Anastasiia Ilvytska, 313823

RAPORT
OZNACZANIE GLUKOZY METODĄ ENZYMATYCZNĄ
1. Porównanie właściwości spektralnych nukleotydów pirydynowych (NAD+ i NADH+H+)
Odczynniki:
- 0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0 i pH 6,5
- 0,2 mM NAD+ w 0,05 M buforze fosforanowym o pH 6,5
- 0,2 mM NADH+H+ w 0,05 M buforze fosforanowym o pH 9,0
Stosujemy pod czas obliczenia bufor fosforanowy o pH 6,5 jako próbę odniesienia dla NAD+ i
bufor fosforanowy o pH 9,0 dla NADH+H+.
NADP: Tylko jedno maksimum absorbancji, przy długości fali λ=260nm.

NADPH+ H+: Dwa maksima absorbancji, przy długości fali λ=260nm oraz λ=340nm.
2.Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi wołowej
Odczynniki:
- 50 mM bufor Tris-HCl, pH 7,6 zawierający 4 mM MgCl2
- 20 mM ATP w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 7,6 zawierającym 4 mM MgCl2
- 4 mM NADP+ w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 7,6 zawierającym 4 mM MgCl2
- 1 mM roztwory glukozy, fruktozy i galaktozy przygotowane w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 7,6,
zawierającym 4 mM MgCl2
- preparat zawierający oczyszczoną heksokinazę i oczyszczoną dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu
o aktywności około 1 U każda w 100 µl 50 mM buforu Tris-HCl, pH 7,6, zawierającego 4 mM
MgCl2
W analizie stężenia glukozy wykorzystowujemy wlaściwości reakcji 1 szlaku
heksozomonofosforanowego (oczyszczoną heksokinazę katalizującą reakcję 1 glikolizy i
oczyszczoną dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu):
ATP + glukoza  ADP + glukozo-6-fosforan glukozo-6-fosforan + NADP+  6-
fosfoglukonolakton + NADPH+H+
gdzie NADP+ ulega redukcji do NADPH+H+ .
 Stężenie
Numer próby Stężenie fruktozy Stężenie galaktozy A [340nm]
glukozy
1 0 0 0 0
2 20 0 0 0,098
3 40 0 0 0,208
4 0 40 0 0,018
5 0 0 40 0,003
6 FBS 0
7 FBS 0,12
Wyniki pomiaru spektrofotometrycznego

Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi wołowej (obliczenia).

1M roztwór NADH+H+ wykazuje przy 340 nm absorbancję 6220, więc:
1mol/1000 ml - 6220
1mmmol/1ml - 6220
1 μmol/1ml - 6,220
1 nmol/1ml - 0,00622
X nmoli – 0,101
X= 16,23 nmoli/ml surowicy

16,23 nmoli/ml * 5 * 100= 81150 nmoli/100ml

Masa glukozy= 180,16 g/mol
1 mol – 180,16 g

81150 nmola – x ng
Y= 0,014 g/100ml
Cp= 0,014 %