Molekulaspektrumok, Jablonski diagram,

fluoreszcencia, fluoreszcencia alkalmazásai.

Az ábrák alatti magyarázó szöveget írta

Nagyné Szabó Ágnes

2019

Ezt az oktatási anyagot a

Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar,

Biofizikai és Sejtbiológiai Intézete
készítette.

https://biophys.med.unideb.hu
Az előadás során az atomok és a molekulák energiaszintjeinek és spektrumainak
megismerése után részletesen tanulmányozni fogjuk a Jablonski diagramot, megbeszéljük az
abszorpció jelenségét és a különböző relaxációs folyamatokat és értelmezzük a Kasha-
szabályt. Megismerkedünk részletesebben a fluoreszcencia jelenségével és a folyamatot
jellemző paraméterekkel, valamint megbeszéljük, hogyan lehet mérni a fluoreszcenciát és az
abszorpciót. Végül a fluoreszcencia néhány felhasználási lehetőségét nézzük át.
Az Orvosi biofizika tankönyv 123.oldalán a II.27. ábra szemléltet egy ehhez hasonló
elektromágneses spektrumot, amelyen láthatóak az elektromágneses sugárzások
tartományai a frekvencia (f) és a hullámhossz (λ) függvényében.
A sugárzásokat többféleképpen lehet csoportosítani, és a különféle sugárzásoknak vannak
közös tulajdonságaik, például az, hogy minden sugárzásban energia terjed. A sugárzások
többnyire valamilyen sugárforrásból indulnak ki, majd hosszabb-rövidebb út megtétele után
elérik a besugárzott testet, amiben részben vagy egészben elnyelődhetnek, szóródhatnak,
vagy akár vissza is verődhetnek. Figyelembe véve a sugárzások fizikai természetét, az alábbi
sugárzásokat különböztethetjük meg:
1) elektromágneses sugárzások: rádióhullám, mikrohullám, infravörös fény, látható
fény, ultraibolya fény, röntgensugárzás, gammasugárzás
2) mechanikai sugárzások: hang, ultrahang
3) részecske sugárzások: alfa-sugárzás, béta-sugárzás
Az elektromágneses hullámok terjedéséhez nem szükséges rugalmas közeg, vákuumban is
terjednek. Terjedési sebességüket vákuumban (c) a c    f képlettel fejezhetjük ki. Az
elektromágneses sugárzások, akárcsak a fény, kettős természetűek. Az elektromágneses
c
sugárzások „részecskéi” a fotonok, melyek energiája a E foton  h  f foton  h  képlettel
 foton
írható le, ahol h a Planck-állandó (h=6,63×10-34 Js), lásd az 1. előadásban. A nagyobb
energiájú fotonoknak magasabb a frekvenciája és alacsonyabb a hullámhossza. Az emberi
szem által látható elektromágneses sugárzások hullámhossztartománya 400-750 nm közé
esik.
A kvantált energiaközlés első kísérleti bizonyítéka a Franck-Hertz kísérlet volt, amely során
elektronok és higany atomok (Hg) ütközését vizsgálta meg két német fizikus (James Franck
és Gustav Ludwig Hertz) 1914-ben. Egy kisnyomású Hg-gőzzel töltött elektroncsőben a katód
és az anód közé elhelyeztek egy harmadik, lyukacsos dróthálóból készült elektródát is (ezt
nevezzük rácsnak vagy hálónak), melyen az elektronok át tudnak jutni. A katód izzítása
következtében elektronok szabadulnak fel (termikus emisszió), melyeket felgyorsítanak a
katód és a háló közé kapcsolt U feszültséggel. Az elektronok az útjuk során ütközhettek
(rugalmasan és rugalmatlanul is) a Hg-atomokkal, és ha ezután átjutottak a hálón, akkor egy
gyenge fékező elektromos térbe kerülve csak egy minimális mozgási energiával legalább
rendelkező elektronok érik el az anódot, és hoznak létre áramot (I). A dián a bal alsó ábra
mutatja az így mért áramerősséget (I) a katód és a háló közé kapcsolt gyorsító feszültség
(U) függvényében. A gyorsító feszültséget növelve az elektronok mozgási energiája
 1 
növekszik  eU  mv 2  , rugalmasan ütköznek a Hg-atomokkal (nem veszítenek energiát),
 2 
átjutnak a hálón, elérik az anódot, és a vártnak megfelelően, nő az áramerősség (a jobb alsó
ábrán a piros vonal szemlélteti ezt). Azonban az U1=4,9V gyorsító feszültség esetén az
áramerősség hirtelen leesik, ugyanis ekkor az elektronok mozgási energiája a
hálóelektródnál 4,9eV, melyet ütközéskor teljes egészében átadnak a Hg-atomoknak a háló
közelében (rugalmatlan ütközés), ezáltal nem képesek átjutni a hálón és elérni az anódot (a
jobb alsó ábrán a kék vonal szemlélteti ezt). A gyorsító feszültséget tovább növelve újra
emelkedik az áramerősség, mert az elektronok rugalmatlan ütközése a Hg-atomokkal még
jóval a háló elérése előtt bekövetkezik, és a fennmaradó távolságon fel tudnak annyira
gyorsulni az elektronok, hogy átjussanak a hálón és elérjék az anódot (a jobb alsó ábrán a
zöld vonal szemlélteti ezt). Amikor a gyorsító feszültség U2=9,8V (2x4,9V), újra lecsökken az
áramerősség, ugyanis a 9,8 V-tal gyorsított elektronok útjuk során kétszer is képesek elérni
a 4,9 eV-os mozgási energiát. Egyszer a katód és a háló között pontosan félúton, amikor
teljes, 4,9 eV-os energiájukat átadják egy Hg atomnak és megállnak (Ekin=0). A hálóig még
pontosan 4,9V-os feszültségen újra felgyorsulnak, és a háló közvetlen közelében egy Hg
atommal ismét rugalmatlanul ütközve elvesztik mozgási energiájukat, és nem jutnak át a
hálón. A feszültséget tovább növelve a jelenség periodikusan folytatódik.
Mi a magyarázata a fenti jelenségnek? Amikor az elektronok rugalmatlanul ütköztek a Hg-
atomokkal, akkor átadták az energiájukat, ezáltal a Hg-atomok gerjesztődtek. Azonban a Hg-
atomok csak meghatározott nagyságú energiát (4,9eV) tudtak felvenni a velük ütköző
elektronoktól, ami pontosan megegyezik a Hg-atom alapállapota és az első gerjesztett
állapota közötti energiakülönbséggel (ezt szemlélteti a bal felső ábra): E2  E1  4,9eV
A gerjesztődést követően a Hg-atomok visszatérnek az alapállapotukba, és egy 4,9eV
energiájú fotont bocsátanak ki. A kísérlet fontos bizonyítékot szolgáltatott az atomi
energiaszintek kvantáltságáról, és alátámasztja a Bohr-féle atommodellt is.
A XIX. században tudósok vizsgálták az abszorpciós és az emissziós színképeket, és azt
találták, hogy az izzó gázok a rájuk eső fehér fényből pont olyan hullámhosszúságú
fotonokat képesek csak elnyelni, mint amilyeneket az emisszió során kibocsátanak (a dia
bal alsó ábráján a zöld színnel jelölt foton), míg a többi hullámhosszúságú fotonokat
egyszerűen átengedik. Ilyen értelemben az abszorpciós színkép vonalas, hiszen a fehér
fényből pont a kisugárzott vonalak hiányoznak (a dia jobb alsó részében az abszorpciós
spektrumban ezt a fekete sáv jelöli), azaz az anyagok csak meghatározott energiájú
fotonokat képesek elnyelni és kisugározni. Az alsó ábrán lévő atom abszorbeált egy adott
hullámhosszúságú és adott energiájú ( E  h  f ) fotont (zöld színnel jelölve), ezáltal egy
alacsonyabb energiájú (E1), az első pályán lévő elektron annyi energiára tett szert, hogy
felkerült a második pályára, egy magasabb energiájú szintre (E2), azaz az atom gerjesztődött.
Az elnyelt foton energiája fedezte a két pálya közti energiakülönbséget:
E  h  f  E2  E1 . A gerjesztett állapot élettartama rendkívül rövid, a magasabb energiájú
pályára került elektron visszatér az alacsonyabb energiájú pályára, és a két energiaszint
közötti különbséget egy ugyanolyan energiájú foton formájában kisugározza, mint amit a
gerjesztődés során elnyelt (ábrán a zöld foton). A folyamatot relaxációnak nevezzük, és a
szintén vonalas emissziós spektrumban csak ennek az emittált fotonnak a színképe fog
látszódni (a dia jobb alsó ábráján zöld sáv az emissziós spektrumban).
Ha hidrogéngázt tartalmazó mintán elektromos kisülést bocsátunk keresztül, akkor a H 2
molekulák elbomlanak, az energetikailag gerjesztett H-atomok pedig diszkrét
frekvenciaértékeket tartalmazó (diszkrét energiájú) fényt (fotonokat) bocsátanak ki. Az így
keletkező vonalas spektrum (a dián a jobb felső ábra) magyarázatában az első jelentős
eredményt Johann Balmer svájci középiskolai tanár érte el 1885-ben. Felfedezte a Balmer-
formulát, ami leírja a hidrogén atom színképének látható tartományában (400-750nm) a
1  1 1 
színképvonalak hullámhosszai (λ) közötti összefüggést:  RH   2  2  , n  3, 4,5,... ahol
 2 n 
RH a hidrogénatomra vonatkozó Rydberg-állandó. A formulához rendelhető spektrumvonalak
összességét Balmer-sorozatnak nevezzük (a dián a hidrogén atom spektrumában a piros
vonalak). A Balmer formulát, mely csak az ún. Balmer sorozathoz tartozó vonalak
1  1 1 
hullámhosszait adja meg, Rydberg általánosította:  RH   2  2  , ahol n1 és n2 az
  n1 n2 
átmenetben részt vevő pályák főkvantumszámai. 1913-ban a Bohr-féle atommodell
segítségével (az elektronok csak meghatározott energiájú pályákon keringhetnek az
atommag körül) elméletileg is meg lehetett indokolni a hidrogén atom vonalas abszorpciós
és emissziós színképét (lásd részletesebben a 4. előadásnál: Röntgensugárzás). Attól
függően, hogy az elektronátmenetek mely pályákat tartalmazzák (E1, E2, E3, ….),
megkülönböztetünk Lyman-, Balmer- és Paschen-sorozatokat. A Lyman-sorozatban csak
olyan fotonok abszorbeálódnak vagy emittálódnak, amelyek alacsony hullámhosszúak, a
nem látható ultraibolya tartományba esnek (nagy energiájúak), és ilyenkor az elektron vagy a
legelső pályáról (E1) gerjesztődik bármelyik magasabb energiájú pályára (E2, E3, ….), vagy
bármelyik magasabb energiájú pályáról relaxálódik a legelső pályára (a dián a hidrogén atom
spektrumában a zöld vonalak). A Balmer-sorozatban lévő fotonok már kisebb energiájúak,
ezért a látható fény tartományába esnek, és ilyenkor az elektron vagy a második pályáról (E2)
gerjesztődik bármelyik magasabb energiájú pályára (E3, E4, ….), vagy bármelyik magasabb
energiájú pályáról relaxálódik a második pályára. A Paschen-sorozathoz tartoznak a
legkisebb energiájú fotonok, melyek az infravörös tartományba esnek, és ilyenkor az
elektron vagy a harmadik pályáról (E3) gerjesztődik bármelyik magasabb energiájú pályára
(E4, E5, ….), vagy bármelyik magasabb energiájú pályáról relaxálódik a harmadik pályára (a
dián a hidrogén atom spektrumában a kék vonalak). Bár a Bohr-modell sikeresen leírta a H-
atom energiaszintjeit és minden egyelektronos („hidrogénszerű”) ion színképvonalait, a
többelektronos atomok és ionok, valamint a molekulák színképvonalait már nem tudta
megmagyarázni, ezeket a kvantummechanikai modell oldotta meg.
A molekulákat felépítő atomok a molekulán belül is folyamatosan mozognak, kovalens kötés
mentén rezegnek, rotálódhatnak, a hosszabb molekulák elhajlanak. Ezek a mozgások
meghatározott (kvantált) energiájúak. A molekulaspektroszkópiában vizsgált színkép úgy
keletkezik, hogy a molekula fotont abszorbeál vagy bocsát ki, miközben az energiája
megváltozik. Az atomspektroszkópiától való eltérése az, hogy a molekulák energiája
nemcsak az elektronátmenetek, hanem a forgási és rezgési átmenetek révén is
megváltozhat, megjelennek a spektrumban a vibrációs és a rotációs energiaszintek is,
emiatt a molekulák spektruma az atomok spektrumánál bonyolultabb. Ezeket az
átmeneteket energiaszint-rendszerben szokás összefoglalni (bal alsó ábra), amelyben az
elektrongerjesztési energiaszintekre ülnek rá a vibrációs energiaszintek sorozatai (v=0, v=1),
az egyes vibrációs szintekre a pedig a rotációs nívók rendszere (r=0,1,2,…). Kiválasztási
szabályok miatt azonban nem minden átmenet megengedett.
A molekulák elektroneloszlásának megváltozásához nagyságrendileg néhány ezer
elektronvolt energia szükséges, ebből kifolyólag az ilyen változások során kibocsátott vagy
elnyelt fotonok a spektrum látható (400-750nm) és ultraibolya (200-400nm) tartományába
esnek. Ennél lényegesen kisebb energiát igényel a molekuláris rezgések átrendeződése
(vibrációs-átmenet), és még ennél is kisebbet a molekula lehetséges forgómozgásai közötti
átmenet (rotációs-átmenet), így ezen átmenetek energiatartománya az infravörös sugárzás
tartományába esik (750nm-400μm).
Miért sávos, és nem vonalas a molekulák UV-látható-spektruma? Az elektronok
gerjesztése együtt jár a molekula rezgési és forgási állapotainak a gerjesztésével is, melyek
sok lehetséges átmenetet eredményeznek (színes vonalak a bal felső ábrán). Ezeket az
átmeneteket különböző energiák és eltérő hullámhosszok jellemzik. Ez a keskeny vonalakból
álló spektrum azonban csak a molekulák gázfázisában figyelhető meg (bal oldali ábra).
Oldatban a gerjesztett molekulák kölcsönhatása az oldószermolekulákkal bizonytalanná teszi
a különböző átmenetek energiáit (széles szürke sávok a középső és a jobb felső ábrán), ezért
sokkal több átmenet lehetséges különböző energiákkal, amelyek energiái átfedésben
vannak egymással. Ezekben az esetekben csak a spektrum burkológörbéje látható
(összefüggő sáv), az egyes spektrumvonalak helyett (jobb alsó ábra).
Fluoreszcencia: molekulák fényemisszióval járó relaxációja, amely során az elektron az első
gerjesztett állapotból (S1) visszatér az alapállapotba (S0), és a két állapot közötti
energiakülönbséget egy fluoreszcens foton formájában kisugározza.
 Az ábrán az 1. folyamat a gerjesztés, ami általában egy Eabsz. foton  hf absz. foton energiájú
foton abszorpciójával valósul meg, és az elektron az alapállapotból (S0) egy magasabb
energiájú gerjesztett állapotba kerül (S1’).
 Ezt követően gyors termikus relaxáció útján, ami fotonemisszió nélküli hőleadás,
energiát veszít (ez a 2. folyamat az ábrán).
 A 3. folyamat során az elektron visszatér a gerjesztett S1 állapotból az alacsonyabb
energiájú S0 alapállapotba, miközben a két állapot közötti energiakülönbséget egy
Eem. foton  hf em. foton energiájú foton formájában kisugározza.
 A kisugárzott foton energiája alacsonyabb, mint az elnyelt foton energiája a termikus
relaxáció során bekövetkezett hőleadás miatt. Emiatt az emittált foton hullámhossza
magasabb, mint az abszorbeálté, azaz a vörös (magasabb) hullámhossztartomány fele
tolódik el összehasonlítva az elnyelt foton hullámhosszával. Ez a Stokes-féle eltolódás
Eabsz. foton  Eem. foton , ami miatt a fluoreszcencia érzékeny spektroszkópiás módszer (hiszen
az el nem nyelt vagy szóródott gerjesztő fény optikai szűrőkkel elkülöníthető az emittált
fénytől, így az utóbbi detektálását nem zavarja).
A dián a Jablonski diagram látható, amely összefoglalja azokat a folyamatokat, amik
lejátszódhatnak egy molekulában fényelnyelődés hatására. Az ábrán az egy
elektronállapothoz (S0, S1, S2 T1) tartozó sok vonal a vibrációs energiaszinteket jelöli. A
rotációs energiaszinteket az egyszerűség kedvéért általában nem tüntetik fel.
 Mi a különbség a szingulett (S0, S1, S2,..) és a triplett (T1, T2,..) állapotok között?
Szingulett állapotban nincsenek párosítatlan elektronok, minden állapot két ellentétes
spinű elektronnal be van töltve  , ezért az elektronok eredő spinkvantumszáma nulla,
és mágneses térben az orientációs állapotok száma 1 (2S+1=1). Ezzel szemben triplett
állapotban két azonos spinű elektron van, melyek eredő spinkvantumszáma +1 
vagy -1  , és mágneses térben háromféle orientációs állapot lehetséges (2S+1=3). A
„Kiegészítő anyagok” 35. diáján látható ezekről az állapotokról egy ábra. A szingulett
állapotok közötti elektronátmenetek valószínűsége sokkal nagyobb, mint a szingulett-
triplett átmenetek valószínűsége, mivel ez utóbbi spinátfordulással jár, emiatt ezt tiltott
átmenetnek nevezzük.
 Foton elnyelésekor femtoszekundumnyi (10-15s) idő alatt az elektronok eloszlása
átrendeződik, és az elektron egy magasabb energiájú gerjesztett szingulett állapot
meghatározott vibrációs szintjére kerül, függően az abszorbeált foton energiájától
(felfele mutató fekete nyilak az ábrán).
 Mivel a gerjesztett állapot nem felel meg a környezettel való termikus egyensúlynak,
pikoszekundumok (10-12s) alatt bekövetkezik a termikus relaxáció, amely során csak
hőleadás történik, fotonemisszió nem, és egy vagy több lépésen keresztül az elektron az
 S1 gerjesztett szingulett állapot legalsó vibrációs szintjére kerül. A vibrációs relaxáció
olyan termikus relaxáció, amely vibrációs átmenetek során valósul meg ugyanazon az
elektronállapoton belül (kv sebességi állandóval jelölve az ábrán). Ezzel szemben a belső
konverzió olyan termikus relaxáció, ami szingulett állapotok között valósul meg (kic
sebességi állandóval jelölve az ábrán, ’internal conversion’).
 Az S1 állapot legalsó vibrációs szintjéről több lehetősége van az elektronnak az S0
alapállapotba történő visszatérésre a molekulától és a környezetétől függően:
o Fotonemisszió nélküli belső konverzió, amikor a gerjesztési energia teljes egészében
hővé alakul át (fekete szaggatott nyíl az ábrán kic sebességi állandóval jelölve).
o Fotonemisszióval járó fluoreszcencia, amikor az elektron foton kibocsátása közben
tér vissza az S0 alapállapot valamelyik vibrációs szintjére (piros fotonok kfl sebességi
állandóval jelölve az ábrán). A fluoreszcencia élettartama nanoszekundumos (10-9s)
nagyságrendű. A Kasha-szabály értelmében fotonemisszióval járó relaxáció csakis az
S1 gerjesztett szingulett állapot legalsó vibrációs szintjéről történhet, mivel az
idevezető relaxációs folyamatok sokkal gyorsabbak, mint a fluoreszcencia.
o Egy másik lehetőség a rendszerek közötti átmenet, az intersystem crossing (kisc
sebességi állandóval jelölve az ábrán), melynek során az elektron az S1 állapotból az
alacsonyabb energiájú gerjesztett triplett (T1) állapotba megy át, aminek a
bekövetkezési valószínűsége kicsi (tiltott átmenet), ugyanis spinátfordulással jár.
Bekövetkezésének egyik feltétele, hogy az S1 állapot valamely vibrációs szintje
átfedjen a T1 állapot valamely vibrációs szintjével. Nézzük meg, hogy milyen
folyamatok következhetnek be a T1 gerjesztett triplett állapotból:
 Ha az elektron foton kibocsátása közben relaxálódik az S0 alapállapotba, akkor
foszforeszcenciáról beszélünk (kph sebességi állandóval és zöld fotonnal jelölve az
ábrán). A foszforeszcencia élettartama lényegesen nagyobb (10-6-10s), mint a
fluoreszcenciáé, mert mind az intersystem crossing, mind a foszforeszcencia
spinátfordulással járó tiltott átmenet során valósul meg. Ezen kívül másik
lényeges különbség, hogy a foszforeszcencia során kisugárzott foton energiája
alacsonyabb, mint a fluoreszcencia során emittált foton energiája (hiszen a T1
állapot legalsó vibrációs szintjének energiája kisebb, mint az S 1 szint legalsó
vibrációs szintjéé), emiatt a foszforeszcencia spektruma a magasabb
hullámhossztartomány (vörös) felé tolódik el a fluoreszcencia spektrumhoz
képest.
 A T1 állapotból is bekövetkezhet fotonemisszió nélküli termikus relaxáció belső
konverzió során az S0 alapállapotba.
 Késleltetett fluoreszcencia történik abban az esetben, ha a T1 állapotból az
elektron visszatér az S1 állapot legalsó vibrációs szintjére (kék szaggatott nyilak
kisc sebességi állandóval jelölve az ábrán), majd onnan foton kibocsátása közben
tér vissza az S0 alapállapotba (kék fotonok kk.fl sebességi állandóval jelölve az
ábrán).
A gerjesztett elektronállapotból származó fényemissziót (fluoreszcencia, foszforeszcencia)
gyűjtőnéven lumineszcenciának nevezzük.
A lumineszkáló anyagot többféle paraméterrel lehet jellemezni (spektrális eloszlások,
kvantumhatásfok, élettartam, polarizációfok), ezeket fogjuk részletesebben megismerni a
következő néhány dián keresztül. Az egyik ilyen paraméter az abszorpció és az emisszió
spektrális eloszlása:
 Emissziós (kibocsájtási) spektrum: az emittált fény intenzitását ábrázolja a hullámhossz
függvényében. A spektrumot úgy lehet felvenni, hogy egy adott hullámhosszon
gerjesztjük a molekulát és megmérjük a kibocsátott, eltérő hullámhosszúságú fotonok
intenzitását spektrofluoriméterrel. A molekula emissziós spektruma reprezentálja az
alapállapot vibrációs szintrendszerét, mivel ezek a fotonok akkor keletkeznek, amikor az
elektron az S1 gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az S0 alapállapot valamelyik
vibrációs szintjére relaxálódik.
 Gerjesztési (excitációs) spektrum: úgy állítjuk elő, hogy az emisszió fényintenzitását
egyetlen hullámhosszon mérjük, miközben a gerjesztési hullámhosszt folyamatosan
változtatjuk. A függvény alakja az abszorpciós spektrummal azonos, amely az
abszorbancia hullámhosszfüggését adja meg. A gerjesztési spektrum a gerjesztett állapot
vibrációs szintrendszeréről ad felvilágosítást. Atomok esetében a spektrum nagyon
keskeny, vonalas szerkezetű, azonban molekulák esetén, oldatban szélesebb, sávos
szerkezetű.
A triptofán egy természetesen lumineszkáló aminosav, melynek az abszorpciós (lila görbe) és
az emissziós spektrumai (kék görbe a fluoreszcencia, zöld görbe a foszforeszcencia) láthatóak
az ábrán. A jobb felső sarokban a Jablonski diagramon láthatók a spektrumokhoz rendelt
elektronátmenetek hasonló színekkel.
 A Stokes-féle eltolódás miatt az emissziós spektrum csúcsa az abszorpciós spektrum
csúcsához képest mindig a vörösebb tartomány (hosszabb hullámhossz) felé tolódik,
hiszen az emittált fotonok energiája mindig alacsonyabb, mint az abszorbeált fotonok
energiája.
 A foszforeszcencia emissziós spektrum csúcsa a fluoreszcencia spektrum csúcsához
képest mindig el van tolódva a hosszabb hullámhossztartományok felé, mert a
foszforeszcencia során kibocsátott foton energiája alacsonyabb, mint a fluoreszcencia
során kibocsátott foton energiája.
 Az abszorpciós és a fluoreszcencia spektrumok alakja egymásra tükörszimmetrikus.
 A triptofán foszforeszcencia spektrumát (zöld görbe) 77K-en rögzítették, emiatt
felbomlott vibrációs sávokra: az első maximum felel meg a T1 és az S0 legalacsonyabb
energiájú vibrációs állapota közötti fotonenergiának, a többi maximum pedig azokat az
átmeneteket mutatja, amikor az S0 magasabb energiájú vibrációs szintjére történt a
relaxáció. A másik két spektrumban ezek a részletek elmosódottak és nem látszódnak.
A fehérjéknek általában 280nm-nél van az abszorpciós maximumuk, míg a
nukleinsavaknak 260nm-nél.
Molekulák abszorpcióját spektrofotométerrel lehet meghatározni, melynek felépítése a
jobb felső ábrán látható. A berendezéssel mérjük a mintára beeső (I0) és a mintán áthaladó
(I) sugárzások intenzitását. Az abszorpció során bekövetkező fényintenzitás gyengülésére
érvényes az intenzitásgyengülés általános törvénye: I  I 0 10  L , ahol I a kilépő fény, I0 a
belépő fény intenzitása, μ az abszorpciós együttható és L a rétegvastagság vagy optikai
úthossz. Ha híg oldatot vizsgálunk, akkor az abszorpciós együtthatót a   c   képlettel
lehet kifejezni, ahol c az oldat koncentrációja (az abszorbeáló részecskék mennyisége) és ε az
anyag moláris abszorpciós együtthatója, aminek értéke függ többek között a fény
hullámhosszától is. Híg oldatok fényabszorpcióját az így kapott Lambert-Beer törvény írja
le: I  I 0 10 cL . A transzmittancia (T, áteresztőképesség) azt mutatja meg, hogy a minta a
beeső fény hányadrészét engedi át: T  I , melynek értéke 0 (minden fény elnyelődik) és 1
I0
(nincs fényelnyelés) között változhat. Az abszorbancia (A, elnyelőképesség, optikai denzitás)
a A   log T    c  L képlettel határozható meg.
Spektrofluoriméterrel lehet mérni a molekulák emisszióját, melynek felépítése látható az
ábrán. Az abszorpciós spektrofotométerhez képest két jelentős különbséget figyelhetünk
meg. Itt két monokromátort kell alkalmaznunk, hiszen nemcsak a megvilágító fény
hullámhosszúságát kell tudnunk szabályozni, hanem a kibocsátott fényből is ki kell tudnunk
választani a kívánt (jellemző) hullámhosszúságú komponenst. A másik különbség, hogy itt a
megvilágítást és a detektálást végző optikai elemek nem egy tengelyben vannak elhelyezve,
hanem azok egymással leggyakrabban derékszöget zárnak be.
Az ultraibolya és a látható fény hullámhossztartományában alkalmazott abszorpciós
spektrofotometria alapvető jelentőségű az orvosi gyakorlatban. Segítségével lehet
azonosítani ismeretlen anyagokat, mennyiségüket és biológiai aktivitásukat is meg lehet
határozni, valamint szerkezetükről és a környezetükkel való kölcsönhatásukról is tudunk
információhoz jutni.
Az abszorpciós spektrumok meghatározására alkalmas eszközök a spektrofotométerek. A
fényforrás fényét kollimátorral (egy gyűjtőlencsével) párhuzamossá kell tenni, majd az így
nyert fénysugarakat a monokromátoron keresztülvezetni, amivel ki tudunk választani egy
szűk hullámhossztartományt, azaz olyan hullámhosszúságú fotonokat, amivel a mintát
gerjeszteni tudjuk. A mintát adott rétegvastagságú (L) követtába helyezve tesszük a detektor
előtt lévő mintatartóba, és detektáljuk a mintán áthaladt fotonok intenzitását, miután a
minta elnyelte a fény egy részét (ami a gerjesztéséhez szükséges).
Spektrofluoriméterrel lehet meghatározni molekulák gerjesztési vagy emissziós
spektrumát. A spektrofluoriméterben nemcsak a fényforrás után van monokromátor, amivel
kiválasztjuk a megfelelő gerjesztési hullámhosszúságú fotonokat, hanem a detektor előtt is,
ugyanis a minta által emittált fotonokat is megszűrjük a hullámhosszúságuk alapján.
Leggyakoribb az olyan elrendeződés, ahol a fluoreszcencia megfigyelésének iránya
merőleges a gerjesztő fény irányára, ugyanis ebben az esetben tudjuk teljesen
megakadályozni, hogy a gerjesztő fényből is jusson a detektorra. A műszer beállításától
függően fel tudjuk venni az oldatban lévő fluoreszcens molekula gerjesztési és emissziós
spektrumát is.
A spektrális eloszlások mellett a fluoreszcencia kvantumhatásfoka (Q) az egyik legfontosabb
paraméter, ami jellemzi a festék emissziós képességét, és meghatározható a fluoreszcencia
N emittált foton
során kibocsátott és elnyelt fotonok számának a hányadosaként: Q  Ki lehet
N elnyelt foton
fejezni a különböző relaxációs folyamatokat jellemző sebességi állandók hányadosaként is:
k fl
Q Értéke mindig 1-nél kisebb, mert a gerjesztett állapotból az alapállapotba
k fl  kic  kisc
való átmenet nemcsak fotonemisszió révén valósulhat meg. Értéke függ a
molekulaszerkezettől és a környezeti paraméterektől (hőmérséklet, oldószer, viszkozitás,
kölcsönhatás környező molekulákkal). Fluoreszcenciás jelzőanyagnak használt festék
(fluorofór) esetén követelmény a nagy kvantumhatásfok. Nézzünk egy példát, amit a
sejtbiológia gyakorlaton is használni fogunk következő félévben a sejtmagok megjelölésére: a
propídium-jodid DNS-be interkalálódó festék, melynek kvantumhatásfoka a DNS-hez
kötődve sokkal nagyobb (Q>0,9), mint a szabad festéké vizes oldatban (Q=0,05). Ez azt
jelenti, hogy a DNS-hez kötődött festék sokkal intenzívebben világít, mert bekötődve védve
van az oldószer molekuláival való ütközéstől és így a fluoreszcencia kioltásától.
A fluoreszcencia intenzitása (I) megadja az időegységenként kibocsátott fotonok számát, és
arányos a besugárzó fény intenzitásával, az okozott abszorpcióval (cL) és a
kvantumhatásfokkal.
A fluoreszcencia intenzitását gyakran befolyásolja az oldat pH-ja és az oldószer anyagi
minősége is.
Az ábra a fluoreszcencia intenzitás exponenciális csökkenését mutatja az idő
függvényében. A gerjesztett állapotban lévő molekulák száma exponenciálisan csökken az
idővel, hiszen a gerjesztés megszűnése után a molekulák visszatérnek az alapállapotba, és a
 ( k f  kic  kisc ) t
kibocsátott fotonok száma időben lecseng. Egy adott t időpontban az N  N 0 e
egyenlet írja le a gerjesztett állapotban lévő molekulák számát (N).
A fluoreszcencia élettartam (τ) az az időtartam, amely alatt a fluoreszcencia intenzitás e-ad
1
részére, azaz a kiindulási intenzitás 37%-ára csökken le:   Mivel a gerjesztett
k f  kic  kisc
molekula nemcsak fluoreszcencia révén tud relaxálódni, a fluoreszcencia élettartam
kiszámításakor figyelembe kell venni a többi, fotonemisszió nélküli relaxációs folyamatot is
(belső konverzió, intersystem crossing). A grafikonon látható, hogyan lehet a fluoreszcencia
intenzitás időfüggő csökkenéséből a fluoreszcencia élettartamot leolvasni. A definícióból
következően a fluoreszcencia élettartam az az idő, amelynél az intenzitás a kiindulási Imax
intenzitás az e-ad részére csökkent (Imax/e).
A fluoreszcencia élettartam (τ) a gerjesztett molekulák által átlagosan a gerjesztett
állapotban eltöltött idő, melyet befolyásol a többi, relaxációhoz vezető folyamat (belső
1
konverzió, intersystem crossing):   Értéke 10-9–10-7s közé esik, és érzékeny a
k f  kic  kisc
mikrokörnyezet polaritására és a pH-jára. Homogén rendszer élettartama egy komponensből
áll, viszont heterogén rendszerek esetén több komponens mérhető.
A gerjesztett állapotban eltöltött idő alatt a molekula a környezetével számos
kölcsönhatáson mehet át, melynek következtében csökken a fluoreszcencia élettartama:
 Ütközéses kioltás: a gerjesztett molekula által kibocsátott fény intenzitásának
csökkenése olyan nem fluoreszkáló molekula jelenlétében, mely elektronszerkezete
megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő molekulával ütközve annak
gerjesztési energiáját átvegye, majd azt valamilyen formában kisugározza (például hő). A
diffúzió nagy mértékben befolyásolja az ütközéses kioltást.
 Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET): a gerjesztett állapotban lévő
molekula (donor) dipól-dipól kölcsönhatás során (sugárzás nélküli folyamat) átadja az
energiáját a közelében lévő (2-10nm), és spektrálisan is megfelelő molekulának
(akceptor), ezáltal fotonemisszió nélkül tér vissza az alapállapotba (l. később).
 Intersystem crossing (isc): a szingulett-triplett átmenet is csökkenti a fluoreszcencia
élettartamot (a triplett állapotból történő fotonemisszió, a foszforeszcencia élettartama
viszont nagyobb, mint a fluoreszcencia élettartama)
 Rotációs mozgás
A bal oldali ábra hasonló a 17. dián látható ábrához, a fluoreszcencia intenzitás (I) időbeli
lecsengését mutatja. A jobb oldalon látható a radioaktív bomlás során az elbomlatlan
atommagok számának (N) csökkenése az idő függvényében (lásd részletesebben ’Az
atommag összetétele, szerkezete, a mag kötési energiája, radioaktivitás, radioaktív bomlási
törvény, radioaktív sorozatok’ című előadásban).
Mindkét esetben t=0 időpillanatban maximális a fluoreszcencia intenzitás (I0), illetve az
elbomlatlan atommagok száma (N0). Összehasonlítva a két ábrát láthatjuk, hogy mind a két
függvény ugyanolyan exponenciálisan csökkenő görbével írható le, amiből
meghatározható az élettartam (τ és T): ennyi idő alatt csökken e-ad részére, azaz a kezdeti
érték 37%-ára a fluoreszcencia intenzitás (I0/e) vagy az elbomlatlan atommagok száma
(N0/e). Az exponenciális függvények meredeksége függ a fluoreszcens molekulák, illetve a
radioaktív atommagok anyagi minőségétől, rövidebb élettartam esetén meredekebben
csökken. Bár a fluoreszcencia és a radioaktív bomlás teljesen más típusú folyamatok,
mindkettő időfüggését exponenciális függvény írja le. Ez abból következik, hogy mindkét
folyamat esetében az „esemény” (fluoreszcens foton kibocsátása, radioaktív bomlás)
véletlenszerűen, a többi atomtól vagy molekulától függetlenül következik be.
A fluorofórok olyan molekulák, amelyek fluoreszcenciára alkalmasak. Ez a fluoreszcencia
lehet natív (intrinsic) fluoreszcencia, amely az élő sejteket felépítő egyes anyagokból
származik, vagy származhat szelektíven kötődő, külső (extrinsic) fluorofórokból is.
A fluorofórokat (leginkább a külső fluorofórokat) fel tudjuk használni biológiai rendszerek
vizsgálatára (pl. sejtalkotók megjelölése), molekulán belüli és molekulák közötti
kölcsönhatások tanulmányozására, molekuláris szintű távolságmérésre (FRET), molekuláris
mozgások vizsgálatára, stb.
 Intrinsic, natív (belső) fluorofórok: UV-ben gerjeszthető aromás aminosavak (triptofán,
tirozin, fenilalanin), NADH, A-, B-, C-vitamin. Az esetek nagy részében a natív
fluoreszcenciát (ez az autofluoreszcencia) inkább kiküszöbölni igyekeznek, amikor
szelektíven kötődő fluoreszcens festékeket alkalmaznak.
 Extrinsic (külső) fluorofórok: Különböző nem fluoreszcens sejtalkotók megjelölésére
használják ezeket. Fluoreszcens molekulákat köthetünk antitestekhez (az antitestek nagy
affinitással kötődnek az általuk felismert antigénhez), vagy fehérjéket is jelölhetünk
amino-reaktív vagy maleimid csoportot tartalmazó fluoreszcens festékekkel (pl.
fluoreszcein, rodamin származékok), toxinokhoz is köthetünk fluoreszcens festékeket
(pl. falloidin: F-aktinhoz kötődik, β-skorpiótoxin: feszültségfüggő K-csatornához kötődik).
Ebbe a csoportba sorolhatók a fluoreszcens fehérjék is. Ezek első típusa az ún. zöld
fluoreszcens fehérje (GFP), amely egy Aequorea victoria nevű medúza saját, természetes
fehérjéje, amely az állat számára zöldes derengést biztosít. A GFP-t széleskörűen
használják a biológiai kutatás során, hiszen génjét tetszőleges fehérje (pl. aktin) génjével
 össze lehet kapcsolni. Az így létrejövő ún. fúziós fehérje tehát tartalmazza a funkcióképes
aktint, és a fluoreszkáló GFP-t. Az aktin-GFP fúziós fehérjét sejtekbe juttatva vizsgálható
az aktin sejten belüli elhelyezkedése. A GFP módosításával rendkívül sokféle színű
fluoreszcens fehérje származékot állítottak elő.
A ’Kiegészítő anyagok’ részben több információt is lehet találni a fluorofórokról.
Az ábra összefoglalja a biológiai alkalmazásoknál leggyakrabban használt fluorofórok
méreteit. A fluorofórokat leggyakrabban valamilyen biológiai célmolekula láthatóvá tételére
használjuk. Mivel az így fluoreszcenssé tett célmolekula viselkedését, eloszlását szeretnénk
vizsgálni, optimális esetben a fluorofór a célmolekula tulajdonságait nem szabad, hogy
befolyásolja. Ezért célszerű, ha a fluorofór mérete sokkal kisebb, mint az általa megjelölt
biológiai célmolekula mérete. Láthatjuk, hogy a fluoreszcens festékek (Atto565, Cy3,
Alexa488, …) mennyivel kisebbek, mint az antitestek (IgG), amikhez a festékeket hozzákötik,
és így a festékkel jelölt antitestet fel lehet használni fehérjék vagy makromolekulák
megjelölésére in situ (sejtekben) vagy ex vivo (sejtekből kivonva). A quantum dot-ok (QDot)
félvezető nanokristályok, melyek emissziós hullámhossztartományai függenek a méretüktől.
Általában széles gerjesztési és keskeny emissziós spektrummal rendelkeznek, fotostabilak és
hosszú a fluoreszcencia élettartamuk, emiatt sokszor előtérbe kerül a használatuk egyéb
fluoreszcens festékekkel szemben. Méretük azonban a fehérjék méretével összemérhető,
általában 15-20nm között van.
A fluorofórokat alkalmazhatjuk immunofluoreszcenciában (festékkel jelölt antitest kötődik
antigénhez), lehetnek pH indikátorok vagy adott ionokra specifikus festékek (pH-tól vagy
ionkoncentrációtól függően eltérő a festék gerjesztési vagy emissziós maximuma vagy
fluoreszcencia kvantumhatásfoka), de membránpotenciál mérésre és DNS jelölésére is
alkalmasak.
Az ábra összefoglalja, hogy fluoreszcenciát lehet mérni a már korábban részletesen
megtárgyalt spektrofluoriméterrel, melyet oldatok vizsgálatára használunk, és beállítástól
függően fel tudjuk venni a fluoreszcens molekulát tartalmazó oldat gerjesztési és emissziós
spektrumát. A megfelelő hullámhosszúságú fotonokat monokromátorral választjuk ki.
Fluoreszcens mikroszkóppal lehet akár élő sejteket is vizsgálni. A fluorofórnak megfelelő
emissziós tartományt általában optikai szűrővel választjuk ki. A fluorofórt gerjesztő
hullámhosszt vagy szintén optikai szűrővel választjuk ki egy széles spektrumú lámpa
fényéből, vagy monokromatikus lézert használunk (ez utóbbit általában konfokális
mikroszkópiában használják, l. egy későbbi előadásban). A mikroszkóp kiválóan alkalmas a
fluoreszcencia intenzitás sejten vagy szöveten belüli eloszlásának tanulmányozására. A
biofizika laborgyakorlat során is használunk fluoreszcens mikroszkópokat fluoreszcens
gyöngyök tanulmányozására, valamint következő félévben a sejtbiológia gyakorlaton
sejtalkotók vizsgálatára.
A fentieken kívül akár áramlási citométerben is lehet fluoreszcenciát mérni (erről
részletesebben az ’Áramlási citometria és konfokális mikroszkópia’ előadásban lesz szó).
Az ábra egy fluoreszcencia mikroszkóp vázlatos felépítését mutatja. A fényforrás által
emittált széles hullámhossztartományú fotonokból a gerjesztési szűrővel kiválasztjuk azokat,
amelyekkel a mintában lévő fluorofór gerjeszthető (a fotonok hullámhossza fedjen át a
fluorofór gerjesztési spektrumával). A gerjesztő és az emittált fotonok szétválasztása
érdekében dikroikus tükröt alkalmazunk, amely visszaveri azokat a fotonokat (gerjesztő
fény), melyek hullámhossza egy adott értéknél kisebb, és az adott hullámhossznál nagyobb
hullámhosszúságú fotonokat (emittált fény) átereszti. Ez a tükör olyan szögben van
elhelyezve a mikroszkópban, hogy a gerjesztő fényt pont a mintára verje vissza. Mivel a
minta által emittált fotonok hullámhossza magasabb (energiája alacsonyabb), mint a
gerjesztő fotonok hullámhossza, a dikroikus tükrön keresztül eltérítés nélkül eljutnak az
emissziós szűrőig, mellyel le tudjuk szűkíteni az okulárba jutó fotonokat hullámhosszuk
alapján. A fluoreszkáló molekulák a sötét háttér miatt jól láthatóak, ezért nagy pontosságú
mérések is elvégezhetőek. Erről részletesebben a ’A geometriai optika alapjai. Optikai
mikroszkópia’ előadásban lesz szó.
Az ábrán látható, hogyan helyezkednek el a gerjesztési és emissziós szűrők, valamint a
dikroikus tükör egy úgynevezett szűrőkockában. Az optikai szűrőket több csoportba lehet
sorolni attól függően, hogy milyen hullámhossztartományban engedik át a fotonokat:
 Aluláteresztő szűrő (Short Pass, SP): azokat a fotonokat engedi át, amelyek
hullámhossza egy adott értéknél kisebb, és az ennél nagyobb hullámhosszúságú
fotonokat nem engedi át.
 Felüláteresztő szűrő (Long Pass, LP): az előző ellentéte, azokat a fotonokat engedi át,
amelyek hullámhossza egy adott értéknél magasabb, és blokkolja azokat, amiknek a
hullámhossza ennél az értéknél alacsonyabb.
 Sáv szűrő (Band Pass, BP): egy adott hullámhossztartományban a fotonokat átengedi, a
tartományon kívül pedig blokkolja a fotonokat.
 Dikroikus tükör (dichroic mirror, DM): egy adott hullámhossz alatti fotonokat visszaveri,
a többit átengedi (részletesebben tárgyalva az előző diánál).
A dián fluoreszcens mikroszkóp által felvett képeket látunk, ahol különböző sejtalkotók
vannak fluoreszcensen megjelölve.
Fotoelhalványítás az egyik leggyakrabban előforduló probléma mikroszkópos képalkotás
során. A fluorofór anyagi minőségétől függően csak meghatározott számú gerjesztési és
emissziós cikluson mehet keresztül, azaz egy idő után már nem képes fotonokat
abszorbeálni. A fotoelhalványítás egy fotokémiai reakció, amelynek során megszűnik a
fluorofór abszorpciós képessége, és irreverzibilisen elveszíti fluoreszcens tulajdonságát. A
folyamat ugyanúgy a fluorofór gerjesztett állapotából indul, mint a fluoreszcencia.
Azonban a fotoelhalványítás gyakran intersystem crossing után következik be, tehát
magába foglalja a fluorofór triplett állapotát is. A fotoelhalványítás folyamatát befolyásolja
a gerjesztés során alkalmazott fény intenzitása és a gerjesztés időtartama: minél hosszabb
ideig tart a megvilágítás, és minél nagyobb intenzitású fénnyel, annál hamarabb következik
be a fluorofórok fotoelhalványítása, illetve annál több fluorofór molekulát érint. Oxigén
jelenlétében is általában gyorsabb a folyamat, de mindenképpen függ a fluorofór
tulajdonságaitól is.
A dia jobb alsó részén levő a és b ábrákon a fotoelhalványítás vizsgálati lehetőségei, ill.
megnyilvánulásai láthatók. (a) Ha a fluoforórokat rövid ideig (<1 ns) tartó, de rendkívül
intenzív gerjesztő fénynek tesszük ki, akkor a fotoelhalványítás abban nyilvánul meg, hogy
az egymást követő impulzusok után mérhető fluoreszcencia maximális értéke folyamatosan
csökken (hiszen minden egyes impulzus csökkenti a fluoreszcenciára még képes fluorofórok
számát). A gerjesztő fény kikapcsolását követő exponenciálisan csökkenő görbék a
fluoreszcencia időbeli lecsengését mutatják (l. 17. dia) (b) Ha a fluorofórokat időben
folyamatos megvilágításnak tesszük ki, akkor a fotoelhalványítás abban nyilvánul meg, hogy
a gerjesztő fény intenzitásától függő időskálán csökken a fluoreszcencia intenzitása (szintén
azért, mert csökken a fluoreszcenciára képes fluoforórok száma).
Az ábrán különböző sejtalkotókat jelöltek meg fluoreszcensen. A kék színnel világító Hoechst
festékkel a sejtmagot tették láthatóvá. A nagy intenzitású gerjesztő fény hatására a Hoechst
festék fotoelhalványítást szenved, és az egymást követő mikroszkópos képeken egyre
kevésbé látszik.
A fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) során két fluorofór molekula van jelen, a
donor (D) és az akceptor (A). Nézzük meg mi történik a folyamat során (jobb felső ábra):
 Gerjesztjük a donort, és a donor a Kasha-szabály értelmében eljut az S1 állapot
alapvibrációs szintjére. Ha az akceptor 2-10nm közelségben van, akkor a korábban már
tárgyalt relaxációs folyamatok (belső konverzió, fluoreszcencia, intersystem crossing)
mellett egy újabb relaxációs lehetőség áll a donor rendelkezésére: dipól-dipól
kölcsönhatás révén átadhatja energiáját az akceptornak.
 A donortól átvett energia miatt az akceptor gerjesztődik, a donor pedig visszatér az
alapállapotába.
 A gerjesztett akceptor vagy foton kibocsátása közben, vagy termikus relaxáció során
visszatér az alapállapotába.
 Azonban, ha az akceptor 10nm-nél messzebb van a donortól, akkor a gerjesztett
állapotban lévő donor nem fogja tudni átadni az energiáját az akceptornak, hanem foton
kibocsátása közben, vagy termikus relaxáció során visszatér az alapállapotba (bal felső
ábra), így ebben az esetben az akceptor nem tud gerjesztődni.
Összefoglalva azt mondhatjuk, hogy a folyamat során gerjesztettük a donort, és ha FRET
bekövetkezik (D-A távolság 2-10nm), akkor detektáljuk az akceptor által emittált
fotonokat, ha viszont nincs FRET, akkor csak a donor által emittált fotonokat tudjuk mérni.
Láthatjuk, hogy a FRET bekövetkezése nagymértékben függ a donor-akceptor távolságtól
(1/R6, ahol R a donor és az akceptor távolsága), emiatt ’spektroszkópiai vonalzó’-nak is
szokták nevezni, és felhasználják molekula asszociációk, fehérje-fehérje és receptor-ligand
kölcsönhatások vizsgálatára.
Mivel a FRET is egy újabb relaxációs lehetőséget biztosít a gerjesztett donor számára, ezért
a relaxáció gyorsabban fog bekövetkezi. Ennek következtében a donor fluoreszcencia
időtartama lecsökken, ha a donortól 10nm-es távolságon belül van egy megfelelő akceptor
molekula. Mivel a FRET tulajdonképpen verseng a fluoreszcenciához vezető relaxációs
folyamattal, ezért kevesebb gerjesztett donornak lesz lehetősége fluoreszcens fotont
emittálni. Ez abban nyilvánul meg, hogy csökken a donor fluoreszcencia intenzitása. Mivel a
FRET során az akceptor gerjesztett állapotba kerül, értelemszerűen az akceptor
fluoreszcencia intenzitása növekedni fog donor jelenlétében.
Ahhoz, hogy FRET bekövetkezzen, nem elég, hogy a donor-akceptor távolság 2-10nm
legyen, számít a két fluorofór megfelelő relatív orientációja, valamint a donor emissziós
spektrumának (szaggatott zöld spektrum) átfedésben kell lennie az akceptor abszorpciós
spektrumával (folytonos sárga spektrum). Ez az átfedés a szürke terület a grafikonon. A
spektrumok mellett a FRET Jablonski sémája látható. A donor szaggatott vonallal jelölt, FRET-
hez vezető relaxációs folyamata (amely különböző a többi, fluoreszcens és belső konverziós
relaxációs lehetőségtől) a donort visszajuttatja az alapállapotba, miközben az akceptor
gerjesztett állapotba kerül az energiaátadás következtében.
A bal alsó képlet írja le az energiatranszfer hatásfokának (E) távolságfüggését, amely a
R6
donor-akceptor távolság (R) hatodik hatványával fordítottan arányos: E  6 0 6 , ahol R0
R0  R
az a D-A távolság, ahol a transzfer hatásfoka pontosan 0,5. Ezt a távolságfüggést mutatja a
mellette lévő ábra, ahol a rózsaszínnel kijelölt tartományban az energiatranszfer hatásfoka a
D-A távolság függvényében érzékenyen változik.
A FRET módszer érzékeny távolságfüggése miatt felhasználható intermolekuláris (molekulák
közötti) és intramolekuláris (egy molekulán belüli) távolságok mérésére egyaránt,
konformációs változások kimutatására, vagy akár különböző molekulák, ionok jelenlétének
detektálására (pl. kinázok, proteázok, fémionok,…). Az ábra két példát mutat a FRET
felhasználási köréből, az egyik amikor proteáz szenzorként, a másik amikor kalcium
szenzorként alkalmazzuk.
Ha a donor (CFP, cyan fluorescent protein) és az akceptor (YFP, yellow fluorescent protein)
fluorofórok egy kaszpáz érzékeny linker két végén vannak elhelyezve, FRET távolságon belül,
akkor proteáz szenzorként lehet a FRET mérést alkalmazni. Ha nem detektálunk FRET-et, az
azt jelenti, hogy a két fluorofór egymástól eltávolodott, azaz a kaszpáz (proteáz) elhasította
a linkert. Így a szenzort a mintában jelen lévő proteáz kimutatására lehet használni.
Hasonló elven működik a kalcium szenzor is, csak ott egy kamlcium kötő fehérje (pl.
troponin C) a linker, aminek a két végén található a donor (CFP) és az akceptor (YFP)
fluorofór, melyek csak akkor kerülnek FRET távolságon belülre, ha a fehérje kalcium iont köt
meg és ezáltal megváltozik a konformációja. Azaz ebben az esetben a FRET mértéke arányos
a mintában levő kalcium ion koncentrációjával.