BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên: Đào Thu Hiền

MSSV: 20201137

BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP RODZEVICH

I. Nguyên tắc của phương pháp Rodzevich

1. Nguyên tắc

Phương pháp Rodzevich dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm thì các đường khử (glucose,
fructoso, mantose,...) có thể khử oxit Cu2+ thành oxit C1+ dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua
lượng CuSO4 dư tính được lượng đường khử.

Đường khử  +  Cu2+/OH- →   -COOH   +    Cu1+ 

Cứ 1ml Na2S2O3 0,1N tiêu tốn định phân tương ứng với 3,3 mg đường khử trong mẫu thử.

2.Phương pháp Rodzevich

Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn:

a. Giai đoạn phản ứng giữa đường khử và Cu2+

Khi trộn hai dung dịch felin I và felin II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng.

 Đầu tiên tạo thành kết tủa hidroxit đồng màu xanh da trời.
CuSO4 + 2NaOH  →  Cu(OH)2  + Na2SO4
 Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối secnhet tạo thành muối phức hòa tan có dung
dịch màu xanh thẫm.         

                         O-CH-COONa
HO-CH-COONa                 /
Cu(OH)2   +            |                     →     Cu        |                        + H2O
                        HO-CH-COOK                   \
                                                                      O-CH-COOK
 Muối phức trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có chứa
nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu 2+ tạo thành kết tủa oxit đồng I màu đỏ, bản thân
đường bị oxi hóa khi cho dung dich đường tác dụng với dung dich felin.

CHO                   O- CH-COONa         COOH

|                        /                                  |                                   HO- CH-COONa     
(CHOH)4  +  2Cu      |       + H2O →  CH(OH)4 + Cu2O↓  +          |
|                        \                                  |                                  HO- CH-COOK
CH2OH                O-CH-COOK         CH2OH

b. Giai đoạn 2: Xác định lượng đường khử thông qua lượng Cu2+ dư 
 Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường axit
sunfuric sẽ giải phóng ra iod tự do.

2CuSO4 dư    + 4KI    + H2SO4  →     I2         + Cu2I2      + 2K2SO4

Chuẩn độ lượng iod tạo thành bằng tiosulfat natri chuẩn, qua đó tính được lượng
đường khử có trong dung dịch.

I2   +     2Na2S2O3       →     Na2S4O6     +    2NaI

II. Cách tiến hành

-
Hóa chất cần dùng
 Dung dịch felin I: 34,64g CuSO4.5H2O/500 ml H2O
 Dung dịch felin II: (173 g secnhet và 50 g NaOH) trong 500 ml H 2O
 Dung dịch KI: 30%
 Dung dịch H2SO4: 25%
 Dung dịch Na2S2O3: 0,1N
☞ Chú ý: Trong felin II lại có thêm secnhet vì : muối secnhet có tác dụng giữ ion Cu 2+
trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH) 2, mà giữ nó ở dạng muối phức.
Muối phức này kém bền vì thế mà đường khử có thể tác dụng được để thực hiện phản ứng
khử Cu2+→Cu1+.

1. Chuẩn bị dịch phân tích

 Cân chính xác 5 g mẫu cho vào cối nghiền nhỏ với một lượng nhỏ nước cất
 Chuyển mẫu vào bình tam giác 100 ml
 Tráng rửa cối, chày (khoảng 30 ml)
 Cho 1 vài giọt chỉ thị phenolphthalein vào bình
 Trung hoà mẫu bằng NaOH 5% đến pH = 7
 Chiết đường trong bình ổn nhiệt ở 70-80oC trong 15 phút.
 Làm nguội, kết tủa protein bằng axetat chì 10%
 Loại chì dư bằng NaH2PO4 bão hoà
 Chuyển hỗn dịch vào bình định mức 100 ml, định mức tới 100 ml bằng nước cất.
 Lắc đều, lọc và thu dịch lọc (dịch phân tích)
2. Tiến hành
a.Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 2 (bình 50ml):
 1 ml dịch phân tích,1 ml Felin 1, 1 ml Felin 2, 2 ml nước
 Đun sôi 2 phút, tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên.
 Làm nguội
 1 ml H2SO425%, lắc đều
 1 ml KI 30%, lắc đều
 Để phản ứng trong 20 phút.
 Chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N đến hết màu iốt (màu trắng sữa)

b.Mẫu kiểm chứng:

  Bình tam giác 1 (bình 50ml): 3 ml nước cất 1 ml Felin 1, 1 ml Felin 2
 Trộn đều
 Đun sôi 2 phút tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên.
 Làm nguội
 1 ml H2SO425%, lắc đều
 1 ml KI 30%, lắc đều
 Để phản ứng trong 20 phút.
 Chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N đến hết màu iốt (màu trắng sữa)
III. Kết quả thí nghiệm

a.Kết quả

 Mẫu thí nghiệm: Mẫu chuối chín

 Lượng cân: 5,0 g
 Thể tích dịch định mức: 100 ml
 Kết quả phân tích: lượng Na2S2O3 tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ
Mẫu thí nghiệm:
Bình 1: 1,75 ml
Bình 2: 1,80 ml
Trung bình: 1,775 ml
Mẫu kiểm chứng: 2,9 ml

b.Tính toán
     Hàm lượng đường khử trung bình chứa trong 1ml dịch phân tích là:
Mđường khử = 3,3*(2,9 – 1,775) = 3,7125 mg
 1 ml Na2S2O3 0,1N tiêu tốn tương ứng với 3,7125mg đường khử trong mẫu .  
 Trong 100 ml dung dịch mẫu có 0,37125 g đường khử 
 Hàm lượng đường khử tổng số trong 5g mẫu là: 0,37125/5 *100%=7,425%
Kết luận: Hàm lượng đường khử tổng số có trong 5,00 g mẫu là 7,425% 

c.Nhận xét:
- Theo kết quả thí nghiệm hàm lượng đường khử trong amaux chuối chín là 7,425%
là gần đúng. Ssai số xảy ra trong quá trình thao tác đo, sai số dụng cụ
- Trong khi chiết do các enzyme có sẵn trong mẫu chuối cùng với nhiệt độ cao có thể
gây hiện tượng thủy phân cá đường không khử thành đường khử gây sai số dương
khi xác định lượng đường khử tổng số

- Trong quá trình thí nghiệm có thể xảy ra phản ứng phụ
Cu2O + H2SO4 (đ) → CuSO4 + Cu(đen) + H2O
Cu sinh ra khuếch tán trong dung dịch tạo kết tủa màu đen

IV. Những lưu ý để thu được kết quả thí nghiệm chính xác

- Cần phải trung hòa mẫu đến pH bằng 7 vì nếu

 Môi trường quá axit: các đường không khử dưới tác dụng của nhiệt độ khi
triết cùng với axit sẽ bị thủy phân thành đường khử xảy ra sai số
  Môi trường quá kiềm: mẫu dễ bị oxi hóa bởi không khí gây thất thoát đường
khử cần xác định
- Chiết trong cồn là hiệu quả nhất vì
 pH=7 các enzyme vẫn hoạt động dưới tác dụng của nhiệt độ có thể gây thủy
phân đường không khử thành đường khử
 Trong môi trường cồn (80% etanol) các enzyme sẽ bị vô hoạt hoặc bị ức chế
- Kết tủa protein bằng chì axetat 10% vì trong phản ứng với Felin 1,2 có Cu 2+/OH-
có mặt protein sẽ xảy ra phản ứng Biure làm cho xác định không đúng lượng
Cu(OH)2
- Phải loại bỏ Pb dư vì Pb2+ + 2I- → PbI2
- Chỉ đun sôi 2 phút tuân thủ đủ 1 ml dịch phân tích,1 ml Felin 1, 1 ml Felin 2, 2 ml nước
vì cần xác định lượng đường khử tổng số gồm nhiều loại đường khác nhau có
khối lượng phân tử và thành phần khác nhau nên hệ số chuyển đổi Na2S2O3 0,1 N
qua đường khử là khác nhau. Trong bài này ta dựa vào hệ số thực nghiệm 1ml
Na2S2O3 0,1 N tương ứng với 3,3mg đường khử nên cần tuân thủ đúng điều kiện.
- Sau khi đun sôi dung dịch vẫn còn màu xanh biếc đặc trưng và có lớp Cu 2O kết
tủa màu đỏ gạch là được.
 Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng Felin cho vào không
đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường cần rút bớt dịch đường hoặc pha
loãng dịch đường
 Nếu không có lớp kết tủa Cu2O cần tang lượng dịch đường giảm nước cất
nhưng vẫn đảm bảo tổng số là 5ml
- Cho H2SO4 vào trước KI để tạo môi trường cho phản ứng CuSO4 + KI
- Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N cho đến khi xuất hiện kết tủa màu trắng sữa

V. Phạm vi áp dụng của phương pháp

Những loại đường chứa trong mẫu mà chúng ta có thể xác định được đó là những loại
đường có chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc xeton (-CO) như glucose, fructose,
arabinose, maltose, lactose,...
Ngoài xác định hàm lượng đường khử tổng số, phương pháp Rodzevich còn có thể sử dụng
để :
 Xác định hàm lượng đường Andose và đường Xetose bằng cách thay đổi môi trường
kiềm mạnh thành môi trường kiềm yếu.
Xác định hàm lượng protein có 2 liên kết peptit trở lên bằng cách tách
đường ra khỏi mẫu
Phương pháp này không xác định được đường saccaroza do saccaroza được cấu
tạo bởi Glucoza-Fructoza liên kết với nhau bằng liên kết α-1,2-glucoside nên không còn chứa
nhóm –OH Hemiaxetan, bởi vậy mà saccaroza không còn tính khử. 

Phương pháp này cũng không xác định được lượng tinh bột dù tinh bột vẫn còn
chứa nhóm –OH Hemiaxetan nhưng do cấu trúc tinh bột rất cồng kềnh mà tinh bột chỉ chứa
một đầu khử rất nhỏ so với cấu trúc của nó, nên gần như tính khử của tinh bột là không
đáng kể.