ПОСТУПАК ПРАВЉЕЊА МИКРОСКОПСКОГ ПРЕПАРАТА И БОЈЕЊА

- Припремање плочице (микросопског стакла): Предметно стакло треба

да буде савршено чисто и суво. Плочице се оперу детерџентом, исперу
водом и потопе у чашу са 96% алкохолом. Пре употребе сваку плочицу
осушити (меким филтер папиром или чистом крпом), држећи плочицу
за ивице, палцем и кажипрстом. Провући плочицу кроз пламен,
проверити читсоћу стављањем капи дестиловане воде, која ће се
правилно разливати, уколико је плочица чиста. У противном поновити
поступак.
- Узимање материјала за посматрање: Езу, којом се узима материјал,
целом дужином провући кроз пламен (до држача езе), задржавајући
се тако да сваки део буде изложен пламену неколико секунди.
Уколико се микроорганизми, нпр.бактерије наносе из течне хранљиве
подлоге, довољно је 2-3 пута захватити езом и суспензију ставити на
центар плочице. Уколико се материјал узима са чврсте хранљиве
подлоге, потребно је претходно ставити на плочицу кап водоводске
воде или физиолошког раствора, затим езом узети мало материјала
(величине главе чиоде) и размутити материјал у капи раствора, да се
добије суспензија бледо млечне боје. Тако се постиже да у препарату
нема исувише ћелија што може отежати посматрање.
Потребно је кап нанесеног материјала размазати езом по површини и
осушити.
- Фиксирање: је процес који зауставља ензимску активност ћелије и
доводи до лепљења ћелије на плочицу, те се не могу скинути са ње
приликом процедуре бојења.
Суви размаз се фиксира брзим проношењем плочице (5- 6 пута) изнад
пламена и тада је препарат спреман за бојење. ВАЖНО је пре бојења
обележити страну плоче на коју је нанесен материјал, лепљењем
етикете или обележавањем оловком. У фиксираном препарату се
углавном налазе мртве ћелије, са изузетком спорогених
микроорганизама, па треба бити пажљив приликом руковања
препаратима патогених микроорганизама (могућа инфекција).
По правилу место одређено за бојење налази се близу чесме и на њему су
припремљени радни раствори боја у бочицама са капаљкама које се користе
за бојење и неопходан прибор.
Он се састоји од:
➢ кадице за бојење,
➢ статива за бојење,
➢ филтар- папира и др.
Кадица за бојење је плитка, најчешће стаклена посуда, у коју се одливају боје
после бојења и вода након испирања препарата.
Сталак за бојење се импровизује спајањем две стаклене цевчице преко
гумених цеви, тако да се поставе паралелно преко кадице за бојење у
размаку од 3-4 cm. На статив се постављају направљени, осушени и
фиксирани размази материјала, а затим се приступа бојењу.

Бојење по Граму је најчешће сложено бојење које се користи за бојење

препарата у бактериологији.
Оно омогућава не само да се уочи облик бактерија, већ и да се на основу
начина примања боје, одреди којој групи бактерија у препарату припада
према структури свог ћелијског зида (Грам- позитивне, Грам- негативне).
Припремљен и фиксиран размаз прелије се најпре генцијаном виолет која
делује 1- 2 минута. Боја се испере водом да не би оставила талог, па се
препарат прелије Луголовим раствором у трајању од једног минута. После
одливања Лугола препарат се испира 96%- тним етанолом пола минута, па се
опет опере водом. На крају се препарат прелије карбол-фуксином пола
минута, потом се боја одлије, препарат опере водом, суши и, најзад,
микроскопира.
Бактерије се у овом размазу могу видети или као љубичасте Грам- позитивне
или ружичасте Грам- негативне или црвене, зависно од структуре њиховог
ћелијског зида.
Бојење по метилену је просто бојење.
- Након припремања и проверавања микроскопске плочице као што је
описано.
- Езом, стерилицаном на пламену, узме се мало течне културе са
бактеријама и направити размаз по плочици, осушити препарат,
фиксирати га над пламеном. Плочица се држи пинцетом и пази се да се
не прегреје, да не би пукла.
- Боја се припрема на следећи начин: 0,3 грама метиленског плавог се
раствори у 30,0 милилитара 96% етанола и дода се 100 милилитара
дестиловане воде.
- На фиксирани препарат се капаљком капну 1-2 капи боје. Потребно је
да боја остане на препарату 3-5 минута.
- Испирање боје се врши водоводском водом, пажљивим држањем
препарата паралелно млазу воде. Препарат се остави да се осуши и
посматра микроскопом (вода се може одстранити филтер папиром).
- При микроскопирању употребити прво мало увеличање и када се нађе
препарат, окренути велико увеличање и тек онда додати кедрово уље
и окренути имерзиони објектив.