DNA , 复 制 叉 相 遇 即 终 止 。
小 结 :
⑴ DNA 解 螺 旋 酶 解 开 双 链 DNA 。
⑵ SSB 结 合 于 DNA 单 链 。
⑶ DNA 旋 转 酶 引 入 负 超 螺 旋 , 消 除 复 制 叉 前 进 时 带 来
的 扭 曲 张 力 。
⑷ DNA 引 物 酶 ( 在 引 发 体 中 ) 合 成 RNA 引 物 。
⑺ DNA ligase 连 接 一 个 冈 崎 片 段 。
有 少 量 dUTP 掺 入 DNA 链 中 , 此 时 , U- 糖 苷 酶 、 AP 内 切 酶 、
DNA polⅠ 、 DNA ligase 共 同 作 用 , 切 除 尿 嘧 啶 , 接 上 正 确 的
碱 基 。
6 、 真 核 生 物 DNA 的 复 制 P343
1、 复 制 起 点 和 单 位
真 核 生 物 染 色 体 DNA 是 多 复 制 子 , 有 多 个 复 制 起 点 ,
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可 以 多 点 起 始 , 分 段 进 行 复 制 。 每 个 复 制 子 大 多 在 100-
200bp 之 间 , 比 细 菌 染 色 体 DNA ( 单 复 制 子 ) 小 得 多 。
★ 试 验 证 据 : 5- 氟 脱 氧 胞 苷 标 记
真 核 生 物 DNA 复 制 叉 移 动 的 速 度 此 原 核 的 慢 , 如 哺 乳
动 物 复 制 叉 移 动 的 速 度 每 分 钟 1-3Kb , 细 菌 每 分 钟 5Kb 。
真 核 生 物 染 色 体 全 部 复 制 完 成 前 , 起 点 不 再 从 新 开
始 复 制 。 而 在 快 速 生 长 的 原 核 生 物 中 , 起 点 可 以 连 续
发 动 复 制 。 真 核 生 物 在 快 速 生 长 时 , 可 采 用 更 多 的 复
制 起 点 同 时 复 制 。 如 黑 腹 果 蝇 , 早 期 胚 胎 细 胞 中 相 邻
复 制 起 点 的 平 均 距 离 为 7.9kb , 而 在 培 养 的 成 体 细 胞 中 ,
平 均 距 离 为 40kb , 成 体 细 胞 只 利 用 一 部 分 复 制 起 点 。
2、 复 制 过 程 中 组 蛋 白 的 装 配
核 小 体 的 结 构 ( 200bp 左 右 )
在 真 核 生 物 的 复 制 子 上 , 亲 代 染 色 体 的 核 小 体 被 逐
个 打 开 , 组 蛋 白 以 完 整 的 八 聚 体 形 式 直 接 转 移 到 子 代
DNA 的 前 导 链 上 , 新 合 成 的 组 蛋 白 与 后 随 链 组 装 成 核 小
体 。 因 此 , DNA 的 复 制 是 半 保 留 的 , 而 组 蛋 白 则 是 全 保
留 的 。
★ 试 验 证 据 : 环 己 酮 亚 胺 抑 制 组 蛋 白 合 成 , 电 子 显
微 镜 下 观 察
3 、 真 核 生 物 DNA 复 制 的 终 止
端 粒 : 一 段 DNA 序 列 与 蛋 白 质 形 成 的 一 种 复 合 体 , 是
真 核 细 胞 染 色 体 末 端 所 特 有 的 结 构 。
功 能 :
⑴ 保 证 线 性 DNA 的 完 整 复 制
⑵ 保 护 染 色 体 末 端
⑶ 决 定 细 胞 寿 命 , 胚 系 细 胞 含 端 粒 酶 , 体 细 胞 不 表
达 端 粒 酶 。
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端 粒 ( telomeres ) 分 布 于 线 性 真 核 染 色 体 未 端 。 酵 母 端
粒 约 100bp 的 重 复 序 列 , 形 式 为 : 5 ,
( TxGy ) n3 ,
(AxCy) n , x
和 y 一 般 为 1—4 。
端 粒 末 端 的 重 复 序 列 , 通 过 端 粒 酶 ( telomerase ) 将 其 加
到 染 色 体 末 端 。
端 粒 酶 含 有 RNA 和 蛋 白 质 ( 起 DNA 聚 合 酶 的 作 用 ) 两
⑴ 杂 交
图
⑵ 聚 合
图
⑶ 转 位 再 杂 交
图
⑷ 进 一 步 聚 合
图
⑸ 非 标 准 GG 配 对
16
7 、 DNA 复 制 的 调 控
8 、 DNA 复 制 的 真 实 性
《杨 岐 生 》 P144
生 物 体 DNA 复 制 具 有 高 度 真 实 性 , 复 制 107-1011 碱 基 对 ,
只 有 一 个 错 误 碱 基 。
碱 基 对 的 自 由 能 通 常 在 4-13KJ/mol , 这 样 的 自 由 能 相 当
于 平 均 参 入 100 个 核 苷 酸 就 可 能 出 现 一 次 错 配 , 仅 靠
Watson-Crick 双 螺 旋 的 碱 基 配 对 原 则 , 突 变 率 将 高 达 10-2 。
1 、 DNA 聚 合 酶 对 碱 基 的 选 择 作 用
酶 的 被 动 论 : 不 同 的 核 苷 酸 在 聚 合 位 点 停 留 时 间 不
同 , 正 确 的 dNTP 能 长 时 间 停 留 , 而 参 与 聚 合 。 DNA 聚 合
酶 能 依 照 模 板 的 核 苷 酸 , 选 择 正 确 的 dNTP 掺 入 引 物 末 端 。
酶 积 极 参 与 理 论 : DNA 聚 合 酶 对 正 确 与 错 误 的 核 苷 酸 ,
不 仅 亲 和 性 不 同 , 而 且 将 它 们 插 入 DNA 引 物 端 的 速 度 也
不 同 。
动 力 学 校 正 阅 读 : 在 新 的 磷 酸 二 酯 键 未 形 成 时 , dNTP
结 合 在 酶 与 模 板 — 引 物 复 合 物 的 聚 合 位 点 上 , DNA 聚 合
酶 能 识 别 正 确 与 错 误 的 dNTP 。
DNA 聚 合 酶 对 底 物 的 识 别 作 用 , DNA 聚 合 酶 有 两 种 底
物 , 一 种 是 DNA 模 板 — 引 物 , 另 一 种 是 dNTP 。
DNA 聚 合 酶 先 识 别 DNA 模 板 和 引 物 的 3 ,
未 端 , 再 识 别
底 物 dNTP , 是 一 种 有 序 的 识 别 过 程 。
17
2 、 3, → 5, 外 切 活 性 的 校 正 阅 读
入 的 核 苷 酸 。
缺 失 3 ,
→5 ,
外 切 活 性 的 E. coli. DNA pol.Ⅰ , 催 化 DNA 合 成 时 ,
出 现 错 误 的 几 率 增 高 5-50 倍 。 因 此 , 3 , → 5 , 外 切 活 性 可
以 使 DNA 复 制 的 真 实 性 , 提 高 1-2 个 数 量 级 。
图
3 、 影 响 DNA 合 成 真 实 性 的 因 素
⑴ 高 浓 度 NMP( 如 3 ,
-AMP, 5 , -GMP)
NMP 竞 争 酶 的 dNTP 结 合 位 点 , 抑 制 3 ,
→ 5 ,
外 切 活 性。
⑵ 某 一 种 dNTP 浓 度 银 高 , 可 使 引 物 3 ,
末 端 离 开 外 切 活
性 中 心 。
⑶dNTP 一 般 与 二 价 阳 离 子 结 合 成 活 化 形 式 , Mg2+ 为 主
要 的 二 价 阳 离 子 。 当 用 其 它 二 价 阳 离 子 ( 如 Mn2+ ) 代 替
Mg2+ 时 , 会 改 变 酶 的 主 体 结 构 , 影 响 聚 合 活 性 和 3 , → 3 ,
外 切 活 性 。
4 、 为 什 么 用 RNA 引 物
⑴ 从 模 板 复 制 最 初 几 个 核 酸 时 , 碱 基 堆 集 力 和 氢 键
都 较 弱 , 易 发 生 错 配
⑵ 新 复 制 的 最 初 几 个 核 苷 酸 , 没 有 与 模 板 形 成 稳 定
双 链 , DNA 聚 合 酶 的 5 , → 3 , 校 对 功 能 难 发 挥 作 用 。
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第 2 节 DNA 的 损 伤 及 修 复
DNA 的 损 伤 , 《 罗 纪 盛 》 P428
一 些 物 理 化 学 因 子 如 紫 外 线 、 电 离 辐 射 和 化 学 诱 变
剂 均 可 引 起 DNA 损 伤 , 破 坏 其 结 构 与 功 能 。 然 而 在 一 定
条 件 下 , 生 物 机 体 能 使 这 种 损 伤 得 到 修 复 。
紫 外 线 可 使 DNA 分 子 中 同 一 条 链 上 两 个 相 邻 的 胸 腺 嘧
啶 碱 基 之 间 形 成 二 聚 体 ( TT ) , 两 个 T 以 共 价 键 形 成 环
丁 烷 结 构 。 CT 、 CC 间 也 可 形 成 少 量 二 聚 体
( CT 、 CC ) , 使 复 制 、 转 录 受 阻 。
P346 图 19-22
细 胞 内 具 有 一 系 列 起 修 复 作 用 的 酶 系 统 , 可 以 除 去
DNA 上 的 损 伤 , 恢 复 DNA 的 双 螺 旋 结 构 。 目 前 已 知 有 4 种
酶 修 复 系 统 : 光 复 活 、 切 除 修 复 、 重 组 修 复 、 SOS 反 应
诱 导 的 修 复 , 后 三 种 不 需 要 光 , 又 称 为 暗 修 复 。
1、 光 复 活
1949 年 已 发 现 光 复 活 现 象 , 可 见 光 ( 最 有 效 400nm ) 可
激 活 光 复 活 酶 , 此 酶 能 分 解 由 于 紫 外 线 形 成 的 嘧 啶 二
聚 体 。 高 等 哺 乳 动 物 没 有 此 酶 。
P347 图 19-23 紫 外 线 损 伤 的 光 复 活 过 程
A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶 被 可 见 光 激 活
D. 修 复 后 释 放 酶
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2、 切 除 修 复
在 一 系 列 酶 的 作 用 下 , 将 DNA 分 子 中 受 损 伤 部 分 切 除 ,
并 以 完 整 的 那 一 条 链 为 模 板 , 合 成 出 切 去 部 分 , DNA 恢
复 正 常 结 构 。
I、 结 构 缺 陷 的 修 复 :
( 1 ) 核 酸 内 切 酶 识 别 DNA 损 伤 部 位 , 在 其 附 近 将 其
切 开 。
( 2 ) 核 酸 外 切 酶 切 除 损 伤 的 DNA 。
( 3 ) DNA 聚 合 酶 修 复 。
( 4 ) DNA 连 接 酶 连 接 。
图
II 、 无 嘌 呤 无 嘧 啶 — — 碱 基 缺 陷 或 错 配 — — 脱 碱 基
( N- 糖 苷 酶 ) :
甲 基 磺 酸 甲 酯 可 使 鸟 嘌 呤 第 7 位 氮 原 子 烷 基 化 , 活 化
β— 糖 苷 键 , 造 成 脱 嘌 呤 作 用 ; 酸 也 能 使 DNA 脱 嘌 呤 。
( 1 ) AP 核 酸 内 切 酶 切 开 , 核 酸 外 切 酶 切 除 , DNA 聚
合 酶 修 复 , DNA 连 接 酶 连 接 。
( 2 ) 插 入 酶 插 入 正 确 碱 基
20
3、 重 组 修 复
P349 图 19—25 重 组 修 复 的 过 程
切 除 修 复 发 生 在 DNA 复 制 之 前 , 而 当 DNA 发 动 复 制 时
尚 未 修 复 的 损 伤 部 位 , 可 以 先 复 制 , 再 重 组 修 复 。
在 重 组 修 复 过 程 中 , DNA 链 的 损 伤 并 未 除 去 。
重 组 修 复 至 少 需 要 4 种 酶 组 分 。
重 组 基 因 recA 编 码 一 种 分 子 量 为 40000 的 蛋 白 质 , 它 具
recB 、 recC 基 因 分 别 编 码 核 酸 外 切 酶 V 的 两 个 亚 基 。
此 外 , 修 复 合 成 还 需 要 DNA 聚 合 酶 和 连 接 酶 。
4 、 诱 导 修 复 和 应 急 反 应 ( SOS 反 应 )
诱 导 修 复 是 细 胞 DNA 受 到 严 重 损 伤 或 DNA 复 制 系 统 受
到 抑 制 的 紧 急 情 况 下 , 为 求 得 生 存 而 出 现 的 一 系 列 诱
导 性 修 复 。
SOS 反 应 诱 导 的 修 复 系 统 包 括 避 免 差 错 的 修 复 ( 无 差
错 修 复 ) 和 倾 向 差 错 的 修 复 。
避 免 差 错 的 修 复 : SOS 反 应 能 诱 导 光 复 活 切 除 修 复 和
重 组 修 复 中 某 些 关 键 酶 和 蛋 白 质 的 产 生 , 从 而 加 强 光
复 活 切 除 修 复 和 重 组 修 复 的 能 力 , 这 属 于 避 免 差 错 的
修 复 。
倾 向 差 错 的 修 复 : SOS 反 应 还 能 诱 导 产 生 缺 乏 校 对 功
能 的 DNA 聚 合 酶 , 它 能 在 DNA 损 伤 部 位 进 行 复 制 而 避 免
了 死 亡 , 可 是 却 带 来 了 高 的 突 变 率 , 这 属 于 倾 向 差 错
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的 修 复 。
RecA 蛋 白 不 仅 在 同 源 重 组 中 起 重 要 作 用 , 而 且 它 也 是
SOS 反 应 的 最 初 发 动 因 子 。 在 有 单 链 DNA 和 ATP 存 在 时 ,
RecA 蛋 白 被 激 活 而
表 现 出 蛋 白 水 解 酶 的 活 力 , 它 能 分 解
λ 噬 菌 体 的 阻 遏 蛋白 和 LexA 蛋 白 。 LexA 蛋 白 ( 22Kd ) 许 多
基 因 的 阻 遏 物 , 当 它 被 RecA 的 蛋 白 水 解 酶 分 解 后 就 可 以
使 一 系 列 基 因 得 到 表 达 其 中 包 括 紫 外 线 损 伤 的 修 复 基
因 uvrA 、 uvrB 、 uvrC ( 分 别 编 码 核 酸 内 切 酶 的 亚 基 ) 以 及
recA 和 lexA 基 因 本 身 , 还 有 单 链 结 合 蛋 白 基 因 ssb , 与 λ 噬
菌 体 DNA 整 合 有 关 的 基 因 himA 、 与 诱 变 作 用 有 关 的 基 因
umuDC , 与 细 胞 分 裂 有 关 的 基 因 sulA , ruv , 和 lon , 以 及 一
些 功 能 不 清 楚 的 基 因 dinA , B , D , F 等 。
SOS 反 应 广 泛 存 在 于 原 核 生 物 和 真 核 生 物 , 它 是 生 物
在 极 为 不 利 的 环 境 中 求 得 生 存 的 一 种 基 本 功 能 。
然 而 癌 变 有 可 能 也 是 通 过 SOS 反 应 造 成 的 , 因 为 能 引
起 SOS 反 应 的 作 用 剂 通 常 都 具 有 致 癌 作 用 , 如 X- 射 线 ,
紫 外 线 , 烷 化 剂 , 黄 曲 霉 素 等 , 而 某 些 不 能 致 癌 的 诱
变 剂 并 不 引 起 SOS 反 应 , 如 5- 溴 尿 嘧 啶 。 目 前 , 有 关 致
癌 物 的 一 些 简 便 检 测 方 法 就 是 根 据 SOS 反 应 原 理 而 设 计
的 , 既 测 定 细 菌 的 SOS 反 应 。
第 3 节 RNA 指 导 的 DNA 合 成 ( 反 转 录 )
与 通 常 转 录 过 程 中 遗 传 信 息 流 从 DNA 到 RNA 的 方 向 相 反 。
病 毒 和 鼠 白 血 病 病 毒 ) 中 发 现 发 反 转 录 酶 。
致 癌 RNA 病 毒 是 一 大 类 能 引 起 鸟 类 、 哺 乳 类 等 动 物 白
血 病 、 肉 瘤 以 及 其 它 肿 瘤 的 病 毒 。 这 类 病 毒 侵 染 细 胞
后 并 不 引 起 细 胞 死 亡 , 却 可 以 使 细 胞 发 生 恶 性 转 化 。
经 过 改 造 后 可 以 作 为 基 因 治 疗 的 载 体 。
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放 线 菌 素 D ( 抑 制 以 DNA 为 模 板 的 反 应 , 复 制 和 转 录 )
能 抑 制 致 癌 RNA 病 毒 的 复 制 , 可 见 致 癌 RNA 病 毒 的 复 制
过 程 必 然 涉 及 DNA 。
Bader 用 嘌 呤 霉 素 ( puromycin ) 来 抑 制 静 止 细 胞 蛋 白 质 的
合 成 , 发 现 这 种 细 胞 仍 能 感 染 劳 氏 肉 瘤 病 毒 ( RSV ) ,
证 实 反 转 录 酶 是 由 反 转 录 病 毒 带 入 细 胞 的 , 而 不 是 感
染 后 在 宿 主 细 胞 中 新 合 成 的 。
1、 反 转 录 酶
由 一 个 α 亚 基 和 一 个 β 亚 基 组 成 , 含 有 Zn2+ , 具 有 三 种
酶 活 力 。
成 一 条 互 补 的 DNA , 形 成 RNA—DNA 杂 种 分 子 ) 。
可 沿 3’→5’ 和 5’→3’ 两 个 方 向 起 外 切 酶 作 用 。
( 3 ) DNA 指 导 的 DNA 聚 合 酶 活 力 。
模 板 : RNA 或 DNA
以 自 身 病 毒 类 型 的 RNA 为 模 板 时 , 该 酶 的 反 转 录 活 力
最 大 , 但 是 带 有 适 当 引 物 的 任 何 种 类 的 RNA 都 能 作 为 合
成 DNA 的 模 板 。
引 物 : RNA 或 DNA
底 物 : dNTP
二 价 阳 离 子 : Mg2+ 或 Mn2+
的 模 板 , 合 成 cDNA 。
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2 、 病 毒 RNA 的 反 转 录 过 程
所 有 已 知 的 致 癌 RNA 病 毒 都 含 有 反 转 录 酶 , 因 此 被 称
为 反 转 录 病 毒 ( retrovirus ) , 反 转 录 病 毒 的 复 制 需 要 经 过
一 个 DNA 中 间 体 ( 前 病 毒 ) 。
1、 反 转 录 病 毒 的 基 因 组 结 构
P353 图 19-27
( 1 ) 反 转 录 病 毒 基 因 组 通 常 由 两 条 相 同 的 ( + ) RNA
链 组 成 。 5’ 端 附 近 区 域 以 氢 键 结 合 在 一 起 , 全
长 7-10Kb 。
( 2 ) 每 一 条 RNA 链 的 两 端 具 有 相 同 的 序 列 , 形 成 正
向 重 复 序 列 。
( 3 ) 5’ 端 有 帽 子 结 构 , 3’ 端 有 polyA , 与 真 核 mRNA 相 似 。
( 4 ) 5’ 端 带 有 1 分 子 的 宿 主 tRNA , 作 为 反 转 录 时 的 引
物 。 某 些 鸟 类 反 转 录 病 毒 携 带 的 是 tRNAtrp , 鼠 类
是 tRNApro
2、 反 转 录 过 程。
当 致 癌 RNA 病 毒 侵 染 宿 主 细 胞 时 , 病 毒 RNA 及 反 转 录
酶 一 起 进 入 宿 主 细 胞 , 病 毒 自 身 带 入 的 反 转 录 酶 使 RNA
反 转 录 成 双 链 DNA 。
( 1 ) 以 病 毒 ( + ) RNA 为 模 板 , 合 成 互 补 的 ( - )
DNA 。
( 2 ) 切 除 RNA—DNA 杂 种 分 子 中 的 RNA 。
( 3 ) 以 ( - ) DNA 链 为 模 板 , 合 成 ( + ) DNA 链 , 最 后
形 成 两 端 带 有 LTR ( 长 末 端 重 复 序 列 ) 的 双 链
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DNA 。
反 转 录 病 毒 只 有 整 合 到 宿 主 染 色 体 DNA 后 才 能 被 转 录 ,
转 录 产 物 经 拼 接 可 以 产 生 不 同 的 病 毒 mRNA 。 LTR ( 长 末
端 重 复 序 列 ) 对 前 病 毒 DNA 整 合 到 宿 主 染 色 体 DNA 以 及
整 合 后 的 转 录 均 起 着 重 要 作 用 。
反 转 录 病 毒 合 成 的 过 程 :
图
缺 口 的 模 板 ( 基 因 组 ) RNA , 在 U3 旁 生 成 一 个 正 链
正 链 DNA 合 成 开 始 , 复 制 。
3、 反 转 录 病 毒 的 生 活 周 期
P354 图 19-29
( 1 ) 病 毒 粒 子 侵 染 细 胞 , 病 毒 RNA 和 反 转 录 酶 一 起
进 入 细 胞 。
( 2 ) RNA 被 反 转 录 成 双 链 DNA ( 前 病 毒 ) , 环 化 , 进
入 细 胞 核 。
( 3 ) 反 转 录 病 毒 的 DNA 整 合 到 宿 主 染 色 体 DNA 中 。
( 4 ) 前 病 毒 DNA 进 行 复 制 , 转 录 出 功 能 基 因 、 基 因
组 RNA 和 病 毒 蛋 白 。
( 5 ) 基 因 组 RNA 和 病 毒 蛋 白 在 胞 质 中 组 装 成 新 病 毒
粒 子 , 转 移 到 质 膜 , 通 过 出 芽 方 式 释 放 新 病 毒
粒 子 。
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3、 反 转 录 的 生 物 学 意 义。
1 . 反 转 录 酶 存 在 于 所 有 致 癌 RNA 病 毒 中 , 它 的 存 在
与 RNA 病 毒 引 起 细 胞 恶 性 转 化 有 关 。
2 . 艾 滋 病 毒 ( AIDS )
人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 ( HIV ) , 也 是 一 种 反 转 录 病 毒 ,
主 要 感 染 T4 淋 巴 细 胞 和 B 淋 巴 细 胞 。 病 毒 粒 子 直 径
100nm , 球 状 , 粒 子 外 包 被 两 层 脂 质 质 膜 , 膜 上 有 糖 蛋
HIV 基 因 组 由 两 条 单 链 正 链 RNA 组 成 , 每 个 链 长
9.7kb , RNA 5 ,
端 有 帽 子 结 构 , 3’ 端 有 PolyA , 链 上 结 合 有 反
3 . 乙 肝 病 毒
大 蛋 白 、 中 蛋 白 、 主 蛋 白 ( 表 面 抗 原 )
核心抗原
双 链 环 状 DNA
乙 肝 病 毒 与 反 转 录 病 毒 的 区 别 :
P355
4、 真 核 生 物 正 常 细 胞 内 也 存 在 反 转 录 过 程
真 核 生 物 的 谈 色 体 基 因 组 中 存 在 为 数 众 多 的 逆 假 基
因 和 逆 基 因 。
逆 假 基 因 : 无 启 动 子 和 内 含 子 , 但 有 polyA 的 残 基 , 推
测 是 由 mRNA 反 转 录 后 整 合 到 基 因 组 中 去 的 。
逆 基 因 : 具 有 启 动 子 和 转 录 功 能 , 无 内 含 子 。 可 能
是 由 于 mRNA 反 转 录 后 刚 好 整 合 到 启 动 子 的 下 游 处 , 或
者 是 带 启 动 子 的 RNA 序 列 反 转 录 后 整 合 到 基 因 组 中
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第 4 节 DNA 合 成 技 术
1 、 cDNA 合 成
1 、 cDNA 文 库 的 构 建
cDNA : 以 mRNA 为 模 板 , 用 反 转 录 酶 合 成 第 一 链 , 去 除
mRNA , 合 成 的 第 二 链 。
cDNA 文 库 是 获 得 真 核 结 构 基 因 的 最 好 方 法 , 成 熟 的
mRNA 无 内 含 子 。
( 1 ) 、 真 核 mRNA 的 分 离 纯 化
特 点 : 含 量 少 , 不 均 一 , 表 达 具 有 发 育 阶 段 性 和 组
织 特 异 性 。
mRNA 1~5%
分 离 、 纯 化 :
用 Oligo dT 纤 维 素 柱 ( 亲 和 层 析 法 ) , 加 入 总 RNA , 高
盐 洗 脱 , 先 流 出 非 mRNA , 降 低 盐 浓 度 , 加 入 Oligo dA 竞 争 ,
可 洗 出 mRNA 混 合 物 。
免 疫 法 可 分 离 特 定 的 mRNA 。
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( 2 ) 、 cDNA 合 成 ( 反 转 录 酶 )
A. 自 身 引 物 法 ( S1 核 酸 酶 降 解 法 )
图
Oligo(dT)15-18 个 核 苷 酸
mRNA5’ 端 序 列 有 丢 失 。
B. 取 代 合 成 法 ( 较 常 用 )
图
DNA 链 。
RNaseH 在 mRNA 上 产 生 多 个 切 口 。
C. 引 物 合 成 法
可 以 合 成 全 长 cDNA , mRNA 的 5’ 端 不 丢 失 。
( 3 ) 、 cDNA 与 载 体 连 接
( 4 ) 、 重 组 体 的 转 化
( 5 ) 、 扩 增 、 保 存
2 、 获 取 特 定 mRNA 的 cDNA
( 1 ) 免 疫 法 分 离 特 定 的 mRNA
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( 2 ) PCR 法
2 、 PCR 技 术 ( 聚 合 酶 链 式 反 应 )
聚 合 酶 催 化 下 , 在 体 外 用 核 苷 酸 大 量 合 成 目 的 基 因 或
DNA 片 段 。
它 能 快 速 、 专 一 地 扩 增 所 希 望 得 到 的 目 的 基 因 或 DNA
片 段 。
1、 反 应 物
( 1 ) 模 板
为 起 始 材 料 , 则 须 经 反 转 录 , 获 得 第 一 条 cDNA 后 才 能 用
于 PCR 。
( 2 ) Taq DNA 聚 合 酶
DNA 聚 合 酶 是 进 行 PCR 扩 增 的 关 键 , 从 水 生 栖 热 菌
保 留 50% 的 酶 活 性 , 在 74℃ 活 性 最 高 , 错 误 掺 入 核 苷 酸
的 比 率 为 1/7500 。
( 3 ) 引 物
引 物 是 决 定 PCR 结 果 的 关 键 , 它 由 寡 核 苷 酸 组 成 , 15-
30 个 b
( 4 ) 核 苷 酸 dNTP
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dNTP 的 浓 度 50-200umul/L 。
( 5 ) 镁 离 子 Mg2+
2 、 PCR 原 理
变性 95℃
复性 55℃
延伸 72℃
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