Professional Documents
Culture Documents
Trần Khải Văn Bctt Vikysinh
Trần Khải Văn Bctt Vikysinh
1
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................... 1
DANH MỤC HÌNH......................................................................................................... 2
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... 4
MỤC ĐÍCH CỦA BÁO CÁO THỰC TẬP ..................................................................... 5
NỘI DUNG ..................................................................................................................... 6
A. GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP ............................................................................ 6
1. Giới thiệu bệnh viện ................................................................................................. 6
1.1. Lịch sử hình thành .............................................................................................. 6
1.2. Chức năng và nhiệm vụ ...................................................................................... 7
2. Giới thiệu Khoa Vi sinh:........................................................................................... 7
3. Cảm nhận về đơn vị thực tập .................................................................................... 9
B. VI SINH.................................................................................................................... 10
I. Kỹ thuật vi sinh cơ bản ........................................................................................... 10
1. Kỹ thuật cấy vi khuẩn.......................................................................................... 10
2. Kỹ thuật nhuộm Gram ......................................................................................... 16
3. Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen (nhuộm kháng acid)............................................ 21
II. Test nhanh ............................................................................................................. 25
1. Test nhanh phát hiện kháng nguyên virus SARS-CoV-2 ..................................... 25
2. Test nhanh Helicobacter pylori............................................................................ 28
3. Test nhanh HIV ................................................................................................... 31
III. Trang thiết bị ........................................................................................................ 35
1. Máy định danh và kháng sinh đồ tự động Phoenix .............................................. 35
2. Máy cấy máu BactecTM FX ................................................................................. 39
C. KÝ SINH .................................................................................................................. 43
1. Soi tươi phân ....................................................................................................... 43
2. Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) ................................................................. 47
TỔNG KẾT ................................................................................................................... 52
ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN .................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 54
1
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
2
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 36: Ống canh trường AST, AST-S và chất chỉ thị tương ứng................................. 38
Hình 37: Chuyển huyền dịch ID Broth và ống AST/AST-S Broth sau khi được nhỏ chất
chỉ thị ............................................................................................................................ 39
Hình 38: Đổ các huyền dịch vào phần giếng tương ứng và đóng nắp ............................. 39
Hình 39: Máy cấy máu tự động BactecTM FX .............................................................. 40
Hình 40: Nguyên lý phát hiện vi khuẩn của máy cấy máu .............................................. 41
Hình 41: Thực hiện cấy phân lập và định danh trên chai cấy máu dương tính ................ 42
Hình 42: Chuẩn bị các dụng cụ làm lame soi phân ......................................................... 43
Hình 43: Nhỏ nước muối NaCl 0,9% và đánh tan đều mẫu phân trong giọt nước muối .. 44
Hình 44: Đậy lamelle ..................................................................................................... 45
Hình 45: Giun lươn, ấu trùng giai đoạn 1 ....................................................................... 46
Hình 46: Nấm men ........................................................................................................ 46
Hình 48: Giardia lamblia, thể bào nang.......................................................................... 46
Hình 47: Trichomonas hominis ...................................................................................... 46
Hình 50: Sợi cơ ............................................................................................................. 47
Hình 49: Hạt mỡ ............................................................................................................ 47
Hình 51: Máy xét nghiệm Immunomat – Virion/Serion ................................................. 47
Hình 52: Các khay vi giếng được đựng trong túi kín ...................................................... 48
Hình 53: Các hóa chất cần thiết cho xét nghiệm............................................................. 49
Hình 54: Xếp các giếng vào khung theo đúng thứ tự hiển thị trên màn hình hệ thống .... 50
3
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
4
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
5
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
NỘI DUNG
A. GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP
1. Giới thiệu bệnh viện
1.1. Lịch sử hình thành
Bệnh viện (BV) Nhi đồng 2 tọa lạc trên một khu đất cao với diện tích 8,6 hecta, giáp bốn
mặt tiền đường: Lý Tự Trọng, Chu Mạnh Trinh, Nguyễn Du và Hai Bà Trưng (Quận 1).
Bệnh viện có vị trí đẹp và gắn liền với quá trình phát triển của thành phố. Lịch sử hình
thành bệnh viện gồm các mốc thời gian như sau:
- Tiền thân của BV Nhi Đồng 2 hiện giờ là
Bệnh viện Quân sự (Tiếng Pháp là Hôpital
militaire) khi họ mới xâm chiếm Nam Kỳ vào
năm 1962. Cơ sở này vào cuối thập niên 1870
chuyển về số 14 rue Lagrandière, hiện nay là
14 Lý Tự Trọng, P. Bến Nghé, Q.1, TP.HCM.
- Từ năm 1905 trở đi, dưới sự điều hành của
bác sĩ Charles Grall, bệnh viện đã mở cửa chữ
trị cho mọi thành phần, quân sự cũng như dân
sự, kể cả dân bản xứ và bệnh viện chính thức
đổi tên thành “Bệnh viện Grall” vào năm 1925
để vinh danh ông. Hình 1: Bệnh viện Quân sự vào đầu thế kỷ 20
- Vào năm 1976, sau khi đất nước ta được giải phóng và người Pháp rút đi thì Bệnh viện
Grall được chuyển giao cho nhà chức trách Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Việt Nam và được
đổi tên thành Bệnh viện Nhi Đồng 2 vào ngày 1/6/1978.
6
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
7
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Phòng Ký sinh trùng Phòng vật tư Phòng môi Phòng môi Phòng rửa
trường trường dụng cụ
Cửa
chính
Phòng trực Phòng PCR Phòng pha chế hóa chất Phòng tách chiết
8
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
9
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
B. VI SINH
Quy trình thời gian định danh trong xét nghiệm vi sinh:
Ngày 1: Lấy và nhận mẫu
Khảo sát đại thể.
Khảo sát vi thể:
Đánh giá chất lượng mẫu đàm (thang Barlett).
Soi tươi.
Soi nhuộm.
Cấy 4 chiều và ủ trong tủ ấm với nhiệt độ ủ 35-37oC hoặc tủ ấm có thêm 5% CO2.
Ngày 2: Đọc kết quả nuôi cấy
Khảo sát tính chất khuẩn lạc, chọn khúm nghi ngờ gây bệnh để:
Các thử nghiệm sinh hóa.
Định danh.
Làm KSĐ.
Đối với các mẫu không mọc hoặc non thì ủ tiếp.
Ngày 3: Định danh loài
Đọc kết quả ủ tiếp từ ngày trước.
Đọc kết quả định danh và KSĐ.
Trả kết quả.
I. Kỹ thuật vi sinh cơ bản
1. Kỹ thuật cấy vi khuẩn
Kỹ thuật cấy vi khuẩn là kỹ thuật chuyển vi khuẩn vào môi trường có các chất dinh dưỡng
và các chất bổ trợ khác nhằm mục đích phân tách, tăng sinh và giúp ta khảo sát từng loại
vi khuẩn.
Đây là kỹ thuật cơ bản và được thực hiện thường xuyên trong các phòng xét nghiệm vi
sinh. Bên cạnh đó, tùy vào mục đích sẽ có các phương pháp cấy khác nhau.
1.1. Chuẩn bị dụng cụ:
- Bút lông, bút chì.
- Bơm kim tiêm (dùng trong cấy máu).
10
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Que cấy.
1 2
3 4
11
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Tủ ATSH cấp 2.
- Tủ ấm
1.2. Quy trình:
Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết đặt trong tủ ATSH và lưu ý phải có thêm đèn cồn nếu thực
hiện kỹ thuật trên bàn nuôi cấy ngoài tủ.
Bước 1: Nhận mẫu bệnh phẩm (đàm, mủ, máu, nước tiểu, dịch não tủy,…) và quan sát
đại thể (màu sắc, nhầy, máu,…) để ghi nhận lại trên phiếu chỉ định và hệ thống của bệnh
viện.
Bước 2: Chọn môi trường phù hợp với từng loại bệnh phẩm và dán code lên hộp thạch.
Mỗi bệnh phẩm đều phải chuẩn bị thêm 1 lame có dán code hoặc ghi thông tin lên để
nhuộm Gram đánh giá vi thể.
Bảng 1: Các loại môi trường được sử dụng và công dụng của chúng
12
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Bromocresol Purple (BCP) BCP khả năng biến đổi màu dựa vào sự thay đổi pH.
Ban đầu, pH ở mức 7 nên môi trường có màu tím
nhưng nếu có mặt vi khuẩn lên men lactose và sản
sinh acid lactic làm giảm pH đi thì vùng có vi khuẩn
sẽ có màu vàng.
Môi trường tuy không chọn lọc nhưng có thể giúp dễ
ta phát hiện họ vi khuẩn đường ruột
(Enterobacteriaceae).
MacConkey Agar (MC) Thạch MC dùng để nuôi cấy chọn lọc các trực khuẩn
Gram âm, đặc biệt là họ vi khuẩn đường ruột và chi
Pseudomonas.
Môi trường còn có khả năng phân biệt được giữa vi
khuẩn có lên men lactose và không lên men lactose.
Những vi khuẩn có lên men lactose sẽ sinh ra acid
nên pH môi trường sẽ giảm, do đó làm đổi màu của
đỏ.
Canh thang Giúp tăng sinh vi khuẩn, dùng để lưu lại các vi khuẩn
từ dịch não tủy, mủ và dịch vô trùng.
Sabouraud Dextrose Agar Môi trường chứa nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho
(SDA) sinh vật phát triển, có thêm Chloramphenicol
và/hoặc Tetracycline - là các kháng sinh phổ rộng -
để ức chế sự sinh trưởng của nhiều vi khuẩn Gram
dương và Gram âm. Vì vậy, SDA chủ yếu dùng để
nuôi cấy chọn lọc nấm.
Salmonella Shigella Agar (SS) Môi trường chọn lọc dùng để nuôi cấy, phân lập
Hekteon Agar (HEK) Salmonella và Shigella.
Bảng 2: Bộ môi trường cần chuẩn bị đối với từng bệnh phẩm
13
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
+ Cấy định lượng thì dùng que cấy 1 µL (que cấy xanh dương).
+ Bơm kim tiêm dùng chọc hút mẫu trong cấy máu, chuẩn bị thêm gòn cồn để sát trùng
miệng chai cấy máu trước khi chọc hút mẫu để tránh ngoại nhiễm.
Bước 4: Tiến hành cấy
Dùng que cấy lấy bệnh phẩm đủ 1 vòng que cấy hoặc dùng bơm kim tiêm để hút mẫu bơm
vào mỗi hộp thạch đối với cấy máu.
Nếu bệnh phẩm được lấy bằng que gòn (mủ, sinh dục) thì dùng que lăn trên một phần nhỏ
ở rìa mỗi hộp thạch trên vùng cấy thứ nhất.
* Cấy 4 chiều:
Cấy đường thứ 1: dùng một tay mở nắp hộp petri, một tay ria đầu khuyên cấy trên 1/4 - 1/3
mặt thạch, ria lại vài lần, tránh chạm vào rìa của đĩa petri gây tạp nhiễm.
Cấy đường thứ 2: quay 1/4 đĩa, đặt khuyên cấy từ đường cấy thứ 1, ria chạm vào đường
cấy thứ 1 khoảng 4 lần. Sau đó, tiếp tục ria đường cấy thứ 2, không chạm vào đường cấy
thứ 1.
Cấy đường thứ 3: xoay 1/4 đĩa thạch tiếp theo, đặt khuyên cấy từ đường cấy thứ 2, ria chạm
đường cấy thứ 2 khoảng 4 lần. Sau đó, tiếp tục ria đường cấy thứ 3, không chạm vào đường
cấy thứ 2.
Cấy đường thứ 4: xoay phần tư đĩa còn lại, đặt khuyên cấy từ đường cấy thứ 3, ria chạm
đường cấy thứ 3 khoảng 4 lần. Sau đó, tiếp tục ria đường cấy thứ 4, không chạm vào đường
cấy thứ 3.
* Cấy định lượng: đối với mẫu bệnh phẩm là nước tiểu:
- Dùng khuyên cấy 1 µL lấy mẫu bệnh phẩm đầy khuyên cấy và kéo 1 đường thẳng từ trên
xuống đến hết đường kính hộp thạch.
- Cấy theo đường zig zag từ trên xuống dưới đến hết hộp thạch. Lưu ý là khoảng cách giữa
các đường cấy.
14
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Bước 5: Sau khi cấy xong, đặt ngược hộp thạch (nắp nằm ở dưới) để dễ cầm nắm và đem
ủ ấm trong các tủ theo quy định.
Bảng 3: Các môi trường và tủ ấm tương ứng
16
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Bước 2: Phủ Crystal Violet lên phết nhuộm và để yên trong 1 phút.
Bước 3: Đổ bỏ thuốc nhuộm và rửa sạch lame bằng nước.
Hình 19: Kết quả nhuộm Gram, cầu khuẩn Gram dương (trái) và trực khuẩn Gram âm (phải)
Sau khi tiêu bản đã khô, ta tiến hành đọc kết quả trên kính hiển vi bằng vật kính dầu (x100).
Kết quả đọc lame sẽ được mô tả thông qua 3 đặc tính:
- Hình thể: cầu khuẩn, trực khuẩn, …
19
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
20
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
21
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
22
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
23
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 23: Máy nhuộm ZN tự động (trái) và kết quả nhuộm ZN (phải) cho thấy có trực
khuẩn kháng acid-cồn bắt màu hồng (khoanh đỏ) trên nền xanh
24
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
25
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Trong quá trình xét nghiệm, mẫu bệnh phẩm phản ứng với thuốc thử tại lớp cộng hợp tạo
thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phức hợp tiếp tục di chuyển trên màng nhờ
mao dẫn, gặp và phản ứng với các kháng thể tại vùng kết quả và tạo ra vạch màu (T). Vạch
màu này xuất hiện cho kết quả dương tính, còn nếu không thì kết quả là âm tính.
- Nhằm mục đích kiểm tra quy trình xét nghiệm, một vạch màu sẽ luôn xuất hiện tại vùng
vạch chứng (C) để khẳng định lượng mẫu bệnh phẩm là đủ và lớp màng đã thấm tốt.
1.3. Bảo quản hóa chất/ sinh phẩm:
- Bộ kit sẽ ổn định cho đến ngày hết hạn in trên túi nếu được bảo quản ở nhiệt độ 2-30oC,
tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, tránh nơi ẩm ướt và tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao.
- Khay thử phải được bảo quản trong túi kín ban đầu cho đến khi sử dụng. Nếu túi đã bị
rách, hỏng hoặc đã hết hạn sử dụng thì không được sử dụng bộ kit test đó.
1.4. Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu:
- Mẫu bệnh phẩm được thu thập bằng tăm bông đã được cung cấp trong bộ kit. Lấy mẫu
dịch tỵ hầu bằng cách đưa tăm bông vào hốc mũi nơi có nhiều dịch tiết nhất, xoay nhẹ
nhàng để thấm ướt tăm bông nhằm lấy đủ lượng dịch tiết.
- Mẫu nên được sử dụng ngay sau khi lấy. Nếu không thể thực hiện liền mà cần vận chuyển
đi nơi khác thì phải cho tăm bông vào ống bảo quản có nắp đậy. Mẫu bệnh phẩm khi gửi
tới PXN phải đầy đủ thông tin bệnh nhân, đủ thể tích, đạt chất lượng, được bảo quản đúng
cách và thông tin phải trùng khớp với phiếu chỉ định.
1.5. Thực hiện xét nghiệm:
- Lấy khay thử và ống chiết ra khỏi túi, đặt trên mặt phẳng nằm ngang. Sử dụng ngay trong
vòng 1 giờ.
- Ghi mã bệnh nhân.
- Nhúng đầu que chứa mẫu vào ống chiết. Xoay đầu que trong khoảng 10 giây, miết đầu
que vào thành và đáy ống 8-10 lần để giải phóng kháng nguyên.
- Bóp cho hai thành ống ép vào đầu que, từ từ xoay que và ép đầu que khi rút que ra khỏi
ống để thu được càng nhiều dung dịch chứa mẫu càng tốt. Hủy que mẫu đã sử dụng theo
quy định khi xử lý chất thải lây nhiễm sinh học.
- Đậy chặt ống bằng nắp nhỏ giọt.
- Lắc mạnh ống theo chiều ngang 10 lần để trộn đều mẫu. Tránh để dụng dịch chạm tới đầu
lọc trong nắp nhỏ giọt.
26
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Bỏ nắp trên ống nhỏ giọt và nhỏ 3 giọt (100µL) nẫu chiết từ ống vào giếng mẫu (S) của
khay thử và bắt đầu tính thời gian.
- Đọc kết quả sau 15 phút.
* Lưu ý:
Độ đậm của vạch kết quả (T) có thể khác nhau phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên
SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm. Vì vậy, bất cứ độ mờ nào xuất hiện tại vạch
kết quả (T) cũng đều được coi là dương tính.
27
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Kết quả không hợp lệ: không xuất hiện vạch chứng (C). Nguyên nhân do lượng mẫu
bệnh phẩm không đủ hoặc thực hiện sai quy trình. Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng và
xét nghiệm lại bằng khay thử mới khác. Nếu kết quả vẫn như cũ, cần liên hệ ngay
với nhà phân phối để được tư vấn, hướng dẫn.
1.7. Lưu và xử lý mẫu:
Tiến hành hủy bỏ toàn bộ mẫu và bộ kit test đã sử dụng theo quy định trong quy trình xử
lý chất thải SARS-CoV-2.
1.8. Hạn chế:
- Kết quả xét nghiệm là định tính, nó không phải là tiêu chí duy nhất để xác định bệnh nhân
nhiễm COVID-19 không mà còn phải kết hợp với các triệu chứng lâm sàng và các xét
nghiệm khác.
- Kết quả xét nghiệm âm tính không loại trừ khả năng bị nhiễm SARS-CoV-2 mà cần phải
theo dõi thêm. Nếu khẳng định chẩn đoán COVID-19 thì phải xét nghiệm RT-PCR.
- Có thể xảy ra âm tính giả khi có quá nhiều máu hoặc nhầy trong mẫu, mẫu được lấy hoặc
bảo quản không đúng cách.
- Kết quả dương tính có thể không phải do COVID-19 mà do nhiễm một chủng coronavirus
không phải SARS-CoV-2 hoặc có các yếu tố gây nhiễu khác.
2. Test nhanh Helicobacter pylori
2.1. Mục đích:
Helicobacter pylori một loại xoắn
khuẩn nhỏ sống trên bề mặt dạ dày và
tá tràng, liên quan đến loạt bệnh
đường tiêu hóa, thường gặp nhất là
viêm dạ dày thể hoạt động và mãn
tính, loét do rối loạn tiêu hóa.
Khoa Vi sinh tại bệnh viện sử dụng
bộ test nhanh kháng nguyên H. pylori
(One Step H. pylori Test Device)
(Phân) của ABON thuộc tập đoàn
Abbott.
Bộ kit bao gồm: khay thử, ống chiết
mẫu (dung dịch đệm NaCl 0.015M), Hình 28: Bộ kit test nhanh H.pylori
ống nhỏ giọt.
28
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
29
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Đối với mẫu phân lỏng: Giữ ống nhỏ giọt thẳng đứng, hút mẫu phân sau đó chuyển
2 giọt (khoảng 80 μL) vào ống chiết mẫu.
Đối với mẫu phân rắn: mở nắp của ống chiết mẫu, sau đó cầm nắp ống và chọc que
lấy mẫu (gắn liền với nắp) vào mẫu bệnh phẩm tại ít nhất 3 vị trí khác nhau để lấy
khoảng 50 mg mẫu (tương đương 1⁄4 hạt đậu). Không xúc mẫu phân.
- Vặn chặt nắp, lắc mạnh ống để trộn đều mẫu và dung dịch chiết mẫu. Để yên ống chiết
mẫu trong 2 phút.
- Lấy khay thử ra khỏi túi. Ghi mã bệnh nhân và giờ thực hiện lên khay thử.
- Giữ ống lấy mẫu đã xử lý thẳng đứng và bẻ đi phần chóp gắn liền với nắp. Đảo ngược
ống dung dịch chiết mẫu và truyền 2 giọt dung dịch mẫu (khoảng 80 μL) vào vùng nhận
mẫu của test thử.
- Chờ và đọc kết quả trong vòng 10 phút. Không sử dụng kết quả sau 20 phút.
30
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
+ Dương tính: khi xuất hiện cả 2 vạch màu kết quả (T) và vạch chứng (C).
Lưu ý: độ đậm màu sắc của vạch kết quả (T) sẽ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ kháng
nguyên H. pylori có trong mẫu bệnh phẩm. Do đó, bất kỳ độ đậm nhạt nào của vạch kết
quả (T) đều được coi là dương tính.
+ Âm tính: chỉ xuất hiện vạch chứng (C). Không xuất hiện vạch kết quả (T).
+ Không xác định: nếu vạch chứng (C) không xuất hiện trong cửa sổ đọc kết quả sau khi
thực hiện thử nghiệm, kết quả coi như không có giá trị. Nguyên nhân có thể do không thực
hiện đúng theo quy định hướng dẫn hoặc có thể test hết hạn sử dụng. Kỹ thuật viên nên
đọc lại quy trình và làm lại xét nghiệm bằng test thử mới khác. Nếu tình trạng vẫn như cũ,
báo với KTV trưởng và báo Trưởng khoa, liên lạc với đại lý phân phối để được giải đáp.
2.7. Lưu và xử lý mẫu:
- Không lưu mẫu, hủy mẫu ngay sau khi thực hiện xét nghiệm. Mẫu phân sau xét nghiệm
được xử lý theo quy trình xử lý chất thải y tế.
2.8. Lưu ý:
- Mỗi test chỉ sử dụng 1 lần, không tái sử dụng test thử.
- Không trộn hoặc trao đổi những mẫu khác lại với nhau.
- Không trực tiếp chạm ngón tay vào vùng nhận mẫu hoặc cửa sổ đọc kết quả vì có thể làm
ảnh hưởng đến kết quả test nhanh.
- Đọc kết quả trong khoảng thời gian quy định.
- Kết quả xét nghiệm âm tính không loại trừ khả năng bị nhiễm H. pylori. Nếu kết quả xét
nghiệm âm tính mà các triệu chứng lâm sàng vẫn xuất hiện, cần làm thêm xét nghiệm bằng
các phương pháp khác.
- Sau khi điều trị bằng kháng sinh, nồng độ kháng nguyên H. pylori có thể giảm xuống
dưới ngưỡng phát hiện của xét nghiệm. Do đó, cần thận trọng khi chẩn đoán trong quá trình
điều trị bằng kháng sinh.
3. Test nhanh HIV
3.1. Mục đích
Xét nghiệm này dùng phát hiện nhanh, định tính sự hiện diện của KT đối với HIV-1 và
HIV-2 trong huyết thanh hoặc huyết tương người giúp chẩn đoán những trường hợp nhiễm
virus HIV. Tại khoa Vi sinh, để chuẩn đoán HIV thì trước tiên phải thực hiện xét nghiệm
trên máy miễn dịch ARCHITECT i2000SR của Abbott (Mỹ) để sàng lọc. Nếu kết quả
31
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
dương tính thì mới tiến hành thực hiện 2 xét nghiệm test nhanh bổ sung để khẳng định,
gồm:
+ Determine HIV 1/2 của Alere (Mỹ).
+ SD Bioline HIV 1/2 3.0 của Standart Diagnostics (Hàn Quốc).
Hình 30: Bộ kit test nhanh HIV gồm SD Bioline HIV 1/2 3.0 (trái) và
Determine HIV 1/2 (phải)
32
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Vạch thử 1 (T1) được phủ KN bắt giữ tái - Vạch thử (T) được phủ kháng nguyên
tổ hợp của HIV-1 (gp4, p24) HIV tái tổ hợp (gp41, gp36). Chúng sẽ bắt
- Vạch thử 2 (T2) được phủ KN bắt giữ tái lấy phức hợp KN-KT được tạo ra ở vùng
tổ hợp của HIV-2 (gp36). cộng hợp và tạo thành vạch đỏ nhìn thấy
Các KN này sẽ bắt giữ phức hợp KN- được. Ngược lại, các công hợp sẽ tiếp tục
KT tạo thành ở vùng cộng hợp sẽ tạo chảy tới vạch chứng (C) theo lực mao dẫn
thành vạch đỏ nhìn thấy được. Nếu và không hiện vạch T.
không có phức hợp KN-KT thì dòng - Vạch chứng (C) được phủ sẵn các kháng
chảy vẫn đi đến vạch chứng (C) và thể kiểm soát để bắt lấy các cộng hợp làm
không xuất hiện các vạch thử. xuất hiện vạch màu đỏ. Vạch chứng giúp
- Vạch chứng (C) được phủ sẵn các kháng đảm bảo tiến trình được thực hiện đúng và
thể kiểm soát để bắt lấy các cộng hợp làm thuốc thử trên vạch chứng vẫn còn hoạt
xuất hiện vạch màu đỏ. Vạch chứng giúp động tốt.
kiểm tra quy trình xét nghiệm được thực
hiện đúng và thuốc thử trên vạch chứng có
phản ứng tốt không.
3.3. Quy trình thực hiện:
3.3.1. Chuẩn bị
- Chuẩn bị sẵn pipette, đầu col, giấy thấm, lọ xử lý chất thải.
- Ly tâm mẫu 2500 vòng/ 10 phút để tách huyết thanh / huyết tương.
- Chuẩn bị kit xét nghiệm tương ứng với số lượng mẫu bệnh phẩm và để chúng ổn định ở
nhiệt độ phòng trong 15-30 phút.
- Ghi thông tin bệnh nhân lên phiếu tiến trình xét nghiệm nhanh.
- Lấy khay thử trong túi kín ra và đặt trên mặt phẳng sạch nằm ngang.
- Ghi tên bệnh nhân, giờ bắt đầu nhỏ mẫu lên khay thử.
3.3.2. Thực hiện xét nghiệm:
SD Bioline HIV 1/2 3.0 Determine HIV 1/2
- Dùng micropipette hút chính xác 10 µL - Gỡ bỏ lớp bảo vệ bên ngoài.
huyết thanh mẫu nhỏ vào vùng nhận mẫu.
- Ngay khi nhỏ mẫu sẽ thấy màu tía di - Dùng micropipette hút chính xác 50 µL
chuyển đến cửa sổ đọc kết quả nằm ở chính huyết thanh mẫu nhỏ vào vùng nhận mẫu
giữa khuôn xét nghiệm. (được đánh dấu bằng kí hiệu mũi tên).
- Nhỏ thêm 4 giọt buffer vào vùng nhận
mẫu.
33
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Đọc kết quả tại thời điểm 15 phút sau khi nhỏ mẫu.
34
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
35
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
kiểm tra áp dụng kỹ thuật đa thông số MPD (Multiple parameter determination) và so sánh
đặc điểm sinh hoá dựa vào các chất đặc trưng và các chỉ thị nhận biết.
- Acid tạo thành khi vi sinh vật sử dụng một cơ chất cụ thể nào đó, được nhận biết bằng
chỉ thị phenol đỏ.
- Cơ chất màu chuyển màu vàng khi có phản ứng enzyme thuỷ phân hoặc có hợp chất P-
nitrophenyl/ P-nitroanilide xuất hiện. Việc thuỷ phân cơ chất huỳnh quang sẽ dẫn đến sự
phát quang.
- Vi sinh vật tiêu thụ một loại carbon nhất định sẽ khiến chỉ thị resazurin-based giảm.
Ngoài ra còn có các test để kiểm tra sự thủy phân, phân hủy hay sử dụng một cơ chất nào
1.2.2. Nguyên lý kháng sinh đồ:
Máy Phoenix áp dụng nguyên tắc thu nhỏ để thực hiện KSĐ. Hệ thống này nhận chỉ thị
oxy hoá khử để phát hiện sự sinh trưởng của VSV trong môi trường chứa kháng sinh. 15
thông số đo của chỉ thị oxy hoá khử kết hợp với đo độ đục được sử dụng trong việc xem
sự phát triển của VSV.
Mỗi thanh panel chứa nhiều thuốc kháng sinh khác nhau và được pha loãng nồng độ theo
cấp số nhân. Kết quả KSĐ được đánh giá thông qua giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
của mỗi vi sinh vật.
1.2.3. Nguyên lý phát hiện chỉ thị kháng thuốc:
Hệ thống có giúp phát hiện các chỉ thị kháng thuốc ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương:
- Khả năng sinh Carbapenemase ở Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp. và P.
aeruginosa.
- Khả năng sinh ESBL ở Enterobacteriaceae.
- Kháng Vancomycin ở Enterococcus.
- Kháng Aminoglycoside nồng độ cao ở Enterococcus.
- Kháng Methicillin ở Staphylococci.
- Sinh β - lactamase ở Staphylococcus.
- Kháng Macrolide ở Streptococcus.
1.3. Kiểm tra chất lượng:
1.3.1. Mẫu bệnh phẩm:
- Mẫu được lấy ở thời điểm trước khi sử dụng kháng sinh.
36
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Bệnh phẩm: các loại bệnh phẩm đã qua nuôi cấy có mọc khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn
gây bệnh trên hộp thạch được chỉ định sử dụng máy tự động Phoenix để thực hiện định
danh và KSĐ.
- Kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc: nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên một hộp thạch
BA/BCP/MC để kiểm tra.
1.3.2. Thiết bị:
Đảm bảo thiết bị được bảo trì, hiệu chuẩn.
1.3.3. Hóa chất/ sinh phẩm, môi trường:
- Thực hiện kiểm tra chất lượng mỗi tuần bằng chủng chuẩn.
Bảng 6: Chủng chuẩn được sử dụng để QC tương ứng với từng nhóm vi khuẩn
P.aeruginosa E. faecalis
ATCCTM 27853 ATCCTM 29212
37
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Chuẩn bị - Tương tự như ID Broth, chúng ta cần chuẩn bị canh trường KSĐ AST
huyền dịch hoặc AST-S khi thực hiện thêm KSĐ.
AST hoặc - Nhỏ 1 giọt chỉ thị AST hoặc AST-S (AST/AST-S Indicator) vào ống
AST-S canh trường AST hoặc AST-S.
- Trộn đều bằng cách đảo ngược vài
lần (không vortex).
- Cấy chuyền huyền dịch từ ID Broth
đã pha ở bước 2 vào ống:
Nếu huyền dịch đạt độ đục là
0,5 – 0,6 McFarland: thêm
25μL huyền dịch định danh
vào ống canh trường AST.
Nếu huyền dịch đạt độ đục là
0,2 – 0,3 McFarland: thêm
50μL huyền dịch định danh
vào ống canh trường AST.
- Đóng nắp, trộn đều vài lần (không Hình 36: Ống canh trường AST, AST-
vortex)
- Đối với nấm, không cần pha ống S và chất chỉ thị tương ứng
canh trường AST mà sẽ làm kháng nấm đồ thay thế bằng phương pháp
thủ công.
38
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 38: Đổ các huyền dịch vào phần giếng tương ứng và đóng nắp
Cấy máu là xét nghiệm vi sinh được chỉ định cho các trường hợp nghi ngờ nhiễm khuẩn
huyết để xác nhận chẩn đoán cũng như xác định tác nhân gây bệnh và có kháng sinh đồ
định hướng cho điều trị.
Ngày nay, cấy máu bằng hệ thống máy tự động được sử dụng phổ biến thay thế cho các
phương pháp cấy trên môi trường lỏng hay chai cấy máu 2 pha.
Tại khoa Vi sinh của bệnh viện đang sử dụng cấy máu BactecTM FX được thiết kế để phát
hiện nhanh vi khuẩn và nấm trong các mẫu bệnh phẩm. Mẫu được lấy từ bệnh nhân và tiêm
trực tiếp vào chai cấy máu BACTEC, sau đó được ủ trong máy. Một số các tính năng và
ưu điểm của máy là:
- Hệ thống trực quan giúp giảm thiểu thời gian thao tác khi trong máy tích hợp cả màn hình
cảm ứng LCD, bộ phận đèn chỉ báo trạng thái và máy quét code ở các vị trí thuận tiện.
- Thiết kế đơn giản giúp cho thao tác dễ dàng, không ảnh hưởng đến người thực hiện.
- Hệ thống luôn theo dõi tình trạng của chai cấy máu mỗi 10 phút trong suốt 24 giờ mỗi
ngày.
- Các kết quả dương được phát hiện nhanh và được thông báo theo 3 cách khác nhau: phát
ra âm thanh báo hiệu, hiển thị trên màn hình của máy số chai cấy máu dương và hiển thị
màu đỏ trên hệ thống đèn chỉ báo trạng thái.
40
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 40: Nguyên lý phát hiện vi khuẩn của máy cấy máu
41
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Nhỏ một giọt lên lam kính, soi tươi. danh trên chai cấy máu dương tính
42
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
C. KÝ SINH
1. Soi tươi phân
1.1 Nguyên lý
Quan sát đại thể và dùng kính hiển vi quang học khảo sát trực tiếp mẫu phân. Soi tươi
không cần nền: là phương pháp soi tươi qua kính hiển vi đóng bớt tụ quang, với bệnh phẩm
được đặt trong một giọt nước muối sinh lý trên một lam kính, ép dưới một lamelle.
1.2 Mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm: phân. Phân nghi ngờ tả, lỏng đục như nước vo gạo, tanh. Đây là mẫu nghiệm
trọng cần thực hiện ngay.
Thời gian lấy mẫu: nên lấy vào giai đoạn sớm của bệnh trước khi dùng kháng sinh.
1.3 Các bước thực hiện
Bước 1: Lấy và nhận mẫu
Điều kiện tiên quyết cho việc hoàn thành kỹ thuật xét nghiệm là thu thập bệnh phẩm đúng
quy cách. Việc thu thập như thế nào còn tùy thuộc vào các kỹ thuật mà KTV thực hiện. Do
đó việc thu thập bệnh phẩm cần tuân thủ một số tiêu chí sau :
- Dụng cụ lấy mẫu :
+ Lọ vô trùng, không thấm nước, có nắp đậy
chặt.
+ Đầy đủ thông tin BN (tên BN, mã số, tuổi,
giới tính) và phù hợp với phiếu chỉ định xét
nghiệm.
- Mẫu bệnh phẩm :
+ Không lẫn đất, cát hoặc nước tiểu.
Hình 42: Chuẩn bị các dụng cụ làm lame soi phân
+ Phải đủ để xét nghiệm (từ 5 – 150 gram).
+ Vận chuyển đến PXN càng sớm càng tốt (không quá 2 giờ).
Bước 2: Khảo sát đại thể:
Quan sát mẫu phân và ghi nhận tính chất của mẫu vào phiếu xét nghiệm:
– Trạng thái: lỏng đục hay đặc/ có nhầy và máu.
– Màu sắc: vàng, nâu đen, trắng, đục như nước vo gạo.
43
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 43: Nhỏ nước muối NaCl 0,9% và đánh tan đều mẫu phân trong giọt nước muối
44
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Đậy lamelle lên phết vừa làm. Cầm miếng lamelle ở 2 cạnh, cho cạnh tiếp xúc với phết
phân vừa thực hiện và hạ nhẹ xuống miếng lame kính, như vậy sẽ tránh có bọt khí trong
phết phân.
Không làm phết quá dày sẽ làm che lấp các mục tiêu cần quan sát hoặc quá mỏng sẽ khó
tìm các mục tiêu.
Có 6 đến 20 trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... trong 1 vi trường +++
Có > 20 trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... trong 1 vi trường ++++
Không có trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... Âm tính
Dưới đây là một số hình ảnh trong quá trình soi phân:
Hình 45: Giun lươn, ấu trùng giai đoạn 1 Hình 46: Nấm men
Hình 48: Trichomonas hominis Hình 47: Giardia lamblia, thể bào nang
46
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Ngoài các ký sinh trùng thì trong soi tươi phân còn phải ghi nhận sự hiện diện của sợi cơ
và hạt mỡ để biết được tình trạng tiêu hóa của bệnh nhân, đặc biệt là trẻ nhỏ, có tốt không.
47
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 52: Các khay vi giếng được đựng trong túi kín
48
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
- Chứng âm: một lọ chứa 1 mL huyết thanh người âm tính pha loãng.
- Chất tạo màu: 1 lọ chứa 11 mL chất tạo màu tetramethylbenzidine (TMB).
- Dịch rửa đậm đặc 20X: 1 chai chứa 25 mL đệm đậm đặc và chất hoạt động bề mặt.
- Đệm pha loãng: 2 lọ chứa 30 mL dung dịch protein đệm.
- Dung dịch dừng phản ứng: 1 lọ chứa 11 mL dung dịch 1M acid phosphoric.
1 2
3 4
Hình 53: Các hóa chất cần thiết cho xét nghiệm
(1): Chứng âm (trái) và chứng dương (phải)
(2) Enzyme liên hợp (phải) và chất tạo màu (trái)
(3) Dung dịch đệm pha loãng (trái) và dung dịch dừng phản ứng (phải)
(4) Các hóa chất được đặt vào các khay
49
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
Hình 54: Xếp các giếng vào khung theo đúng thứ tự hiển thị trên màn hình hệ thống
- Cho khay đã chứa giếng vào máy. Từ đây trở đi thì các thao tác đều được thực hiện tự
động bên trong máy Immunomat.
- Pha loãng tự động mẫu xét nghiệm theo tỷ lệ 1:64.
Bước 1: pha loãng 1:21, hút 620 µL dung dịch pha loãng + 30 µL mẫu bệnh phẩm.
Bước 2: pha loãng 1:64, hut 175 µL dung dịch pha loãng + 80 µL dung dịch đã
pha loãng 1:21.
- Thêm 100 µL chứng âm vào giếng số 1, 100 µL chứng dương vào giếng số 2 và 100 µL
mẫu bệnh phẩm đã pha loãng vào các giếng còn lại. Do chứng âm và chứng dương được
cung cấp đã được pha loãng trước đó nên không cần pha loãng thêm nữa.
50
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
51
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
TỔNG KẾT
Trải qua khoảng thời gian 4 tuần thực tập học phần vi-ký sinh tại bệnh viện Nhi Đồng 2 đã
tạo điều kiện cho em tìm hiểu thêm về các chuyên ngành vi – ký sinh cũng như vận dụng
những kiến thức mà mình đã học được vào thực tiễn.
Nhờ có đợt thực tập này mà em có cơ hội được tham gia vào các công việc trong một phòng
xét nghiệm vi – ký sinh. Trong quá trình làm việc đó, em cũng học hỏi được cách vận hành
phòng xét nghiệm, cách thức làm việc và tác phong của một người KTV khi làm việc tại
phòng xét nghiệm là như thế nào. Dưới sự hướng dẫn tận tình của những anh chị KTV thì
em đã học được nhiều kiến thức mới và có được những kinh nghiệm quý báu để em định
hướng nghề nghiệp cho bản thân sau này.
Bên cạnh đó, không thể không cảm ơn các thầy cô thuộc bộ môn Xét nghiệm vì đã tạo điều
kiện cho chúng em được thực tập tại các bệnh viện chất lượng và bệnh viện Nhi Đồng 2
thật sự đã cho em có được một trải nghiệm thực tập vô cùng bổ ích.
Những gì em tích lũy được trong kỳ thực tập này được thể hiện qua bài báo cáo này của
em. Trong xuyên suốt bài báo cáo, có thể sẽ không tránh khỏi những thiếu sót nên em rất
mong nhận được ý kiến đóng góp từ các thầy cô để bài viết của em được hoàn thiện hơn.
52
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
53
Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
54