ECZ453-4053

Farmasötik Biyoteknoloji
Prof. Dr. Ali Demir SEZER

16.11.2020-20.11.2020 Haftası Dersi

Biyoteknolojik İlaç Üretim Prosesi-1

Prof. Dr. Ali Demir SEZER

Marmara Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi
Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı
Biyoteknolojik İlaç üretimi 2 ana bölümden
oluşmaktadır.

a- Upstream proses

b- Downstream proses
Hücre Bankası Sistemi
 Hücre hattı terapötik proteini kodlayan plazmidin
hücreye integrasyonuna olanak sağlayacak
şekilde oluşturulur.
 Kültür işleminden sonra hücre hatları porsiyonlar
halinde ayrılır ve ampullere yerleştirilir.
 Ampuller sıvı azotta kriyokorunmuş olarak
saklanırlar.
 Saklama süresi çok uzundur.
 Stabildir.
Upstream proses

Hücre bankası iki gruptan oluşur.

a- Ana hücre bankası (master cell bank)

b- Çalışma hücre bankası (Working cell bank)

Çalışma hücre bankası Ana hücre bankasından

alınan hücrelerle oluşturulur.
 Hücre Bankası Sistemi

Ana hücre bankası (Master Cell Bank)

Çalışma Hücre Bankası (Working Cell Bank)

(Ana hücre bankasından 1 ampülün alınması ile
üretimin başlatılması)
Upstream proseste ana hücre bankası ve çalışma hücre bankasının
Hücre Bankası Sistemi
 Hücre bankası sistemi iki ana hücre hücre
bankasından oluşur.

Ana hücre Bankası: Karakterize edilmiş, orjini

belli, tekdüze ve yeni yapılandırılmış hücre
hatlarından oluşur.
- Üretim için kullanılmaz.
- Sadece çalışma hücre bankası için kullanılır.
- Birkaç yüz ampülden oluşur.
Hücre Bankası Sistemi
Çalışma Hücre Bankası: Ana hücre bankasından
alınan ampül ile hücre kültürü yapılır ve bu kültür
çoğaltılarak ampullere ayrılır.
- Protein üretimi bu hücre hatları sayesinde
sağlanır.
- Üretim için kullanılan hücre bankasıdır.
- Hücre hattı bitince yeni bir ampül ana hücre
bankasından alınır.
- Üretim amaçlı geliştirildiği için sonsuz kullanım
sağlamaktadır.
 Biyoteknolojik ilaç üretimi ana hücre
bankasından bir şişenin alınması ile başlar.
 Biyosentez için hücre kültürü ile devam
eder.
 Birbirini takip eden ayırma ve saflaştırma
işlemleri uygulanır.
 Yarı mamülün primer ambalajlara dolumu
 Etiketleme
 Paketleme
Upstream proses

 İlk aşamada hücre hatları, üretilmesi istenilen proteini

kodlayacak plazmidin hücreye yerleştirilmesine uygun
olacak şekilde oluşturulur.

 Hücre hatları küçük porsiyonlara ayrılır ve sıvı azotta

saklanır.

 Ampul içindeki bu hücreler hücre bankasını

oluşturmaktadır.
E. coli’de protein üretimi
Upstream prosesteki çalışma hücre kültüründen üretim

ölçekli aşamaya kadar hücrelerin çoğaltılması

Upstream proses

 Üretim çalışma hücre bankasından 1 şişenin

alınması ile başlar.
 Lab-scale üretim için şişe uygun koşullarda
inkübasyona bırakılır.
 Başlangıç kültüründen üretim boyutuna
geçiş biyoreaktörlerle olmaktadır.
Upstream proses

Fermentasyon

 Başlangıç fermentasyon işlemi yani

- memeli hücre kültürü

- prokaryoitik hücre kültürlerinin

çoğaltılması işlemi upstream prosesin son kademesidir.

 Bu aşamada uygun fermentör seçimi önem

taşımaktadır.
Upstream proses
Biyoteknolojik ilaç üretiminde farklı hücrelere
yönelik 3 ayrı tipte fermentör kullanılmaktadır.

Bunlar;
- Karıştırıcılı tank
- Hava asansörlü

- Akışkan yataklı
fermentörlerdir.
Karıştırıcılı tank tipi fermentör
 Bu tip fermentörler basit bir karıştırıcılı tank
düzeneğine sahip sistemlerdir.
 Tank düzeneği vertikal bir eksen üzerinde
dönen bir motor sistemine bağlıdır.
 Bu aks üzerinde yer alan düz kanatlı pervane
şeklinde apereyler bulunur ve karışmayı
sağlarlar.
 Enzimatik reaksiyonlarda karıştırma işlemi
tercih edilen bir yoldur.
Karıştırıcılı tank tipi fermentör
 Sistemde oluşan köpüğü uzaklaştırıcı bir
mekanizma bulunur.
 Hava bir kompresör vasıtası ile sistem içine
verilir.
 Bu sistemle bir çok hücre hattı başarılı bir
şekilde üretilmektedir.
 Sistem hem küçük üretimler (2-50 L) hem de
büyük çapta üretimler (100-5000 L) için
kullanılmaktadır.
Karıştırıcılı tank tipi fermentör
 Monoklonal antikorlar için gerekli olan
hibridoma hücrelerinin üretiminde bu tip
fermentörler sıklıkla kullanılmaktadır.

 Köpügün kolay uzaklaştırılması ve hücre

hattının hızlı çoğaltılması ve kullanımın kolay
olması bu tip fermentörlerin diğer avantajları
arasında yer almaktadır.
Karıştırıcılı tank tipi fermentör
Hava asansörlü tip fermentör
 Hava asansörlü tip fermentörlerde iki önemli
mekanizma bulunur. Bunlar havalandırma ve
çalkalamadır.

 Sistem iç içe geçmiş iki tanktan ibarettir.

İçteki tankta hava kabarcıkları oluşur ve
havalandırma buradadır.

 Çalkalama sayesinde hava kabarcıkları

tankın en alt kısmına erişebilirler.
Hava asansörlü tip fermentör
 İkinci tankın üst kısmından ise gaz çıkışı
sağlanır.
 Çalkalama sonucunda iç tankta çoğaltılan
hücreler ve medyum devamlı olarak dış
tanka doğru hareket halindedir.
 2 ila 90 L kapasiteli bu tip fermentörler büyük
çapta üretim için kullanılmaktadırlar.
 2000 L kapasitelilerinde ise monoklonal
antikorlar üretilebilmektedir.
Hava asansörlü tip fermentör
 Bu fermentörler karıştırıcılı tank tipi
fermentörlere kıyasla daha az enerji sarf
etmektedirler.

 Hayvan ve bitki hücre kültürlerini çoğaltmak

için kullanılan fermentörlerdir.

 Üretim miktarı yüksektir.

 Oksijen transferi ise karıştırıcılı tank tipine

kıyasla daha düşüktür.
Hava asansörlü tipi fermentör
Akışkan yataklı fermentör
 Bu biyoreaktörlerin farklı dizaynları vardır.
Genel olarak;
 Bu tip fermentörde immoblize veya
biyokatalist bir tankın içine konulmuştur.

 Medyumdan kolona doğru akış sağlanır.

 Karıştırıcılı tank tipine kıyasla partiküler

yapının sistemi yıpratma payı daha azdır.
Akışkan yataklı fermentör

 Bu sistemde medyum defalarca tankla kolon

arasında bir siklusa sahiptir. Buda ürünün
verimliliğini arttırır.

 Sistemdeki partiküllerin boyutu önemlidir

farklı boyutların kanalları tıkama riski
yüksektir.

 Yüksek viskoziteli substratlar biyoreaktörü

bloke edebilirler.
Akışkan yataklı fermentör
Akışkan yataklı fermentör
Downstream proses

 Bu prosesin ilk basamağı upstream prosesin

son kademesi olan üretim boyutlu hücrelerin
çoğaltılmasından sonraki sentezlenen
ürünün ayrılması işlemidir.

 Bu basamağın temelini seperasyon ve

saflaştırma yöntemleri oluşturmaktadır.
Downstream proses

 Bu proses aşamasında kullanılan hücre

tipine göre ürünün intra veya ekstra selüler
ortama salgılanmasında farklılıklar
gözlenmektedir.
Downstream proses

Fermentasyonda kullanılan hücre tipi

Memeli hücre kültürü Prokaryotik hücre

(ürünü ekstraselüler salgılar) (ürün intraselüler
olarak birikir)
Downstream proses

Ürünlerin ekstraselüler ortama salgılanması downstream

basamağını kolaylaştırırken intraselüler birikim ise ürünün
seperasyonu için ek olarak farklı ayırma ve saflaştırma
yöntemlerini gerektirmektedir.
Downstream proses

İntraselüler proteinlerin ayrılması için;

Fermentasyonu takiben hücreler toplanır ve iki yöntemle
ayrılırlar:

- SANTRİFÜJ

- FİLTRASYON
Downstream proses

Sonraki aşama hücrelerin parçalanması basamağıdır.

 Bu aşamada en çok kullanılan yöntem yüksek devirde

hücrelerin parçalanması yani homojenizatör
kullanımıdır.

 Hücreler parçalandıktan sonra hücre kalıntıları ve atıklar

santrifüjle ayırılırlar.
Downstream proses

 Downstream proseste ikinci önemli aşama ham proteini

konsantre etmektir.
 Proteinleri konsantre etmek için çöktürme işlemi
uygulanır.

 Çöktürme için kullanılan yöntemler;

- Kimyasal maddelerle
etanol, solvanlar, NH4SO4

- Ultrafiltrasyon (plastik bazlı membranlar kullanılır

ve genellikle bu yöntem tercih edilir.)
Downstream proses

 Proteinlerin konsantrasyonundan sonraki

aşama saflaştırma işlemidir.
 Saflaştırma işlemi proteinlerin fizikokimyasal
özelliklerine göre farklı yöntemlerle
yapılmaktadır.