ELISA

IMMUNOENZYMATYCZNE TESTY
FAZY STAŁEJ
Dr n. med. Ewa Pius-Sadowska
Immunoenzymatyczny test, który
stosuje się do wykrywania i oceny
stężenia antygenów lub przeciwciał
w materiale biologicznym.
Charakteryzuje się dużą czułością,
dzięki unieruchomieniu antygenu na
stałym podłożu („faza stała”) i
zastosowaniu do detekcji
znakowanych przeciwciał.

ELISA (ANG. ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT

ASSAY)
 ELISA
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY = IMMUNOENZYMOSORBCYJNY

Test płytkowy fazy stałej – jeden z najpowszechniejszych w badaniach biomedycznych,

naukowych i diagnostycznych
Zasada testu opiera się na reakcji: antygen – przeciwciało
Służy do wykrycia i ilościowej oceny określonych antygenów lub przeciwciał
Ocena ilościowa jest możliwa dzięki wykorzystaniu enzymów sprzężonych kowalencyjnie z
przeciwciałami → reakcja barwna po dodaniu do roztworu substratu dla zastosowanego
enzymu

ZALETY:
Wysoka czułość, swoistość, powtarzalność, krótki czas wykonania, tani test – nie wymaga
skomplikowanej aparatury (tylko czytnik płytek – ocena spektrofotometryczna)
MOŻLIWOŚĆ DOBORU MATERIAŁU
BIOLOGICZNEGO
o surowica/osocze
o ślina
o nadsącza z hodowli komórkowych
o homogenaty tkankowe, lizaty komórkowe
o mocz
o płyny zapalne (przesięki, wysięki)/z jam
ciała itp.
PODŁOŻE WIĄŻĄCE
Podstawowym podłożem wiążącym antygeny lub przeciwciała w oznaczeniach
immunoenzymatycznych są 96-dołkowe polistyrenowe płytki. Dzięki odpowiednim
modyfikacjom chemicznym są one przystosowane do niekowalencyjnego wiązania
różnego rodzaju cząsteczek.
Opłaszczanie płytki przeciwciałem lub antygenem w celu wysycenia miejsc wiążących
jest pierwszym etapem wykonania testu.

ZABLOKOWANIE WOLNYCH MIEJSC WIĄZANIA NA PŁYTCE

PRZECIWCIAŁA
 wychwytujące ze znacznikiem (test
bezpośredni)
 podwójne detekcyjne ze znacznikiem (test
pośredni)
 wychwytujące, detekcyjne oraz detekcyjne
ze znacznikiem (test kanapkowy)
 wychwytujące oraz podwójne detekcyjne ze
znacznikiem (test pośredni kanapkowy)
ZNACZNIKI
enzym - peroksydaza chrzanowa
(tetrametylobeznydyna)
enzym - fosfataza alkaliczna
(fosfornan p-nitrofenolu)
znaczniki fluorescencyjne

znaczniki izotopowe
ETAPY REAKCJI W ZALEŻNOŚCI OD WARIANTU TESTU
WARIANTY TESTU ELISA
RODZAJE WYKORZYSTYWANYCH
PRZECIWCIAŁ

- MONOKLONALNE
- POLIKLONALNE
PRODUKCJA
PRZECIWCIAŁ
MONOKLONALNYCH
Otrzymywanie przeciwciał monokłonalnych:

- immunizacja (poprzez podanie antygenu)

zwierzęcia np. myszy
- izolacja produkujących przeciwciała
komórek plazmatycznych ze śledziony
- fuzja komórek plazmatycznych z
komórkami nowotworowymi szpiczaka; po
fuzji otrzymuje się komórki hybrydowe, które
tak jak szpiczak, są nieśmiertelne;
- selekcja klonów przeciwciał;
- hodowla wybranego klonu nieśmiertelnych
komórek hybrydowych z którego otrzymuje
się przeciwciała monoklonalne;
DETEKCJA

Po dodaniu odpowiedniego substratu (np. ALP, TMB), enzym

skoniugowany z przeciwciałem przekształca go w barwny produkt.
Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia oznaczanej substancji.

Pomiar spektrofotometryczny – absorbancja.

RODZAJE PRÓBEK

Kontrola pozytywna Kontrola negatywna

Standardy Próba ślepa

 Analiza danych ilościowych
opiera się na pomiarze
absorbancji próbek o
znanym stężeniu (roztworów
wzorcowych) i wyborze
odpowiedniego modelu
dopasowania krzywej
standardowej, np. regresja
liniowa, semi-log, log/log,
cztero- i
pięcioparametryczna (4-PL i
5-PL).

ANALIZA DANYCH
ANALIZA DANYCH
R2 – współczynnik determinacji, jedna z
podstawowych miar jakości dopasowania
modelu. R2 przyjmuje wartości z zakresu [0;1]
– im bliżej 1, tym dopasowanie modelu jest
lepsze.
CV (%) – współczynnik zmienności (coefficient
variation), jest wyrażony jako % wariancji
względem średniej i wskazuje na wszelkie
niespójności w teście. Im wyższa wariancja,
tym większa niespójność i błąd. CV jest
obliczane w celu oceny precyzji między
testami (CV<15) lub między powtórzeniami
tej samej próbki (CV<10).
Oznaczanie antygenów
ZASTOSOWANIE
TESTÓW
Oznaczanie przeciwciał PŁYTKOWYCH W
DIAGNOSTYCE
MEDYCZNEJ
Oznaczanie haptenów
OZNACZANIE ANTYGENÓW
Przeciwciało wychwytujące immobilizowane do podłoża

Antygen

Przeciwciało detekcyjne

Przeciwciało detekcyjne ze znacznikiem

Substrat

Barwny produkt
OZNACZANIE ANTYGENÓW
Zastosowanie:
 ilościowe oznaczanie stężeń hormonów białkowych
 markerów nowotworowych
 białek ostrej fazy
 cytokin i cząsteczek adhezyjnych
OZNACZANIE PRZECIWCIAŁ

Antygen immobilizowany do podłoża

Przeciwciało obecne w badanej surowicy

Przeciwciało detekcyjne ze znacznikiem

Substrat

Barwny produkt
OZNACZANIE PRZECIWCIAŁ
Zastosowanie:
 diagnostyka chorób infekcyjnych
 w alergologii do oznaczania przeciwciał IgE
OZNACZANIE HAPTENÓW (TESTY
KONKURENCYJNE)
Przeciwciało wychwytujące immobilizowane do podłoża

Hapten obecny w badanej surowicy

Hapten detekcyjny ze znacznikiem

Substrat

Barwny produkt
OZNACZANIE HAPTENÓW
Zastosowanie:
 Oznaczanie stężenia hormonów steroidowych i hormonów tarczycy
 Obecności w wydzielinach pozostałości i metabolitów leków, używek
i suplementów
 Technologia Luminex xMAP umożliwia jednoczesny pomiar
stężenia do 100 (do 500) różnych antygenów w pojedynczym
dołku płytki pomiarowej. Opiera się ona na podobnej zasadzie
działania jak testy ELISA.

Podobieństwa w stosunku do metody ELISA:

• pomiar stężenia badanego antygenu opiera się na
TECHNOLOGIA utworzeniu potrójnego kompleksu: przeciwciało
unieruchomione na stałym nośniku/antygen/drugie
LUMINEX przeciwciało zawierające znacznik
• Utworzenie kompleksu umożliwia pozbycie się wszystkich
XMAP innych składników badanego roztworu (np. z osocza) przez
ich odmycie
• Stosując drugie znakowane przeciwciało rozpoznające
kompleks możemy wykonać oznaczenie ilościowe
• Natężenie sygnału pochodzącego od znakowanych
przeciwciał będzie proporcjonalne do ilości antygenu
związanego przez pierwsze przeciwciała unieruchomione na
stałym nośniku.
 Różnice w stosunku do metody ELISA:

• Przeciwciała wychwytujące badany antygen z roztworu są

unieruchamiane nie na powierzchni studzienek na płytce
pomiarowej, lecz na powierzchni
polistyrenowych/magnetycznych mikrokuleczek o jednakowych
rozmiarach
• Mikrokuleczki różnią się między sobą spektralnie - różniące się
kolorem rozpoznawane są jako różne obiekty przez aparat
Luminex 200
• Każda mikrokuleczka zawiera unieruchomione przeciwciało (ang.
detection antibody) przeciwko określonemu antygenowi (bądź
opłaszczona jest inną substancją np. oligonukleotydową sekwencją)
• Można w ten sposób wykorzystać do 100 różnych rodzajów
przeciwciał skierowanych przeciwko 100 różnym antygenom,
teoretycznie w jednym dołku płytki (płytka 96-cio dołkowa)
• Ilościowe oznaczenie każdego z ocenianych antygenów
(analitów/białek) dokonuje się dzięki zastosowaniu
drugorzędowych przeciwciał znakowanych znacznikiem
fluorescencyjnym (najczęściej fikoerytryną - PE)
• Przy pomocy jednej wiązki lasera identyfikuje się kolor
mikrokuleczki, a tym samym rodzaj badanego antygenu; druga
wiązka światła lasera wzbudza flurescencję w znaczniku
przyłączonym do drugorzędowego przeciwciała.
TECHNOLOGIA XMAP - KORZYŚCI
Fazą stałą są opłaszczone
różnymi reagentami mikrokulki
(mikrosfery)
polistyrenowe/magnetyczne, a
nie jak w teście ELISA – dno
dołka płytki
Możliwość wykorzystania różnych
materiałów biologicznych
(surowica, osocze, ekstrakty
komórkowe, supernatanty
komórkowe (hodowlane), płyny z
jam ciała, ślina, mocz, wysięki
nowotworowe)
Niewielka ilość materiału
badanego (klinicznego)
wykorzystywanego do oceny
stężenia ocenianych analitów
(średnio 25 µL/dołek)
Bardzo szerokie spektrum
wykorzystania technologii xMAP
(medycyna, przemysł spożywczy,
ekologia itp.)
Możliwość wykrywania do 100
analitów w jednej próbie (teraz
do 500) = w jednym dołku płytki
reakcyjnej (96-cio dołkowej)
Duża efektywność, szybkość,
dokładność, powtarzalność,
redukcja kosztów pojedynczego
oznaczenia
Innowacyjność metody
 Diagnostyka medyczna: testy alergiczne, wykrywanie chorób
autoimmunizacyjnyh, wykrywanie chorób zakaźnych i genetycznych
Wykrywanie markerów nowotworowych
Wykrywanie cytokin, chemokin, czynników wzrostu, cz. adhezyjnych
TECHNOLOGI Badanie poziomu hormonów we krwi

A XMAP – Badanie sygnalizacji komórkowej (wewnątrzkomórkowe kinazy)

Określenie profilu ekspresji genów
MOŻLIWOŚCI Genotypowanie

WYKORZYSTA Badanie interakcji czynników transkrypcyjnych

Ocena jakości żywności
NIA W ekologii
Do wykrywania broni biologicznej
Do wykrywania genetycznie zmodyfikowanych organizmów
TECHNOLOGIA LUMINEX XMAP