1. Dzień dobry, Nazywam się Mateusz Kowalski i jestem studentem V roku chemii kryminalistycznej.

Bardzo dziękuję za
możliwość zaprezentowania wyników związanych z moją pracą magisterską dotyczące syntezy c-3 podstawionych kumaryn jako
potencjalnych sond fluorescencyjnych do wykrywania biologicznych związków tiolowych.

2. Związki zawierające grupy tiolowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach biologicznych. Najbardziej powszechnymi i
niezwykle istotnymi związkami zawierającymi grupy tiolowe są aminokwasy takie jak cysteina (Cys), homocysteina (Hcy) oraz
glutation (GSH). Spośród tioli Cys, Hcy i GSH występują najobficiej w organizmach żywych. Cysteina i homocysteina posiadają te
same aktywne grupy funkcyjne, tj. -NH2, -SH i -COOH, natomiast glutation występuje zwykle w formie utlenionej i zredukowanej.
Należy również wspomnieć o tiolach takich jak tiopronina, dimerkaprol i penicylamina stosowanych w leczeniu wielu chorób

W ostatnich latach liczne badania potwierdziły, że reaktywne formy siarki, takie jak tiole, odgrywają ważną rolę w komórkach
roślinnych i zwierzęcych. W roślinach utrzymują one homeostazę redoks, wpływają na fotosyntezę i procesy transdukcji sygnału, a
także zwiększają tolerancję roślin na stres oksydacyjny. Glutation z kolei występuje najobficiej w komórkach zwierzęcych, a zmiany
jego poziomu mogą być przyczyną poważnych problemów zdrowotnych serca, a nawet nowotworów. Stwierdzono również
związek między nieprawidłowym poziomem cysteiny a uszkodzeniem wątroby, zmianami skórnymi oraz AIDS. Z kolei
nieprawidłowe stężenie homocysteiny w ludzkim osoczu zostały powiązane z choróbami sercowo-naczyniowymi, chorobą
Alzheimera, schorzeniami neuropsychiatrycznymi, udarem mózgu. Wykrywanie biotioli w próbkach biologicznych jest zatem
bardzo ważne. W tym celu pożądane są szybkie, czułe i dokładne metody ich detekcji.

3. Możliwość "zaglądania do komórek" jest niezbędna w diagnostyce i leczeniu chorób, a także w badaniach podstawowych
procesów życiowych. Dlatego coraz większe znaczenie w naukach biomedycznych nabierają techniki wizualizacji fizjologicznych
zmian w organizmie i komórkach za pomocą sond fluorescencyjnych.

Sondy fluorescencyjne to cząsteczki, które absorbują światło o określonej długości fali i emitują światło o innej, zazwyczaj dłuższej
długości fali (fluorescencja). Cząsteczki te, znane również jako fluorofory, mogą być dołączone do cząsteczki docelowej i działać
jako znacznik do analizy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Sondy fluorescencyjne w połączeniu z nowoczesną technologią obrazowania bioluminescencji pozwalają na detekcję składników
biologicznych w organizmach in vitro oraz in vivo na poziomie komórkowym lub zwierzęcym. Wśród niektórych zastosowań sond
fluorescencyjnych można wymienić wykorzystanie ich do wykrywania lokalizacji i aktywacji białek, identyfikacji tworzenia
kompleksów białkowych, monitorowania procesów biologicznych, wykrywania i ilościowego oznaczania jonów.

Dotychczas skonstruowano wiele sond fluorescencyjnych opartych na prostych szkieletach związków organicznych lub ich
kompleksach z metalami. Wśród najlepiej znanych fluoroforów służących do obrazowania związków tiolowych należy wymienić
fluoresceinę, rodaminę, BODIPY (4,4-difluoro-4-borata-3a,4a-diaza-s-indaken), naftalimid, flawon, oraz kumaryny

4. Technika wykorzystania sond fluorescencyjnych w obrazowaniu bazuje przede wszystkim na zmianie właściwości
fotofizycznych cząsteczki sondy przed i po specyficznym związaniu z analitem, tak aby wykryć zmianę sygnału fluorescencji,
podczas wykrywania różnych cząsteczek lub jonów w organizmie lub środowisku

Nowa sonda fluorescencyjna o nazwie NaFP została skonstruowana z grupą hydrazynową jako miejscem rozpoznawania
formaldehydu (FA) w żywych komórkach. Sonda ta charakteryzuje się dużym sygnałem włączania i wysoką selektywnością dla FA.
Ponadto, wyniki eksperymentów obrazowania komórek wskazują, że NaFP może obrazować egzogenny/endogenny FA w żywych
komórkach.

5. Na rysunku, który państwo widzicie przedstawiono sondę fluorescencyjna opartą na szkielecie kumaryny, która posłużyła do
detekcji jonów Al3+. Kumaryna w postaci niezwiązanej wykazywała słabą fluorescencję. Po związaniu jonów glinu następowało
przesunięcie pasma emisji ku czerwieni i 24-krotne wzmocnienie początkowo słabego pasma fluorescencji przy λmax 453 do 461 nm.
Co ważne, za pomocą sondy możliwe było obrazowanie jonów Al 3+ w obszarze wewnątrzkomórkowym żywych ludzkich komórek
raka szyjki macicy.

6. Znanych jest wiele różnych metod detekcji tioli, które nadają się do rutynowych badań klinicznych i naukowych. Wśród nich
można wymienić wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC/UV), spektrometrię mas (MS), HPLC-MS, testy
kolorymetryczne, testy enzymatyczne, elektroforezę kapilarną i żelową. Większość z tych metod wymaga skomplikowanego i
długotrwałego etapu przygotowania próbki oraz uprzednio procesu homogenizacji w celu rozbicia komórek lub tkanek przed
zastosowaniem metody analitycznej. Ze względu na niestabilność chemiczną tioli, etap przygotowania próbki dość często może
wprowadzać potencjalne artefakty i powodować utratę analitu

W ciągu ostatnich dwóch dekad, jednym z najbardziej popularnych podejść rozwijanych w celu analizy analitu w żywych
komórkach jest wykorzystanie techniki obrazowania fluorescencyjnego poprzez zastosowanie sondy fluorescencyjnej. Obrazowanie
fluorescencyjne wyróżnia się prostotą, wysoką czułością i możliwością wizualizacji analitów w żywych komórkach w sposób
nieinwazyjny umożliwiając określenie wewnątrzkomórkowej dystrybucji i dynamicznego ruchu analitu w jego nienaruszonym
środowisku natywnym.

7. Szeroki i różnorodny obszar zastosowania kumaryn w naukach medycznych, badaniach biomedycznych oraz w wielu gałęziach
przemysłu, w tym w perfumerii, jest imponujący. Profil farmakologiczny tych fitochemikaliów obejmuje ich działanie
przeciwbakteryjne (nowobiocyna), przeciwzapalne (kumaryna), przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe, antyoksydacyjne
(eskuletyna), przeciwgrzybicze, przeciwzakrzepowe (warfaryna, skoparon), neuro- i hepatoprotekcyjne (ostol)

8. Z chemicznego punktu widzenia kumaryny to cząsteczki o kilku atrakcyjnych cechach, takich jak mała masa cząsteczkowa,
prosta struktura, wysoka biodostępność, dobra rozpuszczalność w większości rozpuszczalników organicznych oraz niska
toksyczność. Wiązanie C=C w kumarynach jest stale w konformacji cis i przyczynia się do silnej emisji fluorescencji i dobrej
fotostabilności związków. Chociaż wszystkie sześć miejsc C-H i wiązanie C=C są podatne na postfunkcjonalizację, najbardziej
reaktywne chemicznie są pozycje C-3 i C-4. Co ciekawe, większość naturalnych kumaryn posiada tlenowy podstawnik w pozycji
C-7, podczas gdy najważniejsze fluorescencyjne kumaryny mają podstawnik aminowy lub hydroksylowy w pozycji C-7, o czym
będzie mowa w kolejnych rozdziałach.

9. Przy projektowaniu sond fluorescencyjnych do selektywnego oznaczania tioli należy brać pod uwagę przede wszystkim
reaktywność chemiczną analitów.

Odróżnienie glutationu od cysteiny i homocysteiny pozostaje wyzwaniem ze względu na podobieństwo struktury i reaktywności
chemicznej GSH do Cys/Hcy. Większość sond tiolowych nie jest w stanie odróżnić GSH od innych tioli, w tym Cys i Hcy,
ponieważ ulegają podobnym reakcjom i podobnym zmianom emisji po reakcji z analitem.

Mając na uwadze silny nukleofilowy charakter grupy tiolowej reakcje takie jak: addycja Michaela, substytucja nukleofilowa i
eliminacja sulfonamidów, estrów sulfonianowych i disulfidów to główne strategie wykorzystywane do detekcji grup –SH. Chociaż
we wszystkich tych reakcjach preferowana jest reakcja z tiolem, inne nukleofile, jak -OH, czy -NH mogą być również
zaangażowane i wpływać na obrazowanie tioli, zwłaszcza ilościowe obrazowanie analitów.

Biorąc pod uwagę chemiczny charakter grup tiolowych sondy oparte na kumarynie posiadają różne receptory funkcjonalne. Gdy
detekcja tioli wykorzystuje reakcję addycji Michaela kumaryny zwykle zawierają wiązania α, β-nienasycone, natomiast gdy
mechanizm ma związek z substytucją nukleofilową cząsteczka sondy zawiera grupy opuszczające takie jak: halogen, grupa eterowa
czy tioeterowa. Często w pozycji C-7 występują grupy aminowa lub hydroksylowa w celu wzmocnienia fluorescencji sondy.

Sondy są zaprojektowane tak, aby zapewnić zmiany w odpowiedzi fluorescencji, gdy sonda jest wystawiona na działanie tioli.
Niektóre kumaryny są słabymi fluoroforami przed związaniem analitu i dopiero po interakcji obserwuje się silną fluorescencję i
reakcję reakcje typu turn-ON.

10. W 2019 roku Jiang i wsp. zaprezentowali odwracalną sondę fluorescencyjną RP-1 opartą na reakcji addycji Michaela do
obrazowania glutationu w komórkach HeLa. Do struktury sondy wprowadzono grupę karboksylową, której obecność poprawiła
rozpuszczalność w wodzie. Dwa sześcioczłonowe pierścienie piperydyny zostały dodane w celu poprawy fotostabilności i
wydajności kwantowej fluorescencji. Co więcej, w tym samym czasie wprowadzono jednostkę metinową (-CH =CH-) łączącą
szkielet kumarynowy z grupami cyjanowymi (-CN) i grupą karboksylową (-COOH) co spowodowało rozszerzenie π-koniugacji i
tym samym przesunięcia w kierunku czerwieni maksimum emisji fluorescencji (E m 571 nm). Po dodaniu GSH w wyniku reakcji
addycji RP-GSH emitował zieloną fluorescencję (λex=405 nm).

11. C-3 podstawione allilowe pochodne kumaryny można otrzymać na wiele sposobów. Pierwszym z nich jest prosta reakcja
kondensacji aldehydu salicylowego z malonianem diallilu. Kolejną metodą jest synteza z użyciem salicylaldehydu, kwasu Meldrum
oraz alkoholu allilowego katalizowania chlorkiem żelaza(III). Ostatnią z nich jest reakcja kwasu 3-karboksykumarynowego z
alkoholem z użyciem DCC (N,N’-dicykloheksylokabodiimid) oraz DMAP (4-dimetyloaminopirydyna) lub KPF 6
(heksafluorofosforan potasu).

12. Niestety wiele z tych reakcji wymaga użycia drogich i toksycznych dla środowiska katalizatorów takich jak pirydyna czy
piperydyna i z tego względu postanowiliśmy skupić nasza uwagę na katalitycznych właściwościach L-proliny. L-prolinę cechuje
wiele zalet, dzięki którym może być atrakcyjnym katalizatorem: jest bifunkcyjna przez co może zachowywać się zarówno jako kwas
jak i zasada, jest tania i komercyjnie dostępna, co najważniejsze, jest naturalna i przyjazna dla środowiska.
13. Na podstawie reakcji kondensacji malonianu dietylu z aldehydem salicylowym postanowiono przeprowadzić optymalizację
warunków do syntezy estrów kwasu 3-karboksykumarynowego. Sprawdzono takie parametry jak wpływ użytego rozpuszczalnika,
temperatury reakcji oraz ilość katalizatora. Ilość użytej L-proliny wpływa na wydajność końcową reakcji. Można zauważyć znaczną
różnicę pomiędzy reakcją 1 i 2 gdzie przy różnicy zaledwie 0,5 mol% wydajność reakcji 2 jest dwukrotnie większa od reakcji 1.
Najlepszy wynik uzyskano z zastosowaniem 10 mol% L-proliny. Wpływ rozpuszczalnika był mało zauważalny, jak można
zauważyć w reakcjach 7-9 z zastosowaniem każdego z nich otrzymano zadowalające wyniki. Największy rozbieżność w wynikach
można zaobserwować w reakcji 6, gdzie zamiast podwyższonej temperatury, reakcję przeprowadzono w temperaturze pokojowej.
Po przeprowadzeniu optymalizacji warunków najlepszą wydajność 94% uzyskano w reakcji 5 używając 10 mol% L-proliny, etanolu
jako rozpuszczalnika ogrzewając reakcję przez 18 godzin w temperaturze 80°C.

14. Przeprowadziliśmy zatem szereg reakcji kondensacji malonianu diallilowego z pochodnymi aldehydu salicylowego. Reakcje
prowadzone były w obecności 10 mol% L-proliny, w acetonirylu i temperaturze 80˚C w czasie 48 godzin. Mieszanina poreakcyjna
była zatężana a docelowe produkty reakcji otrzymywano na drodze krystalizacji prostej z etanolu. Docelowe produkty reakcji
uzyskano z wydajnością do 90%. Od rozmieszczenia elektronów w cząsteczce aldehydu salicylowego zależała wydajność reakcji.
Podstawniki elektronodonorowe w pierścieniu benzylowym wydawały się pozytywnie wpływać na wydajność procesu z kolei
obecność halogenku znacznie obniżała wydajność reakcji kondensacji; 72% produktu dla pochodnej 6-Br i 54% dla pochodnej 6,8-
diBr- kumaryny

15. Dane spektroskopowe wszystkich otrzymanych przeze mnie kumaryn z uwzględnieniem ich najbardziej charakterystycznych
przesunięć czyli węgla karbonylowego C9, węgla C2 i C4 oraz wodoru C4 zamieściłem w tabeli. Tak jak różnice w przypadku
przesunięć CNMR dla pochodnych są niewielkie tak warte jest zaznaczenie znacznej różnicy przesunięcia dla H4 występujące u
pochodnej naftylowej.

Uzyskane allilowe kumaryny zostały przekazane do badań we współpracy z dr hab. Arkadiuszem Matwijczukiem, profesorem
Uniwersytetu Przyrodniczego z zakładu biofizyki molekularnej. Celem badań były analizy spektroskopowe nowego materiału
kumaryną, analizy IR, badanie luminescencji fluorescencji i fosforescencji: stacjonarne jak i czasowo-rozdzielcze, pomiary
anizotropii fluorescencji i fosforescencji w układach rozpuszczalnikowych. Do badań jest użyty m.in. Spektrofluorymetr
umożliwiający pomiar widm fosforescencji jak i czasów życia fosforescencji. Oprócz tego zostaną wykonane pomiaru anizotropii
fluorescencji i fosforescencji z wykorzystaniem polaryzatorów.