Họ và tên: Đào Thu Hiền

MSSV: 20201137

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 6: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ GLUCOAMYLASE
(Xác định đường khử theo phương pháp DNS)
I) NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP
Glucoamylase là enzym phân cắt các liên kết glicozit α (1-4) , α(1-6) bên trong phân tử tinh
bột giải phóng glucoza. (trong phản ứng này không có saccaroso hay mantozo, lactoso vì
cấu trúc phân tử các chất này không có trong thành phần thủy phân của tinh bột)
(C6H10O5)n + nH2O  glucoamylase, 30°C, pH tối ưu n C6H12O6

Phương pháp này dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng enzym glucoamylase sau đó xác
định lượng đường khử glucose bằng phương pháp DNS. Đo quang ở 540nm, theo đường
chuẩn xác định glucoso từ đó xác định hoạt độ enzym

- Nguyên tắc làm mẫu kiểm chứng:

 Nguyên tắc: không cho phản ứng thủy phân tinh bột nhờ xúc tác enzim diễn ra bằng
cách cho DNS vào vào trước khi cho tinh bột để vô hiệu hóa enzym
 Mục đích: Để có thể xác định được lượng đường khử nằm ngoài phản ứng thủy phân
nhờ xúc tác enzym.

Đơn vị hoạt độ glucoamylase : một đơn vị hoạt độ glucoamylase được định nghĩa là lượng
enzym cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30°C tác dụng lên tinh bột tan giải phóng được 1mg
glucose. (Tinh bột tan là hồ tinh bột).

II) CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Chuẩn bị:
- Dung dịch cơ chất: Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch enzym: pha loãng enzyme gốc trong dung dịch đệm citrate pH 4,7
- Đặt bình ổn nhiệt ở 30°C; Để lọ dung dịch cơ chất và lọ dung dịch enzym trong bể ổn nhiệt
30°C (để ổn nhiệt trước khi phản ứng).
2. Tiến hành (Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)

Các bước Ống nghiệm 1 (mẫu thí nghiệm) Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm chứng)
tiến hành

Bước 1: 0,5ml dịch enzym phân tích (đã ở

 Phản ứng 30oC)
enzyme
0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1% (đã ở
30oC)
Trộn đều và để phản ứng đúng 10
phút ở 30oC

Bước 2: Bổ sung 3ml DNS, trộn đều ngay lập 0,5ml dịch enzym phân tích
tức (sau đó nhanh chóng đặt ống
Vô hoạt 3 ml DNS
nghiệm vào giá trong nồi cách thủy
enzyme
đang sôi) Trộn đều
bằng DNS
0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%
Trộn đều ngay lập tức (sau đó
nhanh chóng đặt ống nghiệm vào
giá trong nồi cách thủy đang sôi)

Bước 3: Đun sôi cách thuỷ 5 phút Đun sôi cách thuỷ 5 phút
Phản ứng Làm nguội nhanh (bằng cách nhúng Làm nguội nhanh (bằng cách nhúng
giữa ống nghiệm vào khay/chậu nước lạnh ống nghiệm vào khay/chậu nước
đường hoặc nước đá) lạnh hoặc nước đá)
khử và
DNS

Bước 4 Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 540 nm với dung dịch
đối sánh là mẫu kiểm chứng.

III) TÍNH TOÁN CÁC KẾT QUẢ THÍ NGIỆM, NHẬN

Ta có phương trình Glucose: y = 1,749x-0,0746
Với 0,5ml dung dịch enzyme Glucoamylase tác dụng với 0,5ml hồ tinh bột 1%.
Ta có bảng số liệu:

Mẫu OD (540nm) Nồng độ Glucose x(mg/ml)

Kiểm chứng 0
Thí nghiệm 1 0,245 nm 0,1827
Thí nghiệm 2 0,225 nm 0,1713
xtb = 0,177
 Hàm lượng Glucose trung bình khi cho 0,5ml dung dịch enzyme Glucoamylase tác dụng
với 0,5ml hồ tinh bột 1% được giải phóng là:
mtb = xtb * (0,5+0,5) = 0,177 * 1 = 0,177 (mg)
10 phút ở 30⸰C 0,5ml enzyme thu được 0,177 mg glucose
60 phút ở 30⸰C 0,5ml enzyme thu được 0,177*60/10=1,062 mg glucose
 0,5 ml enzyme Glucoamylase có 1,062U - đơn vị hoạt độ enzym
 Hoạt độ enzyme sau khi bị pha loãng 14000 lần là là 1,062*2= 2,142U/ml
 Hoạt độ enzyme ban đầu là 2,142*14000=29736 U/ml
Nhận xét kết quả thí nghiệm:
Trong quá trình xác định nồng độ glucose, ta thấy có sự chênh lêch ở mẫu thí nghiệm 1 và 2.
Một số nguyên nhân dẫn đến sai số có thể là: mỗi lần lấy thể tích enzyme, khác khau, thời gian
khi tiến hành đo OD có chênh lệch từ 15-30s dẫn đến hàm lượng glucose được thủy phân
không giống nhau, thể tích DNS mỗi lần lấy bị chênh lệch dẫn đến cường độ màu khác nhau
dẫn đến OD khác nhau…

IV) CÁC LƯU Ý KHI TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

- Chúng ta cần chuẩn bị dung dịch hồ tinh bột 1% bằng cách đun tinh bột tại độ khoảng 80 ⸰C
vì enzyme glucoamylase không thủy phân được tinh bột sống
- Thời gian xác định hoạt độ không quá lâu, thường là 10 phút (từ 5-30 phút) vì ở thời gian
đầu tốc độ phản ứng khá ổn định, sau đó bắt đầu giảm. Trong 1 số trường hợp hoạt độ
enzyme quá thấp có thể kéo dài thời gian phản ứng giữa enzyme với cơ chất đến 1 giờ hay
lâu hơn
- Cần tránh các yếu tố gây biến tính protein (do enzyme có nguồn gốc là protein có Thời hoạt
tính xúc tác nên không bền, nhạy với các tác động lý, hóa học như nhiệt độ cao pH quá axit
hoặc quá kiềm, muối kim loại năng… Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong hỗn hợp phản ứng vì
một số enzyme có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia. Các điều kiện phản ứng (pH, nhiệt
độ) phải được cố định trong suốt thời gian phản ứng và phải được ở trong giới hạn enzyem
có thể tồn tại bền vững.
- Khi xác định hoạt độ enzyme phải làm mẫu kiểm chứng song song với thí nghiệm. Trong
mẫu kiểm chứn enzyme đã bị vô hoạt trước khi cho tiếp xúc với cơ chất
- Phản ứng enzyme được tiến hành trong điều kiện dư cơ chất. Sau khi dừng phản ứng lượng
bị chuyển hóa không quá 20% để có thể bão hòa hết lượng enzyme

V) CÂU HỎI
Có thể sử dụng phương pháp khác để xác định đường khử trong trường hợp này không? Giải
thích?
Ngoài xác định hoạt độ enzyme Glucoamylase bằng phương pháp DNS ta có thể sử dụng
phương pháp Rodzevich và bổ sung thêm chất bất hoạt enzyme vào mẫu kiểm chứng. Tuy
nhiên phương pháp này có thao tác chuẩn độ bằng tay dẫn tới sai số nhiều hơn máy đo quang,
không chính xác bằng phương pháp DNA