Citometria in flux

1. Citometria de flux este o tehnică de laborator biomedicală care folosește

un fascicul de lumină laser pentru detectare, numărare, caracterizare și, folosind
instrumente avansate, separarea celulelor suspendate .
2. Citometria de flux folosește un instrument, citometrul de flux, care este capabil să
măsoare simultan unii parametri morfologici care derivă din traversarea celulelor
individuale de un fascicul de lumină laser.
3. Instrumentul este numit flux deoarece celulele curg rapid și individual prin
fasciculul de lumină care le lovește.
4. Citometria de flux este utilizată în mod obișnuit în diagnosticul tulburărilor de
sânge, dar și, prin defalcarea țesuturilor, a tumorilor țesuturilor solide sau
a neoplasmelor
5. Primul citometru de flux bazat pe impedanță și principiul Coulter a fost dezvoltat
de Wallace H. Coulter și Mack Fulwyler în 1953 . Coincidând cu descoperirea
principiului lui Coulter, un articol a fost publicat în revista Science .
6. Primul citometru de flux, pe de altă parte, a fost dezvoltat de Wolfgang Göhde de la
Universitatea din Münster la 18 decembrie 1968 , produs de compania Partec și
comercializat în 1968/1969 de compania germană Phywe AG lângă Göttingen.
7. În acei ani, metodele analitice de absorbție au fost preferate față de cele de
fluorescență. La scurt timp după aceea, au fost dezvoltate citometre de flux, inclusiv:
 Citofluorograf Bio / Physics Systems Inc. (mai târziu Ortho Diagnostics) în 1971.
 PAS 8000 din Partec (1973)
 FACS de Becton Dickinson (1974)
 ICP 22 din Partec / Phywe (1977/78)
 Ampha Z30 de Amphasys (2012) primul citometru de flux cu microfluidice
localizate pe microcircuite
8. Originea numelui
În principiu, definiția citometrie de flux bazată pe fluorescență (în citometrie cu debit
scurt), a fost numită citofotometrie de impuls (din limba
germană: Impulszytophotometrie), pe baza primului instrument brevetat. În 1976, în
timpul celei de-a cincea conferințe a American Engineering Foundation on Automated
Cytology, desfășurată la Pensacola, Florida, la opt ani de la introducerea primului
citometru pe bază de fluorescență, denumirea de citometrie în flux a fost acceptată și a
devenit rapid popular
9. Principiul fundamental pe care se bazează citometria în
flux este împrăștierea luminii. Citometrul (sau citometrul de flux ) folosește un flux
laminar de lichid (numit lichid înveliș - care înseamnă înveliș, ceea ce înseamnă că
înfășoară celulele) pentru a organiza celulele într-un flux ordonat, constant și
continuu, astfel încât fiecare celulă să poată fi adus (numit și eveniment) în camera de
numărare unde va avea loc analiza. Fenomenul ordonării celulare se
numește focalizare hidrodinamică .
10. La instrumentele cu mai mult de două fascicule laser (pentru împrăștiere înainte și
laterală), numite citofluorimetre , există surse de lumină care
emit lungimi de undă prestabilite pentru excitația fluorocromilor legați

1
de imunoglobuline ; acești complexe sunt utilizate pentru a căuta markeri celulari
specifici, cum ar fi clusterele de diferențiere , utile pentru definirea liniei celulare
căreia îi aparține eșantionul.
n citometria de flux, se folosesc anticorpi monoclonali legați de anumite molecule,
numite fluorocromi , adică molecule capabile să emită fluorescență atunci când sunt
excitați cu radiații de lumină având lungimi de undă specifice. Prin urmare,
citometrele de flux au atât surse de lumină specifice (pentru a emite radiații
monocromatice), cât și detectoare specifice. Această analiză specială este utilizată
pentru a căuta markeri celulari specifici, cum ar fi clusterele de diferențiere , utile
pentru definirea liniei celulare căreia îi aparține eșantionul. Datorită prezenței mai
multor detectoare pe același instrument, este posibil să se analizeze simultan mai
mulți parametri în aceeași achiziție. Citometria de flux, pe lângă faptul că este o
tehnică de analiză calitativă, datorită unei relații direct proporționale între cantitatea
de fluorocrom și intensitatea luminoasă a radiației emise (fluorescență), este, de
asemenea, posibil să se obțină informații despre cantitatea de site-uri de legare pentru
complex antigen. - marker anticorp prezent pe fiecare celulă analizată.
11. Citometrele de flux moderne sunt capabile să analizeze în timp real (adică cu
returnarea imediată a rezultatelor și capacitatea de a modifica parametrii de analiză în
timp ce achiziția este în curs) multe mii de celule pe secundă. Un citometru de flux
este similar cu un microscop, cu excepția faptului că, în loc să producă o imagine a
celulei, citometria de flux oferă cuantificare automată pe scară largă și
imunofenotipare a parametrilor optici specifici pentru fiecare tip de celulă. Un
citometru de flux are cinci componente principale: o cameră de curgere, o cameră de
numărare, un detector, un sistem de amplificare și un computer pentru analiza
semnalului.
12. Camera de curgere
Camera de curgere este modelată pentru a crea un flux de lichid (prin intermediul unui
lichid înveliș sau lichid înveliș), care transportă și aliniază celulele astfel încât acestea
să traverseze camera de numărare formând o singură linie care va fi analizată prin
fascicul de lumină. pentru detectarea caracteristicilor fizice sau imunofenotipice.
Fenomenul hidrodinamic care stă la baza alinierii celulare este focalizarea
hidrodinamică .
13. Camera de numărare
Camera de numărare este o parte a citometrului de flux prin care celulele, aliniate
anterior, întâlnesc fasciculele de lumină care determină citirea evenimentelor și
caracterizarea lor. De obicei, este alcătuit din material transparent, astfel încât să
permită operatorului să îl observe din exteriorul camerei, în special pentru a verifica
prezența bulelor de aer care ar afecta citirea eșantionului și, prin urmare, analiza
14. Sistem de detectare

2
 Schema bloc a structurii interne a unui citometru de flux

Sistemul de detectare în citometre de flux constă din:

 Surse de lumină
 Grup optic
 Detector
15. Surse de lumină
Sursele de lumină dintr-un citometru de flux pot fi de diferite tipuri. Există diferite
tipuri de lămpi care emit radiații luminoase mai mult sau mai puțin monocromatice,
pe baza naturii materialului din care este fabricat catodul. Cele mai frecvent utilizate
sunt:
 Lămpi răcite cu apă: Argon , Krypton , laser.
 Lămpi laser răcite cu aer: Argon (488 nm), Heliu - Roșu neon (633 nm), Heliu-
Neon verde, Heliu- Cadmiu (<200 nm - UV)
 Laser cu diode: albastru, roșu, verde, violet
16. Grup optic
Unitatea optică este un element necesar pentru direcționarea fasciculelor de lumină
asupra curentului fluid al probei și, ulterior, după ce a fost absorbit / dispersat de
probă, fasciculul trece printr-un sistem de oglinzi și, eventual, prisme care acționează
ca monocromatori , pentru a direcționa la diferiți detectori. Calea pe care o ia lumina
pentru a ajunge la detector este numită și calea optică .
17. Detector
Detectorul convertește măsurătorile analogice ale intensității luminii, transformându-
le într-un semnal electric pentru a permite software-ului de gestionare să proceseze
semnalul și să returneze rezultatul analizei. Pe baza numărului de surse de lumină
(numărul de fascicule de lumină monocromatice) prezente, numărul detectorilor de pe
instrument variază, de asemenea. În mod normal, detectoarele sunt componente
capabile, după cum sa menționat deja, să transforme un semnal analog (intensitatea
fasciculului de lumină) într-un semnal electric, sub forma unui ddp (diferență de
potențial) sau a unui curent electric. Dispozitivul capabil să îndeplinească această
sarcină este fotodetectorul (sau fototubul) sau, pentru detectarea intensităților foarte
mici, fotomultiplicatorul . Instrumentele moderne au de obicei mai multe lasere și

3
 detectoare de fluorescență. Înregistrarea actuală pentru un instrument comercial este
de zece lasere și 30 de detectoare de fluorescență.

Culturi celulare

1. Cultura celulară este procesul prin care celulele sunt crescute în condiții controlate,
cel mai frecvent în afara mediului natural.
2. Condițiile de cultivare diferă în funcție de tipul celular, dar, în general, acestea sunt
un substrat-placă cu mediu care furnizează nutrienții necesari creșterii și un incubator
care reglează caracteristicile fizico-chimice (pH, presiune, concentrație de CO2,
presiune osmotică și temperatură). Deși cele mai multe tipuri celulare necesită un
substrat de care să adere, denumite culturi monostrat sau culturi aderente, alte tipuri
cresc flotând liber în mediu (culturi în suspensie).
3. Celulele pot fi îndepărtate din țesutul inițial direct sau prin metode enzimatice sau
mecanice înainte de cultivare sau pot fi derivate din linii celulare deja stabilite.
4. Pentru aceste operațiuni și nu numai vă punem la dispoziție o gamă complexă de
baloane, cutii (vase) Petri, încărcătoare de celule, lamele, pipete, pipete serologice,
micropipete, plăci de cultură, anse inoculare, răzuitoare de celule, site etc.
5. Fie că vorbim de centrifuge industriale sau centrifuge de laborator, fie că vorbim de
centrifuge medicale, necesitatea este aceeași: centrifuge profesionale, accesibile și
fiabile pentru a putea fi utilizate cu succes pentru procese de separare, sedimentare,
decantare, paletizare etc.
6. În acest sens, punem la dispoziția clienților noștri o gamă complexă de
centrifuge: Centrifuge PRP/PRF/ A-PRF, Centrifuge de Viteza Mică, Centrifuge de
Viteza Mare, Centrifuge de Capacitate Mare, Centrifuge de Viteza Mare cu Răcire,
Centrifuge de Capacitate Mare cu Răcire, Centrifuge de Podea de Viteză Mare cu
Răcire, Centrifuge de Podea de Capacitate Mare (Blood Bank) cu Răcire, Centrifuge
Produse Petroliere (Crude Oil), Centrifuge Gerber, Centrifuge Hematocrit, Centrifuge
Gel Card, Centrifuge Serum, Centrifuge Cytospin.

Scurtă descriere:

7. Laboratoarele sunt complet echipate pentru cultivarea in vitro a celulelor și pentru

realizarea unei game largi de experimente.
8. Personalul care lucrează în laboratoarele de cultură celulară este foarte bine
pregătit, cu o experiență de peste zece ani în domeniul biologiei celulare, producția și
cultivarea liniilor celulare și dezvoltarea tehnicilor de citotoxicitate. Toate tipurile de
celule pot fi cultivate, inclusiv celule primare, celule stem mezenchimale și
hematopoietice, precum și celule stem pluripotente.
9. Principalele activități/tehnici:

 Culturi de celule primare (celule stem hematopoietice, celule stem mezenchimale,

celule endoteliale, celule dendritice etc.)
 Diferențierea celulelor stem în diferite tipuri de celule
 Izolarea și caracterizarea celulelor tumorale
 Culturi de celule stem embrionare

4
 Cultivarea și analizarea diferitelor linii celulare (normale și tumorale)
 Extinderea in vitro a celulelor pentru terapii celulare
10. Echipament:

 Hote cu flux laminar

 Incubatoare CO2
 Centrifuge de laborator
 Dispozitive de sortare a celulelor magnetice (MACS Miltenyi Biotec, celulă stem)
 Dispozitiv de electroforație pentru transfecții (Amaxa, Lonza)
 Microscop pentru culturi de celule cu fluorescență (Zeiss)
 Microscop cu brațe de micromanipulare (Narishige)
 Microscop video pentru experimente la scară de timp (Zeiss)
 xCELLIGENCE (ACEA Bioscience)

Fractionarea celulara

1. Este o metoda prin care se pot izola si identifica organitele celulare dupa
distrugerea integritatii membranei.
Are mai multe etape :
2. Omogenizarea - ce consta in distrugerea integritatii tisulare si apoi celulare
cu obtinerea unei suspensii de organite si membrane veziculate in mediul de
omogenizare
3. Separarea prin centrifugare si/ sau ultracentrifugare - adica centrifugare la
forte centrifugale mare 10000 - 500000 de ori acceleratia gravitationala , procedeu
prin care se obtine izolarea si purificarea componentelor ultrastructurale.

4. OMOGENIZAREA
Se poate executa in 3 moduri :
5.a.      prin soc osmotic , de ex. La obtinerea membranelor eritrocitare care
se bazeaza pe suspendarea celulelor tesutului maruntit in
solutii hipotone . Diferenta de osmolaritate intre mediul i.c. si cel e.c.
duce la umflarea celulelor pana la ruperea membranelor.Continutul se
devarsa in mediul de omogenizare , iar membranele care nu pot exista
cu capete libere se veziculeaza
6.b.     prin ultrasonicare - presupune ruperea membranelor sub actiunea
undelor ultrasonice
7.c.      cu omogenizatoare se realizeaza sub actiunea fortelor de frecare si
torsiune care contribuie la ruperea membranelor. Aceasta metoda este
cea mai folosita ; socul osmotic nu da intotdeauna rezultate
satisfacatoare , iar ultrasonicarea este o metoda dura ce necesita
precautii suplimentare referitoare la timpul de omogenizare si puterea
undelor5
8.Omogenizatorul
Este format dintr-o eprubeta cu pereti grosi care are la capat o camera de fuga pentru
materialul supus omogenizarii , si un pistil care in prezent este format dintr-o tija de
otel inoxidabil cu un cap de teflon.
Poate avea diferite calibre , adica distanta dintre suprafata capatului pistilului si
peretele eprubetei poate varia intre 10 - 100 mm.

5
9. Alegerea omogenizatorului se face in functie de marimea celulelor supuse
omogenizarii. Operatia de omogenizare se realizeaza prin trecerea fortata a suspensiei
de celule intre peretele eprubetei si capatul pistilului ca urmare a miscarii de dute-
vino intre cele doua componente. Miscarea de rotatie imprimata pistilului fie manual
fie ca urmare a cuplarii acestuia la un electromotor genereaza fortele de torsiune care
maresc eficienta ruperii membranelor celulare.
10. SEPARAREA
Din omogenatul obtinut , organitele se pot izola prin utilizarea centrifugarii , respectiv
ultracentrifugarii . Acestea se pot realiza in doua moduri:
diferential - cand organitele se depun la baza tubului , in ordinea densitatii lor prin
centrifugari repetate la forte din ce in ce mai mari
in gradient de densitate - cand printr-o singura centrifugare la forte suficient de
ridicate se obtin organitele ca fractii separate . Ele floteaza in diferite pozitii
ale gradientului la nivelul la care acesta are o densitate echivalenta cu a
componentelor.
11. Etape  se recolteaza un fragment de tesut care se marunteste si apoi este supus
omogenizarii. Se obtine suspensia de organite in mediul de omogenizare. Omogenatul
weste last in repaus pentru a se depune resturile celulare si celulele neomogenate.
Ssupernatantul este colectat si supus unei prime centrifugari timp de 20 min. la o
1000g obtinandu-se fractia nucleara. Supernatantul obtinut dupa depunerea fractiunii
nucleare este supus unei noi centrifugari TIMP DE 20 MIN. LA 10000g obtinandu-se
un al doilea sediment ce contine mitocondriile si lizozomii. Supernatantul este din nou
centrifugat la 106000g obtinandu-se fractia microzomala ce contine RER , REN , si
aparat Golgi.
12. Daca se face un tratament cu deoxicolat de sodiu 2% si fractia obtinuta se
centrifugheaza tot la 106000g sedimentul va contine ribozomii la baza iar veziculele
de RE deasupra acestora.
In acest fel se pot obtine diverse organite celulare cu grade suficiente de
puritate ptr. A fii supuse analizelor ulterioare.
13. CENTRIFUGAREA IN GRADIENT DE DENSITATE
Se poate realiza pe gradiente continui sau in trepte . Gradientii cei mai folositi se
bazeaza pe solutii de sucroza , Ficoll sau percol.
Gradientul cu solutie de percol se poate autogenera in timpul centrifugarii. Forma sa
depinde de concentratia percolului si forta de centrifugare . Variatia acestor parametrii
duce la obtinerea de gradienti cu distributie diferita.
Aceasta tehnica a fost folosita de profesorul George Emil Palade in experimentele ce
au dus la descoperirea ciclului secretor celular. Experimentul a constat in
administrarea in perfuzie a unor aminoacizi tritiati celulelor pancreatice in situ. Dupa
eliminarea excesului de trasori nepreluat de celula s-a urmarit localizarea
radioactivitatii la diferite intervale de timp. Astfel , dupa 3 min. , emisia radioactiva
era localizata perinuclear respectiv in RE. Dupa 20 min. radioactivitatea era maxima
in zona ap. Golgi , iar dupa 90 min. era concentrata la polul apical al celulei in zona
corespunzatoare granulelor de secretie.
Acest experiment a permis stabilirea etapelor parcurse de proteinele destinate
exportului. Astfel , aceste proteine sunt sintetizate la nivelul RER ,maturate si
impachetate la nivelul ap. Golgi , stotocate temporar in granule de secretie si
eliminate din celula prin exocitoza.