LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FISIKOKIMIA UJI

KESESUAIAN SISTEM (UKS) KCKT UNTUK

PENETAPAN KADAR PARASETAMOL DAN KAFEIN
DALAM TABLET

DISUSUN OLEH : KELOMPOK 2

Fahman Nurhakim (211FF03062)
Firyaal Andiyani Putri (211FF03091)
Arin Nur Halizah (211FF03054)
Ratih Septiana. (211FF03072)
Maghdalena Putriati Angellika (211FF03082)
Nurdiana (211FF03061)
Chalista Azqia L (211FF03095)
Ilmi Intan Maharani (211FF03093)
Vina Restu Fauzi (211FF03092)
Rima Yusliana (211FF03085)
M.Taopik (211FF03076)
Endah Pratama (211FF03069)
Dea Nurul Ulfah (211FF03059)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS BHAKTI KENCANA
2022
 MODUL 6
Uji kesesuaian sistem (UKS) KCKT untuk penetapan kadar parasetamol dan kafein
dalam tablet

1. Tujuan :
 Memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kuantitatif.
 Melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian HPLC.
2. Prinsip
Prinsip kerja HPLC berdasarkan distribusi differensial komponen di antara dua fasa
yang disebabkan oleh perbedaan kepolaran.
3. Pendahuluan/dasar teori
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah metode
kromatografi cair bertekanan tinggi. HPLC sangat berguna untuk analisis kimia secara
kualitatif dan kuantitatif senyawa organic atau anorganik yang berkadar sangat kecil,
dalam skala ng/L juga metoda ini hanya memerlukan jumlah cuplikan yang sangat
kecil (ml). Oleh karena itu HPLC, misalnya dapat digunakan dalam analisis cuplikan
Kimia Lingkungan, Farmasi, atau kedokteran.
Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran
luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/ area standar.
Pada prakteknya teknik perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila
hanya melibatkan satu konsentrasi standar. Oleh karena itu, lebih akurat dilakukan
dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Prinsip kerja HPLC adalah berdasarkan distribusi differensial komponen di
antara dua fasa yang disebabkan oleh perbedaan kepolaran. Prinsip kerja alat
instrument HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa, fasa gerak cair
dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak
dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen – komponen
campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute – solute terhadap fasa
diam. Solute – solute yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute – solute yang kuat interaksinya dengan fasa
diam maka solute – solute tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap
komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram GC,
jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk
mengontrol kerja sistem HPLC.

Terdapat dua perbedaan dalam HPLC berdasarkan polaritas dari pelarut dan
interaksi terhadap fasa diamnya.
1) Fasa normal HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat lebih polar
daripada pelarutnya.
2) Fasa balik HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat non-polar
dibandingkan dengan pelarutnya
Jenis retensi solute merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahan senyawa
bergantung pada jenis dan kekuatan interaksi solute dengan fasa diam. Mekanisme
retensi dapat dikelompokan menjadi 5 katagori :
1. Kromatografi Adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-
senyawa yang agak polar. Partikel- partikel silica atau alumina biasanya
digunakan sebagai adsorben. Gugus – gugus polar silanol pada permukaan
silica dan gugus – gugus polar aluminol pada permukaan alumina
bertindak sebagai tempattempat adsorbs untuk molekul polar. Jenis
kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar dan jenis kromatografi
ini disebut kromatografi fasa normal.
2. Kromatografi Partisi
Dalam kromatografi ini, biasanya fasa gerak lebih polar daripada fasa
diam sehingga kromatografi jenis ini disebut juga kromatografi fasa
terbalik. Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung
 inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan
melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair
cair (LLC).
3. Kromatografi Fasa terikat
Kromatografi fasa terikat dilakukan dalam dua cara, yaitu fasa normal
dan fasa balik. Fasa diam dari fasa terikat terdiri dari suatu pengepak silica
yang disalinasi (misalnya C8 dan C18), fasa diam yang dipakai adalah C5
atau C15 BPC packing. Fasa gerak terdiri dari suatu larutan buffer
(ditambah suatu kosolven organik seperti methanol atau asetonitril untuk
pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding, yang
muatannya berlawanan dengan molekul sampel. Fasa terikat mempunyai
beberapa keuntungan merupakan fasa yang stabil.
4. Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran –
campuran ion atau molekul – molekul yang dapt diionkan. Ion – ion
bersaing dengan ion fasa gerak untuk memperebutkan tempat berikatan
dengan fasa diam.
5. Kromatografi eksklusi ukuran
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran
molekul dari zat padat. Pemisahan terjadi karena solute – solute berdifusi
masuk dan keluar poripori material paking kolom. Molekul- molekul yang
lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom
tanpa ditahan.

Pelarut dalam HPLC diantaranya n-heksana, sikloheksana, tetraklorometana,

metilbenzena, isopropanol, etanol, methanol, asam etanoat, dan air. Sementara fasa
diam dalam HPLC diantaranya oktilsilika, propilsilika, aminopropil, asam sulfonat,
dan amina kuartener.

Parasetamol dan kafein umumnya terdapat bersama-sama dalam satu tablet

obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan dapat menyerap sinar UV.

Parasetamol berwujud serbuk hablur berwarna putih tidak berbau dan sedikit
pahit. Mengenai kelarutannya parasetamol larut dalam air mendidih dan dalam NaOH
 1N, mudah larut dalam etanol, memiliki rumus empiris C8H9NO2 .Adapun struktur
kimia parasetamol adalah :

Kafein dengan rumus empiris C8H10N4O2 adalah senyawa alkaloid xantina

berbentuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang psikoaktif
dan diuretic ringan. Adapun struktur kimia darikafein adalah :

4. Alat dan bahan

Alat Bahan
 - Neraca analitik - Parasetamol
- KCKT (Kromatografi Cair - Kafein
Kinerja Tinggi) - Asetonitril gradien grade LC
- Filter holder - Air distilasi
- Membran Filter
- Ultrasonic
- Labu Ukur
- Pipet Volumetric
- Peralatan kaca lainnya

5. Prosedur kerja
1. Pembuatan fase gerak
o Campurkan pelarut asetonitril dengan air dengan konsentrasi asetonitril yaitu
10%, 15%, dan 20%.
o Konsentrasi asetonitril 10% dipipet 5 mL kemudian di tambahkan aquadest
sebanyak 50 mL.
o Konsentrasi asetonitril 15% dipipet 7,5 mL kemudian di tambahkan aquadest
sebanyak 50 mL.
o Konsentrasi asetonitril 20% dipipet 10 mL kemudian di tambahkan aquadest
sebanyak 50 mL.
2. Pembuatan larutan standar
o Timbang 500 mg standar parasetamol dan 30 mg kafein secara bersamaan.
o Lartukan dalam fase gerak dengan komposisi hingga 50 mL (larutan A).
o Masukkan larutan A ke dalam labu takar 10 mL kemudian dipipet 1,0 mL dan
ditera dengan pelarut.
o Kemudian dipipet 1,0 mL lagi ke dalam labu takar 10 mL, dan diperoleh
larutan parasetamol 100 ppm dan kafein 6 ppm.
o Campuran dihomogenkan dan disaring dengan Filter holder, membrane filter
(millipore) 0,2 µm, 13mm.
3. Pembuatan fase gerak sampel
o Campurkan pelarut asetonitril dengan air dengan konsentrasi asetonitril yaitu
10%, 15%, dan 20%.
 o Konsentrasi asetonitril 10% dipipet 10 mL kemudian di tambahkan aquadest
sebanyak 100 mL.
o Konsentrasi asetonitril 15% dipipet 15 mL kemudian di tambahkan aquadest
sebanyak 100 mL.
o Konsentrasi asetonitril 20% dipipet 20 mL kemudian di tambahkan aquadest
sebanyak 100 mL.
4. Pembuatan larutan sampel
o Sebanyak 20 tablet ditimbang dan ditentukan nilai rata-rata bobotnya
kemudian digerus hingga halus dan tercampur homogeny.
o Ditimbang setara 1 bobot tablet (digunakan bobot rata-rata 20 tablet)
kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan dilarutkan dengan fase
gerak dengan komposisi yang diinginkan (larutan B).
o Larutan B dilakukan pengenceran sebanyak 50 kali.
o Campuran dihomogenkan dan disaring dengan Filter holder, membrane filter
(millipore) 0,2 µm, 13 mm.
5. Uji kesesuaian sistem
o Larutan standar parasetamol konsentrasi 100 ppm dan standar kafein 6 ppm
diinjeksikan sejumlah 20 µL melalui injector ke dalam KCKT, digunakan
kecepatan alir hasil optimasi dan detector PDA diatur pada λ 270nm.
o Diperoleh kromatogram untuk setiap injeksi yang akan digunakan untuk
menentukan kadar penyuntikan larutan baku, yang dinyatakan dalam waktu
retensi, luas puncak, tinggi puncak factor kapasitas, selektivitas, efesien
kolom, resolusi.
6. Hasil pengamatan
1. Sistem kromatografi yang dipakai pada analisis meliputi :
a. Fase gerak dan tipe elusinya
 Fase gerak bersifat polar menggunakan Asetonitril : Air (10 : 90)
 Tipe Elusi: elusi gradient
b. Laju alir: 1.0 mL/menit
c. Kolom: Pesrsuit agilent C18 (125 x 4mm, 5 μm)
d. Detektor: PDA 270 nm
e. Waktu retensi analit:
 2. Data Uji Kesesuaian Sistem
a. Parasetamol
Replikasi ke- tR AUC Tf (<2) 𝒌𝟐 (≥2) N(>2000)

1 3,6 28,247 1,534 27,4 4456

2 3,55 27,098 1,498 28,9 4022
3 3,50 26,871 1,470 25,7 3876
4 3,49 26,990 1,500 28,8 3709
5 3,59 26,554 1,530 27,3 3900
6 3,58 27,002 1,678 29,0 3877
Rata-rata 3,551666667 27,127 1,535 27,85 3973,333333
SD 0,04708149 0,580258563 0,07388369 1,30038456 256,6473586
RSD (<2%) 1,325616789 2,139044358 4,81326986 4,66924438 6,459245602

b. Kafein
Replikasi tR AUC Tf (<2) 𝒌𝟐 (≥2) N(>2000) Rs (>1,5)
ke-

1 4,35 10,27 2,00 8,8 4500 4,7

2 4,4 12,45 1,89 8,5 4200 4,8
3 4,31 11,44 1,93 8,7 3950 4,9
4 4,50 10,50 1,85 8,8 4160 4,9
5 4,25 10,89 1,82 8,9 4602 4,5
6 4,50 10.89 1,78 8,5 4567 4,6
Rata-rata 4,385 11,11 1,878333 8,7 4329,833 4,7333333
SD 0,10173495 0,87043093 0,07935154 0,16733201 264,29258 0,16329932
RSD(<2%) 2,320067269 7,83466182 4,22457171 1,92335638 6,1039896 3,44998555

3. Hasil Uji Kesesuaian Sistem Parasetamol dan Kafein

Data Persyaratan Parasetamol Kafein
tR = Waktu Retensi (menit) - 3,551666667 4,385
RSD waktu retensi (%) <2% 1,325616789 2,320067269
%
AUC = Luas area - 27,127 11,11
RSD Luas area (AUC) (%) <2% 2,139044358 7,83466182
%
 *Plat Teoritis <2000 3973, 4329,833
333333
*Tailing Faktor <2 1,535 1,878333
*Resolusi >1,5 - 4,7333333
*Faktor kapasitas ≥2 27,85 8,7

*Parameter yang digunakan memenuhi persyaratan

7. Pembahasan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa jugadisebut dengan
HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy) merupakan tekhnik pemisahan
yang diterima secara luas untukanalisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel. Fungsidari HPLC yaitu untuk mengukur senyawa-senyawa kualitatif
(wakturetensi) dan kuantitatif (luas area dan tinggi puncak).Teknik HPLC merupakan
suatu metode kromatografi cair-cair,yang dapat digunakan baik untuk keperluan
pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC
didasarkanpada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode
pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan datayang akurat bila
hanya melibatkan suatu konsentrasi standar.Bagian-bagian HPLC dibagi menjadi
enam bagian yaitu :
1. Eluen , berfungsi sebagai fase gerak yang membawa sampel masuk ke
dalam kolom.
2. Pompa, berfungsi mendorong eluent dan sampel masuk ke dalam kolom

3. Injektor, berfungsi sebagai tempat memasukkan sampel dan

dapatdidistribusikan masuk kedalam
4. Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang adadalam
sampel
5. Detektor, untuk membaca ion yang lewat dalam detector

6. Dekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang masuk.
Pada praktikum ini dilakukan percobaan uji kesesuaian sistem pada KCKT .
Kromatografi cair kinerja tinggi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat
kimia yang berdasarkan pada perbedaan distribusi masing-masing komponen
campuran yang terpisah pada fase diam dibawah pengaruh fase gerak. Sampel yang
akan diujikan yaitu parasetamol dan kafein. Metode yang dapat digunakan untuk
menganalisis kombinasi parasetamol dan kafein yaitu kromatografi cair kinerja tinggi.
Adapun keunggulan dari KCKT dibanding metode pemisahan lainnya terletak pada
ketepatan analisis dan kepekaan yang tinggi serta cocok untuk memisahkan
senyawasenyawa yang tidak tahan pada pemanasan.
Metode untuk menentukan kondisi optimum penetapan kadar parasetamol dan
kafein dipengaruhi dua faktor yang berperan sebagai perubah bebas, adapun kedua
faktornya yaitu konsentrasi fase gerak dan laju alir , sedangkan respon yang diamati
adalah waktu retensi dan resolusi. Berdasarkan pada jurnal Nopita, dkk , percobaan
ini digunakan dua variabel bebas, yaitu konsentrasi fase gerak asetonitril 10 %; 15 %;
dan 20 %, sedangkan laju alirnya yaitu 0,5; 1,0; dan 1,5 mL/menit. Metode ini
digunakan untuk mengamati pengaruh konsentrasi fase gerak dan laju alir terhadap
waktu retensi dan resolusi dari dua zat aktif, yaitu parasetamol dan kafein.
Laju alir yang lebih tinggi dari 1,0 mL/menit dapat menyebabkan tekanan
dalam kolom meningkat sehingga mempercepat kerusakan kolom. Oleh karena itu,
dilakukan pemilihan komposisi lain yang masih mendekati kondisi optimum yaitu
pada laju alir 1,0 dan 1,5 mL/menit. Semakin cepat laju alir, waktu retensi akan
semakin pendek dan resolusinya pun akan semakin kecil. Pengukuran kondisi
optimum dengan dilakukan dengan berbagai parameter seperti perbandingan fase
gerak, laju alir, panjang gelombang, waktu retensi, jumlah lempeng, faktor kapasitas,
dengan tujuan menetapkan kondisi optimum untuk meningkatkan efisien waktu
pengujian.
Terdapat dua cara umum yang sering digunakan dalam mengukur efisiensi
kolom kromatografi salah satunya yaitu jumlah lempeng teoritis . Jumlah lempeng
teoritis merupakan suatu ukuran yang mencerminkan tingkat efisiensi pemisahan
kinerja kolom. Semakin tinggi nilai N, maka semakin kecil pelebaran puncak, maka
semakin baik kinerja kolom dalam proses pemisahan, syarat nilai N yaitu > 2000 .
Berdasarkan pada hasil UKS ini, jumlah lempeng teoritis dari senyawa parasetamol
dan kafein adalah memenuhi syarat dengan rata-rata kafein sebesar 4329,833 dan rata-
rata parasetamol sebesar 3973,333333 Maka dapat disimpulkan bahwa efisiensi
kinerja kolom dalam proses memenuhi syarat karena sudah menimbulkan pemisahan
yang sudah cukup baik.
Semakin kuat komposisi fase gerak tersebut, semakin kecil nilai k’ yang
dihasilkan . Faktor kapasitas dapat memberikan gambaran dimana puncak – puncak
analit terelusi secara relatif terhadap puncak fase geraknya, persyaratan nilai faktor
kapasitas 2 . Hasil pengujian UKS pada praktikum ini menunjukkan untuk nilai k’
parasetamol 27,85 dan kafein 8,7 maka dapat dikatakan memenuhi syarat mempunyai
 kemampuan berinteraksi dengan fase diam cukup baik. Harga k’ yang baik berkisar
antara 2 sampai 10, pada parasetamol memiliki harga k’ yang lebih besar dari rentang
tersebut, sehingga menunjukkan pemisahan yang baik tetapi menyebabkan waktu
analisis terlalu lama.
Untuk parameter selanjutnya adalah resolusi. Resolusi merupakan ukuran atau
nilai yang menunjukkan seberapa baik pemisahan antara puncak pada kromatogram.
syarat dari resolusi ialah R > 1,5 dimana dua puncak terpisah secara sempurna . Bila
pada suatu analisis diperoleh R Nilai resolusi juga menggambarkan seberapa baik
sistem KCKT yang digunakan dalam memisahkan dua senyawa. Nilai resolusi puncak
kromatogram parasetamol dan kafein adalah 4,7333333, artinya memenuhi syarat dan
memberikan pemisahan yang baik.
Waktu retensi merupakan waktu yang diperlukan suatu komponen untuk
keluar dari kolom, yaitu dari menit ke-0 hingga muncul puncak peak. Waktu retensi
analit dikurangi dengan waktu retensi pelarut pengelusi atau pelarut pengelusi campur
disebut sebagai waktu retensi terkoreksi yang dinyatakan sebagai tR’. Waktu retensi
yang dinyatakan dalam satuan memberikan arti yang sangat penting dalam analisa
kualitatif dengan KCKT.
8. Kesimpulan
Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menerapkan
kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati. Hal ini
disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas
yang tinggi.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis
senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil), penentuan molekul-molekul
netral, ionik, maupun zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan
senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama, pemisahan senyawa-senyawa dalam
jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses
industri. KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
9. Daftar pustaka
Al-Anshory, Jamaludin. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung : Universitas
Padjadjaran.
Andrade A, Dievart P, Dagaut P. (2009). Improve optimization of polycylic aromatic
hydrocarbon (PAHs) mixtures resolution in reversed phase high performance liquid
chromathography by using factorial design and responsse surface methodology.
France: CNRS-ICARE IC, Avenua de la Recherche Scientifique.

Depkes RI. (1995). Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Departemen Kesehatan
RI.

Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungan.

Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol 1 (3), hlm 117-135.

Lukitaningsih, Endang. (2010). Kromatografi. Yogyakarta: Fakultas Farmasi UGM.

Nopita, Dayanti, R., Tutik., Supardi. (2018). Penetapan Kondisi Optimum Pengujian
Kadar Parasetamol dan Kafein Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Jurnal
Farmasi Malahayati. Vol 1 (2), hlm 96-106.

Sabir, M. Azim, Moloy, M., dan Parminder, S. Bashir. (2013). HPLC Method
Development and Validation: A Review. International Research Journal of Pharmacy,
4(4), 43-45. States Pharmacopeia.

Sudjadi dan Rahman, A. 1994. Analisis Obat dan Makanan. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar

Susanti M & Dachriyanus. (2017). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang :

Universitas Andalas Press.

Synder, I.R., Kirkland, J.J., Dolan J.W. (2010). Introduction to Modern Liquid
Chromatography 3th Ed. USA : John Wiley & Sons, Inc Publication.

Tim Dosen Kimia Analitik. 2013. Petunjuk Praktikum Kimia Instrumen. Bandung:
LKI Universitas Pendidikan Indonesia.