HÜCRENİN MİKROSKOPİK VE MOLEKÜLER

DÜZEYDE İNCELENMESİ

Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı

Dr. Öğretim Üyesi

Ferah CÖMERT ÖNDER
Giriş
Robert Hooke ilk defa 1665 yılında İngiltere'de ağaç kabuklarındaki
mantar dokudan aldıkları kesitlerin boş kutucuklarını hücre olarak
tanımlamıştır.

1831 Yılında İngiliz botanist Robert Brown hücre çekirdeğini keşfetmiştir.

1932 Yılında Frits Xernike faz kontrast mikroskobu

1938 Yılında Ernst Ruska elektron mikroskobu

Hücre ve organelleri; ışık mikroskobunun geliştirilmesi ve elektron mikroskobunun (1950-1956) yardımı ile
incelenmiştir.

İnsan gözü 0.1 mm’den daha küçük cisimleri göremez.

Ortalama 10-20 mikron büyüklüğünde olan hücreler mikroskop ile incelenebilir.

2
Giriş

▪ Mantarın hücresel yapısı Robert

Hooke'un ışık mikroskobunda
incelenen ince bir mantar dilimi
çizimi

▪ Hooke'un gözlemlediği
"hücreler" aslında uzun zaman
önce ölmüş hücrelerden kalan
hücre duvarları
Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition
2019 Oxford University Press 3
Giriş

• Anton van Leeuwenhoek 1670'lerde nesneleri gerçek boyutlarının

yaklaşık 300 katına kadar büyüten bir mikroskop kullanarak, sperm,
kırmızı kan hücreleri ve bakteriler dahil olmak üzere çeşitli hücre türlerini
gözlemleyebilmiştir.

• Schleiden bitki dokuları ve Schwann tarafından hayvan dokuları

üzerinde yapılan mikroskobik çalışmalar aynı sonuca yol açmıştır

Tüm organizmalar hücrelerden oluşur. Kısa bir süre sonra, hücrelerin de

novo oluşmadığı, yalnızca önceden var olan hücrelerin bölünmesinden
kaynaklandığı anlaşılmıştır.

4
 Objektif
lens

▪ Hücreleri ve hücre alt

Örnek
yapılarını görüntüler ve
Lam
özel moleküllerin hücre
içindeki yerleşimini belirler.
Tabla

Mercek ▪ Çoğu hücrenin çapı 1-100

µm arasında olduğundan
ve çekirdek, kloroplast ve
mitokondri gibi daha büyük
hücre altı organellerin
bazıları ışık mikroskobu ile
Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition 2019 Oxford University Press
gözlemlenebilir.

5
Işık mikroskobu

• Hücre yapısının çeşitli yönlerini incelemek için birkaç farklı ışık

mikroskobu türü kullanılır.

• Bunlardan biri ışığın doğrudan hücre içinden geçtiği ve hücrenin farklı

kısımlarını ayırt etme yeteneğinin hücre bileşenleri tarafından görünür
ışığın soğurulmasından kaynaklanan kontrasta bağlı olduğu parlak alan
mikroskobudur.

6
Işık mikroskobu

• Çoğu durumda hücreler, hücrenin farklı

bölümleri arasındaki kontrastı arttırmak
için proteinler veya nükleik asitlerle
reaksiyona giren boyalarla boyanır.

• Boyama olmadan ışığın doğrudan geçişi

hücrenin birçok bölümünü ayırt etmek için
yeterli kontrast sağlamaz. Bu da parlak
alan mikroskobunun kullanışlılığını
sınırlar.
Lekeli doku bölümünün parlak alan mikrografı.
İyi huylu bir böbrek tümörü.
Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition
2019 Oxford University Press

7
• Canlı hücreleri görselleştirmek için en yaygın kullanılan faz
kontrast ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu.

• Her iki tür mikroskopta hücrenin farklı kısımları arasındaki

yoğunluk veya kalınlıktaki değişiklikleri son görüntüde
görülebilen kontrast farklılıklarına dönüştüren optik
sistemler kullanır.

• Parlak alan mikroskobunda, saydam yapılar (çekirdek gibi)

çok az kontrasta sahiptir çünkü ışığı zayıf bir şekilde
soğururlar. Bununla birlikte, ışık bu yapılardan geçerken
yavaşlar, böylece çevresindeki sitoplazmadan geçen ışıkla
karşılaştırıldığında fazı değişir.

• Faz-kontrast ve diferansiyel kontrast mikroskopisi, fazdaki bu

farklılıkları kontrasttaki farklılıklara dönüştürür, böylece canlı İnsan yanak hücreleri. A) Faz kontrast mikroskobu B) Diferansiyel
girişim-kontrast mikroskobu (Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell:
boyanmamış hücrelerin net görüntülerini verir. A Molecular Approach, Eighth Edition 2019 Oxford University Press)

8
Elektron mikroskobu

➢ Işık mikroskobunun sınırlı çözünürlüğü nedeniyle hücre yapısının

ayrıntılarının analizi 1930'larda geliştirilen ve ilk olarak Albert Claude,
Keith Porter ve 1940 ve 1950'lerde George Palade tarafından biyolojik
örneklere uygulanan elektron mikroskobu gibi daha güçlü mikroskobik
tekniklerin kullanılmasını gerektirmiştir.

• Elektron mikroskobundaki elektronların dalga boyu 0,004 nm kadar kısa

olabilir - görünür ışığın dalga boyundan yaklaşık 100.000 kat daha
kısa olduğu için ışık mikroskobu ile elde edilenden çok daha büyük
bir çözünürlük elde edebilir.

• Büyütme oranı ve çözünürlük ışık mikroskobuna göre daha fazladır

9
İki tür elektron mikroskobu – Hücreleri incelemek için yaygın olarak kullanılır

• Geçirimli (Transmission) Elektron Mikroskobu (TEM)

• Taramalı (Scanning) Elektron Mikroskobu (SEM)

https://yasam.gazi.edu.tr/view/page/73007/transmisyon-elektron-mikroskobu-tem https://sem.metu.edu.tr/egitim/taramali-elektron-mikroskobu-sertifika-programi.html

10
TEM ile incelenecek numuneler pozitif veya negatif
boyama ile hazırlanmalıdır

Pozitif boyamada doku örnekleri ince kesitler

halinde kesilir ve lipidler, proteinler ve nükleik
asitlerle reaksiyona giren ağır metal tuzları
(osmiyum tetroksit, uranil asetat ve kurşun sitrat
gibi) ile boyanır
Pozitif boyama
Ağır metal tuzları ile boyanan beyaz kan
hücreleri (Kaynak Geoffrey M. Cooper. The
Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition
2019 Oxford University Press)

Negatif boyama bakteriler izole edilmiş hücre

altı organeller ve makromoleküller gibi
bozulmamış biyolojik yapıların
Negatif boyama aktin filamentler. (Kaynak Geoffrey M. Cooper.
The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition 2019 Oxford görselleştirilmesi için faydalıdır
University Press)
11
SEM, hücrelerin üç boyutlu görüntüsünü
sağlamak için kullanılır.

• Taramalı elektron mikroskobunda elektron

ışını numuneden geçmez.

• Hücrenin yüzeyi ağır bir metal ile kaplanır

ve numuneyi taramak için bir elektron ışını
kullanılır.

• Elektron ışını hücre boyunca hareket Bir makrofajın görüntüsü

ederken numune yüzeyinden saçılan veya Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition
yayılan elektronlar üç boyutlu bir görüntü 2019 Oxford University Press

oluşturmak için toplanır.

12
Floresan mikroskobu

• Optik mikroskopta görülemeyen örneklerin hücre içi

dağılımını incelemek için yaygın olarak kullanılır

• İlgili molekülü sabit veya canlı hücrelerde etiketlemek

için bir floresan boya kullanılır

• Floresan boya bir dalga boyunda ışığı absorblayan DNA'nın maviye ve sitoplazmadaki
ve ikinci bir dalga boyunda ışık yayan bir moleküldür mikrotübüllerin yeşile boyandığı bir
semender akciğer hücresinin floresan
görüntüsü. (Kaynak Geoffrey M. Cooper. The
Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition
2019 Oxford University Press)

13
Floresan mikroskobu

Floresan boyalar insan gözünün görme

sınırı altındaki dalga boylu ışıklarla
uyarılarak, daha yüksek dalga boyunda
ışık yayarlar.

Yayılan ışık uygun filtreler kullanılarak

analiz edilir ve örneğe ait yapı, dağılım
ve miktarları hakkında bilgiler elde edilir.

https://daytam.atauni.edu.tr/altyapi/yasam-bilimleri/mikroskobi-ve-ileri-goruntuleme-
laboratuvari/floresan-mikroskobu/

14
Konfokal mikroskop

Numunede yalnızca tek bir noktadan floresans

analiz edilerek artırılmış kontrast ve detay
görüntülerinin elde edilmesini sağlar

En yüksek ışık mikroskobu çözünürlüğü ile

hücre altı yapılar, fonksiyonları ve
hücre/organizma yapısının net bir şekilde
görüntülenmesini sağlar
İnsan hücreleri. Mikrotübüller sarı, aktin
filamentleri mavi ve çekirdekler kırmızıdır.
(Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A
Molecular Approach, Eighth Edition 2019 Oxford
University Press)

15
 Hücre altı ayırma
• Elektron mikroskobu hücre yapısının ayrıntılı bir şekilde görüntülenmesini sağlasa da
ökaryotik hücrelerin çeşitli bileşenlerinin işlevlerini tanımlamak için tek başına mikroskop
yeterli değildir.

• Hücre altı organellerin işleviyle ilgili birçok soruyu ele almak için ökaryotik hücrelerin
organellerini biyokimyasal çalışmalarda kullanılabilecek bir biçimde izole etmek gerekir.

• Albert Claude, Christian de Duve ve meslektaşları tarafından 1940 ve 1950'lerde

hücrelerin bileşenlerini büyüklüklerine ve yoğunluklarına göre ayırmak için geliştirilen
bir yöntem olan diferansiyel santrifüjleme

• Hücrenin iç bileşenlerini tahrip etmeyen koşullar altında plazma zarının

bozulmasıdır.

• Sonikasyon (yüksek frekanslı sese maruz kalma), mekanik bir homojenleştiricide öğütme
veya yüksek hızlı bir karıştırıcı ile çeşitli yöntemler kullanılır.

16
 Santrifüj 800 × yerçekimi (10 dak)

hücre süspansiyonu, lizozomlar,

peroksizomlar ve zar parçaları gibi
hücre altı bileşenleri içerir. Santrifüj 15.000 × yerçekimi (10 dak)

çekirdek tortusu
Santrifüj 100.000 × yerçekimi (60 dak)

Mitokondri, lizozomlar ve
peroksizom tortusu
Santrifüj 200.000 × yerçekimi (3 sa)
Plazma zarının parçaları ve
endoplazmik retikulum tortusu

Sitosol

Ribozom (Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular

Approach, Eighth Edition 2019 Oxford University Press) 17
HÜCREYİ İNCELEME YÖNTEMLERİ

A. Hücrenin Mikroskobik Olarak İncelenmesi

Hücrenin normal yapısı ile hücrede meydana gelen değişimler çeşitli

mikroskoplar ile incelenir

Canlı veya fikse edilmiş hücrelerde

Organizmadan alınan hücreler incelenir. Hücreler değişik işlemlerden geçirilerek

Hücre veya doku kültürü yapılır hazırlanan devamlı preparatlarda incelenir

18
A. Hücrenin Mikroskopik Olarak İncelenmesi

Hücrenin doğrudan vital boyama ile

Hücrenin incelenmesi
Canlı
Olarak
Hücre veya doku kültürleri ile inceleme
İncelenmesi
- Hücre hattı
- Kök hücre
Hücrelerin Tespit
Edilerek (cansız)
İncelenmesi

19
1. Hücrenin Canlı Olarak İncelenmesi
a. Hücrenin Doğrudan Vital Boyama ile İncelenmesi

Hücreler izotonik çözelti

içine alınarak incelenir

• Dil epitel hücreleri, kan ve sperm hücreleri bir damla sıvı içinde mikroskopta

Canlı boyama (vital boyama);

• Hücrenin hücre zarı, hücre çeperi, nükleusu, organelleri için özel boyalar kullanılması

• Amip, terliksi hayvan vb. için asidik boyalar (tripan mavisi, çini mürekkebi, lityum karmin)
• Boyalar besin vakuolleri tarafından alınır

20
a. Hücrenin Doğrudan Vital Boyama ile İncelenmesi

H&E lekelenme ışık mikroskobu

Hematoksilin
Bakkam ağacı odunundan
(Asidik) (Bazik)

Hücre çekirdeği H Maviye

Sitoplazma E Kırmızıya
Böbrek dokusu Hematoksilen Eozin ile boyanmış bir
örnekte böbreğe ait yumakçık

21
a. Hücre veya Doku Kültürleri ile İnceleme

• Çok hücreli bir organizmadan alınan hücrelerin çoğaltılması 1907’de Alman zoolog Ross
Harrison tarafından başlatılmıştır

• Semender hücrelerini ortamda yaşatmıştır.

Organizma dışında yapılan işlem in vitro,

Organizma üzerinde in vivo

Kültür kabında adherent (yapışan) hücreler

22
a. Hücre veya Doku Kültürleri ile İnceleme
• Hücre kültürü için hücrelerin yaşayabileceği kültür
ortamı belirlenir

• Her hücre için besiyerler farklılık gösterir.

• İçeriğinde karbonhidratlar, amino asitler, vitaminler,

tuzlar, hormonlar, büyüme faktörleri vb. vardır

• Ortam ve kullanılan malzemeler steril olmalıdır

• Hücre kültürleri ilaç araştırmaları, hücrenin

moleküler düzeyde incelenmesi, kromozomların
araştırılması vb.

Hidrokortizon 23
Kolera toksin
a. Hücre veya Doku Kültürleri ile İnceleme
1. Hücre hattı

Embriyonik kök hücreler veya tümörlerden alınan hücreler kültürde süresiz çoğalırlar ve
sürekli yada ölümsüz hücre hatları olarak tanımlanırlar

Aynı tip hücre çoğaltılarak çalışmalarda kullanılır.

Örn. Üçlü Negatif Meme Kanseri MDA-MB-231 hücre hattı üzerinde in vitro kanser ilaç
araştırmaları

Hücre Pasajlama
Hücre Hücreye
kültür ile gerekli İstenilen
hattı Madde
ortamında sayıda Analizler
temini Uygulaması
çoğaltma hücre
eldesi

24
 Hücre süspansiyonu

Ortam
Birincil kültür

Hücreler kültür kabından

çıkarılabilir ve ikincil bir kültür
oluşturmak için daha düşük bir
yoğunlukta tekrar kaplanabilir.
İkincil kültür

25
Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition 2019 Oxford University Press
 İnsan kök hücre uygulamaları
a. Hücre veya Doku Kültürleri ile İnceleme
2. Kök Hücre

• Vücudun bütün doku ve organlarını oluşturan ana hücrelerdir

• Henüz farklılaşmamış, sınırsız bölünme, kendilerini yenileme,

doku ve organlara dönüşebilme yeteneğine sahiptirler

• Kanser, sinir sistemi hastalıkları (Alzheimer vd.), kalp hastalıkları,

metabolik hastalıklar (diyabet), romatizmal hastalıklar gibi birçok
alanda kullanılabilirler

• Uygun besiyer ve ortam kullanılarak in vitro olarak elde edilebilirler

Miyelin yenilenmesi için kök hücreler

• In vitro kök hücre kaynakları;

Kordon kanından elde edilen kök hücre

Yetişkin kök hücre
Embriyonik kök hücre
www.freepik.com
Embriyonik kök hücre
26
2. Hücrelerin Tespit Edilerek (Cansız) İncelenmesi
• Hücre ve dokular kimyasal ve fiziksel (ısı, kurutma, dondurma) olarak tespit edilebilir.

• Organizmadan alınan örneğin mikroskop altında incelenebilecek hale gelinceye kadar geçirdiği
işlemlere mikroteknik denir.

Rutin preparat hazırlanması (mikroteknik) basamakları

1. Parçanın alınması; biyopsi organizma canlı iken; otopsi ölmüş bir organizmadan

2. Tespit (fiksasyon): Hücrenin canlı haline en yakın şekilde tespitidir. Hücre membranı geçirgen
hale gelir.

• Hücrenin yapısında bulunan proteinleri çöktürür.

• Hücreyi otoliz ve bakteri sindiriminden korur.
• Kimyasal madde karışımlarına fiksatif denir. Amaca uygun olarak seçilir.

Fiksatifler: Alkol, formaldehit, aseton, pikrik asit, asetik asit, civa klorür
27
2. Hücrelerin Tespit Edilerek (Cansız) İncelenmesi

Organ parçaları serum fizyolojikte yıkanır, tespit solüsyonuna konur

3. Dehidrasyon doku alkolden (etil alkol, izopropil alkol) geçirilir

4. Parlatma toluen gibi petrol türevleri (benzen, toluen, ksilen) ile sertleştirilir. Dokular transparan hale gelir

5. Gömme (inklüzyon) dokunun parafin içine yerleştirilmesi

6. Kesit alma Mikrotomla 10-15 mikron veya daha ince kesitler alınır

7. Boyama: Hematoksilen-Eozin, Hematoksilen, Metilen mavisi, Giemsa, PAS (Periyodik Asit Schiff) ve
Feulgen (DNA için) metodları ile gümüşleme teknikleri vb.

Metilen mavisi
(Bazik) 28
Özel Tekniklerin Uygulanması
Histokimya: Doku ve hücrelerde protein, lipid, polisakkarit, enzim, pigment ve vitaminlerin yerleşimlerini ve
miktarları saptar

1. Histokimyasal Yöntemler
A. Kimyasal

Karbonhidratlar

• PAS (Periyodik Asit Schiff) reaksiyonu ile belirlenirler. HIO4 ve Schiff ayıracı
• Asit ile şekerlerdeki komşu dioller arasındaki tepkime ile bir çift aldehit oluşur. Schiff ayıracı ile mor renkli
kompleks oluşur

Glikojen
• Kalp ve iskelet kaslarında, karaciğer vb. bulunur
• Suda çözündüğü için formalin kullanılmaz
• PAS ve Best Karmin teknikleri
• Bauer-Feulgen (kromik asit ve Schiff ayıracı)

Alcian Blue Metodu

Glikozaminoglikanlar belirlenir. Parlak mavi renkli reaksiyon
29
 1. Histokimyasal Yöntemler
A. Kimyasal

Lipidler

• Hidrofobik ve hidrofilik lipidlerin belirlenmesi amaçlanır

• Trigliseritler belirlenir
Nükleik asitler
• Sudan boyaları (Sudan Black vb.) kullanılır
Örn: DNA için Feulgen metodu
Proteinler

• Boyanmaları amino asit bileşimine bağlıdır

Performik asit-Alcian Blue metodu ile sistein, sistin,

metiyonin disülfid ve sülfidril bağları mavi renkle belirlenir

30
 1. Histokimyasal Yöntemler
B. Fiziksel

• Otoradyografi Radyoaktif maddeler kullanılır

• UV Spektrofotometri Belli dalga boyundaki ışık miktarının ölçülmesi (DNA ve RNA 260 nm)

2. İmmünohistokimyasal Yöntemler

İmmünohistokimya bazı enzim veya makromoleküllerin yerleşimlerini incelemeye yardımcı olur

• Dokuda saptanmaya çalışılan protein antijen

• Antijenin saptanması için yararlanılan protein antikor

• İşaretlenmeye çalışılan proteinin tam olarak dokunun neresinde olduğunu gösterebilen

avantajlı bir yöntemdir

31
 Doku antijenlerinin gösterilmesinde kullanılan teknikler

Direkt Yöntem Indirekt Yöntem Çözünebilir

Enzim-i̇mmün
• Dokudaki antijene işaretlenmiş • İşaretsiz birincil antikorlar kompleks yöntemi
birincil antikor bağlanır dokudaki antijenle • Birincil ve ikincil antikor ile
reaksiyona girer çözünebilir bir enzim–antienzim
• İşaretleyiciler peroksidaz, kompleksinden oluşan
alkalen fosfataz • İşaretli ikincil antikor ile basamaklı bir yöntemdir
muamele edilir
• İşaretli kompleks mikroskopta • Peroksidaz-antiperoksidaz
gözlenir • Antijenin yeri mikroskopta (PAP)
gözlenir • Alkalen fosfataz-antialkalen
fosfataz (APAAP)

32
B. Hücrenin Moleküler Düzeyde İncelenmesi
Dördüncül
Moleküler biyoloji teknikleri kullanılır yapı
İkincil Üçüncül
Birincil
yapı yapı
yapı
Farklı teknik ve cihazlar ile incelenebilir

• Hücrenin taşıdığı protein ve nükleik asitler elde

edilebilir, saflaştırılabilir
Amino α-Heliks Polipeptid
• DNA’dan kesilen bir parça çoğaltılabilir özel gen asit Kompleks protein
bölgesi araştırılabilir molekülü

• Bir canlının gen bölgesi başka bir organizmanın

kromozomuna aktarılabilir

• Antijen ve antikor üretimi incelemeleri yapılabilir

• Fosiller hakkında bilgi

33
 Moleküler biyoloji teknikleri
1. Rekombinant DNA (rDNA) Teknolojisi

• Farklı türlerden elde edilen DNA molekülü veya

gen bölgelerinin kesilerek birbirleriyle
birleştirilmesi yeni DNA molekülünün eldesi

• Çoğaltılarak (klonlama) çeşitli amaçlar için

kullanılabilir (Dolly (koyun)’nin klonlanması)
Rekombinant
• Genetik rekombinasyon olaylarının yapay olarak DNA parçası Vektör
DNA
gerçekleştirilmesi esasına dayanır

• Çevre mühendisliği, ziraat, tıp ve endüstri

alanlarında kullanılmaktadır

• Genetik bozuklukların gen transferi yardımıyla

düzeltilmesi veya tedavisi vb.
34
1. Rekombinant DNA (rDNA) Teknolojisi

rDNA teknolojisinde uygulanan yöntemler

a. Klasik uygulamalar

• Restriksiyon enzimleri ile rDNA kesilerek istenilen DNA parçası elde edilir

• Bu DNA parçalarının seçilen vektörün aynı enzimle kesilmiş DNA bölgesine

aktarılması

• Klonlama ile yüksek sayılarda DNA problarının eldesi

35
1. Rekombinant DNA (rDNA) Teknolojisi

b. Hibridizasyon yöntemi

DNA hibritleşmesi: Birbirine eşlik eden iki adet tek sarmal nükleik asit dizisinin çift sarmallı
tek bir yapı haline gelmesidir

Hibridizasyon: Özel DNA parçalarının (prob) in vitro çoğaltılması ve niteliği araştırılacak

hedef DNA molekülü ile birleştirilmesidir

Amaç: incelenen örnekte (doku, organ, hücre kültürü vb.) bulunan hastalık edici etkenlerin
veya bu dokulara ait hücre DNA’larındaki spesifik genlerin işaretli problarla ortaya konulması

95 ºC
Denatürasyon

65 ºC
Renatürasyon
36
Hibridizasyon yöntemleri

Southern blot DNA parçalarının agaroz jel elektroforezinde ayrılması sonucu nitroselüloz
filtreye transferi ile radyoaktif bir probla DNA parçalarının bulunması

• Patolojik materyalden DNA izolasyonu

• DNA’nin restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilmesi
• Parçaların agaroz jel elektroforezi
• Transfer
• Radyoaktif probla işaretleme
• Otoradyografi

37
 Southern blot

Restriksiyon
endonükleaz

Jel elektroforez
X-Ray film

Farklı boyutlardaki
restriksiyon parçaları jel
elektroforezi ile ayrılır

Filtreye bağlı olan prob

filme maruz bırakılarak tespit
Denatürasyon edilir. Probun hibritlendiği DNA
Filtreye transfer parçasını ortaya çıkarır

Filtre Filtre, tamamlayıcı

DNA dizilerine 38
bağlanan etiketli bir
prob ile inkübe edilir
Northern blot DNA yerine RNA'nın saptanması için kullanılan Southern blot tekniğinin bir çeşidi

• Bu yöntemde jel elektroforezi ile RNA'lar ekstrakte edilir ve boyutlarına göre parçalara ayrılır

• Southern lekelemede olduğu gibi RNA'lar bir filtreye aktarılır ve etiketli bir prob ile
hibridizasyon yoluyla saptanır

• Gen ekspresyonu çalışmalarında, örneğin farklı hücre tiplerinde spesifik mRNA'ların bulunup
bulunmadığını belirlemek için sıklıkla kullanılır

Basamakları

• RNA izolasyonu
• Elektroforez
• Transfer
• İşaretli DNA veya RNA problarla hibridizasyon
• Otoradyografi

39
Hibridizasyon yöntemleri

Dot blot Örnek DNA parçasının ilgili DNA probu ile yaptığı hibridizasyon işlemidir

Yarı kalitatif yöntem, hızlı görüntüleme, geniş sayıda örnek

Tanıma, analiz etme ve proteinleri tanıma gibi Western blota benzer.

• Otoradyografi yöntemi ile film üzerinde radyoaktif sinyaller görünür hale getirilir

• Sinyal yoğunluğu örnek DNA miktarını verir

• Elektroforez ile ayrılma işlemi uygulanmaz

40
In situ hibridizasyon

• Yöntem, isaretli bir nükleotid probu ve tamamlayıcı hedef RNA veya DNA
dizileri arasında bir hibridizasyon reaksiyonunu içerir

• Tek bir hücre içinde belirli bir nükleik asit dizisinin tespitini ve kesin
yerleşimlerini inceler

• Radyoizotop işaretleme (3H, 35S, 125I, 32P) X-ray veya emülsiyon

otoradyografi ile tanımlanır

41
• Nükleik asit hibridizasyonu, yalnızca hücre
ekstraktlarında değil aynı zamanda
kromozomlarda veya bozulmamış
hücrelerde de homolog DNA veya RNA
dizilerini tespit etmek için kullanılabilir - in
situ hibridizasyon

• Floresan probların spesifik hücrelere veya

hücre altı yapılara hibridizasyonu,
mikroskobik inceleme ile analiz edilir.
Floresan in situ hibridizasyon İnsan kromozomlarının, 24
kromozomun her birini farklı bir renkle etiketleyen
kromozoma özgü floresan problarla hibridizasyonu.
• In situ hibridizasyon bir doku içindeki farklı (Kaynak Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular
Approach, Eighth Edition 2019 Oxford University Press)
hücre tiplerindeki spesifik mRNA'ları
saptamak için de kullanılabilir
42
1. Rekombinant DNA (rDNA) Teknolojisi
c. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polimerase Chain Reaction) (PCR)

• Küçük DNA örneğinin istenilen miktarda in vitro çoğaltılarak,

DNA analizinin kısa sürede yapılması.

• Deri, saç teli, sperm vb. hücreler ile sonuca ulaşılır.

➢ Adli tıp örnekleri (analık-babalık tayini)

➢ İnsan genom projesi araştırması

PCR Test çalışması

➢ DNA parmak izi analizi

➢ AIDS, lösemi, kistik fibrozis vb. tanısında

Örnek alma Lizis tamponu RT-PCR cihazı

www.freepik.com 43
c. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

• DNA’nın iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden

DNA ayrılması (94-98 °C)
denatürasyonu

• Çoğalması istenen genin iki ucuna özgü ve baz

sırasının tamamlayıcısı olan oligonükleotit primerinin
Primerin (18-20 baz uzunluğunda sentetik DNA parçacığı)
bağlanması bağlanması (37-65 °C)

• Primerler sayesinde istenilen çift iplikli DNA

sentezlenir ve zincir uzar. DNA polimerizasyonu (72
DNA sentezi °C)

44
B. Hücrenin Moleküler Düzeyde İncelenmesi
2. Elektroforez
• Ortamın pH’sına göre (+) veya (-) olarak yüklenen biyomoleküllerin, elektrik alanında ayrılmasını
sağlayan bir tekniktir

• Basit, hızlı, oldukça etkin ve güvenli bir ayırma sağlar.

• Yüklü tanecikler, yüklerine ve büyüklüklerine göre belirli bir hızda hareket ederler.

• Yapılar molekül ağırlıklarına göre jel

üzerinde bantlar halinde gözlenir.

• En çok kullanılanı jel elektroforezdir.

• Nükleik asitler ve proteinler tayin edilir.

• Nükleik asit için agaroz jel, proteinler için

poliakrilamid jel.
45
 Jel
2. Elektroforez Elektroforez
SDS-PAGE

Kullanım alanları

• Saflık kontrolü,
• Molekül kütlesi belirleme, Protein
• Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık belirleme vb. bantlar

Jel Elektroforezi İnkübasyon

a. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) (Western blot)

Antikor spesifik
proteine bağlanır
❖ Proteinlerin ayrılması için uygulanabilir

❖ Sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında proteinler denatüre

edilerek molekül kütlesi tayininde de kullanılır Kemilüminesans
ile bağlı antikor
tespit edilir
❖ SDS-PAGE yaygın olarak kullanılır
46
b. Agaroz jel elektroforezi

❖ Destek maddesi agaroz

❖ Serum proteinleri, nükleik asitler vb. analizlerde

47
B. Hücrenin Moleküler Düzeyde İncelenmesi

3. İmmünolojik Yöntemler
Antikorlar floresans boyalarla işaretlenerek özel moleküllerin hücrede yerleşimi saptanabilir

Floresan mikroskop veya elektron mikroskobu ile işaretli yerler gözlenir

İşaretlenmiş antikorlarla yapılan immunoassay yöntemleri

Serolojik çalışmalarda kullanılır

Amaç, bilinen antijen veya antikordan biri kullanılarak kullanılanın karşılığını belirlemektir

48
 Enzim Bağlı Radio Floresan
Immunoassay Immunoassay Antikor
(ELISA) (RIA) Teknikleri (FAT)

49
İşaretlenmiş antikor teknikleri
Tekniklerin temel prensibi: bilinen bir antijenin sabit bir
yüzeye önceden tespit edilmesidir.

➢ Antikoru belirlenecek örnek (serum) ortama eklenir

➢ Serum içinde aranan antikor tespit edilmiş antijenle

bağlanarak antijen-antikor immun kompleksi oluşturulması
sağlanır

➢ İmmun kompleks oluşumu için ikinci bir işaretli antikor ilave

edilir

➢ Sonuç bağlanan işaretli antikor miktarı ölçülerek

değerlendirilir.

Antikor Immün kompleks İşaretli antikor SONUÇ

YOK OLUŞMAZ BAĞLANAMAZ NEGATİF
50
İşaretlenmiş antikor teknikleri

Antikor işaretlemede floresan boya, enzim veya radyoaktif madde kullanılır.

İşaretli antikor (konjugat) = floresan veya enzim konjugatı

Enzim Bağlı Immunoassay (ELISA)

❖ Geniş kullanım alanına sahiptir.

❖ Antijen antikor reaksiyonlarını gösterir

❖ Enzimle işaretli ikinci bir antikor kullanılır. Renk değişimi spektrofotometrik olarak ELISA
okuyucuyla değerlendirilir.

❖ Virüs ve parazit enfeksiyonları tanımlamada

❖ Hormon, ilaç düzeyi vb. tayininde kullanılır.

51
ELISA Çeşitleri

Direkt ELISA Birincil antikor konjugattır.

• Yüksek molekül ağırlıklı antijenin miktar tayininde

İndirekt ELISA bir birincil antikor numune antijen-antikora bağlanır ve daha sonra birincil antikoru
saptamak için ikincil bir etiketli antikor kullanılır

Sandviç ELISA, antijenin iki antikor arasına sıkıştırılması olarak adlandırılır

• Bilinmeyen örneklerin içindeki antikor miktarı belirlenir

Yarışmalı ELISA hem enzime bağlı (etiketli) bir kontrol antijeni hem de bilinmeyen miktarda
etiketlenmemiş antijen içeren bir numune, antikorla kaplanmış bir numuneye eklenir

• Materyalde bulunan etken veya bunlara karşı oluşmuş antikor varlığının araştırılması amacıyla
kullanılan bir yöntemdir.
52
Direkt ELISA İndirekt ELISA

Sandviç ELISA Yarışmalı ELISA

53
İşaretlenmiş antikor teknikleri

Radio Immunoassay (RIA)

• ELISA tekniğine benzer. Hormon testlerinde kullanılır

• Radyoaktif madde işaretli antikor kullanılır

• Radyoaktif madde ölçen aletle değerlendirilir

• Madde derişimleri ölçülür (Kandaki hormon seviyeleri vb.)

54
Floresan Antikor Testi (FAT)

❑Kullanım alanı ve deney prensibi ELISA ve RIA gibidir.

❑Belirleyici antikor floresan boya (izotiyosiyanat (mavi), tetrametil rodamin

izotiyosiyanat (yeşil) ile işaretleme

❑Şüpheli materyalde bulunan etken (veya antijen) ya da bunlara karşı oluşmuş

antikor varlığı araştırılır

❑Floresan mikroskoplar kullanılır

❑Enfekte hücrelerde, patolojik materyalde antijen tespiti vb.

55
Kaynaklar
▪ Prof. Dr. Ayşe BAŞARAN. Tıbbi Biyoloji Ders Kitabı. Pelikan Yayıncılık-2015. Genişletilmiş 9. Baskı

▪ Geoffrey M. Cooper. The Cell: A Molecular Approach, Eighth Edition 2019 New York Oxford University Press

▪ Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman. Çeviri Editörleri: Neşe ATABEY, Ersan KALAY, Meral SAKIZLI Hücre Moleküler Yaklaşım 7. Baskı

▪ J.D.BANCROFT. Histochemical Techniques, Book Chapters, 2nd Edition, 1975. Elsevier https://doi.org/10.1016/C2013-0-03917-5

▪ Molecular Diagnostics: Techniques and Applications for the Clinical Laboratory. 2010. Elizabeth R. Unger Hiroaki Nitta Daisy R. Lee Thomas M.
Grogan. Chapter 7. In Situ Hybridization: Principles and Applications.
▪ Long Jin and Ricardo V. Lloyd. 1997. In Situ Hybridization: Methods and Applications. Journal of Clinical Laboratory Analysis 11:2–9.

▪ I.L. Pepper, C.P. Gerba, T.J. Gentry: Environmental Microbiology, Third edition. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-394626-3.00012-0.
Hye-Weon Yu, Marilyn J. Halonen and Ian L. Pepper. Immunological Methods. Chapter 12. 253-255.
▪ Neilson, J. W., and Maier, R. M. (2001) Biological techniques for measuring organic and metal contaminants in environmental samples. In “Humic
Substances and Chemical Contaminants” (C. E. Clapp, M. H. B. Hayes, N. Senesi, P. R. Bloom, and P. M. Jardine, eds.), Soil Science Society of
America, Madison, WI, pp. 255273.

56