Genómica Íñigo Garay Echevarría Tema 11

Tema 11. Técnicas avanzadas

Técnicas avanzadas
• Quantitive Trait Loci (QTL)

• Genome Wide Association Studies (GWAS)

• Mejora asistida por marcadores (MAS)

• Genomic Selection (GS)

• Plantas Modi cadas Genéticamente

Estas técnicas se basan en mapas físicos y genéticos. Las mejores técnicas se basan en ambos
mapas.

Antes de la existencia de mapas físicos completos solo había genéticos, por lo que, las
conclusiones eran menos aproximadas. Ahora que se dispone de mapas físicos ya que tenemos
acceso a secuenciamiento, se pueden combinar ambos mapas.

1. QTL
La diferencia entre un carácter cuantitativo y uno cualitativo es
que los primeros son caracteres in uenciados por muchos genes,
mientras que los segundos solo están in uenciados por un gen.

La altura de una persona es un carácter cuantitativo.

En un experimento de QTL se pueden observar marcadores en un
cromosoma (mapa de ligamiento). Sobre este mapa genético,
estadísticamente, se puede asociar un carácter con un marcador/
es.

En el mapa hay marcadores que no están asociados a mi carácter,

pero al nal del mapa, existen marcadores claramente asociados
con mi carácter. Esto se realiza con todo el cromosoma
observando diferentes picos de asociación

Para un estudio de QTL se necesita:

i. Carácter cuantitativo

ii. Población de mapeo (descendencia controlada)

iii. Marcadores moleculares (genotipado)

iv. Mapa de ligamiento

Este mapeo se basa en asociar estadísticamente un marcador con un carácter. Para ello, se hace
una población de mapeo (F2), ya que en la F1 no se produce segregación y no se observa nada.
Me interesa cruzar individuos que sean muy diferentes en el carácter que yo voy a estudiar, por lo
que, si se estudia la altura se cruza una planta muy baja con una muy alta. De esta manera, se
consigue obtener una mayor distribución de altura, que está relacionada con los alelos
parentales. Si los dos individuos tienen alelos iguales, no se puede distinguir estadísticamente
donde están los QTLs, ya que no se observará una diferentes segregación en mi población de
mapeo. Por lo tanto, solo se pueden estudiar alelos que segregan en la población.

Una vez realizada la población de mapeo, se lleva a cabo un genotipado masivo de todos los
individuos para observar los marcadores de cada uno de ellos, ya que hay que asociar las
diferencias alélicas/marcadores con el carácter fenotípico.

La población F2 tiene sus ventajas y desventajas. Por un lado, es fácil de llegar a ella, aunque el
principal inconveniente es que se suele tardar más si quiero llegar a siguientes generaciones. En
cada generación se observa mayor sobrecruzamiento, por lo que, habrá mayor resolución en
generaciones avanzadas. Además, a mayor número de individuos, mayor número de bloques,
que ayudará en la asociación marcador-carácter.

Por término medio, existen 1 o 2 sobrecruzamientos por meiosis por generación.

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Los marcadores asociados al gen de estudio son heredados en bloque (haplotipo). A veces estos
bloques son tan grandes que algún marcador puede estar alejado del gen, siendo el ligamiento
no muy bueno. A medida que avanzan las generaciones, estos bloques son más pequeños
estando el marcador más cercano al gen.

En un estudio QTL se observan cromosomas,

siendo cada línea gris un marcador. Sobre estos
cromosomas se colocan los QTLs ( echas). Los
QTLs más ables serían aquellos que no han
cambiado en diferentes años ya que estos
caracteres están muy in uenciados por el
ambiente. De esta manera, se pueden localizar
los genes asociados a un carácter. A partir de
ahora, sabiendo que hay un gen involucrado, se
puede secuenciar el gen o mirar en el mapa
físico y estudiar si hay un gen con el que se
pueda relacionar esta función obteniendo un
gen candidato.

2. GWAS
Se trata de averiguar asociaciones entre marcadores y
caracteres. En esta técnica no se necesita de una
población de mapeo, es decir, no se requiere estudiar la
descendencia. En este caso se necesita de una
población natural (diferentes razas, países,…) con la que
se va a estudiar la relación entre el carácter estudiado y el
marcador. Por lo tanto, no se necesita cruzar dos
individuos para llevar a cabo el estudio (QTL), aunque se
requiere una mayor información de marcadores, lo cual no
supone problema ya que hay muchas técnicas de
genotipado masivo.

La principal ventaja en la utilización de poblaciones

naturales es que ésta va a haber tenido mucha más
recombinación ya que se ha acumulado a lo largo de
varias generaciones. Por lo tanto, los bloques de
ligamiento van a ser más pequeños obteniendo una
resolución mayor. Sin embargo, para poder utilizar esta
resolución se requiere de un mayor número de
marcadores (1 marcador: 1 bloque).

Al nal de un estudio GWAS se observan Manhattan plots, ya que se asemejan a los rascacielos
de Manhattan. Cada uno de los colores se asocia a un cromosoma distinto, siendo cada uno de
esos puntos un marcador (SNPs). Si la asociación supera un umbral de signi cancia estadística,
estas asociaciones marcador-carácter son ables. En estos grá cos hay varios marcadores
asociados a un carácter y cercanos entre ellos.

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GWAS vs QTL

Ventajas e Inconvenientes
a) La resolución es mayor en GWAS que en QTL. La recombinación
estudiada en GWAS es histórica y utiliza más marcadores

b) GWAS utiliza poblaciones naturales (nº de individuos in nito) ya

existentes mientras que en QTL se necesita crear una población de
mapeo (nº de individuos limitado)

c) GWAS emplea toda la diversidad alélica de la especie ya que han

tenido recombinación durante mucho más tiempo, mientras que los
QTL la tiene limitada a los alelos diferentes entre los parentales (2
individuos)

d) GWAS explota múltiples recombinaciones acumuladas en

generaciones

e) GWAS requiere un gran número de marcadores (no es gran problema debido a técnicas de
genotipado masivo)

f) Se necesita utilizar un mayor número de individuos en GWAS

g) Por el hecho de utilizar poblaciones naturales y tener más nº de alelos, el tratamiento

estadístico es más complejo en GWAS

Las poblaciones GWAS tienen bloques más pequeños debido a acumulaciones de éstos durante
más tiempo y se evita el hecho de cruzar dos individuos.

Los estudios de QTL se visualizan mediante picos, mientras que en GWAS mediante Manhattan
blots.

La acumulación de alelos en QTL solo se puede

estudiar entre los dos parentales, mientras que esa
restricción en GWAS no existe ya que hay mayor
número de alelos en la población natural.

Normalmente, es mejor cuando ambas técnicas se

combinan ya que se puede obtener una con rmación
de un carácter asociado a un carácter. Lo que se
tiende a hacer es superponer ambas técnicas.

En la grá ca se observa unos SNPs altamente

asociados a un carácter (GWAS) en una posición del
cromosoma y se con rma con la presencia de QTLs
para ese carácter en el mismo lugar.
3. Mejora Asistida por Marcadores (MAS) y Genomic Selection
(GS)
Tanto una como otra se basan en obtener información de marcadores a lo largo del genoma para
mejorar una característica que yo quiero. Se emplea en mejora genética animal y/o vegetal.

Para ello, se necesitan:

• Información de asociación marcador-carácter (fenotipo). Se pueden lograr por estudios QTL

o por GWAS para saber que alelos positivos están relaciones con el fenotipo

• Sistema de manejo de datos

MAS

Esta técnica trata de ser capaz de mejorar un carácter/fenotipo con información directa de los
marcadores.

Se está interesado en buscar individuos con ambos alelos de interés, por lo que, en el ejemplo se
cruzan ambos parentales (A y B) y se seleccionan los individuos AABB.

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Un QTL signi ca un locus en el genoma con un gen subyacente, por lo que, se puede hablar
indistintamente de un QTL, locus o gen. Si se tiene el gen A, se trata de buscar un marcador por
QTL/GWAS que esté íntimamente asociado a ese gen ya que, al realizar un genotipado y se
ensaye este marcador, se va a ver si éste tiene el alelo A (alelo de interés).

Cuanto más cerca esté el gen del marcador, mejor es la predicción. Por ejemplo, una distancia de
5 cM signi ca que de 100 individuos, 5 por término medio van a tener sobrecruzamiento entre el
gen y el marcador. Se busca una distancia menor de 5 cM ya que así se mantiene mejor la
asociación y me garantice que solo un 1% de los individuos tengan sobrecruzamiento.

Si se consideran dos marcadores anqueantes, la probabilidad de perder información es mucho

menor. Por lo tanto, cuantos más marcadores se utilicen, mejor va a ser mi predicción.

Cuando no existían marcadores, se cultivaban plantas en el campo/invernadero, infectarlas con

esa enfermedad y observar cuales sobrevivían y cuales no. Esto requiere una cantidad de
espacio, dinero y recursos, ya que esas plantas tienen que crecer hasta su estado adulto.

Si hay un marcador asociado a la enfermedad, ensayando los marcadores se puede en cualquier

estadío de la planta (incluso semilla) extraer el DNA y realizar un estudio de marcadores. Los
marcadores de interés son aquellos que tienen dos alelos resistentes. De esta manera, se
eliminan muchos individuos ahorrándonos mucho dinero y espacio.

Ventajas
a) Al extraer DNA se puede hacer un estudio de marcadores sin esperar a que la planta llega a
su fase adulta (árboles frutales)

b) No está afectado por las condiciones ambientales (genotipo)

c) Si se hace un ensayo fenotípico, no se pueden distinguir heterocigotos de homocigotos, pero

con esta técnica sí es posible.

d) Cuando hay varios genes que afectan un carácter, el saber cuántos alelos positivos tiene ese
individuo es complicado, pero realizando un estudio de marcadores se saben todos

e) Dependiendo del carácter puede ser más rápido y barato. En el caso de frutales, un ensayo
de marcadores es más barato. Nos interesa estudiar caracteres fáciles de ver, no
in uenciados por el ambiente y rápidos de expresar

Inconvenientes
a) Más caro dependiendo de la situación

b) El marcador debe estar más cercano al gen (falsos positivos)

c) La información de QTLs ha de ser able

d) Puede ocurrir que los marcadores estudiados para una población no funcionan bien en otra

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4. Marker Assisted Back Selection (MABS)

Se busca un antepasado silvestre de una planta de cultivo.
Normalmente, los antepasados de plantas silvestres están
acostumbradas a vivir en condiciones de ataques de plagas
siendo más resistentes. Por lo que, se busca el antepasado
resistente a esa enfermedad.

La variedad de élite (rr) se cruza con la planta silvestre (RR)

pasando el gen de resistencia a la descendencia. Como
solo nos interesa el gen de resistencia, la descendencia se
vuelve a cruzar con la variedad. Siempre se busca quedarse
con aquellas plantas que guarden el gen de resistencia (Rr).

Me interesa quedarme con el alelo de gen de resistencia

procedente de la planta silvestre, pero también interesa que
el resto del cromosoma sea blanco. A medida que se
realizan cruzamientos, va a ver más lugares blancos
manteniéndose el gen de resistencia (negro). Para ello, se
pueden ensayar los individuos o los marcadores. En
cruzamientos sucesivos se busca quedarme con
fragmentos blancos (variedad élite) pero manteniendo el gen
de resistencia.

Suele interesar hacer plantas resistentes a varias enfermedades (varios genes de resistencia)
mediante el proceso de gene pyramiding.

LIMITACIONES DE MAS
i. La información de marcadores para este tipo de ensayos no es muy elevada. La mayoría
de los caracteres de interés son complejos. Algunas enfermedades pueden requerir de
varios genes.

ii. Para tener una mayor precisión en la búsqueda de marcadores se requiere de un gran
número de individuos.

5. Genomic Selection (GS)

Se va a utilizar información de todos los marcadores siendo la precisión mucho mayor. Para ello,
se necesita:

• Alto número de marcadores repartidos por el genoma

• Algoritmos de predicción genómica para predecir cómo va a ser la descendencia

Se utilizó por primera vez en la mejora de producción de leche (varios genes involucrados).

Se basa en elegir un individuo por su valor utilizando información de marcadores de todo el

genoma, pudiendo asignar un número a un individuo. Por lo tanto, se seleccionan los individuos
con un número mayor. Esta técnica no requiere de un mapeo previo de QTLs, sino que analizando
los marcadores de cada individuo se puede establecer el Genomic Estimate of Breeding Value
(GEBV).

Se necesita información de absolutamente todos los marcadores que se puedan utilizar a lo largo
del genoma sin un conocimiento previo de dónde se localizan estos genes.

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Para llevarlo a cabo, lo primero es realizar una ecuación de estimación del Breeding Value. Para
ello, se utiliza una población de referencia (>1000 individuos). De esta población se va a fenotipar,
es decir, medir el carácter pero también se va a genotipar los 1000 individuos con muchos
marcadores (50-100K marcadores). Con esta información de genotipado y fenotipo se va a
establecer la ecuación de predicción mediante análisis estadístico. Esta ecuación es donde se va
a obtener el Breeding Value. Para seleccionar los mejores individuos se genotipan y con la
ecuación de predicción se pueden seleccionar.

Este método es cíclico ya que la ecuación de predicción se puede mejorar aún más. Si además
de ciertos individuos se utiliza información genotípica y fenotípica, se puede ir mejorando cada
vez más la estimación.

- Ejemplo forestal

Hay una población de referencia/training en la cual hay que fenotipar y genotipar. Se saca la
ecuación de predicción y se aplica a los demás individuos. Con esta ecuación se seleccionan los
mejores individuos de la población y se inicia un nuevo ciclo.

MAS vs GS

• GS no precisa de mapeo de QTLs

• GS incrementa la ganancia genética ya que incrementa la precisión de selección

• MAS y GS seleccionan individuos en una edad temprana

• Para ser preciso GS necesita de un número bastante grande de individuos

• Algunas especies no tienen un número elevado de marcadores para GS

Obteniendo marcadores a partir de QTLs o GWAS se pueden introducir en el estudio de GS,

pudiendo mejorar el modelo de predicción (información extra).

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6. Microchips de mejora
Muchas de estas placas son personalizables con los marcadores de interés. Se requiere una
investigación previa de QTLs o GWAS para obtener SNPs interesantes para mi programa de
mejora. Con esa información se le puede decir a la compañía que realice un chip con esos
marcadores. A partir de aquí, se pueden realizar varias cosas:

a) Si se tiene mucha información de marcadores, se realiza un estudio GS

b) Si necesito pocos marcadores, podemos realizar un genotipado menos masivo realizando un

MAS

También se puede combinar información de especies

similares, es decir, están relacionadas ya que tienen
una antecesor común. Es posible intercambiar
información entre ellas. Para ello, se realiza un estudio
de QTLs pudiéndolos aplicar a regiones conservadas
en otras especies, es decir, si sé que hay un gen de
interés en una fracción del genoma y se quiere aplicar
a otra especie, nos vamos a la zona sinténica de esa
especie y se buscan marcadores para ese QTL. Las
especies algo relacionadas presentan varios bloques
de sintenia, es decir, genes conservados. Por lo tanto,
tienen bloques conservados de una especie a otra.

Los diferentes mapas mantienen el orden de los

marcadores en los diferentes experimentos, es decir,
este QTL es importante ya que se mantiene en
diferentes poblaciones.

Para hacer un buen plan de mejora o estudiar cualquier carácter, a veces es necesario combinar
varias técnicas.

Plantas genéticamente modi cadas

El término “planta transgénica” presenta una connotación negativa hoy en día, aunque en
realidad son muy bene ciosas.

Una planta modi cada genéticamente es aquella cuyo material genético ha sido alterado por
técnicas de ingeniería genética. Mucho material genético de plantas ha sido alterado a lo largo de
la historia, aunque no se consideraría modi cadas genéticamente ya que no se ha realizado
mediante técnicas.

Esta edición de material genético se puede realizar mediante un gen procedente de la misma
especie o de una complementaria (cisgénesis), o de una especie totalmente distinta
(transgénesis).

Se denomina especie compatible a aquella que se pueda hibridar. Se considera transgénesis si

esa hibridación no puede ocurrir de manera natural.

Alguna de las técnicas de edición son CRISPR/Cas9.

DNA recombinante
A estas técnicas se las denominan técnicas de DNA recombinante ya que se recombinan
fragmentos de DNA de varios individuos en un solo genoma mediante técnicas de ingeniería
genética.

Importancia por países

Está creciendo aunque en Europa lamentablemente vamos por detrás. En Europa hay muy pocos
países que crece plantas transgénicas, siendo España uno de ellos. Sólo se puede cultivar el
maíz Bt que produce resistencia a ciertas plagas (oruga). Se pueden importar hasta 109 plantas
genéticamente modi cadas cultivadas en otros países.

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Los países líderes son EEUU, Brasil y Argentina. Los principales cultivos son maíz, soja, algodón.
En la soja, alrededor del 90% que se cultiva en EEUU, es genéticamente modi cada.

Los principales caracteres que se buscan son resistencias a enfermedades, mejora de la calidad
nutricional y resistencia a ciertos factores ambientales (sequías).

Historia

No fue hasta nales de los 80s cuando se empezó en el laboratorio a hacer organismos
modi cados genéticamente. Esto empezó en microorganismos y en plantas comenzó en la
década de los 90s con la producción de la primera variedad de tomates modi cados. A partir de
los 90s surgieron otra serie de cultivos (algodón, maíz, soja, calabaza, papaya, aceite de colza,
patata, frutales,…).

Cómo hacer mejores plantas

Línea tradicional. Se realizan cruzamientos convencionales tratando de cruzar dos caracteres en
una planta sola asistidos por marcadores

Modi cación genética. Mediante técnicas de edición y transformación se introduce el construct

para que realice la edición.

Una vez se tiene el vector que va a realizar la edición, existen 4 maneras de introducirlo en la
planta:

• Transformación mediada por Agrobacterium

• Inyección de genes. Unas bolitas recubiertas con el vector son disparadas contra la planta con
la intención de que este DNA se inserte en el genoma.

• Bombardeo con partículas de DNA

• Edición génica.

Transformación por Agrobacterium

Esta bacteria se encuentra en el suelo e infecta plantas. Para ello, la bacteria produce tumores
(crecimiento masivo de células) introduciendo el plásmido (Ti plasmid) donde hay una serie de
genes (T-DNA), que producen el tumor, en el cromosoma de la planta.

La técnica consiste en sustituir los genes perjudiciales causantes del tumor por los genes de
interés. La planta es infectada con esta bacteria con el gen de interés, que los introducirá en el
cromosoma de la planta y se expresarán. Con técnicas de reproducción vegetativa, se puede
reconstruir la planta entera.

En el plásmido Ti se insertan los genes de interés junto con unos marcadores para asegurarnos de
qué plantas han insertado el plásmido. Se puede sustituir desde el extremo a la derecha (TR) hasta
el extremo a la izquierda (TL) siendo el ADN introducido entre estos dos bordes el que se inserta
en la planta.

Uno de los principales marcadores, a parte de los de resistencia a enfermedades, existen los
genes BUF que dan una coloración azul.

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Ejemplos

La característica más modi cada es la resistencia a un herbicida denominado glifosfato. Además,

existen genes que retrasan el pardeamiento, resistencia a insectos, mejoramiento de calidad
(mayor contenido en sacarosa → caña de azúcar).

El porcentaje de plantas cultivadas en EEUU es bastante considerado. A nivel mundial, la planta

modi cada genéticamente más abundante es la soja.

No solo se han utilizado en plantas, también se utilizan en animales. Se han introducido hormonas
de crecimiento para aumentar la producción de leche.
La línea más utilizada hoy en día es utilizar esos organismos para producir compuestos médicos.
Aprovechando que éstos crecen de forma más masiva, se pueden sintetizar productos como
inmunoglobulinas o factores de coagulación.

Una línea más moderna es la utilización de cerdos para producir órganos humanos. Para ello, los
cerdos son modi cados para que el órgano no cause rechazo en el paciente.

El tomate fue la primera variedad que se introdujo comercialmente. La modi cación se basaba en
el retraso de su proceso de maduración. Por otro lado, el arroz dorado tiene un precursor de la
vitamina A aumentado. Otra modi cación es en salmón añadiendo una hormona de crecimiento
pudiendo crecer en un tiempo más reducido (de 3 años a 16/18 meses).

Resistencia Bt

El maíz Bt es la única planta modi cada genéticamente que se puede cultivar en Europa. Existe
una bacteria en el suelo Bacillus thuringiensis que produce una toxina venenosa para ciertos
insectos incluyendo la larva de la oruga. La técnica consiste en introducir la toxina en el genoma
de la planta. Esta toxina es bastante especí ca ya que solo afecta a un grupo reducido de
insectos (a humanos no). Curiosamente, las esporas de esta toxina se utilizan en agricultura
biológica para producir cultivos orgánicos.

Resistencia a herbicidas

El carácter más introducido es la resistencia a glifosfato (Roundup). La compañía (Monsanto) que

tenía la patente del glifosfato diseñó una manera de que las plantas pudiesen ser resistentes al
herbicida que ellos mismos producían. Tanto el herbicida como las plantas modi cadas tienen
mucho éxito.

Este herbicida afecta a una ruta metabólica shikimate exclusiva en plantas, por lo que, no
afecta a animales. Esta ruta crea en plantas los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y
triptófano). Se descubrió que hay unos microorganismos con una enzima EPSPS que desactiva el
glifosfato, por lo que, esta enzima se introdujo en los cultivos de interés.

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