Praktikum Toksikologi Klinik

Percobaan 9
PEMERIKSAAN COHb
(METODE CONWAY MICRODIFFUSION)

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat menentukan kadar COHb dalam darah (serum darah dan
secara spektrofotometri dengan metode Conway Microdiffusion.

B. Kompetensi Dasar
1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip penentuan kadar COHb dalam
darah menggunakan Conway Microdiffusion.
2. Mahasiswa dapat mengoperasikan alat spektrofometer dengan benar.
3. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar COHb
menggunakan metode Conway Microdiffusion.
4. Mahasiswa dapat menganalisis data.
5. Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan.
6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan.

C. Dasar Teori
Hemoglobin (Hb) merupakan salah satu jenis protein yang terdapat dalam sel
darah merah makhluk hidup. Tubuh membawa hemoglobin masuk dalam sel darah
merah dan memberikan perlindungan dari terjadinya proses denaturasi dalam plasma
dan keluar melalui ginjal. Hemoglobin bebas (non-RBC), yang dihasilkan dari sel darah
merah melalui proses hemolisis, memiliki waktu paruh pendek ketika berada di luar sel
darah merah (RBC). Konsentrasi hemoglobin dalam sel darah merah kira-kira 34. g/dL,
Fungsi utama hemoglobin adalah untuk mengangkut oksigen dari paru-paru ke jaringan
dan transportasi karbondioksida dari jaringan ke paru-paru untuk dihembuskan.
Hemoglobin juga berkontribusi pada keseimbangan asam-basa dengan mengikat dan
melepaskan ion hidrogen dan mengangkut oksida nitrat, pengatur tonus (tekanan)
pembuluh darah (Otto, 2020).
Karbonmonoksida (CO) merupakan suatu senyawa yang tidak berwarna, tidak
berbau, tidak memiliki rasa. CO merupakan suatu gas yang terbentuk dari sisa
pembakaran yang tidak sempurna suatau zat organic. Keracunan gas CO bisa
disebabkan akibat menghirup asap dari pembakaran zat organic seperti penggunaan
bahan bakar minyak atau suatu asap yang timbul dari sistem pemanas yang tidak
bekerja secara sempurna serta asap rokok.
CO memiliki efek toksik dalam tubuh dengan menyebabkan hipoksia pada
jaringan perifer. Sehingga hal ini dapat mengganggu proses pengangkutan / transportasi
oksigen (O2) oleh hemoglobin (Hb) serta dapat mengganggu proses respirasi sel.
CO berikatan dengan hemoglobin memiliki afinitas 240-250 kali apabila
dibandingan dengan hemoglobin berikatan dengan oksigen, untuk membentuk
carboxyhaemoglobin (COHb). Sehingga jumlah hemoglobin yang tersedia untuk
mengangkut gas oksigen (O2) berkurang. Dengan adanya karboksihemoglobin (COHb)
dan oksigenhemoglobin (Oxyhaemoglobin) maka kurva disosiasi terdistorsi dan
bergeser ke kiri. Sebagai akibatnya, oksigen cenderung tetap terikat pada hemoglobin
dalam sirkulasi perifer daripada dilepaskan ke dalam jaringan. Dengan kata lain, lebih
sedikit oksigen yang dibawa dalam sirkulasi, dan dari oksigen yang dibawa, banyak
yang tetap terikat menjadi hemoglobin dan tidak tersedia untuk respirasi jaringan
(Davies, 2010).
Selain pada efek pengangkutan oksigen oleh darah, CO juga mengganggu
transpor elektron yang terjadi di mitochondria dan proses seluler lainnya. Secara
keseluruhan, memiliki efek mengurangi pengiriman oksigen ke jaringan perifer, dan
mengurangi kemampuan jaringan dalam menggunakan oksigen. Jumlah ATP yang
terdapat dalam system seluler turun dan dapat mengakibatkan gagalnya fungsi vital
seluler. Dalam kasus keracunan yang parah, hal ini dapat menyebabkan gangguan pada
sistem pernapasan dan kardiovaskular, yang memperburuk transportasi oksigen
(Davies, 2010).
Spektrofotometri UV-Vis telah banyak digunakan dalam pemeriksaan kimia,
baik untuk analisis proses biokimia, kimia klinis ataupun penentuan jenis parameter
kimia klinis biokimia. Teknik pemeriksaan ini memungkinkan untuk penentuan
konsentrasi analit senyawa tertentu, hal ini disebabkan sebagian besar senyawa
biokimia memiliki karakteristik mampu menyerap daerah UV-Vis ataupun dirubah
dalam bentuk turunan lainya. Beberapa senyawa organik yang terjadi dalam sistem
biologi memiliki memiliki karakteristik mampu menyerap daerah UV-Vis, dan
beberapa jenis lain menunjukkan sedikit atau bahkan tidak terdapat penyerapan,
sehingga dibutuhkan teknik terhadap analit tersebut sehingga mampu berubah menjadi
zat penyerap yang berwarna. Dalam penetuan kadar suatu senyawa organic biological
yang berasal dari cairan tubuh seperti urin atau darah harus dirubah terlebih menjadi
senyawa kompleks berwarna. Perubahan analit menjadi senyawa kompleks dengan
karakteristik berwarna dapat dicapai melaui reaksi redoks, ataupun penambahan zat
anorganik seperti logam untuk membentuk senyawa kompleks berwarna (Rojas, 2013).
a. Sumber Karbon monoksida (CO)
Karbon monoksida yang terdapat di alam terbentuk dari salah satu proses sebagai
berikut :
1) Pembakaran tidak lengkap terhadap karbon atau komponen yang mengandung
karbon
Oksidasi tidak lengkap terhadap karbon atau komponen yang
mengandung karbon terjadi jika jumlah oksigen yang tersedia kurang dari
jumlah yang dibutuhkan untuk pembakaran sempurna dimana dihasilkan
karbon dioksida. Pembentukan karbon monoksida hanya terjadi jika reaktan
yang ada terdiri dari karbon dan oksigen murni. Jika yang terjadi adalah
pembakaran komponen yang mengandung karbon di udara, prosesnya lebih
kompleks dan terdiri dari beberapa tahap reaksi.
Secara sederhana pembakaran karbon dalam minyak bakar melalui
beberapa tahap sebagai berikut :
2C + O2 2CO
2CO + O2 2CO2
Reaksi pertama berlangsung sepuluh kali lebih cepat daripada reaksi
kedua, oleh karena itu CO merupakan intermediet pada reaksi pembakaran
tersebut dan dapat merupakan produk akhir jika jumlah O2 tidak cukup untuk
melangsungkan reaksi kedua. CO juga dapat merupakan produk akhir meskipun
jumlah oksigen di dalam campuran pembakaran cukup, tetapi antara minyak
bakar dan udara tidak tercampur rata. Pencampuran yang tidak rata antara
minyak bakar dengan udara menghasilkan beberapa tempat atau area yang
kekurangan oksigen. Semakin rendah perbandingan antara udara dengan
minyak bakar, semakin tinggi jumlah karbon monoksida yang dihasilkan.
2) Reaksi antara karbon dioksida dan komponen yang mengandung karbon pada
suhu tinggi
 Reaksi antara karbon dioksida dan komponen yang mengandung
karbon pada suhu tinggi dapat menghasilkan karbon monoksida dengan reaksi
sebagai berikut :
CO2 + C 2CO
Reaksi ini sering terjadi pada suhu tinggi yang umum terdapat pada
industri-industri, misalnya pada pembakaran di dalam furnish. CO yang
diproduksi dengan cara ini mempunyai keuntungan dan diperlukan pada
beberapa proses, misalnya pada furnish cepat, dimana CO bertindak sebagai
komponen produksi dalam produksi besi dari besi oksida.
3) Saat suhu tinggi, karbon dioksida terurai menjadi karbon monoksida dan O
Suhu tinggi merangsang pembentukan CO dan O. Sebagai contoh,
pada suhu 2960C terjadi disosiasi CO2 sebanyak 1 persen menjadi CO dan O,
sedangkan pada suhu 249,50C sebanyak 5 persen CO2 yang terdisosiasi
menjadi CO dan O. Jika campuran ekuilibruium pada suhu tinggi tiba-tiba
didinginkan, CO akan tetap berada dalam campuran yang telah diinginkan
tersebut karena dibutuhkan waktu yang lama untuk mencapai ekuilibrium yang
baru pada suhu rendah.
Berbagai proses geofisika dan biologis diketahui dapat memproduksi
CO. Proses-proses tersebut misalnya aktivitas vulkanik, emisi gas alami,
pancaran listrik dari kilat, germinasi dan pertumbuhan benih, dan sumber
lainnya. Tetapi kontribusi ke atmosfer yang disebabkan proses-proses tersebut
relatif kecil. Pembebasan CO ke atmosfer sebagai akibat aktivitas manusia lebih
nyata, misalnya transportasi, pembakaran minyak, gas arang atau kayu, proses-
proses industri seperti industri besi, petroleum, kertas dan kayu, pembuangan
limbah padat, dam sumber-sumber lain termasuk kebakaran hutan. Transportasi
menghasilkan CO paling banyak di antara sumber-sumber CO lainnya,
terutama dari kendaraan-kendaraan yang menggunakan bensin sebagai bahan
bakar. (Fardiaz, 2008)
b. Pengaruh Karbon monoksida (CO) terhadap manusia
Pengaruh beracun gas CO terhadap tubuh manusia terutama disebabkan
oleh reaksi antara CO dengan hemoglobin (Hb) di dalam darah. Hemoglobin di
dalam darah secara normal berfungsi dalam sistem transpor dalam membawa
oksigen dalam bentuk oksihemoglobin (O2Hb) dari paru-paru ke sel-sel tubuh dan
membawa CO dalam bentuk CO2Hb dari sel-sel ke dalam paru-paru.
 Adanya CO, hemoglobin dapat membentuk karboksihemoglobin, jika
reaksi tersebut terjadi maka kemampuan darah untuk mentransport oksigen menjadi
berkurang. Afinitas CO terhadap hemoglobin adalah 200 kali lebih tinggi daripada
afinitas oksigen terhadap hemoglobin, akibatnya jika CO dan O2 terdapat bersama-
sama diudara akan terbentuk COHb dalam jumlah jauh lebih banyak dari pada
O2Hb (Agusnar, 2007).
Faktor penting yang menentukan pengaruh CO terhadap tubuh manusia
adalah konsentrasi COHb yang terdapat dalam darah, dimana semakin tinggi
persentase hemoglobin yang terikat dalam bentuk COHb, semakin parah
pengaruhnya terhadap kesehatan manusia. Konsentrasi COHb di dalam darah
dipengaruhi secara langsung oleh konsentrasi CO dari udara yang terhisap (Agusnar,
2007).
Kadar 20 bpj CO dalam udara dapat menyebabkan manusia sakit, dalam
waktu 30 menit 1300 ppm dapat menyebabkan kematian. Menghisap gas yang
keluar dari knalpot mobil di ruang garasi tertutup lebih banyak menyebabkan
kematian (Sastrawijaya, 2009).
Keadaan normal konsentrasi CO di dalam darah berkisar antara 0,2%
sampai 1,0% dan rata-rata sekitar 0,5%. Kadar CO didalam darah dapat seimbang
selama kadar CO di atmosfer tidak meningkat dan pernafasan tetap konstan
(Mukono, 2008).
Gejala-gejala keracunan CO antara lain pusing, rasa tidak enak pada mata,
telinga berdengung, mual, muntah, detak jantung meningkat, rasa tertekan di dada,
kesukaran bernafas, kelemahan otot-otot, tidak sadar dan bisa meninggal dunia
(Mukono, 2008).
Tabel Pengaruh Konsentrasi COHb di dalam Darah Terhadap Kesehatan

Konsentrasi COHb di Pengaruhnya terhadap kesehatan

dalam darah
< 1.0 Tidak berpengaruh

1.0 – 2.0 Penampilan agak tidak normal

2.0 – 5.0 Pengaruh terhadap sistem syaraf sen-

tral, reaksi panca indra tidak normal,
benda terlihat agak kabur

5.0 – 10.0 Perubahan fungsi jantung dan pulmo-

nary
 10.0 – 80.0 Kepala pening, mual, berkunang-
kunang, pingsan, kesukaran bernafas,
kematian

c. Pemeriksaan CoHb metode sel Difusi Conway

Adanya karbon monoksida dalam darah dapat dideteksi dengan metode difusi
conway (Penny, 1996). Dalam metode ini asam sulfat digunakan untuk melepaskan
karbon monoksida dari molekul hemoglobin. CO kemudian berdifusi ke larutan PdCl2
dan mengurangi ion Pd2+ menjadi logam Pd, yang muncul sebagai cermin palladium
di permukaan larutan PdCl2.
Palladium merupakan logam transisi yang berada pada golongan VIIIB dan
banyak digunakan sebagai katalis. Garam maupun senyawa palladium telah lama
dikenal penggunaannya dalam reaksi sintesis organik yaitu sebagai katalis heterogen.
Tetapi dalam beberapa tahun terakhir ini penggunaan senyawa palladium sebagai
katalis homogen telah memberikan inovasi dalam reaksi sintesis organik (Tsuji, 1969).
Dalam pemeriksaan COHb, CO akan terlepas dari darah dan berdifusi pada PdCl2
dengan reaksi sebagai berikut :
Pd2+ + CO + H2O → Pd + CO2 + 2H+
Konsentrasi karbon monoksida dalam darah dinyatakan dalam persen, yaitu
persentase situs hemoglobin yang ditempati oleh molekul CO. Persentase ini adalah
ditentukan dengan mengukur konsentrasi karboksihemoglobin dengan
spektrofotometer, mengubah oksihemoglobin menjadi hemoglobin tereduksi, dan
mengukur konsentrasi hemoglobin dengan spektrofotometer. Rasio tersebut kemudian
memberikan persen karbon monoksida yang diinginkan (Ramieri, 1974).

D. Alat dan Bahan

Alat:
➢ Spektrofotometer UV-Vis
➢ Kuvet kaca/kuarsa
➢ Vacum tube
➢ Spuit
➢ Labu ukur 25,0 mL
➢ Labu ukur 10.0 mL
➢ Labu ukur 50.0 mL
➢ Pipet ukur 1.0 mL
 ➢ Pipet ukur 10.0 mL
➢ Mikropipet
➢ Neraca
Bahan :
➢ Darah EDTA
➢ PdCl2 0.005N
➢ KI 5%
➢ H2SO4 5N
➢ H2O

E. Prosedur

Metode Spektrofotometri

a) Preparasi sampel darah

• Buat sampel darah dalam vacumtube Na2EDTA >> sesuaikan
perbandingan yang disyaratkan vacumtube > syarat di ilmu plebotomi >>
b) Pembuatan Larutan induk (stock solution) PdCl2 konsentrasi 44%
❖ Buat larutan larutan induk PdCl2 konsentrasi 44% dalam labu takar 25,0
mL. >> Pahami makna konsentrasi yang diminta << >>b/v,v/v, b/b <<
>>satuan yang digunakan <<
• Lakukan perhitungan besaran massa PdCl2 ( Bovine Serum Albumin)
yang harus ditimbang dalam pembuatan larutan induk tersebut.
• Lakukan penimbangan massa PdCl2 ( Bovine Serum Albumin) sesuai
perhitungan diatas.
• Lakukan pelarutan massa yang telah ditimbang berdasarkan
perhitungan tadi dalam labu takar 25,0 mL menggunakan pelarut yang
sesuai (jangan lupa teknik pelarutan).
• Berilah label.
c) Pembuatan larutan deret seri standar PdCl2
❖ Buat larutan standar PdCl2 dengan konsentrasi 0, 0.616 %, 0.704 %, 0.792
%, 0.88 %, 0.968 % dan 1.056% dalam labu ukur 25.0 mL. >>ingat bentuk
awal larutan induk (stock solution) <<
• Lakukan perhitungan besaran volume larutan induk PdCl2 yang harus
dipipet dalam pembuatan setiap konsentrasi larutan deret standard tersebut.
>>ingat rumus <<
 C1V1=C2V2
Kons induk X Vol. Induk = Kons yang dinginkan X Vol. yang diinginkan
• Lakukan pemipetan larutan induk BSA ( Bovine Serum Albumin) sesuai
perhitungan diatas untuk tiap-tiap seri konsentrasi letakan dalam tabung
reaksi.
• Lakukan pelarutan volume larutan induk berdasarkan perhitungan
menggunakan pelarut yang sesuai (jangan lupa teknik pelarutan).
• Berilah label.
Konsentrasi Vol.Stock Vol.Pelarut > H2O (mL)
PdCl2 (%) solution 44 % (vol.stok solution + H2O = 25,0 mL)
(mL)
0,0 0,0 25,0

0.616 ? ?

0.704 ? ?

0.792 ? ?

0.88 ? ?

0.968 ? ?

1.056 ? ?

d) Pencarian Panjang gelombang maksimal

Penentuan panjang gelombang maksimal dalam analisis ini memiliki tujuan
untuk menentukan panjang gelombang pengukuran senyawa kompleks yang
terbentuk dari reaksi logam Cu2+ dengan 4 atom N dari peptida yang terdapat
dalam sampel dalam suasana basa membentuk senyawa kompleks tetradentat
menjadi yang berwarna ungu memberikan absorbansi optimum pada panjang
gelombang 540 nm – 560 nm (Rodger.A, Sanders, 2017 dan Dietzen,2018).
• Ambil larutan Aquades sebanyak 10.0 mL dalam labu ukur 25 mL.
• Tambahkan 1,0 mL pereaksi KI 5 %.
• Tambahkan 1,0 mL pereaksi PdCl2 0.005 N.
• Atur spektrofotometer pada panjang gelombang 400 – 600 nm, record
range (range Abs 0.0 -1.0), scan pitch (0.1 nm).
• Bilas kuvet yang digunakan dengan larutan yang akan dibaca .
 • Masukan larutan blangko (aquadest) dalam kuvet dan baca sebagai baseline
correction.>> Tekan menu baseline correction.
• Masukkan larutan deret standard 4 mg/mL dalam kuvet dan baca sebagai
pencarian Panjang gelombang maksimal. >> Tekan Start >> tunggu
sampai selesai
• Proses data yang diperoleh > lihat peak (puncak) yang diperoleh. > Catat
(cetak) hasil pengolahan data dimana data panjang gelombang maksimal
yang diperoleh. > Data ini digunakan untuk pemeriksaan deret standard
serta analisis sampel.
Hasil pencarian panjang gelombang maksimal ...............nm
e) Pembuatan kurva deret standar (baku) PdCl2
• Ambil larutan induk standard dengan konsentrasi 0, 0.616 %, 0.704 %,
0.792 %, 0.88 %, 0.968 % dan 1.056 % masukkan dalam tabung (setiap
konsentrasi dalam tabung sendiri) >> dari prosedur pembuatan seri
standard (point d).
• Atur spektrofotometer pada panjang gelombang X nm (X > Panjang
gelombang yang diperoleh dalam proses pencarian panjang gelombang),
record range (range Abs 0.0 -1.0), scan pitch (0.1 nm).
• Bilas kuvet yang digunakan dengan larutan yang akan dibaca (tiap-tiap
larutan dalam tabung seri standard).
• Masukan larutan 0 % dalam kuvet dan baca sebagai blangko.>> Tekan start.
• Masukkan larutan deret standard mg/mL dalam kuvet dan baca sebagai nilai
abs untuk seri standard kons 0.616 %. >> Tekan Start >> tunggu sampai
selesai.
• Masukkan larutan deret standard 0.704 % – 1.056 % mg/mL dalam kuvet
dan baca sebagai nilai abs untuk seri standard tiap-tiap konsentrasi. >>
Tekan Start >> tunggu sampai selesai. > Tiap konsentrasi dibaca berurutan
dari seri terendah sampai konsentrasi tertinggi.
• Proses data yang diperoleh > lihat data yang diperoleh pada layar. > Catat
(cetak) hasil data yang diperoleh. > Data ini digunakan untuk pembuatan
kurva baku.
• Buat kurva baku dari data pembacaan diatas hingga diperoleh persamaan
regresi linier. > Menggunakan Microsoft Office > Excel.
Contoh:

Konsentrasi Abs
protein (mg)
0,0 0,0

0.616 % 0,201

0.704 % 0,397

0.792 % 0,594

0.88 % 0,797

0.968 % 0,978

1.056 % 1,189

Data pembacaan deret baku PdCl2

Dari data diatas (data yang saudara peroleh dalam pembacaan deret
baku) maka buatlah kurva menggunakan Microsoft Excel hingga keluar
persamaan regresi.

Kurva baku
1,2

1 y = 0,1964x + 0,0034
R² = 0,9998
0,8
Abs

0,6

0,4

0,2

0
0 1 2 3 4 5 6
Konsentrasi (%))

Series2 Linear (Series2)

Gambar 1. Contoh kurva baku

Dari gambar 1 diperoleh persamaan y=0.1964x + 0.0034, dari persamaan

yang diperoleh ini kadar sampel yang dianalisa dihitung berdasarkan persamaan
regresi ini. >> ingat siapa x dan siapa y <<
e) Pembacaan nilai sampel

Gambar 1. Cawan Conway (Huddle, 2012)

Gambar 1. Skematik konfigurasi mikrodiffusion Cawan Conway (Jacson,R. 2017)

• Tambahkan 1.5 mL pereaksi aquadest bagian sisi luar cawan Conway

(sample chamber).
• Tambahkan 0.2 mL pereaksi H2SO4 5N pada bagian sisi luar cawan
Conway (sample chamber).
• Tambahkan 0.25 mL sampel darah pada bagian sisi luar cawan Conway
(sample chamber).
• Tambahkan sebanyak 1.0 mL PdCl2 0.005 N dan masukkan dalam cawan
conway bagian sisi dalam (capture chamber).
• Dengan segera tutup cawan conway.
• Homogenkan campuran yang terdapat dalam cawan Conway (di putar
secara perlahan jangan sampai larutan yang bearada dibagian luar
(sample chamber) tidak bercampur dengan bagian tengah cawan
Conway (capture chamber).
• Tunggu selama 37 menit (sesuai OT).
• Siapkan labu ukur 25.0 mL
• Tambahkan 10.0 mL Aquadest dan 1.0 mL KI 5% (menggunakan pipet
ukur).
• Setelah 37 menit, bagian tengah (bagian yang berisi PdCl2 0.005N)
diambil sebanyak 0.50 mL dimasukkan dalam labu ukur 25 mL (yang
telah berisi 10.0 aquadest dan 1.0 mL KI 5% ) >> pipet harus
menyentuh dasar agar lapisan tipis logam Pd tidak terhisap.
• Tambahkan pelarut (Aquadest) sampai tanda batas >> Ingat Teknik
pelarutan dan homogenisasi <<
• Atur spektrofotometer pada panjang gelombang A nm (A > Panjang
gelombang yang diperoleh dalam proses pencarian panjang
gelombang), record range (range Abs 0.0 -1.0), scan pitch (0.1 nm).
• Catat nilai abs sampel.
• Nilai normal kadar karboksihemoglobin sendiri menurut PERMENKES
RI nomor 70 tahun 2016 yaitu tidak lebih dari 3,5%.
• Hitung kadar sampel tersebut menggunakan persamaan regresi yang
diperoleh dalam tahap analisa kurva baku.
No.Sampel Abs Konsentrasi Sampel (%)

Sampel 1 Dihitung berdasarkan

Sampel 2 rumus regresi yang

diperoleh dengan nilai
Sampel 3
Abs dari masing-masing
Sampel 4
sampel.
Sampel 5

Sampel 6
F. Pertanyaan
1. Buat kurva kalibrasi. Sebagai sumbu x adalah konsentrasi larutan
standar, sebagai sumbu y adalah Absorbansi.
2. Cari persamaan regresi linier, dan tentukan besar koefisien regresinya
(r).
3. Tentukan kadar COHb sampel darah saudara
4. Kenapa COHb perlu dilakukan pemeriksaan?
5. Bagaimana hubungannya dengan nilai asam basa darah?
6. Jelaskan metoda lain untuk menentunkan kadar COHb sampel darah.

G. Tugas Pendahuluan
1. Lengkapilah tabel di atas
2. Berapakah konsentrasi PdCl2 (% b/v)?
3. Berapakah kadar COHb yang diperbolehkan dalam darah orang sehat?
4. Jelaskan reaksi yang terjadi dalam analisi ini!

H. Daftar Pustaka