BIOLOGIA MOLEKULARNA

Biotechnologia II rok I st.

Materiały do ćwiczeń

Dr Agnieszka Mierek-Adamska
Dr Agnieszka Richert

Katedra Genetyki

Toruń 2022
Plan zajęć:

Temat zajęć Termin

1. Mutacje, mutageny i naprawa DNA. Chromatografia bibułowa 11.10.2022
barwników oka D. melanogaster i test Amesa.
2. Transformacja bakterii E. coli metodą szoku cieplnego. Transformacja 18.10.2022
bakterii glebowych metodą elektroporacji.
3. Izolacja kwasów nukleinowych 1 (DNA genomowe i RNA z roślin). 25.10.2022
4. Izolacja kwasów nukleinowych 2 (DNA plazmidowe). 08.11.2022
5. Analiza kwasów nukleinowych - elektroforeza i pomiar 15.11.2022
spektrofotometryczny. Trawienie restrykcyjne DNA.
6. Mapowanie restrykcyjne. Analiza struktury genu prokariotycznego. 22.11.2022
7. Identyfikacja płci człowieka metodą PCR 29.11.2022
8. Podsumowanie. 06.12.2022
9. Kolokwium zaliczeniowe. grudzień 2022
Ćwiczenie 1

Mutanty Drosophila melanogaster - chromatografia bibułowa barwników oka

Mutageny, naprawa DNA, mutacje indukowane u bakterii – test Amesa

A. Wprowadzenie do genetyki Drosophila melanogaster

1. W butelce z hodowlą Drosophila melanogaster zaobserwuj stadia rozwojowe: jajo, larwę,

poczwarkę oraz imago.
2. Zaobserwuj charakterystyczne cechy muchy szczepu dzikiego, a następnie uzupełnij tabelkę:

Ciało
Barwa
Skrzydła
Ułożenie
Wielkość
Kształt
Oczy
Barwa
Kształt
Wielkość
Budowa

3. Zaobserwuj różnice między samicą i samcem, a następnie uzupełnij tabelkę:

Cecha Samica Samiec

Wielkość

Kształt odwłoka

Barwa odwłoka

Brzuszna strona
odwłoka
Inne

4. Narysuj odwłok samicy i samca.

Ćwiczenie 1

B. Mutanty Drosophila melanogaster

1. Pod DYGESTORIUM na watę w korku do butelki nakropić kilka kropel eteru. Przesypać muchy
dzikie i mutanty z butelek hodowlanych do pustej butelki i zamknąć korkiem z watą nasączoną
eterem.
2. Po kilku minutach wysypać muchy na szkiełka i przenieść pod lupę. Do obracania mych używać
pędzelków.
3. Dokonać obserwacji dostępnych szczepów mutantów i uzupełnić tabelę:

Gen Lokalizacja Fenotyp

C. Chromatografia bibułowa barwników oka

1. Uśpić muchy typu dzikiego oraz dostępnych mutantów (punkt B1).

2. Na bibule filtracyjnej Whatman (10 cm x 20 cm) 2 cm od dołu narysować ołówkiem linię i
zaznaczyć co 2,5 cm punkty (miejsca nanoszenia prób).
3. Po uśpieniu za pomocą igły preparacyjnej oddzielić głowy, przenieść 1 głowę na oznaczone na
bibule miejsce i tam rozgnieść ją bagietką. Po wyschnięciu plamy w tym samym miejscu
rozgnieść w ten sam sposób jeszcze dwie głowy. Na dole ołówkiem wpisać symbol szczepu.
4. Identycznie postępować przy pozostałych mutantach, pamiętając o dokładnym umyciu
bagietki po zakończeniu pracy z każdym z rodzajów much. Na chromatogramie powinny być
muchy typu dzikiego oraz 4 mutanty.
5. Bibułę pozostawić do wyschnięcia.
6. Chromatogram zostanie rozwinięty po zajęciach. Komorę chromatograficzną napełnić do
wysokości 1,5 cm mieszaniną 70% propanol i 1% amoniak. Włożyć bibułę do komory tak aby
linia startu nie była zanurzona. Rozwijanie chromatogramu jest zakończone po około 4-5
godzinach. Chromatogram wysuszyć na powietrzu.
7. Na następnych ćwiczeniach obejrzeć chromatogram w świetle UV.
8. Po obserwacji wypełnij tabelę:

Pterydyny Kolor w UV Szczep dziki

sepiapteryna żółtozielony
ksantopteryna zielononiebieski
isoksantopteryna fioletowoniebieski
drosopteryna pomarańczowy
Ćwiczenie 1

D. Test Amesa

1. Przy palniku na 8 płytek z pożywką minimalną M9 (Na2HPO4 x 12 H2O, KH2PO4, NaCl, NH4Cl,
agar, MgSO4, CaCl2, glukoza, ampicylina, biotyna, histydyna) nakropić po 0,1 ml hodowli
płynnej dwu szczepów Salmonella typhimurium (4 płytki szczep TA98, 4 płytki szczep TA100) i
rozprowadzić za pomocą sterylnej głaszczki. Płytki podpisać symbolami wysianego szczepu.

2. Płytka I – pozostawić dnem do góry. Płytka te będzie stanowiła kontrolę rewersji (tj. ile kolonii
pojawi się spontanicznie).
3. Płytka II – indukcja mutacji promieniowaniem UV:
a. na denku płytki zaznaczyć 3 równoległe linie dzielące powierzchnię płytki na 4 równe
części i podpisać powstałe pola 2, 5, 10, 20,
b. przesłaniając część płytki, naświetlać je wcześniej nagrzaną lampą UV, tak aby czas
naświetlania wynosił odpowiednio 2 s, 5 s, 10 s, 20 s.
4. Płytki III – indukcja mutacji czynnikami chemicznymi:
a. płytkę od spodu podzielić na krzyż na cztery części i zaznaczyć rodzaj użytego związku,
b. na środku każdego pola położyć sterylny krążek bibuły i nakropić na niego 2-3 µl
wybranego roztwór mutagenu.
5. Płytki IV – sprawdzenie mutagenności substancji znajdujących się w przedmiotach
codziennego użytku np. kosmetyki:
a. płytkę od spodu podzielić na krzyż na cztery części i zaznaczyć rodzaj użytego związku,
b. na krążki sterylnej bibuły nanieść próbki substancji i nałożyć na środek odpowiednio
oznaczonego pola na płytce.
6. Wszystkie płytki inkubować odwrócone do góry dnem i zawinięte w folię aluminiową przez
dwie doby w temperaturze 37°C.
7. Na następnych ćwiczeniach sprawdzić wyniki, obserwacje i wnioski zapisać w tabeli.
Ćwiczenie 1

Wzrost bakterii Wnioski

TA-98 TA-100
Płytka I – kontrola
rewersji
Płytka II - UV
Czas ekspozycji – 2s

Czas ekspozycji – 5s

Czas ekspozycji – 10s

Czas ekspozycji – 20s

Płytka III – czynniki chemiczne

Płytka IV – własne czynniki

1. Jakie cechy D. melanogaster sprawiają, że jest dobrym organizmem modelowym biologii

molekularnej?
2. Gdzie na chromatogramie zlokalizowane są ommochromy?
3. O czym świadczy różny wynik chromatogramów uzyskiwany dla poszczególnych mutantów?
4. Dlaczego w doświadczeniu używamy dwóch różnych szczepów bakterii Salmonella?
5. Wyjaśnij na czym polega rewersja mutacji.
6. O czym świadczy duża/mała liczba kolonii wokół krążka nasączonego badaną substancją? Kiedy
można powiedzieć, że badany czynnik jest mutagenny?
7. Dlaczego po wysianiu bakterie umieszczamy w ciemności?
Ćwiczenie 2

Transformacja bakterii E. coli metodą szoku cieplnego

Transformacja bakterii glebowych metodą elektroporacji

A. Transformacja bakterii E. coli metodą szoku cieplnego

Dzień przed ćwiczeniami założono hodowlę płynną komórek bakteryjnych E. coli (szczep DH5α).
Na 3 h przed ćwiczeniami pobrano 0,5 ml nocnej hodowli i zaszczepiono 50 ml pożywki LB (trypton,
ekstrakt drożdżowy, NaCl).

Przygotowanie komórek chemokompetentnych

1. Kolbę z bakteriami schłodzić na lodzie przez 5 minut, a następnie rozlać do

2 probówek typu Falcon o pojemności 50 ml. Probówki zwirować w 4°C, przy 5000
obrotów/min, przez 10 minut.
2. W trakcie wirowania przygotować:
- 50 ml 100 mM CaCl2 z roztworu wyjściowego 2 M CaCl2
- 5 ml mieszaniny 100 mM CaCl2 i 15% glicerol z roztworu wyjściowego 2 M CaCl2
i 80% glicerol.
Przygotowane roztwory/mieszaniny umieścić w lodzie.
3. Po zakończeniu wirowania bakterii (punkt 1) supernatant zlać do kolby oznaczonej symbolem
Biohazard.
4. Do powstałego po wirowaniu osadu bakterii dodać 50 ml 100 mM CaCl2 (punkt 2) i zawiesić
osad przez intensywne wytrząsanie probówki.
5. Inkubować na lodzie przez około 30 minut (co 10 minut mieszać przez odwracanie).
6. Następnie zwirować w 4°C, przy 5000 obrotów/min, przez 10 minut.
7. Supernatant zlać do kolby oznaczonej symbolem Biohazard, a do osadu dodać 5 ml mieszaniny
15% glicerolu i 100 mM CaCl2 (punkt 2) i mieszać do czasu uzyskania zawiesiny przez
odwracanie i wytrząsanie.
8. Do probówki typu Eppendorf pobrać 100 μl bakterii i inkubować w lodzie.

Transformacja metodą szoku cieplnego

1. Do 100 µl wcześniej przygotowanych komórek chemokompetentnych dodać 2 µl plazmidu

pUC19 niosącego gen oporności na ampicylinę.
2. Mieszaninę inkubować w lodzie przez 15-20 min.
3. Probówkę następnie inkubować w temperaturze 42°C przez 75 sekund, a następnie przenieść
do lodu na 2 minuty.
4. Dodać 0,5 ml pożywki SOC (trypton, ekstrakt drożdżowy, glukoza, NaCl, KCl, MgCl2, MgSO4), a
następnie inkubować 1 h w 37°C z wytrząsaniem (etap ten podnosi efektywność
transformacji).
5. Zawartość probówek wylać na płytki z pożywką LB z ampicyliną i rozprowadzić za pomocą
głaszczki. Inkubować do góry dnem w 37°C przez dobę.
6. W celu kontroli sterylności plazmidu na płytki z pożywką wysiać sam plazmid, a w celu kontroli
wrażliwości szczepu biorcy na ampicylinę na płytki wysiać 100 µl komórek kompetentnych.
Ćwiczenie 2

B. Transformacja bakterii glebowych metodą elektroporacji

Bakterie glebowe hodowano przez dwie doby w pożywce płynnej R2A (pepton, hydrolizat kazeiny,
ekstrakt drożdżowy, glukoza, K2HPO4, MgSO4, NaCl).

Przygotowanie komórek do elektroporacji

1. Kolbę z bakteriami schłodzić na lodzie przez 5 minut, a następnie rozlać do

2 probówek typu Falcon o pojemności 50 ml. Probówki zwirować w 4°C, przy 5000
obrotów/min, przez 5 minut.
2. Po zakończeniu wirowania bakterii supernatant zlać do kolby oznaczonej symbolem Biohazard.
Do powstałego po wirowaniu osadu bakterii dodać 50 ml zimnej sterylnej wody
i zawiesić osad przez wytrząsanie i odwracanie probówki.
3. Zwirować w 4°C, przy 5000 obrotów/min, przez 5 minut.
4. Po zakończeniu wirowania bakterii supernatant zlać do kolby oznaczonej symbolem Biohazard.
Do powstałego po wirowaniu osadu bakterii dodać 25 ml zimnej sterylnej wody
i zawiesić osad przez wytrząsanie i odwracanie probówki.
5. Zwirować w 4°C, przy 5000 obrotów/min, przez 5 minut.
6. Po zakończeniu wirowania bakterii supernatant zlać do kolby oznaczonej symbolem Biohazard.
Do powstałego po wirowaniu osadu bakterii dodać 25 ml zimnej sterylnej wody
i zawiesić osad przez wytrząsanie i odwracanie probówki.
7. Zwirować w 4°C, przy 5000 obrotów/min, przez 5 minut.
8. Po zakończeniu wirowania bakterii supernatant zlać do kolby oznaczonej symbolem Biohazard.
Do powstałego po wirowaniu osadu bakterii dodać 1 ml zimnej sterylnej wody
i zawiesić osad przez wytrząsanie i odwracanie probówki.
9. Do probówki typu Eppendorf pobrać 50 μl bakterii i inkubować w lodzie.

Transformacje metodą elektroporacji

1. Kuwetę do elektroporacji umieścić w komorze UV i uruchomić program Str, a następnie kuwetę

umieścić w lodzie.
2. Do 50 μl wcześniej przygotowanych bakterii dodać 1 μl plazmidu pUC19 niosącego gen
oporności na ampicylinę.
3. Mieszaninę bakterie-plazmid inkubować 3 minuty w lodzie, a następnie nałożyć na schłodzoną
kuwetę do elektroporacji.
4. Kuwetę umieścić w elektroporatorze i wykonać elektroporację nastawiając następujące
parametry procesu: 2,5 kV, 25 μF, 200 Ώ.
5. Wyjąć kuwetę z elektroporatora, dodać do kuwety 1 ml SOC i wymieszać przez pipetowanie.
Do sterylnej szklanej probówki przenieść jak najwięcej mieszaniny. Probówkę inkubować przez
3 h w 37°C z wytrząsaniem (etap konieczny).
6. Następnie wylać na płytki z pożywką R2A z ampicyliną i rozprowadzić za pomocą głaszczki.
7. Inkubować w 37°C przez dwie doby.

1. Co oznacza pojęcie stanu kompetencji?

2. W jakim celu po transformacji komórki bakteryjne inkubuje się z pożywką SOC?
3. W jakim celu pożywka, na którą wysiewa się komórki bakteryjne po transformacji zawiera
ampicylinę? Od czego zależy jaki antybiotyk zostanie użyty?
4. Wyjaśnić mechanizm szoku cieplnego oraz mechanizm elektroporacji.
5. Podać podobieństwa i różnice pomiędzy elektroporacją a szokiem cieplnym.
Ćwiczenie 3/4

Izolacja kwasów nukleinowych

A. Przygotowanie buforów do izolacji genomowego DNA i całkowitego RNA z roślin

1. Genomowe DNA
Do probówki typu Falcon (50 ml) pobrać 6 ml buforu CTAB (3% bromek
cetylotrimetyloamoniowy, 1,4 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl) i dodać pod DYGESTORIUM 12 µl
β-merkaptoetanolu (0,2%). Szczelnie zakręcić i umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 65°C
na minimum 15 minut.
2. Całkowite RNA
Do probówki typu Eppendorf pobrać 250 µl buforu LG i pod DYGESTORIUM dodać 2,5 µl
β-merkaptoetanolu. Do probówki typu Eppendorf pobrać 350 µl buforu RL i pod
DYGESTORIUM dodać 3,5 µl β-merkaptoetanolu. Pozostawić w temperaturze pokojowej.

B. Przygotowanie materiału roślinnego do izolacji genomowego DNA i całkowitego RNA

z roślin

1. Przygotować około 1,5 g tkanki roślinnej.

2. Z naczynia Dewara nalać do termosu ciekły azot (około ¾ objętości).
3. Do moździerza nalać ciekły azot i umieścić w nim tłuczek. Zaczekać aż moździerz się schłodzi
(ciekły azot przestanie gwałtownie parować). Dolać ciekły azot i umieścić w nim tkankę
roślinną.
4. Za pomocą tłuczka ucierać tkankę roślinną do uzyskania gładkiego proszku. W trakcie ucierania
dolewać ciekły azot, tak aby tkanka nie ulega rozmrożeniu.

C. Izolacja roślinnego DNA genomowego

1. Utartą tkankę przenieść sterylną i schodzoną w ciekłym azocie szpatułka do ogrzanego buforu
CTAB i wymieszać przez odwracanie i potrząsanie, do uzyskania zawiesiny.
2. Inkubować w temperaturze 65°C przez 1 h, mieszać zawiesinę przez odwracanie probówki co
około 10-15 minut.
W czasie inkubacji przejść do punktu D – izolacja całkowitego RNA z roślin.
3. Pod DYGESTORIUM dodać równa objętość (np. jeżeli w probówce jest 1 ml to należy dodać 1
ml) mieszaniny chlorofom:izoamyl (24:1) i dokładnie wytrząsnąć.
4. Zwirować w 4°C przez 15 minut, 5 000 obrotów/minutę.
5. Pod DYGESTORIUM przenieść fazę wodną (górną) do czystej probówki typu Falcon (15 ml).
Fazę dolną wylać do butelki z napisem zlewki fenol:chloroform.
6. Do fazy wodnej dodać 1/10 objętości (np. jeżeli faza wodna to 5 ml to 1/10 objętości to 0,5 ml)
3 M octan sodu pH 5,2 oraz równą objętość izopropanolu.
7. Wymieszać przez odwracanie probówki i inkubować do następnych zajęć w temperaturze
-20°C.
8. Zwirować w 4°C przez 15 minut, 5 000 obrotów/minutę.
9. Zlać supernatant (powinien być widoczny niewielki biały osad), dodać 1 ml 70% etanolu,
zwirować przez 5 minut, 5 000 obrotów/minutę.
10. Zlać supernatant, krople etanolu odciągnąć na pomocą pipety.
11. W celu osuszenia osadu pozostawić otwartą probówkę. Po około 5-10 minutach osad zawiesić
w 200 μl sterylnej wody.
12. Genomowe DNA przechowuje się w temperaturze 4°C lub -20°C. Należy unikać wielokrotnego
zamrażania/rozmrażania genomowego DNA.
Ćwiczenie 3/4

D. Izolacja całkowitego RNA roślinnego

Izolacja zostanie wykonana przy użyciu GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit zgodnie
z instrukcją producenta zestawu (EURx, Gdańsk, Polska).

1. Za pomocą sterylnej szpatułki umieścić rozdrobnioną tkankę (max. 100 mg) w schłodzonej
(otworzyć probówkę, chwycić za wieczko za pomocą pęsety i na kilka sekund zanurzyć w
ciekłym azocie, wylać azot z probówki i umieścić probówkę w statywie),
2 ml probówce typu Eppendorf wolnej od RNaz (materiał powinien być poniżej linii
oznaczającej 1 ml).
2. Pod DYGESTORIUM dodać 200 µl buforu LG z β-merkaptoetanolem oraz 100 µl buforu RL z β-
merkaptoetanolem (punkt A2) do rozdrobnionej tkanki. Dokładnie wymieszać przez
worteksowanie.
3. Wirować próbkę przez 4 min z prędkością 12 000 obrotów/minutę.
4. Pod DYGESTORIUM ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki typu Eppendorf i
dodać 200 µl buforu RL z β-merkaptoetanolem. Dokładnie wymieszać przez pipetowanie.
5. Ostrożnie przenieść supernatant do minikolumny homogenizacyjnej umieszczonej w 2 ml
probówce odbierającej. Wirować przez 2 min z maksymalną prędkością.
6. Do przesączu (roztworu który przeszedł przez złoże) dodać 0,6 objętości alkoholu etylowego
(96-100%). Wymieszać dokładnie przez pipetowanie.
7. Przenieść mieszaninę (razem z osadem jeżeli powstał) do minikolumny wiążącej umieszczonej
w probówce odbierającej. Wirować przez 1 min z prędkością 12 000 obrotów/minutę. Wylać
przesącz.
8. Dodać 400 µl buforu płuczącego Wash DN1 do minikolumny. Wirować przez 1 min z prędkością
12 000 obrotów/minutę. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i powtórnie umieścić
minikolumnę w probówce.
9. Dodać 600 µl buforu płuczącego Wash RBW do minikolumny. Wirować przez 1 min z
prędkością 12 000 obrotów/minutę. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i powtórnie umieścić
minikolumnę w probówce.
10. Dodać 300 µl buforu płuczącego Wash RBW do minikolumny. Wirować przez 2 min z
prędkością 12 000 obrotów/minutę.
11. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz, umieścić minikolumnę w probówce i ponownie wirować
przez 1 min.
12. Minikolumnę umieścić w nowej probówce typu Eppendorf 1.5-2 ml. Dodać 40-60 µl wody
RNase-free centralnie na membranę.
13. Wirować przez 1 min z prędkością 12 000 obrotów/minutę.
14. RNA przechowuje się w temperaturze -80°C.

E. Izolacja DNA plazmidowego metodą lizy alkalicznej

1. W probówce typu Eppendorf przygotować 250 µl roztworu II (0,2 M NaOH, 1% SDS). Stężenia
początkowe: 5 M NaOH, 20% SDS. Mieszanie roztworu rozpocząć od pobrania wody, do której
następnie dodać NaOH i SDS.
2. Do probówki typu Eppendorf pobrać 1,5 ml hodowli płynnej założonej na dzień przed zajęciami
z pojedynczej kolonii bakteryjnej i zwirować przez 1 minutę, 13 000 obrotów/minutę. Zlać
supernatant.
3. Powtórzyć etap 2.
4. Do osadu bakterii dodać 100 μl zimnego roztworu I (50 mM glukoza, 25 mM Tris-HCl, 10 mM
EDTA) i wymieszać przez pipetowanie (osad powinien zostać zawieszony).
5. Dodać 200 μl roztworu II, bardzo delikatnie wymieszać przez odwracanie (nie potrząsać
probówką) i inkubować w lodzie przez 1 minutę.
Ćwiczenie 3/4

6. Dodać 150 μl zimnego roztworu III (octan potasu, kwas octowy), delikatnie wymieszać przez
odwracanie (nie potrząsać probówką) i inkubować w lodzie 5 minut.
7. Zwirować przez 5 minut, 13 000 obrotów/minutę.
8. Za pomocą pipety zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki typu Eppendorf.
9. Dodać 1 μl RNazyA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
W czasie inkubacji przejść do punku C8.
10. Pod DYGESTORIUM dodać równą objętość mieszaniny fenol:chloroform:izoamyl (25:24:1),
dokładnie zamknąć probówkę i mocno wytrząsnąć.
11. Zwirować przez 2 minuty, 13 000 obrotów/minutę.
12. Pod DYGESTORIUM przenieść fazę wodną (górną) do świeżej probówki Eppendorf. Fazę dolną
wylać do butelki z napisem zlewki fenol:chloroform.
13. Dodać 1 ml zimnego 96% etanolu, inkubować 5 minut w temperaturze -20°C.
14. Zwirować przez 5 minut, 13 000 obrotów/minutę.
15. Zlać supernatant (powinien być widoczny niewielki biały osad), dodać 1 ml 70% etanolu,
zwirować przez 3 minuty, 13 000 obrotów/minutę.
16. Zlać supernatant, krople etanolu odciągnąć na pomocą pipety.
17. W celu osuszenia osadu pozostawić otwartą probówkę. Po około 5-10 minutach osad zawiesić
w 20 μl sterylnej wody.
18. DNA plazmidowe przechowuje się w temperaturze -20°C.

1. Jak przygotować następujące mieszaniny:

a) objętość końcowa 300 µl, związek A stężenie początkowe - 3 M, stężenie końcowe – 0,15 M;
związek B stężenie początkowe – 1 mM, stężenie końcowe – 25 µM.
b) objętość końcowa 1 l, związek A stężenie początkowe - 2 M, stężenie końcowe – 1 M; związek B
stężenie początkowe – 10 mM, stężenie końcowe – 560 µM; związek C stężenie początkowe - 500
mM, stężenie końcowe – 5 mM.
c) objętość końcowa 150 ml, związek A stężenie początkowe – 0,15 M, stężenie końcowe – 25 mM;
związek B stężenie początkowe – 50%, stężenie końcowe – 5%; związek C stężenie początkowe - 50
mM, stężenie końcowe – 5 mM; związek D stężenie początkowe - 300 µM, stężenie końcowe – 4 µM.
2. Określi funkcje związków i mieszanin używanych w czasie izolacji DNA (związki i mieszaniny zostały
podkreślone w tekście instrukcji).
3. Wyjaśnij jak w czasie lizy alkalicznej zachodzi oddzielenie DNA plazmidowego od DNA
genomowego?
4. Wyjaśnij jak w czasie izolacji DNA genomowego z roślin dochodzi do oddzielenia polisacharydów
od DNA?
5. Jak w czasie izolacji oddzielić DNA od białek?
6. W czasie izolacji omyłkowo zawieszono osad DNA w 500 µl wody zamiast w 50 µl. Jak można
naprawić tę pomyłkę?
7. Dlaczego w czasie ucierania tkanki roślinnej nie wolno pozwolić na rozmrożenie się materiału?
8. Dlaczego izolacja RNA jest trudniejsza niż izolacja DNA?
9. Wyjaśnij mechanizm działania złóż krzemionkowych.
Ćwiczenie 5

Analiza kwasów nukleinowych - elektroforeza i pomiar spektrofotometryczny

Trawienie restrykcyjne DNA

A. Trawienie restrykcyjne DNA

Trawienie DNA plazmidowego

1. Przeanalizować mapę restrykcyjną plazmidu pJET1.2 i wybrać enzym, który pozwoli na
przecięcie plazmidu w dwóch miejscach.
2. Po wybraniu enzymu w katalogu sprawdzić w jakim buforze wydajność działania tego enzymu
jest najwyższa.
3. Zaplanować reakcję trawienia restrykcyjnego:
Składnik Stężenie początkowe Stężenie końcowe Objętość
DNA z pomiaru w punkcie B 200 ng
bufor 10x 1x
enzym restrykcyjny 5 U/µl 1U
H2O - -
20 µl

4. Zmieszać wszystkie składniki mieszaniny w probówce typu Eppendorf i inkubować przez 90

minut w temperaturze 37ºC.

Trawienie roślinnego DNA genomowego (przygotowane przed ćwiczeniami)

1. Przygotowano następującą mieszaninę reakcyjną:

Składnik Stężenie końcowe Objętość
DNA 200 ng 8 µl
Bufor Yellow Tango 2x 6 µl
EcoRI 1U 1 µl
H2O - 15 µl
30 µl

2. Inkubowano przez noc (około 16 h) w temperaturze 37ºC.

B. Elektroforeza kwasów nukleinowych

Przygotowanie żelu agarozowego

1. Odważyć 1 g agarozy.
2. Do cylindra o pojemności 100 ml dodać 2ml 50x stężonego TAE (Tris-kwas octowy, EDTA) i
uzupełnić wodą destylowaną do 100 ml (stężenie końcowe TAE 1x).
3. Agarozę i TAE rozgrzać w kolbie w kuchence mikrofalowej (około 2-3 minuty), aby uzyskać
klarowny roztwór.
4. Rozgrzany roztwór schłodzić pod bieżącą wodą.
5. Dodać 3 μl bromku etydyny. Bromek etydyny jest substancją mutagenną – do jego dodania
używamy oznakowanej pipety, a końcówkę wyrzucamy do pojemnika opisanego odpady z
bromkiem etydyny. Zamieszać przez delikatne poruszanie kolbą.
6. Saneczki elektroforetyczne umieścić w podstawce z silikonowymi uszczelkami i zacisnąć zacisk.
Włożyć grzebień.
7. Wylać żel do saneczek i zaczekać aż stężeje.
Ćwiczenie 5

Przygotować próby do nałożenia na żel

1. Do probówki typu Eppendorf pobrać 2 μl DNA plazmidowego wyizolowanego na poprzednich
zajęciach dodać 2 μl barwnika do elektroforezy i 6 μl wody.
2. Do probówki typu Eppendorf pobrać 2 μl DNA genomowego wyizolowanego na poprzednich
zajęciach dodać 2 μl barwnika do elektroforezy i 6 μl wody.
3. Do mieszaniny reakcyjnej (punkt A) dodać 2 µl barwnika do elektroforezy.
4. Przygotować marker wielkości DNA – do probówki typu Eppendorf pobrać 3 µl markera i 7 µl
wody.

Wykonanie elektroforezy
1. Aparat do elektroforezy wypełnić buforem 1x TAE i umieścić w nim żel. Wyjąć grzebień i
sprawdzić czy powierzchnia żelu jest pokryta buforem.
2. Do kieszonek żelu nałożyć próby.
3. Podłączyć aparat do zasilacza podłączając elektrodę dodatnią na tym biegunie aparatu, w
kierunku którego podążać mają cząsteczki DNA. Nastawić napięcie na około 80-100 V.
4. Elektroforezę prowadzić przez około 30 minut.
5. Po tym czasie odłączyć zasilacz, żel przenieść do systemu do dokumentacji żelu.
6. Dobierać odpowiednie warunki (czas ekspozycji na promienie UV, natężenie tła) wykonać
zdjęcie żelu.
7. Żel wyrzucić do pojemnika opisanego odpady z bromkiem etydyny.

C. Pomiar spektrofotometryczny kwasów nukleinowych

1. Uruchomić urządzenie NanoDrop i wybrać rodzaj mierzonego kwasu nukleinowego (RNA,
dsDNA – dwuniciowe DNA, ssDNA – jednoniciowe DNA).
2. Na cokół aparatu nanieść 2 µl wody (tej samej, która była użyta na poprzednich zajęciach do
zawieszenia DNA), opuścić delikatnie ramię i wybrać BLANK. Usunąć wodę z cokołu za pomocą
bezpyłowej chusteczki. Powtórzyć.
3. Na cokół nanieść 2 µl mierzonej próby, opuścić delikatnie ramię i wybrać SAMPLE. Odczytać
stężenie oraz stosunek A260/A280. Usunąć próbę za pomocą bezpyłowej chusteczki i powtórzyć
z kolejną próbą.
4. Po zakończeniu pracy nałożyć na cokół 5 µl wody, opuścić delikatnie ramię i odczekać 3 minuty.
Po tym czasie usunąć wodę za pomocą bezpyłowej chusteczki i wyłączyć aparat.

1. Wyjaśnij zasadę działania elektroforezy.

2. Wyjaśnij mechanizm pomiaru spektrofotometrycznego.
3. Jakich informacji na temat preparatu DNA dostarcza pomiar spektrofotometryczny.
4. Opisz mechanizm działania enzymów restrykcyjnych. Jaka cecha działania enzymów
restrykcyjnych sprawia, że są szczególnie przydatne w biologii molekularnej?
5. Jaka jest rola buforu w mieszaninie reakcyjnej?
6. Na podstawie podanych wyników pomiaru spektrofotometrycznego DNA określ jakość
uzyskanego preparatu DNA:
a) stężenie 201 ng/µl, A260/A280 1,81, A260/A280 1,99
b) stężenie 11 ng/µl, A260/A280 1,81, A260/A280 1,54
c) stężenie 65 ng/µl, A260/A280 1,63, A260/A280 1,99
7. Na podstawie poniższych zdjęć rozdziału elektroforetycznego określ jakość analizowanego kwasu
nukleinowego.
Ćwiczenie 5
Ćwiczenie 6

Mapowanie restrykcyjne
Analiza struktury genu prokariotycznego

A. Mapowanie restrykcyjne

1. Do wektora o wielkości 3 kpz wklonowano na EcoRI wstawkę o wielkości 4 kpz. Na podstawie

podanych trawień ustal mapę restrykcyjną wstawki (wiesz, że podane enzymy restrykcyjne nie tną w
obrębie wektora).

EcoRI – 3 kpz, 4 kpz

XhoI/EcoRI – 3 kpz, 0,8 kpz, 3,2 kpz
HindIII/EcoRI – 3 kpz, 1,2 kpz, 2,8 kpz
SalI/EcoRI – 3 kpz, 0,1 kpz, 3,9 kpz
SalI/XhoI – 0,7 kpz, 6,3 kpz
XhoI/HindIII – 2 kpz, 5 kpz
SalI/HindIII – 2,7 kpz, 4,3 kpz

2. W wektor o wielkości 3,2 kpz wklonowano wstawkę 4,3 kpz na enzymy EcoRI i HindIII. Na podstawie
podanych trawień ustal mapę restrykcyjną wstawki (wiesz, że podane enzymy restrykcyjne nie tną w
obrębie wektora).

EcoRI – 2 kpz, 1,5 kpz, 4 kpz

HindIII – 3,8 kpz, 3,7 kpz
SalI – 7,5 kpz
EcoRI/SalI – 1,5 kpz, 1,7 kpz, 0,3 kpz, 4 kpz
HindIII/SalI – 2,6 kpz, 1,1 kpz, 3,8 kpz.

3. Do wektora o wielkości 3 kpz wklonowano na PstI i SalI wstawkę o wielkości 4,2 kpz. Wektor ma
jedno miejsce cięcia na EcoRI (wiadomo, że od SalI, na który wklonowano wstawkę do EcoRI – 1 kpz).
Na podstawie podanych trawień ustal mapę restrykcyjną wstawki (wiesz, że podane enzymy
restrykcyjne nie tną w obrębie wektora).

EcoRI – 2,7 kpz, 2,5 kpz, 2,0 kpz

BamHI – 7,2 kpz
EcoRI/BamHI – 2,7 kpz, 2,0 kpz, 2,1 kpz, 0,4 kpz
EcoRI/SalI – 2,7 kpz, 2,0 kpz, 1,5 kpz, 1,0 kpz
EcoRI/PstI – 2,5 kpz, 2,0 kpz, 2,0 kpz, 0,7 kpz

4. Pokazany plazmid o wielkości 5,2 kpz przecięto HindIII i HincII i zligowano wstawkę
o wielkości 3,0 kpz.
Ćwiczenie 6

Na podstawie podanych trawień ustal mapę restrykcyjną wstawki

PstI – 6,1 kpz, 2,1 kpz

HincII/HindIII – 5,2 kpz, 3,0 kpz
XhoI – 4,7 kpz, 2,3 kpz, 1,2 kpz
TaqI/XhoI – 4,5 kpz, 2,3 kpz, 1,2 kpz, 0,2 kpz
PstI/TaqI – 5,7 kpz, 2,1 kpz, 0,4 kpz

5. W celu sporządzenia mapy restrykcyjnej wstawki o wielkości 3,6 kpz, którą wklonowano
w wektor o wielkości 2,7 kpz na EcoRI, plazmid poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Następnie trawione DNA wraz z markerem wielkości λ/BstEII poddano elektroforezie, po czym żel
sfotografowano w świetle UV. Na podstawie zdjęcie wyżej opisanego żelu sporządź mapę restrykcyjną
wstawki.

a) sporządź krzywą kalibracyjną umieszczając na papierze półlogarytmicznym na osi X odległość

poszczególnych fragmentów λ/BstEII od startu, a no osi Y ich długość w kpz

1 8454
2 7242
3 6369
4 5686
5 4822
6 4324
7 3675
8 2323
9 1929
10 1371
11 1264
12 702
13 224

b) wyznacz z krzywej kalibracyjnej długość fragmentów restrykcyjnych analizowanego plazmidu

c) ułóż mapę restrykcyjną analizowanego plazmidu.
Ćwiczenie 6

B. Analiza struktury genu prokariotycznego

Poniżej przedstawiono sekwencję fragmentu DNA bakterii zawierającego gen kodujący białko o
długości około 20 aminokwasów. Po analizie sekwencji należy:

1. zapisać sekwencję komplementarną i zaznaczyć jej orientację

2. odszukać sekwencję promotora i terminatora transkrypcji
3. zapisać sekwencję mRNA i zaznaczyć jej orientację
4. odszukać w sekwencji mRNA sekwencje inicjacji i terminacji translacji, zaznaczyć ich położenie
w genie (sekwencja DNA) i transkrypcie (sekwencja mRNA)
5. na podstawie załączonego kodu genetycznego zapisać sekwencję białka kodowanego przez
analizowany gen

5’ AGCAATATTG ACAAGCTCAG CACTGGCTAT AATCGTTCAC CCTAAGGAGA CAGCTATGAC

CATGATTCAC TGGCCGTCGT TTCACCTTTG TAGTGCCTTA AAATGGGTTG ATTATTGTCA

AACTTAGTGA ATGAGTATCG CTATATCTCA AGCGCCGACC GCGGCGCTTT TATTTATTTC ATTGC 3’

Ćwiczenie 7

Identyfikacja płci człowieka metodą PCR (łańcuchowa reakcja polimeryzacji)

A. Planowanie reakcji PCR

1. Uzupełnić poniższą tabelę:

Składnik Stężenie początkowe Stężenie końcowe Objętość
DNA 10 ng/ µl 50 ng
bufor 10x 1x
MgCl2 25 mM 1,5 mM
dNTP 10 mM 200 µM
starter 1 10 µM 0,2 µM
starter 2 10 µM 0,2 µM
polimeraza DNA Taq 5 U/µl 1U
H2O - -
20 µl

2. Na podstawie poniższych informacji zaplanować przebieg reakcji PCR.

Reakcja PCR składa się z 20-40 cykli, a każdy z nich to 3 etapy: denaturacja DNA, przyłączanie starterów,
wydłużanie. Ponadto właściwe cykle reakcji poprzedza denaturacja wstępna, która jest szczególnie
istotna kiedy matrycą są duże cząsteczki DNA np. DNA genomowe. Na końcu przeprowadza się również
wydłużenie końcowe, które ma pozwolić polimerazie DNA na dokończenie syntezy brakujących
fragmentów DNA. Do denaturacji stosuje się zwykle temperaturę 94-96ºC, czas trwania wstępnej
denaturacji zależy od rodzaju matrycy tj. im dłuższe fragmenty DNA tym ten czas będzie dłuższy np.
DNA genomowe wstępna denaturacja 1-3 minuty, denaturacja w każdym cyklu 30-60 s. Temperatura
przyłączania starterów zależy od temperatury topnienia (Tm) określonej dla każdego startera i powinna
być około 5ºC niższa niż Tm. Dla starterów stosowanych w tym doświadczeniu Tm wynosi odpowiednio
58ºC dla startera 1 i 59ºC dla startera 2. Czas przyłączania starterów zależy od złożoności matrycy tj.
dla złożonych matryc (np. DNA genomowe) jest dłuższy niż dla matryc prostych (np. DNA plazmidowe).
Typowo zawiera się pomiędzy 30 s dla matryc prostych do 60 s dla matryc złożonych. Temperatura w
jakiej należy przeprowadzać elongację jest określona przez producenta polimerazy DNA i jest
temperaturą, w której enzym działa z najwyższą wydajnością. Dla większości polimeraz DNA (w tym dla
polimerazy stosowanej na tych zajęciach) jest to 72ºC. Czas trwania elongacji zależy od szybkości
działania polimerazy DNA. W przypadku polimerazy stosowanej na tych zajęciach jest to 1000
nt/minutę, a oczekiwana wielość produktu reakcji to 800-1000 pz.

Etap Temperatura Czas Liczba powtórzeń

denaturacja wstępna
denaturacja
przyłączanie starterów
elongacja
elongacja końcowa

B. Wykonanie reakcji PCR i analiza produktów reakcji

1. Do probówki typu Eppendorf o pojemności 0,2 ml dodać wszystkie składniki reakcji zaczynając
od składników o największej objętości, polimerazę DNA dodać na końcu.
2. Wymieszać przez pipetowanie i krótko zwirować.
3. Probówkę umieścić w termocyklerze i wpisać program.
Ćwiczenie 7

4. Po zakończeniu reakcji do prób dodać barwnika do elektroforezy

i przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 80-100 V przez 30-45 minut.

C. Analiza przebiegu reakcji PCR oraz produktów reakcji PCR

1. Narysować schemat obrazujący przebieg 3 pierwszych etapów reakcji PCR.

2. Na poniższym schemacie zaznaczyć miejsce przyłączania starterów, ich orientację oraz
kierunek wydłużania przez polimerazę DNA.

3. Zakładając, że w probówce są dwie cząsteczki DNA będące matrycą do reakcji PCR ile kopii
produktu reakcji PCR powstanie po 32 cyklach reakcji?
4. Na podstawie analizy poniższego zdjęcia rozdziału elektroforetycznego określić jaka jest
wielkość otrzymanych produktów reakcji PCR.

1. Czy przeprowadzone doświadczenie pozwala odróżnić płeć badanych osób? Jakie produkty
pojawią się kiedy jako matrycy użyjemy DNA kobiety, a jakie kiedy DNA mężczyzny?
2. Wyjaśnij znaczenie poszczególnych składników mieszaniny reakcyjnej w przebiegu reakcji.
3. Objaśnij znaczenie poszczególnych etapów reakcji PCR.
4. Jakie cechy musi wykazywać polimeraza używana do reakcji PCR?
5. Czy możemy użyć RNA jako matrycy do reakcji PCR? Uzasadnij.