SDS PAGE

ZAKŁAD PATOLOGII OGÓLNEJ 2022

Elektroforeza to rozdział molekuł obdarzonych
ładunkiem w polu elektrycznym.
 Żel poliakrylamidowy

 Żel utworzony z polimeru stanowi rodzaj sita molekularnego, siatki,

umożliwiając rozdzielanie molekuł ze względu na ich wielkość i kształt
 Można zaplanować gęstość sita używając różnej procentowości żelu z
reguły 10-15% albo żel gradientowy, zawierający różną procentowość
Podstawą polimeryzacji żelów poliakrylamidowych jest reakcja pomiędzy
akrylamidem i bis-akrylamidem.
Do żelu dodaje się jeszcze:
 bufor Tris-HCl/Tris-base o odpowiednim stężeniu molowym i pH
SDS (sodium dodecyl sulfate, laurylosiarczan sodu)
 Na samym końcu dodaje się TEMED oraz APS.
APS (ammonium persulfate) – źródło wolnych rodników; rozpoczęcie reakcji polimeryzacji
TEMED to stabilizator wodnych rodników, promujących polimeryzację żelu; przyspieszenie reakcji polimeryzacji
Przygotowanie próbek

Elektroforeza musi być prowadzona w warunkach

denaturujących i redukujących (SDS-PAGE), żeby:
- Białka posiadały rozfałdowaną strukturę
- Były jednakowo naładowane
- Ich rozdział zależał wyłącznie od masy
Próbka

 Denaturacji termicznej (gotowanie w 95°C)

 Silnym środkom redukującym, 2-merkaptoetanol
lub DTT, które redukują mostki disiarczkowe
obecne w białkach
Bufor do elektroforezy

 Dodecylosiarczan sodu (SDS) – detergent jonowy; niszczy

oddziaływania niekowalencyjne. SDS łączy się z grupami
hydrofobowymi aminokwasów, nadając białkom ładunek ujemny,
co sprawia że wędrują w kierunku anody. Ilość związanego SDS jest
proporcjonalna do wielkości białka.

 Glicyna – nadaje wszystkim białkom podobny ładunek; jej ładunek

w żelu zagęszczającym jest obojętny albo lekko ujemny – wędruje
zatem powoli

 Tris – zapewnia stałe pH

Wyjątki – migracja nie do końca
zgodna wyłącznie z masą
 białka obdarzone wysokim ładunkiem
natywnym (np. białka histonowe, migrujące
wolniej niż wskazywałaby na to ich masa)
 białka błonowe
Etap zagęszczania

 Układ Laemmliego: układ tris-glicyna, w którym pH żelu zatężającego

wynosi 6,6, zaś żelu rozdzielającego 8,8.
 Jonami zaangażowanymi w zagęszczanie analizowanych białek w żelu
zatężającym są aniony chlorkowe i glicynianowe
 pH żelu zatężającego jest nieznacznie wyższe niż pI glicyny  raczej jony
obojnacze, słabo migrują w polu elektrycznym, jon opóźniony (ang. trailing
ion)
 aniony chlorkowe, posiadające wysoką ruchliwość elektroforetyczną,
przemieszczają się szybko w kierunku anody wraz z czołem próbki jako tzw.
„jon wiodący” (ang. leading ion)
 Niskie stężenie poliakrylamidu na tym etapie nieznacznie ogranicza ruch
zdenaturowanych białek.
Etap rozdzielania

 pH żelu rozdzielającego jest znacznie powyżej pI glicyny

(pH = 8,8), praktycznie całość glicyny ulega
deprotonacji i jako aniony wyprzedza białka
 Białka migrują zależnie od swojej masy