Ingeniería Genética I

TRANSFERENCIA HORIZONTAL
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

OBJETIVO
Introducción de la construcción plasmídica realizada en el hospedador para
amplificar número de moléculas

HOSPEDADOR:
Escherichia coli

Cepas modificadas
PLATAFORMA LIGADA genéticamente a partir
CON INSERTO DE de 2 aislamientos
INTERÉS
clínicos: cepas K-12 y B

AMPLIFICACIÓN
PLÁSMIDOS EN
HOSPEDADOR
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL
Gene(s) Description Functional Consequence

Características de las cepas de E. coli más dam

DNA adenine methylase mutation
Preparing unmethylated DNA, important when
trying to cut with certain restriction enzymes (ex:
(GATC)
comunes para transferencia horizontal: ClaI or XbaI)

Preparing unmethylated DNA, important when trying

DNA cytosine methylase mutation
• Que se multipliquen rápido dcm
(CCWGG)
to cut with certain restriction enzymes that
are methylation sensitive.

• Alta eficiencia de transformación dnaJ Mutation in a chaperonin gene Increases the stability of certain expressed proteins
• Que repliquen ADNs inestables endA, endA1
Endonuclease I (nonspecific cleavage of
Improves plasmid yield
•
dsDNA ) mutation
Que produzcan ADN no metilado Host does (F') or does not (F-) contain
A low copy-number plasmid, encodes proteins

•
F needed for bacterial conjugation. Genes listed on F´
Aumentar el rendimiento de plásmido the fertility plasmid.
are wild-type unless indicated otherwise

• ADN de buena calidad lac Lac operon mutations

lacIq
Blue/white screening of clones
lac repressor overproduced, expression from pLac
repressed more
LacZ β-galactosidase activity abolished
Lactose permease inactivated, lactose cannot be
lacY
taken up by cell
Mutation in a DNA-dependent ATPase
recA, recA1, Reduces plasmid recombination, increases
that is essential for recombination and
recA13 plasmid stability
general DNA repair
recBCD Exonuclease V activity abolished Increased plasmid stability, reduced recombination
Relaxed phenotype, mutation eliminating Allows RNA synthesis in absence of protein
relA or relA1
stringent factor synthesis
Ptrc-ccdA Propagation of ccdB-containing plasmids
Hte High transformation efficiency
constitutive expression of genes for
deoR Allows uptake of large plasmids
deoxyribose synthesis
hee High electroporation efficiency
rpsL Mutation in subunit S12 of 30S ribosome Confers resistance to streptomycin
https://blog.addgene.org/plasmids-101-common-lab-e-coli-strains Tn10 Confers resistance to tetracycline
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

Cepas recA (recombinasa)? LacI (represor lac)

DH5α - +
Top 10 - - Cepas de clonado
XL1 Blue - lacIq
BL21 - + Cepa de expresión, P(-)
LE 392 + + Cepa de recombinación

Tiene represor lac?

Sí No
Agregar IPTG y x-gal Agregar sólo x-gal para
para selección por α- selección por α-
complementación complementación
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

Bacterial strain Genotype proteasas

– – –
BL21-AI F omp T hsd SB (rB , mB ) gal dcm ara B::T7RNAP-tet A

BL21(DE3) F– omp T hsd SB (rB–, mB–) gal dcm (DE3) Lisógeno DE3; T7 RNA pol

BL21(DE3)pLysS F– omp T hsd SB (rB–, mB–) gal dcm (DE3) pLysS(CamR) Plásmido plysS;
Lisozima T7 RNA pol: inhibe
BL21(DE3)pLysE F– omp T hsd SB (rB–, mB–) gal dcm (DE3) pLysE(CamR) expresión basal de T7 RNA pol
BL21 Star(DE3) F– omp T hsd SB (rB–, mB–) gal dcm rne 131 (DE3) RNAsa mutada; mayor
estabilidad de mRNAs
BL21 Star(DE3)pLysS F– omp T hsd SB (rB–, mB–) gal dcm rne 131 (DE3) pLysS(CamR)

ccdB Survival 2 F– mcr A Δ(mrr -hsd RMS-mcr BC) φ80lac ZΔM15 Δlac X74 rec A1 ara Δ139 Δ(ara -
leu )7697 gal U gal K rps L(StrR) end A1 nup G fhu A::IS2
lacZ mutado. Sin subunidad
DH5α F– φ80lac ZΔM15 Δ(lac ZYA-arg F)U169 rec A1 end A1 hsd R17(rK–, mK+) pho A sup E44 λ– thi -
1 gyr A96 rel A1
Alpha
DH10B F– mcr A Δ(mrr -hsd RMS-mcr BC) φ80lac ZΔM15 Δlac X74 rec A1 end A1 ara D139 Δ(ara-
leu )7697 gal U gal K λ– rps L(StrR) nup G Deleción completa operón
DH10Bac F– mcr A Δ(mrr -hsdRMS-mcr BC) φ80lac ZΔM15 Δlac X74 rec A1 end A1 ara D139 Δ(ara - lac
leu )7697 gal U gal K λ– rps L nup G / bMON14272 / pMON7124 https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-
–
TOP10 F mcr A Δ(mrr -hsd RMS-mcr BC) φ80lac ZΔM15 Δlac X74 rec A1 ara D139 Δ(ara- science/cloning/cloning-learning-
center/invitrogen-school-of-molecular-
leu )7697 gal U gal K λ– rps L(StrR) end A1 nup G
biology/molecular-
TOP10F′ F′ [lac Iq, Tn 10(TetR)] mcr A Δ(mrr -hsd RMS-mcr BC) φ80lac ZΔM15 cloning/transformation/competent-cell-
Δlac X74 rec A1 ara D139 Δ(ara-leu )7697 gal U gal K rps L(StrR) end A1 nup G genotypes-genetic-markers.html
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

Bacterias
POR SHOCK TÉRMICO competentes
TRANSFERENCIA TRANSFORMACIÓN químicas
HORIZONTAL
POR SHOCK
ELÉCTRICO Bacterias
(ELECTROPORACIÓN) electrocompetentes

- Se compran
- Se preparan

Raspar palillo Dilución Tiempo? Hasta

estéril 1/100 DO600nm= 0,5
FRENAR
CRECIMIENTO

STOCK -80°C Cultivo 5 ml LB Cultivo 500 ml LB*

SIN ANTIBIÓTICO; SIN ANTIBIÓTICO; Fase 20 min en hielo
ON, 200 rpm, 37°C 200 rpm, 37°C exponencial

*Para electrocompetentes el LB es sin NaCl DO600nm= 0,5 = 5 x 108 bact/ml

 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

Concentrar
biomasa: 5000
rpm, 5 min

Cultivo
DO600nm=0,5 MANTENER SIEMPRE EN FRÍO

LAVADOS

Bacterias competentes X3 Bacterias

químicas, Agregar un vol, mezclar, electrocompetentes
LAVADOS CON CaCl2 centrifugar 5000 rpm, 5 LAVADOS CON GLICEROL TODO EL
100 mM min, A 4°C; descartar 10% PROCEDIMIENTO
líquido
Resuspender en Resuspender en SE REALIZA EN
FRÍO

1 ml de CaCl2 100 mM / Alícuotas de 100 ul; 1 ml de glicerol 10%

glicerol 10% guardar en -80°C
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

TRANSFORMACIÓN
POR SHOCK TÉRMICO POR SHOCK
ELÉCTRICO
(ELECTROPORACIÓN)

EXCESO DE BACTERIAS PARA INCORPORAR

UN PLÁSMIDO/BACTERIA

100 ul Ligación 100 ul Ligación

competentes electrocompetentes
químicas

25% de Ligación 10% de Ligación

Mezclar Mezclar
8-17 kV /
30´ en frío cm de
90´´ a 42°C Shock térmico Verter en cubeta
2´en hielo cubeta y 2,5 – 7,5
electroporar mseg
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

TRANSFORMACIÓN
POR SHOCK TÉRMICO POR SHOCK
ELÉCTRICO
(ELECTROPORACIÓN)

BACTERIAS DESPUÉS DEL SHOCK

900 ul LB 900 ul LB

1 hora, 1 hora,
37°C, 200 rpm 37°C, 200 rpm
Plaquear el Plaquear el
10% en LB-agar 10% en LB-agar
+ ATB + (x-gal) + ATB + (x-gal)
+ (IPTG) + (IPTG)
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN

¿Cómo saber si se preparó la inducción de la competencia correctamente?

¿Cómo saber cuán eficientemente el stock de bacterias competentes puede recibir el plásmido?

Unidad de eficiencia:
UFC/µg DNA transformado

Competentes químicas Competentes eléctricas

105-6 UFC/µg DNA 109-10 UFC/µg DNA

¿Cómo se determina?

Dil 1
Plaquear Contar entre 100-
Transformar Dil 2 200 colonias
diluciones
Alícuota de 100 con 1 ng de
µl de un lote de en distintas
plásmido* Dil 3
competentes placas
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

Tomo 100 ul (0,1 Tomo 100 ul y le Tomo 100 ul y le

ng plásmido) y le agrego 900 de LB agrego 900 de LB
900 ul LB agrego 900 de LB
1 hora,
37°C, 200 rpm 1 2 3

Bacterias 0,1 ng 0,01 ng 0,001 ng

transformadas 1 ng plásmido plásmido plásmido
plásmido
1 ng
plásmido
Plaqueo y Recuento de Colonias

10% Tubo 2 → 191 colonias

Tubo Volumen Número de Eficiencia
100% Tubo 2 → 1910 colonias
plaqueado colonias
1 10 % dil > 1000 -
0,01 ng plásmido → 1910 colonias
1000 ng (1 µg) plásmido → X = 1,9 x 108UFC/µg DNA 2 10 % dil 191 ¿?
3 10 % dil 25 -
 TRANSFERENCIA HORIZONTAL

CONTROL DE VIABILIDAD

TIENE QUE CRECER

UNA PÁTINA
PLAQUEO
Placa de LB con
SIN ab

CONTROL DE CONTAMINACIÓN

NO TIENE QUE
CRECER NADA
PLAQUEO
Distintas placas de
LB con distintos atb