Professional Documents
Culture Documents
Oznaczanie Wybranych Węglowodorów Aromatycznych Przy Zastosowaniu Chromatografii Gazowej
Oznaczanie Wybranych Węglowodorów Aromatycznych Przy Zastosowaniu Chromatografii Gazowej
1
AKADEMIA PODLASKA
______________________________________________
Kierunek chemia
Monika Suszek
Siedlce, 2007
2
Improved Analytical Assay for Selected PAHs Using GC/MS and RP-HPLC-FLD
3
Panu prof. dr hab. Bronisławowi K. Głodowi
składam serdeczne podziękowania
za okazaną pomoc i cenne wskazówki
w czasie wykonywania pracy magisterskiej
4
Panu mgr Pawłowi Piszczowi
składam podziękowania za wszelką
udzieloną pomoc przy wykonywaniu tej pracy
5
Praca dyplomowa może przyjmować różne formy w zależności od typu studiów i kraju, w którym
są realizowane. Najczęściej spotykanymi rodzajami prac dyplomowych są:
Praca licencjacka: Jest to praca napisana na zakończenie studiów licencjackich. Zazwyczaj skupia
się na prezentacji podstawowej wiedzy w wybranym obszarze naukowym lub zawodowym.
Praca magisterska: Praca magisterska jest pisana przez studentów na zakończenie studiów
magisterskich. Często ma charakter bardziej pogłębiony niż praca licencjacka i wymaga wykonania
własnych badań lub analizy konkretnego problemu.
Praca inżynierska: Jest to praca napisana przez studentów studiów inżynierskich. Skupia się na
praktycznym zastosowaniu wiedzy inżynierskiej w rozwiązaniu konkretnego problemu
technicznego.
Zarządzanie, marketing, ekonomia i administracja to obszary, w których prace dyplomowe mogą
przynieść wiele interesujących wniosków. W zarządzaniu można badać strategie firmy,
zachowania liderów, czy wpływ kultury organizacyjnej na wyniki. W pracach z marketingu
tematyka może obejmować analizę rynku, badanie zachowań konsumentów czy ocenę
skuteczności kampanii marketingowych. Prace z ekonomii mogą badać wpływ polityki
gospodarczej na gospodarkę, analizować zmiany na rynkach finansowych, czy badać przyczyny i
skutki ubóstwa. W pracach z administracji natomiast można skupić się na strukturach
administracyjnych, procesach decyzyjnych czy wpływie polityki publicznej na społeczeństwo.
Prace z politologii to kolejny szeroki obszar, w którym student może zająć się badaniem procesów
politycznych, systemów wyborczych, czy wpływu mediów na politykę. Niezależnie od obszaru,
każda praca dyplomowa zawsze wymaga pisanie analiz. To proces, który obejmuje interpretację
zebranych danych, identyfikację wzorców, wnioskowanie i tworzenie argumentów. Z kolei prace
z rolnictwa wymagają przeprowadzanie badań. Często podobne badania zawierają prace z ekologii.
Prace z filozofii z kolei, to obszar, w którym studenci mogą badać różne filozoficzne koncepcje,
teorie i idee, zastanawiać się nad pytaniem o sens życia, wolną wolę, prawdę, moralność, a także
analizować dzieła różnych filozofów.
W sumie, prace dyplomowe są wyrazem umiejętności, wiedzy i zrozumienia studenta dla danego
obszaru nauki. Są one ważne nie tylko jako końcowy produkt edukacyjny, ale także jako dowód
na zdolność studenta do samodzielnego myślenia, badania, analizy i argumentacji. Bez względu na
to, czy dotyczą one teologii, bankowości, prawa, zarządzania, marketingu, ekonomii, administracji,
politologii czy filozofii - są one nieodłączną częścią edukacji akademickiej.
Kochanym Rodzicom
oraz wszystkim, którzy się przyczynili do powstania tej
pracy dziękuję za wiarę, optymizm i wsparcie
6
SPIS TREŚCI
1. WSTĘP ...................................................................................................................................3
2. CZĘŚĆ LITERATUROWA .................................................................................................4
2.1. Ogólna Charakterystyka Wielopierścieniowych Węglowodorów Aromatycznych .........
(WWA) .............................................................................................................................4
2.1.1. Właściwości fizyczne WWA .....................................................................................7
2.1.2. Właściwości chemiczne WWA .................................................................................7
2.2. Odkrycie i występowanie WWA......................................................................................9
2.3. Toksyczność WWA, absorpcja i metabolizm w organizmach żywych..........................10
2.3.1. Aktywność biologiczna i absorpcja WWA .............................................................10
2.3.2. Działanie kancerogenne i mutagenne WWA .........................................................11
2.3.3. Metabolizm WWA w organizmie ..........................................................................13
2.4. Charakterystyka skażenia żywności WWA....................................................................15
2.5. Metody oznaczania WWA..............................................................................................17
2.6. Wpływ rodników hydroksylowych na benzo[a]piren ....................................................18
3. CEL PRACY ........................................................................................................................19
4. CZEŚĆ EKSPERYMENTALNA.......................................................................................20
4.1. Aparatura ........................................................................................................................20
4.1.1. Preparatywny chromatograf wykluczania sterycznego (SEC) ..............................20
4.1.2. Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas (GC/MS) I.....................................20
4.1.3. Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas (GC/MS) II ...................................20
4.3.2. Analityczny wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC)..............................21
4.2. Odczynniki .....................................................................................................................22
4.3. Procedura analityczna.....................................................................................................24
4.3.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych ................................................................24
4.3.2. Przygotowanie próbek olei i wyodrębnienie frakcji WWA z matrycy tłuszczowej 24
4.3.3. Warunki analizy za pomocą chromatografii cieczowej.........................................25
4.3.4. Przeprowadzanie reakcji B[a]P z rodnikami hydroksylowymi .............................26
4.3.5. Statystyczna analiza danych ..................................................................................26
5. WYNIKI I DYSKUSJA ......................................................................................................27
5.1. Przygotowanie próbki – chromatografia preparatywna..................................................27
5.2. Analizy chromatograficzne GC/MS ...............................................................................28
5.3. Analizy chromatograficzne HPLC .................................................................................31
5.4. Oznaczanie WWA w próbkach olejów jadalnych..........................................................32
1
5.5. Wpływ temperatury na rozdział WWA metodą HPLC ..................................................34
5.6. Walidacja metody ...........................................................................................................40
5.7. Utlenianie B[a]P przez rodniki hydroksylowe ...............................................................42
6. WNIOSKI.............................................................................................................................44
7. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................45
2
1. WSTĘP
3
2. CZĘŚĆ LITERATUROWA
Tabela 1.
Najczęściej oznaczane WWA - lista EPA-US (1-16) i KN UE (SCF-UE) (9-23) [1, 2]
EPA-US – Environmental Protecting Agency United States, KN UE- Komisja Nauki Unii Europejskiej, (SCF-UE –
Union European Commission Scientific Committee on Food )
4
5 Fluoren FL 166 C13H10
5
14 Chryzen Ch 228 C18H12
6
21 Dibenzo[a,i]piren D[i]P 302 C24H14
H3C
WWA są to ciała stałe o krystalicznej budowie, które w stanie czystym występują jako
bezbarwne, jasno żółte lub zielone kryształy. Mają niską lotność (głównie cięższe WWA) i słabą
rozpuszczalnością w wodzie (brak grup polarnych). Im większa jest ich masa cząsteczkowa tym
mniejsza rozpuszczalność węglowodorów. Przykładowo, rozpuszczalność naftalenu (M=128) w
wodzie wynosi 37,2 [µg/l], benzo[a]antracenu (M=228) - 14 [µg/l], benzo[a]pirenu (M=252) -
3,8 [µg/l] natomiast perylenu (M=252) tylko 0,4 [µg/l]. Z tego powodu bardzo łatwo adsorbują
się one na cząstkach niepolarnych, takich jak np. pyły. Absorbują one światło w zakresie UV-
VIS, co wykorzystuje się to do oznaczeń zarówno ilościowych i jakościowych [3, 4].
Węglowodory aromatyczne pod wpływem światła oraz tlenu łatwo ulegają reakcjom
fotochemicznym tworząc epoksydy, chinony, diole, fenole i aldehydy (Schemat 1). W układach
biologicznych reakcje te są kontrolowane enzymatycznie (Schemat 2). Im większa liczba
7
skondensowanych pierścieni w cząsteczce WWA tym łatwiej się ona utlenia. Będąc związkami
aromatycznymi ulegają także reakcjom substytucji elektrofilowej.
O HO OH
[O] [O]
epoksyd dihydrodiol
O O [O] [O] OH
chinon fenol
O2
enzym
O
benzo[a]piren 7,8-epoksybenzo[a]piren
enzym
O
O2
enzym
HO HO
OH OH
9,10-epoksy-trans-7,8-dihydroksybenzo[a]piren trans-7,8-dihydroksybenzo[a]piren
Już w 1775 roku anglik sir Percival Pott wskazał na powiązania pomiędzy wzmożoną
zachorowalnością na raka moszny u londyńskich kominiarzy, a ekspozycją na WWA. Wysunął
hipotezę, że zachorowalność na nowotwory jest powiązana z ekspozycją na smołę i sadzę, z
którą mieli do czynienia podczas wykonywania swojej pracy. Pott nie potrafił jeszcze nazwać i
wyodrębnić związków chemicznych, które zawarte w sadzach powodowały nowotwory. Dopiero
po ponad 150 latach, w roku 1929 zidentyfikowano dibenzo[a,h]antracen występujący w
sadzach, który jest odpowiedzialny za powstawanie chorób nowotworowych [5].
WWA powstają podczas niepełnego spalania substancji organicznej (z syntezy
niskocząsteczkowych związków lub rozpadu wysokocząsteczkowych, głównie lignin). Jako
naturalne źródła emisji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych do środowiska
należy wymienić: pożary, wybuchy wulkanów, wypalanie traw i nieużytków. W niewielkich
ilościach zawierają je także naturalne kopaliny, a mianowicie węgiel kamienny czy ropa
naftowa. Spośród źródeł generowanych przez człowieka najważniejszymi są emisja gazów i
dymów z zakładów przemysłowych (szczególnie z przemysłu ciężkiego) oraz procesy
wytwarzania energii w elektrowniach i elektrociepłowniach. Istotnymi źródłami uwalnianie
WWA do środowiska są także: motoryzacja (spaliny samochodowe, ścieranie się opon) oraz
dymy z kotłowni i pieców domowych [6]. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne
występują także w surowcach przemysłowych takich jak pak węglowy, oleje mineralne oraz w
produktach ich obróbki: smoła pogazowa, sadze czy też olej kreozotowy. Skład i ilość mieszanin
WWA emitowanych do środowiska zależy od rodzaju substancji spalanej, metody spalania oraz
stosowania filtrów i innych urządzeń chroniących przed ich emisją [7].
Większość wielopierścieniowych węglowodorów w powietrzu występuje pod postacią
par i aerozoli zaadsorbowanych na pyłach o średnicy około 0,5 nm. Tak zaadsorbowane
cząsteczki WWA mogą być przenoszone za pomocą wiatru daleko od miejsc, w których
powstały, zanieczyszczając glebę, wodę i rośliny. Szczególnie dotyczy to węglowodorów
ciężkich.
W literaturze można znaleźć dużo prac odnośnie zależności charakterystyki emisji WWA
od źródeł ich powstawania. Jednym z ważniejszych czynników wpływających na immisję
węglowodorów do środowiska są ruchy powietrza [8]. Węglowodory skażające atmosferę to
głównie węglowodory alifatyczne zarówno nasycone jak i nienasycone, a także węglowodory
aromatyczne o małej masie cząsteczkowej [9]. Tylko cząstki o średnicy mniejszej niż 1 µm
wnikają drogą oddechową. W szczególności zagrożenie ekspozycją na WWA występuje w
9
takich gałęziach przemysłu jak hutnictwo, przemysł gumowy, produkcja sadzy czy
koksownictwo [7]. Odrębnym źródłem powstawania i emisji WWA jest palenie papierosów.
region zatoki
12 1
11 2
10 3
9
8 4
7 6 5
region M region K
10
W procesie pobrania drogą pokarmową WWA stwierdzono, że największy udział mają
produkty pochodzenia zwierzęcego, następnie oleje i tłuszcze roślinne, produkty zbożowe, ryby i
produkty rybne. Udział warzyw i owoców w przeciętnym pobraniu WWA jest minimalny [12].
Tabela 2.
Względne aktywności kancero- i mutagenna wybranych WWA [15,16]
Aktywność Aktywność
Nazwa związku
kancerogenna mutagenna
Tabela 3.
Klasyfikacja WWA ze względu na siłę działania kancerogennego według IARC
(Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem) [17]
12
Okazało się, że dwu-, trzy- oraz czteropierścieniowe węglowodory nie są kancerogenne.
Również 9,10-dwumetyloantracen, 1,2,3,4-terametylofenantren i benzo[a]antracen posiadają
niski potencjał kancerogenny. Natomiast dibenzo[a,h]antracen oraz benzo[a]piren są silnie
kancerogenne [17].
Korzystając z wyników badań przeprowadzonych na zwierzętach doświadczalnych
wyznaczono dawkę minimalnego poziomu ryzyka (z ang. minimal risk lewel – MRL). Dla ludzi
wynosi ona 0,01 mg B[a]P na kg mc na dzień oraz 3,65 mg na kg mc na rok. Należy zaznaczyć,
że sugerowana dawka nie oznacza konieczności wystąpienia choroby nowotworowej, a jedynie
prowizoryczną dawkę względnego ryzyka.
13
O
EH MFO
OH
region zatoki EH
W ydalanie z moczem
OH
OH
12
2
11
3
MFO
10
OO
OH HO
HO
HO
9
EH
HO
HO
8
HO
4
MFO EH
7
6
5
O
OH
B[a]P
region M region K epoksy-dihydroksydiole tetra-ole
OH
EH – hydrolazy epoksydowe
EH
O
OH
epoksydy Kwas glukuronowy
OH
dihydroksydiole wydalanie z moczem
DNA
fenole w pozycjach
HO
HO
1-,3-,6-,7- lub 9-
12
2
11
OH
10
W ydalanie z moczem
9
OH
8
4
addukt DNA
7
6
5
OH
Odnowa DNA Mutacja DNA
HO
OH
OHHO
W ydalanie z moczem
OH
HO
OH
fenolo diole
14
2.4. Charakterystyka skażenia żywności WWA
15
Tabela 4.
Zawartości oznaczanych WWA w różnych olejach roślinnych [26].
16
2.5. Metody oznaczania WWA
17
2.6. Wpływ rodników hydroksylowych na benzo[a]piren
18
3. CEL PRACY
19
4. CZEŚĆ EKSPERYMENTALNA
4.1. Aparatura
Część pomiarów wykonanych zostało na, znajdującym się na terenie Instytutu Przemysłu
Mięsnego i Tłuszczowego, aparacie GC/MS TSQ500 połączonym z spektrometrem mas
20
17A/QP5050 (Finnigan – Thermo Quest, Waltham, MA, USA) z pułapką jonową, wyposażonym
w kolumnę BPX-35, 30m x 0,025mm I.D x 0,25 μm FT (Phenomenex, Torrance, CA, USA).
Jako gaz nośny został użyty hel o czystości 99,99999% i przepływie 0,8 ml/min. Temperatura
dozownika wynosiła 200 oC, programowalna temperatura kolumny: izoterma 80oC – 2 min,
przyrost 5 oC/min, izoterma końcowa 320 oC - 15 min, temperatura linii transferowej – 310 oC,
zakres m/z -110 – 310.
21
Rysunek 2. Schemat zestawu HPLC: 1 - butle ze składnikami fazy ruchomej, 2 - interfejs, 3 -
pompa, 4 - mieszadło, 5 - dozownik, 6 - termostat z kolumną, 7 - detektor spektrofotometryczny,
8 - detektor fluorescencyjny, 9 - butla na ścieki i 10 - komputer.
4.2. Odczynniki
23
- wtórne materiały odniesienia FAPAS oliwy: 0618, 0621,0615 (Central Science Laboratory,
York, UK),
- próbki olejów jadalnych (rzepakowy rafinowany , słonecznikowy, oliwa z oliwek) zakupione
zostały w najbliższym sklepie,
- butlę ze sprężonym azotem o czystości 5,0 (99,999%),
- bufor fosforowy w tabletkach PBS (0,02M) (Phosphate Buffered Saline),
- kwas tereftalowy (TFA) (10mM) (Sigma-Aldrich, Niemcy),
- 3% wodę utlenioną (Infarm, Polska),
- siarczan (VI) żelaza (II) (10 mM) (Sigma-Aldrich, Niemcy).
24
rozpuszczona w acetonitrylu (200 µl), a następnie poddana analizie na GC/MS i HPLC. Warunki
pracy preparatywnego chromatografu cieczowego:
- faza ruchoma - dichlorometan (temp. pokojowa),
- szybkość przepływu fazy ruchomej - 1 ml/min,
- objętość wstrzykiwanej próbki - 400 µl,
- długość fali detektora - 254 nm,
- czas zbierania frakcji WWA - 18-24 min.
Rozdział WWA na HPLC był wykonywany w układzie faz odwróconych (na niepolarnej
kolumnie). Warunki rozdziału zostały zoptymalizowane eksperymentalnie w oparciu o dostępne
dane literaturowe.
Warunki pracy analitycznego chromatografu cieczowego:
- Faza ruchoma: - woda – acetonitryl lub woda – metanol o gradiencie:
Czas [min] 0 20 35 40
Woda [%] 50 0 0 50
Acetonitryl lub metanol [%] 50 100 100 50
25
Stężenie, ci, węglowodoru w próbce obliczano ze wzoru (1):
(1) S s cb Ab cstVst
ci =
Sb cS As m
gdzie:
Sb – pole powierzchni węglowodoru w materiale certyfikowanym (SRM 1491),
SS – pole powierzchni benzo[b]chryzenu dodanego do materiału certyfikowanego (SRM 1491),
cb – stężenie węglowodoru w materiale certyfikowanym (SRM 1491) [µg/kg],
cs – stężenie benzo[b]chryzenu dodanego do materiału certyfikowanego (SRM 1491) [µg/kg],
Ab – pole powierzchni badanego węglowodoru w próbce,
As - pole powierzchni benzo[b]chryzenu dodanego do próbki,
cst – stężenie benzo[b]chryzenu dodanego do próbki,
Vst – objętość roztworu benzo[b]chryzenu dodanego do próbki,
m – masa próbki [kg].
26
5. WYNIKI I DYSKUSJA
Rysunek 4. Chromatogram GC/MS (m/z=128, 140, 152,154, 166, 178, 192, 202, 226, 228, 242,
252, 276, 278) 24 WWA SRM 1491 (1 - naftalen, 2 - 2-metylonaftalen, 3 - 1-metylonaftalen, 4 -
bifenyl, 5 - 2,6-dimetylonaftalen, 6 - acenaftylen, 7 - acenaften, 8 - 2,3,5-trimetylonaftalen, 9 -
fluoren, 10 - fenantren, 11 - antracen, 12 - 1-metylofenantren, 13 - fluoranten, 14 - piren, 15 -
benzo[a]antracen, 16 - chryzen, 17 - benzo[b]fluoranten, 18 - benzo[k]fluoranten, 19 -
benzo[e]piren, 20 - benzo[a]piren, 21 - perylen, 22 - indeno[1,2,3-cd]piren, 23 -
dibenzo[a,h]antracen, 24 - benzo[ghi]perylen). Warunki chromatograficzne zostały
przedstawione w opisie aparatury (4.1.2.)
28
Rysunek 5. Chromatogram GC/MS (m/z=128, 152, 166, 178, 202, 226, 228, 242, 252, 276, 278,
302) 23 WWA z list US-EPA i KN UE (1 - naftalen, 2 - acenaftalen, 3 - acenaftylen, 4 -
fenantren, 5 - fluoren, 6 - antracen, 7 - fluoranten, 8 - piren, 9 - cyklopenta[cd]piren, 10 -
benzo[a]antracen, 11 - chryzen, 12 - 5-metylochryzen, 13 - benzo[b]fluoranten, 14 -
benzo[j]fluoranten, 15 - benzo[k]fluoranten, 16 - benzo[a]piren, 17 - indeno[1,2,3-cd]piren, 18 -
benzo[ghi]perylen, 19 - dibenzo[a,h]antracen, 20 - dibenzo[a,l]piren, 21 - dibenzo[a,e]piren, 22 -
dibenzo[a,i]piren, 23 - dibenzo[a,h]piren). Warunki chromatograficzne zostały przedstawione w
opisie aparatury (4.1.3.).
30
5.3. Analizy chromatograficzne HPLC
Rysunek 7. Chromatogram HPLC 16 WWA z listy EPA. SRM 1491 (1 – nie analizowane
niskocząsteczkowe WWA, 2 – benzo[a]antracen, 3 – chryzen, 4 – benzo[b]fluorantenu, 5 –
benzo[k]fluorantenu, 6 – benzo[a]piren, 7 – indeno[1,2,3-cd]piren, 8 – dibenzo[a,h]antracen, 9 –
benzo[ghi]perylen, i 10 – benzo[b]chryzen).Warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil (5
μm, 250x3 mm I.D.), faza ruchoma : gradient acetonitrylu wody (zgodnie z tabelą podaną w
warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej), detektor fluorescencyjny (długości fal
wzbudzenia i emisji podane w tabeli w warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej),
temperatura - 25 ºC, przepływ – 0,8ml/min, objętość nastrzyku - 20 μl.
Tabela 6.
Stężenie B[a]A i B[a]P [µg/kg] w próbkach olejów jadalnych
32
Tabela 7.
Porównanie wartości B[a]P i B[a]A oznaczonych w próbkach olejów z wartościami
rekomendowanymi przez UE.
33
5.5. Wpływ temperatury na rozdział WWA metodą HPLC
Ponieważ okazało się, że metoda GC/MS charakteryzowała się zbyt wysokim progiem
wykrywalności, dlatego dalsze pomiary przeprowadzałam z zastosowaniem HPLC w układzie
faz odwróconych z detekcją fluorescencyją. W tym przypadku progi wykrywalności były
wystarczające (poniżej ppb) do celów analitycznych. Okazało się jednakże, że nie mogłam
uzyskać rozdziału B[j]F i 5MCh poprzez zmianę składu i szybkości przepływu fazy ruchomej.
Rozdział chromatograficzny następuje wtedy, gdy α > 1. Współczynnik selektywności
jest wielkością termodynamiczną, co wynika ze wzoru (2).
(2) -RTlnα = Δ(ΔG).
Wynika z niego, że zmniejszenie temperatury zwiększa selektywność rozdziału.
Tabela 8.
Czasy retencji 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F) i wyliczone z nich
współczynniki rozdziału (Rs) i selektywności (α). Warunki chromatograficzne: kolumna –
Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - gradient acetonitrylu i wody (zgodnie z tabelą podaną w
warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej); przepływ - 0,8 ml/min; objętość
wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali – 254 nm.
tR [min] tR [min]
T [°C] RS α
5MCh B[j]F
5 26,70 27,62 2,10 1,038
34
Tabela 9.
Czasy retencji 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F) i wyliczone z nich
współczynniki rozdziału (Rs) i selektywności (α). Warunki chromatograficzne: kolumna –
Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - metanol; przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej
próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali – 254 nm.
tR [min] tR [min]
T [°C] RS α
5MCh B[j]F
8 11,36 12,06 1,51 1,080
Rysunek 8. Zależność czasu retencji (tR) od temperatury (T) dla 5-metylenochryzenu (5MCh) i
benzo[j]fluorantenu (B[j]F). Warunki chromatograficzne: kolumna – Hypersil, 5µm, 250x3mm
I.D; eluent - gradient acetonitrylu i wody (zgodnie z tabelą podaną w warunkach analizy za
pomocą chromatografii cieczowej); przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki -
20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali – 254 nm.
35
Rysunek 9. Zależność czasu retencji (tR) od temperatury (T) dla 5-metylenochryzenu (5MCh) i
benzo[j]fluorantenu (B[j]F). Warunki chromatograficzne: kolumna – Hypersil, 5µm, 250x3mm
I.D; eluent - metanol; przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor
spektrofotometryczny, długość fali – 254 nm.
1,20
1,10
RS
α
0,80
1,05
0,40
1,00 0,00
8 10 12 14 16 18 20 22
o
T [ C]
37
Rysunek 12. Chromatogramy HPLC 2 WWA zarejestrowane w różnych temperaturach (1 – 5-
metylochryzen, 2 – benzo[j]fluoranten). Warunki chromatograficzne jak na Rysunku 8.
38
Rysunek 14. Chromatogramy HPLC 2 WWA zarejestrowane w różnych temperaturach (1 – 5-
metylochryzen, 2 – benzo[j]fluoranten).Warunki chromatograficzne: kolumna – Hypersil, 5µm,
250x3mm I.D; eluent - gradient metanolu i wody (zgodnie z tabelą podaną w warunkach analizy
za pomocą chromatografii cieczowej); przepływ - 0,8ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki -
20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali - 254 nm.
39
Rysunek 15. Trójwymiarowy chromatogram 5MCh (1) i B[j]F (2) zarejestrowany za pomocą
detektora z matrycą diodową.
40
Tabela 6.
Materiały odniesienia
Tabela 7.
Wtórne materiały odniesienia
41
5.7. Utlenianie B[a]P przez rodniki hydroksylowe
Rysunek 16. Obserwowane zmniejszenie wysokości piku roztworu B[a]P po upływie 50 minut.
Rysunek 17. Zmniejszenie wysokości piku i pola powierzchni piku B[a]P po 3, 20 i 50 minutach
reakcji.
42
Istotnym problemem związanym z ochroną środowiska jest usuwanie z niego związków
toksycznych. W literaturze opisane są metody ich rozkładu oparte na ich utlenianiu ozonem,
działaniem promieniowania UV czy ultradźwięków [31]. Ostatnio opisano również metody
utleniania fenoli za pomocą rodników hydroksylowych. Rodniki te generowane są w reakcji
Fentona [32, 33]:
Fe 2 + + H 2 O 2 = Fe 3 + + OH - + OH •
Jako modelowy związek do zbadania reakcji wybrany został benzo[a]piren.. Okazało się,
że stężenie, (przedstawione w postaci wysokości piku) B[a]P po 50 min. reakcji zmniejszyło się
o połowę (Rysunek 16). Powyższe badania należy traktować jako pilotażowe. Dobór parametrów
reakcji może zwiększyć wydajność metody.
43
6. WNIOSKI
1. Metoda HPLC z detekcją fluorescencyjną okazała się znacznie bardziej czuła niż GC/MS.
2. Obniżenie temperatury kolumny poprawiło selektywność układu i umożliwiło rozdział B[j]F
i 5MCh.
3. Próg wykrywalności, oznaczalności i odzysk dla benzo[a]pirenu wynosiły odpowiednio 0,1
µg/kg, 0,3 µg/kg, 93÷106%, a dla benzo[a]antracenu 0,2 µg/kg, 0,5 µg/kg, 94÷104%. Próg
wykrywalności (< 0,3 µg/kg), próg oznaczalności (< 0,9 µg/kg) i wartość odzysku (50 ÷ 120
%) są zgodne z wytycznymi dyrektywy UE 10/2005 (02, 04, 2005).
4. Rodniki hydroksylowe mogą być stosowane do usuwania B[a]P ze środowiska, aczkolwiek
metoda ta wymaga jeszcze dopracowania.
44
Prace dyplomowe są końcowym etapem edukacji na studiach wyższych. Są one znaczącym
przejawem umiejętności badawczych, analizy i krytycznego myślenia studenta. W zależności od
dyscypliny naukowej, prace dyplomowe przybierają różne formy i poruszają różnorodne tematy,
od praktycznych do teoretycznych, od konkretnych do abstrakcyjnych. Wybór tematu, zebranie i
analiza danych, tworzenie wniosków - wszystko to jest nieodzowną częścią procesu tworzenia
pracy dyplomowej.
Pierwszym przykładem, który warto rozważyć, są prace z teologii. W takich pracach student może
badać wpływ wiary na społeczeństwo, relacje między religią a nauką, lub analizować interpretacje
i znaczenia konkretnych tekstów religijnych.
Kolejnym obszarem zainteresowania mogą być prace o prawach człowieka. Tutaj studenci mogą
zająć się badaniem historii praw człowieka, analizować różne przypadki naruszeń tych praw, lub
zbadać jak prawa człowieka są przestrzegane w różnych częściach świata.
Prace z negocjacji to z kolei prace, które koncentrują się na strategiach negocjacyjnych, procesach
decyzyjnych, czy wpływie kultury na negocjacje. W praktyce mogą one obejmować studia
przypadków, symulacje, czy analizę transkryptów rzeczywistych negocjacji. Warto też zauważyć,
że polskie prace dyplomowe nie ustępują jakością tym tworzonym za granicą. Niezależnie od tego,
czy dotyczą one kampanii społecznych, zagadnień związanych z prawem czy bankowością, są one
z reguły dobrze napisane i gruntownie zbadane. Prace o kampaniach społecznych mogą obejmować
analizę skuteczności konkretnej kampanii, badać wpływ mediów społecznościowych na kampanie
społeczne, czy porównać różne strategie używane w kampaniach społecznych.
Śląsk to wyjątkowy region, o bogatej historii i kulturze, więc prace o Śląsku mogą dotyczyć
różnych aspektów, od historii gospodarczej regionu, przez analizę dialektów śląskich, do badań
społeczno-kulturowych. W dziedzinie bankowości, prace dyplomowe mogą obejmować analizę
ryzyka kredytowego, badanie innowacji w usługach bankowych, lub analizowanie skutków
kryzysów finansowych na sektor bankowy. Prace z prawa to z kolei obszar, który może obejmować
szerokie spektrum tematów, od badań konkretnych przypadków, przez analizę ustaw, po badanie
wpływu prawa na społeczeństwo.
Praca dyplomowa jest oceniana przez opiekuna pracy oraz komisję egzaminacyjną na podstawie
jej treści, jakości wykonania, oryginalności, umiejętności analizy i wnioskowania oraz sposobu
prezentacji. Praca dyplomowa ma duże znaczenie dla studentów, ponieważ może mieć wpływ na
ocenę końcową oraz być podstawą do dalszej kariery zawodowej lub podjęcia dalszych studiów.
7. BIBLIOGRAFIA
45
Bronchoalveolar Lavage Fluid Composition, and Histopathology, J. Toxicol. Environ.
Health, 27, 123-138, 1989.
15. I. C. T. Nisbet, P. K. LaGoy, Toxic (TEFs) for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs),
Toxicol. Pharmacol., 16, 290-300, 1992.
16. IARC, Monographs on the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 32, 1983.
17. IARC, International Agency for Research on Cancer, Monographs on the evaluation of
carcinogenic risk of the chemical to humans. Polynuclear aromatic compounds, Chem.
Environ. Exp. , Lyon France, 32, 1983.
18. M. D. Guilen, P. Sopelana, Polycyclic aromatic hydrocarbons in diverse foods. Food Safety
Cont. Toxins, 17, 175-198, 1999.
19. B. Schoket. DNA damage in humans exposed to environmental and dietary polycyclic
aromatic hydrocarbons. Mut. Res., 424, 143-153, 1999.
20. K Hemminki, DNA adducts in humans related to occupational and environmental
exposureto aromatic compounds, IARC, 181-191, 1990.
21. K Hemminki., K Randerath., M Reddy, Postlabelling and immunoassay analysis of
polycyclic aromatic hydrocarbons – adducts of deoxyribonucleic acid in white blood cells of
foundry workers.Scand. J. Environ. Health, 16, 158-162, 201, 1990.
22. N. Kishikawa, M Wada, N. Kuorda., S. Akiyama, K. Nakashima, Determination of
polycyclic aromatic hydrocarbons In milk samples by high-performance liquid
chromatography witch fluorescence detection. J. Chromatogr. A, 789,
256-264, 2003.
23. S.Y.N. Yang, D. W. Conell, D. W. Havker, S. I. Kayal, Policyclic aromatic hydrocarbons in
air, soil and vegetation in the vincinty of urban roadway, Sci. Total Environ., 102, 229 -
240, 1991.
24. W. Lijnsky, The formation and occurrence of polynuclear aromatic hydrocarbons associated
witch food, Mut. Res., 259, 252-261, 1991.
25. M. E. Doremire, G. E. Harmon, D. E. Pratt, 3, 4-benzopyrene in charcoal grilled meats, J.
Food Sci., 622-623, 1979.
26. E. Węgrzyn, S. Grześkiewicz, W. Popławska, B. K. Głód, Udoskonalona metoda oznaczania
ośmiu WWA w olejach jadalnych przy zastosowaniu RP-HPLC-FLD oraz preparatywnej
SEC, Acta Chromatogr.,11, 2005.
27. K. Speer, A. Montag, Polycyclishe aromatische kohlenwasserstoffe In nativen pflanzlichen
olen, Fat Sci. Techn., 163-167, 1988.
28. Regulation (EC) No. 2065/2003 of the Europen Parliament and of the Council of November
2003 on smoke flavourings used or intendent for use in foods. J. Eur. Comm. L 309
46
,http://europa.eu.int/eurlex/lex/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32003R2065:EN:HT
Ml, 2003.
29. A. S. Płaziak, Spektrometria masowa związków organicznych, Wydawnictwo Naukowe
UAM, Poznań 1997.
30. R. Simon, S. Palme, E. Anklam, Single-laboratory validation of a gas chromatography-mass
spectrometry method for quantitation of 15 Europen priority polycyclic aromatic
hydrocarbons in spiked smoke flavourings, J. Chromatogr. A, 1103, 307-313, 2005.
31. M. Eberius, A. Berns, J. Schuphan, Ozonation of pyrene and benzo[a]pyrene in silica and
soil -14C mass balances and chemical analisys of oxidation products as a first step to
exotoxicological evolution, J. Anal. Chem., 359, 274-279, 1997.
32. V.Kavitha, K. Palanivelu, Destruction of cresolsby Fenton oxidation process, Wat. Res., 30,
62-3072, 2005.
33. F. J. Rivas, F. J. Beltron, J. F. And P. Buxeda, Oxidation of p-hydroxybenzoic acid by
Fenton's reagent, Wat. Res., 35, 387-396, 2001.
47