Maturitní otázka č.

1
Úvod do imunohematologie a imunologie
Transfuze krve
 Lékařský zákrok, kdy převádíme krev zdravého člověka (nebo její část) → DÁRCE do krevního
oběhu člověka nemocného → PŘÍJEMCE

 Léčbu transfuzními přípravky, které se získávají z lidské krve nazýváme hemoterapie

(haima = krev, thérapia = léčení)

Transfuzní lékařství
 Široký rozsah oborů, z kterých vychází a do kterých zasahuje a zahrnuje problematiku ITS
- Farmacie (laboratorní medicína)
 Systém správné laboratorní praxe
- Výroba transfuzních přípravků
 Systém správné výrobní praxe
- Klinická praxe
 Interní obory
 Chirurgické obory
 Urgentní medicína
 Jejich rozvoj a úspěchy často umožňuje právě hemoterapie

1. Imunita
2. Imunitní reakce
3. Imunohematologie
4. Základní imunologické a imunohematologické pojmy:
 Antigen
 Protilátky
 Komplement
 Reakce antigen – protilátka

1. Imunita
 Schopnost bránit se cizorodým látkám, škodlivým a nebezpečným pro organizmus.
 Dělení imunity:
 Přirozená – nespecifická
 Fyzikální, chemické a biologické bariéry (kůže, pohyb řasinek sliznic, enzymy ve slinách,
nepatogenní flóra zažívacího traktu…)
 Humorální – komplement, cytokiny, interferony
 Buněčná – fagocytující a NK buňky (natural killer cells)

 Získaná – specifická
 Pomalejší reakce, druhá linie obrany, vývoj až po kontaktu se specifickým antigenem
 Humorální – protilátky (imunoglobuliny) produkované B lymfocyty
 Buněčná – T lymfocyty (CD4+, CD8+) v periferních lymfatických orgánech

Lymfocyty T
Podle přítomnosti povrchových antigenů
se dělí na dvě hlavní populace:
  Pomocné buňky CD4+, jejichž úloha
spočívá hlavně v produkci cytokinů
(látek, které ovlivňují buněčný růst)
 Buňky CD8+ s funkcí cytotoxickou
(dokážou zničit vlastní infikované
nebo pozměněné buňky)
 Obě tyto populace vznikají v brzlíku
(tymu – proto T-buňky) ze společného prekurzoru a
specializují se teprve během svého dozrávání

2. Imunitní reakce
 Imunitní reakce – rozpoznání cizorodé látky a reakce s ní přímo, či pomocí protiláteky
 Buněčná – cytotoxická reakce
- Namířena proti antigenům uvnitř buňky, proti transplantované tkáni, tumorům (T a NK
lymfocyty)
 Protilátková – humorální reakce
- Namířena proti cirkulujícím antigenům, extracelulárním bakteriím (hlavně B lymfocyty)

3. Imunohematologie
 Imunohematologie se zabývá problematikou humorálního typu specifické odpovědi
 Cizím antigenem stimulovaný B lymfocyt se pomnoží a diferencuje v plazmatickou buňku,
která produkuje protilátku
 Polysacharidové antigeny přímo stimulují B lymfocyt
 Proteinové antigeny závisí na spolupráci B a T lymfocytů

4. Základní imunologické a imunohematologické pojmy:

Antigen
 Organická látka rozpustná v tělních tekutinách nebo se vyskytuje na povrchu buněk.
 Antigen obsahuje na svém povrchu antigenní determinanty, které organizmu rozpoznává jako
cizí a reaguje imunitní odpovědí

Krevní skupiny (KS)

 Jsou antigeny vyskytující se v krvi většinou na povrchu buněk, ale mohou být i rozpuštěny v
krevní plazmě, v tělesných sekretech
 Dle výskytu je označujeme KS erytrocytů, leukocytů, trombocytů… sérové (bílkovinné),
enzymové…

Dědičnost krevních skupin

 Geny jsou pro jednotlivé KS umístěny na různých chromozomech, a proto se každá skupina dědí
samostatně a nezávisle
 Během vývoje se mohlo vytvořit pro jedno genové místo více genů (alel). Alely téže skupiny tvoří
skupinový systém.

 Pro každý systém existuje pár genů, jeden od otce, jeden od matky.
 Homozygotní kombinace (oba geny jsou stejné)
 Heterozygotní kombinace (geny jsou odlišné)
 Výsledná vlastnost závisí na vzájemném chování alel vůči sobě.
 Dominantní alela (převládající)
 Recesivní alela (ustupující), pokud je v homozygotní kombinaci, může se projevit ve
fenotypu
 Kodominantní alely (stejně silné)
o Fenotyp = výsledná krevní skupinová vlastnost
o Genotyp = příslušná kombinace alel

Protilátka
 Jsou syntetizovány plazmatickými buňkami
 Patří mezi bílkoviny – imunoglobuliny
Složení: 4 bílkovinné řetězce
 Dva těžké (gama, mí, alfa, delta epsilon)
 Dva lehké (kappa, lambda)
 H2L2 spojené disulfidickými můstky

Pantová oblast – místo ohybu a rozevření protilátky

Fragment Fab – místo vazby na antigen
Fragment Fc – místo vazby s buňkou a aktivace komplementu
Třídy imunoglobulinů:
Dle těžkých řetězců
 IgG – monomerní, 2. fáze imunizace, 70-80 %, procházejí do tkání
 IgM – pentamerní, široký rozsah účinku – 10 Fab zakončení, 1. fáze imunizace, 5-10 %,
neprochází do tkání
 IgA – vylučovány na povrch těla
 IgD
 IgE – význam při alergické reakci

Komplement
 Komplex bílkovin krevní plazmy, 9 základních složek, které se aktivují
1. Klasickou cestou – vazba C1 složky na komplex antigen + protilátka
2. Alternativní cestou – bez účasti protilátky (reakce složky C3 např. s toxiny, nádorové buňky,
povrchy mikrobiálních patogenů…)
 Obdoba krevního srážení, potřebné Ca. Navázáním aktivovaného komplexu na buněčnou
membránu vede k její lýze a zničení buňky.
 In vivo je proces inaktivován inhibitory

 In vitro zrušení nežádoucí aktivity komplementu: zahřátí na 56 st. C, stání, přidání citrátu
 Masivní aktivace: intravaskulární destrukce erytrocytů (proděravění membrány)

 Mírnější aktivace: zastavení ve fázi aktivace C3 – indukce fagocytózy – extravaskulární destrukce

erytrocytů

Reakce antigen – protilátka

aglutinace, lýza, precipitace

Aglutinace
 Shlukování krvinek, protilátka musí překlenout alespoň 2 zakončeními Fab prostor mezi
krvinkami.
Odpudivé síly mezi krvinkami elektrostaticky negativně nabité.
 Makroskopicky viditelná aglutinace 4-5 krvinek
 2 fáze aglutinace:
1. Specifická – vazba protilátky na
antigen
2. Nespecifická – vlastní aglutinace.
Ovlivněna druhem protilátky, jejím
množstvím, množstvím
antigenu na krvinkách, vzdáleností
mezi krvinkami

 Protilátky IgM – kompletní protilátky, velká

molekula, přímá aglutinace (překlenutí prostoru
mezi krvinkami – negativní náboj)
 Protilátky IgG – inkompletní protilátky,
monomerní, obvykle nepřeklenou prostor mezi krvinkami, pouze se navazují na antigen a vyžadují
pomocné mechanismy – nepřímá aglutinace
  Natrávení povrchu krvinek enzymem (bromelin, papain…) - enzymový test (pozor, někdy
destrukce antigenů –MNS,Fy)
 Bílkovinné prostředí (albumin, AB sérum)
 Prostředí s nízkou iontovou silou LISS (Low Ionic Strength Solution), PEG
 AGH sérum (antiglobulinum humanum) – antiglobulinový (Coombsův test)
 Inkompletní protilátky
 Blokující protilátky – obsazují receptory a brání vazbě dalších protilátek (např. IgM)
 Výjimečně může působit aglutinaci přímo, je-li jí velké množství a rovněž je velké množství
antigenních receptorů
 Centrifugace zvýrazní aglutinaci

 Nadbytek elektrolytů (fyziolog. roztok) přispívá k narůstání odpudivých sil a vede k odlišení pravé
a nepravé aglutinace (pseudoaglutinace, penízkovatění)

Reakci antigenu s protilátkou ovlivňuje:

 Teplota
 Iontová síla prostředí
 pH – optimu obvykle pH7, prostředí v pufrovaném fyziologickém roztoku
 Kvalitativní a kvantitativní vlastnosti antigenů a protilátek
 Hustota exprese antigenu, jeho vzdálenost od povrchu membrány
 Koncentrace protilátek (nadbytek-fenomén prozóny, je nutné naředění vzorku)

Hodnocení aglutinace:
 Pozitivní – agregáty 3-5 buněk“
4+ jeden solidní shluk
3+ několik větších shluků
2+ malé až velmi jemné agregátty
1+ drobné agregáty v červeně zabarveném prostředí
MF – Mixed Field směs aglutinovaných a neaglutinovaných krvinek
 Negativní – aglutinace chybí

Vyšetřovací metody sloužící k detekci antigenů i protilátek:

 Přímé aglutinační testy (IgM)
 Zkumavkový (mikrotitrační desky)
 Sklíčkový
 Sloupcová aglutinace (mikrozkumavky s gelovou matrix neutrální / obsahující specifickou
protilátku)
 Antiglobulinové testy (IgG)
 Přímý (PAT)
 Nepřímý (NAT)

Antiglobulinové (Coombsovy) testy

 Přímý antiglobulinový test (PAT)
Slouží k detekci IgG protilátek a/nebo složek komplementu navázaných na erytrocyty Postup:
 Promytí vyšetřovaných erytrocytů fyziologickým roztokem (odstranění bílkoviny)
 Inkubace s polyspecifickým AGH sérem
 Přítomná protilátka = aglutinace
  Při negativní reakci ověření funkčnosti AGH séra pomocí kontrolních (sensibilizovaných
erytrocytů – erytrocyty s navázanou protilátkou), s kterými musí být reakce pozitivní
 Užití při podezření na AIHA, HON, u hemolytické potransfuzní reakce
 Upřesnění senzibilizace erytrocytů
 ID karta DC-Screening I obsahuje gel s pěti různými monospecifickými AGH (anti-IgG, anti-
IgA, anti-IgM, anti-C3c, anti-C3d) namířenými proti jednotlivým imunoglobulinům
(IgG,IgA,IgM) či komplementu (C3c,C3d) a negativní kontrolu (ctl). Složení karty pomáhá
upřesnit typ senzibilizace erytrocy

 Nepřímý antiglobulinový test (NAT)

Detekuje vazbu erytrocytu – protilátka a/nebo erytrocyt – C3 složka komplementu vzniklou in
vitro.
Postup:
 Inkubace vyšetřovaného séra se známými krvinkami – v případě setkání protilátky s
příslušným antigenem dojde k jejímu navázání na krvinky
 Promytí fyziologickým roztokem – odstraní se nenavázané bílkoviny
 Inkubace s polyspecifickým AGH sérem
 Přítomná protilátka ve vyšetřovaném séru = aglutinace
 Při negativní reakci ověření funkčnosti AGH séra pomocí kontrolních (sensibilizovaných
erytrocytů), s kterými musí být reakce pozitivní
Užití:
 detekce volných protilátek – screening protilátek, testy kompatibility
 určování antigenů pomocí inkompletních (IgG) diagnostických sér

Metody vyšetření:
Zkumavkový test
- viz výše

NAT sloupcová aglutinace

- odstraněna potřeba promývání
- Anti IgG protilátka je obsažena v gelové matrix a
po inkubaci v horní části mikrozkumavky se při
centrifugaci rychleji dostávají do kontaktu s
protilátkou erytrocyty než volné protilátky
- Jednodušší, citlivější

NAT v systému pevné fáze

- V mikrotitrační desce jsou na dně jamky navázány membrány erytrocytů nesoucí potřebné antigen
- Po přidání vyšetřované plazmy a inkubaci se přítomné protilátky navážou na příslušný antigen a
po promytí se odstraní volné protilátky
- Následně se přidají indikátorové krvinky s navázanou IgG protilátkou a ty se navážou jako další
vrstva
- Pozitivní reakce = homogenní zabarvení jamky
- Negativní reakce – indikátorové krvinky se nemají na co navázat sedimentují na dně jako terčík

Lýza – hemolýza – cytotoxicita

 Je vyvolána protilátkami aktivujícími komplement. Vyžaduje dostatek míst s poškozenou
membránou a dostatečné množství komplementu – rozpad buňky

Precipitace
 Vysrážení, vyvločkování
 Je vyvolána protilátkami působícími proti bílkovinám či jiným rozpustným antigenům – vznikají
mléčně zkalené vločky
 Využití v imunohematologii s jinými metodami, např. s elektroforézou
 Ve vhodném gelovém prostředí působením elektrického pole ji lze zachytit jako precipitační čáru
 Lze zvýraznit speciálním barvením