中国中医基础医学杂志 2001年第7卷第2期

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tity of BDN F， trkBpositive neurons decrease obviously in the cortex and hippocampus after cortical devas-
culation， T hose changes are obvious in the cinbulatic cortex and CA 1subregion of hippocampus． T he quan-
tity of A chE， ChA T ， BDN F， trkB positive neurons decrease obviously in the M BN ，
and the atrophic cells are
also found in M BN ， cell body become small， branches become less or even disappear． Conclusion：T hese re-
sults show that this model is an ideal model for the study of V D．
Key words：V ascular Dementia； rat model of cortical devasculation

ꆤ实验研究ꆤ
●
建立小鼠黄褐斑实验动物模型的初步研究
过伟峰，徐 立，项晓人，司晓晨，程海波，夏卫军，唐含艳
（ 南京中医药大学93号，江苏 南京 210029）

摘 要：目的：建立小鼠黄褐斑动物实验模型。方法：用黄体酮注射液（ 高、低两个剂量组） 攻击雌性小鼠1

个月，以皮肤、肝脏组织酪氨酸、M DA 含量变化及皮肤黑色素细胞病理形态学指标作为考察模型是否成功
的依据。结果：酪氨酸、M DA 明显升高，皮肤黑色素沉着增加。结论：黄体酮攻击雌性小鼠所致的黄褐斑动物
实验模型获得成功。
关键词：黄体酮注射液；黄褐斑
中图分类号：R758.4＋2 文献标识码：B 文章编号：1006-
3250（2001）02-
0049-
03

根据黄褐斑的发生与内分泌紊乱有关及目前通 后用高速分散器粉碎、匀浆。匀浆液以3500 r／min 离

行的“雌激素和黄体酮增多进而刺激黑色素细胞而 心15
min，取上清液进行相关指标的测定。
致色素沉着”的发病学假说，用黄体酮攻击雌性小 3 M DA 、SOD 测定
鼠，复制黄褐斑动物实验模型。 按测定试剂盒的操作要求进行。
实 验 材 料 4 酪氨酸测定
1 实验动物 采用同步荧光分析法［1］ 。
昆明种小鼠，体重30 g±2 g，均为雌性。 5 免疫组织化学标记黑色素阳性目标
2 实验药品和试剂 以黄体酮高剂量组小鼠皮肤为研究对象。剥取
黄体酮注射液：20 mg／ml，使用前用灭菌注射用 背部皮肤一块，去毛，10％福尔马林固定。常规石腊
水稀释至所需浓度。酪氨酸储备液：以 L - 酪氨酸用 包埋，连续5μm 厚切片，HE 染色。黑色素标记采用
蒸 馏 水 配 制 成 0.3 mg／ml 的 水 溶 液。 丙 二 醛 免疫组织化学技术，选用链霉菌素ꆤ生物素法。一抗
（ M DA ） 、超氧化物歧化酶（ SOD） 测定试剂盒：购自 选用鼠抗人单克隆抗体 HM B45，DA B 显色，苏木素
南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所。 鼠 抗 人 单 克 隆 抗 体 村染。用 PBS 代替一抗做阴性对照，用人体皮肤组
HM B45（ melanoma 黑素瘤） 即用型试剂盒：购自福建 织做阳性对照。
迈新公司。 6 黑色素阳性目标的计算机病理图像分析
实 验 方 法 各组随机选取8只小鼠的皮肤组织块，各制成1
1 动物分组及攻击 张病理切片，每片观察5个互不重叠的视野，找到阳
将上述小鼠33只，随机分为3组，每组11只。①正 性目标（ 皮肤表皮和附件上皮细胞胞浆中呈现棕色
常组：5 ml／kg 灭菌注射用水肌注。②黄体酮低剂量 反应） 后，用 CM IA S 系列98
A 型多功能真彩色病理
组：2倍于人临床等效剂量，即5 mg／kg （ 0.1％水溶液 图像分析系统对目标图像进行定量分析，得出每张
5 ml／kg） 肌注。③黄体酮高剂量组：4倍于低剂量组。 切片5个视野及每组8只动物黑色素阳性目标的平均
各组均注射于小鼠大腿根部，1日1次，两侧交替，共1 面积、目标与统计场面积之比（ 面密度） 、目标个数与
个月。 统计场面积之比（ 数密度） 、平均灰度、平均光密度、
2 皮肤、肝组织匀浆制备 积分光密度，用 t 检验方法对各组之间的数值进行
攻击1个月后颈椎脱臼，处死小鼠，背部去毛，取 统计学处理。
皮肤、肝脏各一块，用预冷生理盐水（ 4℃） 冲洗，除净 结 果
杂质，滤纸拭干，切取皮肤、肝脏各0.5 g，分别放入装 1 酪氨酸含量
有9倍于组织块重的预冷生理盐水的小烧杯内，剪碎 黄体酮高剂量组皮肤、肝脏酪氨酸含量与正常

● 江苏省中医管理局资助项目，编号：9503。
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组比较明显升高，肝脏酪氨酸含量还显著高于低剂 剂量组比较：＃ P ＜0.05（下同）

量组（ 见表1）。 以人体皮肤组织 HM B45标记作为阳性对照，黑
2 M DA 、SOD 含量 色素细胞整齐排列于基底层，棘细胞层中偶见阳性
两剂量组的肝 M DA 含量及高剂量组的皮肤 细胞。
M DA 含量明显升高，与正常组比较有显著性差异。 模型组：HM B45标记的黑色素阳性细胞明显增
两剂量组皮肤、肝 SOD 含量与正常组比较，无明显 多，成簇分布于毛囊基底细胞团中，呈强阳性反应，
变化（ 见表1）。 表皮基底细胞和棘细胞层中亦见单个散在分布的黑
3 小鼠皮肤 HE 染色切片及 HM B45标记黑色 色素细胞，伴细胞核增大及核上移。表皮细胞数增
素的病理形态学观察 多，局部呈疣状增生。
正常组：鳞状上皮较菲薄，由排列整齐的基底细 4 HM B45标记黑色素细胞的病理图像学分析
胞和棘细胞组成，共2～3层，表面有少量角质。真皮 4.1 小鼠表皮黑色素沉着面积、数量和细胞核
中见毛囊，皮脂腺与表皮相连，未见汗腺。皮下脂肪 数目
组织未见特殊。HM B45标记表皮中几乎未见黑色素 模型组表皮黑色素阳性目标平均面积（ 黑色素
细胞，毛囊、皮脂腺基底细胞中见少量黑色素细胞。 染色面积） 、面密度、目标个数、数密度、细胞核数目
表1 黄体酮注射液攻击后 均明显高于正常组动物，有显著性差异，P ＜0.01
酪氨酸、MDA、SOD 含量（ ￣x ±s，／mg 蛋白） （ 见表2）。
组 别 组织 n 酪氨酸（ μg） M DA （ nmol） SOD（ nu） 4.2 小鼠表皮黑色素沉着的深浅度
一幅黑白图像上每一点的深浅度在计算机内可
正常组 皮肤 10 0.34±0.21 3.06±0.73 47.29±13.37
化分为0～255个等级，称灰度值；光密度则反应物体
肝脏 11 0.27±0.08 5.73±1.39 40.73±9.97 对光的吸收率（ 透过率） ，两者都反应物体颜色的深
黄体酮 皮肤 9 0.42±0.14 3.96±1.76 52.26±10.61
浅程度。颜色越深，灰度值越小；而其对光线的吸收
越多，故光密度越高。积分光密度是物体的平均光密
**
低剂量 肝脏 9 0.35±0.13 10.64±2.96 53.60±17.88 度与物体面积的乘积，颜色越深，面积越大，光密度
黄体酮 皮肤 11 0.56±0.19 *
4.10±1.33
*
50.87±11.09 越高。
结果显示，模型组小鼠皮肤黑色素阳性目标的
高剂量 肝脏 10 0.87±0.23**＃9.18±2.11** 46.33±15.38
平均灰度值明显低于正常组，平均光密度和积分光
注：与正常组比较：* P ＜0.05，** P ＜0.01；与黄体酮低 密度明显高于正常组，有显著性差异（ 见表3）。
表2 小鼠皮肤黑色素沉着面积、数量的变化（ ￣x ±s）
目标面积 数密度
组 别 面密度 目标个数 细胞核数
（ μm 2） （ E-
06）

正常组 324.68±107.12 0.0014±0.00052 0.40±0.19 1.60±0.74 0.83±0.25

模型组 2351.88±1044.28** 0.01 ±0.0045** 1.35±0.49** 5.73±2.18** 5.73±2.41**

表3 小鼠表皮黑色素细胞的灰度值和光密度值（ ￣x ±s） 物质在酪氨酸酶的进一步影响下，聚并而最后氧化

组 别 平均灰度 平均光密度 积分光密度 成棕色黑色素［2］ 。可见，酪氨酸增多为黄褐斑发病的
主要物质基础。
正常组 113.48±29.19 0.24±0.14 226.97±183.17
由于黑色素的形成是酪氨酸酶一系列氧化反应
模型组 85.14±18.22 0.38±0.11
* *
764.35±383.75** 的结果，揭示体内氧化与抗氧化之间的平衡系乱，可
讨 论 能是黄褐斑发病的重要环节之一。王氏［3］ 对35例黄
1 用黄体酮攻击雌性小鼠复制黄褐斑实验动 褐斑做 LPO、SOD 含量测定，有15例 LPO 超过正常
物模型的依据 值，占42.9％，29例 SOD 低于正常值，占82.9％，而7
黄褐斑的确切病因、发病机制目前不甚清楚，根 例正常人对照组各为1例异常。两组 LPO、SOD 含量
据多数患者的性别、发病年龄等进行推断，主要与内 及阳性率有显著性差异（ P ＜0.01）。
分泌紊乱有关。而妊娠、哺乳、口服避孕药、卵巢及乳 根据黄褐斑的发病学说及皮肤色素沉着的机
腺病变等因素，导致内分泌失调，使体内黄体酮、雌 制，以黄体酮（ 孕激素） 长时间攻击雌性小鼠，使其内
激素含量增高，刺激黑色素细胞，导致皮肤色素沉着 分泌失调，并以肝、皮肤组织中酪氨酸、M DA 、SOD
增加。 含量变化及皮肤黑色素细胞增长情况为考察造模是
研究黄褐斑的发病机制，首先必须弄清色素沉 否成功的指标。
着的机制。皮肤色素是在基底层黑色素母细胞中形 2 生化指标检测结果符合黄褐斑发病学特征
成的，体外研究表明，皮肤色素的合成是酪氨酸通过 结果显示，以2倍、8倍于人临床等效量的黄体酮
酪氨酸酶的作用而缓慢地氧化成多巴，多巴又在多 攻击雌性小鼠1个月后，肝、皮肤的 M DA 含量明显
巴氧化酶的影响下氧化形成无色的中间质量，这种 高于正常组动物，黄体酮高剂量组的皮肤、肝酪氨酸
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含量也明显高于正常组及低剂量组。可见，以8倍于 对照的病理分析，却可见黑色素细胞整齐排列于基
人黄体酮等效剂量，注射时间1个月，可以达到升高 底层，提示黑色素特染并不对昆明种小鼠的皮肤黑
皮肤、肝脏酪氨酸含量，并导致氧化与抗氧化之间平 色素细胞显色。而采用免疫组化技术，以鼠抗人单克
衡系乱的目的，它符合黄褐斑发病的生化学改变特 隆抗体 HM B45作为抗体来标记黑色素细胞，即可显
征。 示出小鼠皮肤中的黑色素颗粒，提示其黑色素可能
3 皮肤黑色素病理形态学研究结果证实模型 与人体皮肤黑色素有抗原交叉反应。这一病理组织
取得成功 学方法的建立，为进一步进行皮肤黑色素代谢障碍
就黄褐斑的动物模型而言，判断是否成功最直 性疾病的组织病理学研究奠定了良好的基础。
接、最客观的指标，是皮肤病理学检查黑色素沉着是 参 考 文 献
否增多，它较之酪氨酸等生化指标的测定更具实际 ［ 1］ 李耀群，许金均，黄贤智，等.氨基酸注射液和水解蛋
意义。结果显示，正常组小鼠 HM B45标记皮肤仅在 白注射液中色氨酸、酪氨酸和苯丙甲酸的同步荧光分
毛囊、皮脂腺基底细胞中见少量黑色素细胞；模型组 析［J］.药物分析杂志，1991，11（6）：323- 326.
黑色素细胞明显增多，成簇分布于毛囊基底细胞团 ［ 2］ 陈庭仁.紫外线治疗学［M ］．第1版.重庆：科学技术出
中，呈强阳性反应。病理图像学多参数定量分析结果 版社重庆分社，1988.61.
显示，模型组皮肤黑色素着色面积、深度明显大于正 ［ 3］ 王国丽，李慕庄，宋翔，等.黄褐斑患者中 L PO 和 SOD
含 量 初 探 ［J ］ .临 床 皮 肤 科 杂 志，1994，23（ 3） ： 129-
常组，这从病理学角度进一步证实，用本方法制作的
130.
小鼠黄褐斑动物模型是成功的。
4 对小鼠皮肤黑色素病理形态学研究方法的
收稿日期：2000-
10-
16 修回日期：2000-
11-
09
评价
作者简介：过伟峰，男，江苏无锡人，副研究员，
小白鼠正常组和模型组皮肤 HE 染色病理切片
医学博士，主要从事脑病、神经病、黄褐斑的临床与
在光镜下均不能发现黑色素细胞，用黑色素特殊染
科研研究。
色方法，以黑色素特染试剂对皮肤病理切片染色，仍
未见黑色素颗粒。而以人体正常皮肤组织作为阳性

Development of a Ex perimental M odel of Chloasma in M ice

GU O Wei-feng， XU li，XIA N G Xiao- ren， SI Xiao-chen， CHEN Hai- bo， XIA Wei- jun，
T A N G Han-
yan
（ 93
＃
J iangsu N anj ing 210029China）
N anj ing Univ ersity of T raditional Chinese M edicine，

Abstract：Objective：to create a experimental moolel of chloasma in female mice． M ethods：after muscu-

lal injection of progesterone at high and low dosage for one month in female mice，tyrosine and M DA in
skin and liver w ere measured， and skin melanocyte w as observed．
Results：tyrosine and M DA Significantly rose and the deposit of melanin in skin increased．
Conclusion：
the model of chloasma in female mice can be induced by the administration of pyogesterone．
Key words：progesterone； chloasma

ꆤ临床基础ꆤ

从脾胃的生理特点探讨消化性溃疡的组方结构
贾风新，李 桂
（ 张家口市第五医院胃肠病专科，河北 张家口 075000）

摘 要：消化性溃疡其病位在胃而与肝脾相关。溃疡病的存在更易导致胃、肝、脾功能失调。在溃疡病治
疗过程中，应结合脾胃之生理特点，用理气活血、凉润通降、健脾化湿之药合理组方，达到脾胃纳运相协，燥湿
相济，升降相因，从而利于提高溃疡病的愈合质量。
关键词：脾胃；生理特点；消化性溃疡；组方结构
中图分类号：R255 文献标识码：A 文章编号：1006-
3250（2001）02-
0051-
02

消化性溃疡（ 下称溃疡） 是指胃、十二指肠部的 学观点来看，其病位在胃而与肝脾相关。溃疡病的存

溃疡，属于中医“胃脘痛”、“心下痞”等范畴。从中医 在更易导致胃、肝、脾功能失调。脾胃居于中焦，互为