Chương 7

CH ẤT THƠM

7.1. GIÓI THIỆU

Chất thcrm của một sàn phẩm thực phẩm là một tổ hợp gồm rất nhiều chất
hoấ học khác nhau (như hợp chất amine, những hợp chất dị vòng chứa nitơ hoặc lưu
huỳnh, những rượu, aldehyt, xeton, những hợp chất cacbiiahydro, tecpen...) chúng
có với lượng vô cùng nhỏ (vài mg/kg sản phẩm) hoặc ở trạng thái vết mà con người
có thể cảm nhận được qua khứu giác.

Những tiến bộ m ới của phương pháp phân tích lý - hoá, những cô' gắng của
nhiều nhà khoa học để thiết lập những quan hệ giữa sự có mặt hoặc không có của
một vài hợp chất bay hơi với chất lượng của sản phẩm đang trên đà phát triển.

Những chất thơm phải là những chất bay hơi và có nồng độ nhất định để cảm
nhận được bằng cảm giác. Ngưỡng cảm nhận của các chất rất khác nhau, có những
chất với nồng độ vô cùng nhỏ nhưng cường độ mùi thơm lại lớn hcfii so với những
chất có nồng độ cao hơn, và chất đó là chất chính đặc trưng cho m ùi của sản phẩm
đó. Cùng một hợp chất thơm, nhưng nằm trong môi trường khác nhau sẽ cảm nhận
khác nhau. Chẳng hạn trong m ôi trường có lip it thì cường độ m iii thcrm sẽ thay đổi
so với môi trường không có lip it.

Để phân tích những chất thơm trước hết phải tiến hành chiết chúng ra khỏi
các sản phẩm thực phẩm.

187
7.2. NHỮMG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CHẤT THƠM

Nghiên cứu những hợp chất bay hơi cùa chấl thơm rất phức tạp bới vì trong
một sản phẩm thực phấm có rất nhiều chất bay hơi. Những chất này có nhữiig tính
chất lý học và hoá học rất khác nhau (áp suất hơi, tính có cự c...) và nồng độ của
chúng trong sản phẩm cũng rất khác nhau. Hiện nay để phân tích chất thơm bàng
phương pháp sắc kí khí, nhất thiết phái tách nhimg hợp chất bay hơi ra khỏi phần
không bay hơi. Có Iiliiề ii phương pháp tách chiết khác nhau, và hiện nay khó có thể
nói là phương pháp nào tốt nhất vì mỗi phương pháp tách chiết thích hợp cho một
vài hợp chất có trong thành phần chất thơm, có nghĩa là hiệu suất tách chiết từng
cấu từ chất bay hơi tiiỳ thuộc vào phương pháp tách chiết (bảng 7.2).

Báng 7.2. Hiệu suất thu hổi (%) của một số chất theo phương pháp tách chiết

Nhóm hoá hoc Không gian đầu Chưng cất Trích li lỏng- lỏng
Tecpen 74,5 2,1 23,4
Sexquitecpen 5,3 1,8 6,1
Rượu béo mạch thẳng 1,4 17,9 14,2
Rượu tecpen 7,8 57,2 36,7
Lonon và dẫn suất 2,2 8,0 13,9
Các xeton khác 3,9 2,2 2,6
V ì vậy tùy thuộc vào thành phần và lính chất của các hợp chất thơm có trong
sản phẩm mà dùng những phương pháp tách chiết khác nhau.

7.2.1. PHƯƠNG PHÁP KHÒNG GIAN ĐẦU (PHƯƠNG PHÁP HEAD-

SPACE)

Phương pháp này dùng một khí trơ (nitơ, acgon, CO 2) với tốc độ nhất định đi
qua dung dịch phân tích, khí trơ sẽ kéo theo hơi của nhữiig chất bay hơi có trong
dung dịch. H ơi này sẽ được đưa trực tiếp vào CỘI của máy sắc kí khí nhờ hệ thống
van tự động để phân tích hoặc thu hồi chất thơm bằng các cột hấp thụ.
Nồng độ của chất bay hơi trong pha hơi phụ thuộc vào bản chất của chất

bay hơi và bản chất của môi trường chứa chất bay hơi. V í dụ trong dung dịch chứa
chất thơm, nếu cho thêm đường saccaroza, glucoza hoặc fructoza, sẽ làm tăng áp

188
suất hơi của những chất bay hơi. Ngược lại nếu có thêm axit citric ihì áp suất hơi sẽ
giảm xuống. Nồng dộ của các chất trong pha hơi còn phụ thuộc vào hệ số hoạt độ
cỉia các chất hoặc hệ số phân chia cứa chất bay hơi.
1 ’rường hợp khi phân tích chất thơm cùa một sản phám, nồng độ chất thơm

quá nhò cần phải cò đạc bằng cách:

- Ngưng lụ hơi của các chất thơm bàng cách làm lạnh, theo phương plìáp
này thì nước cũng bị ngưng tụ;
- Hấp phụ hơi thu được bằng cột có c h ứ a các chất hấp phụ, những chất hấp
thụ thường dùng là than hoạt tính, chromosorbe 102, Porapak Q (polyme cua e th yl-
vinylbenzen-divinylbenzen), Tenax G .c (polyme của 2.6 diphenyl-p-phenylen

oxyl). Sau đó phải tiến hành quá trình nhả hấp phụ, lức là giải phóng chất thơm ra
khỏi c ộ t hấp phụ b ằ n g c á c h đ u n n ó n g cột hấp phụ và c h o k h í trơ đi q u a CỘI hấp phụ

theo chiểu ngược lại với tốc độ nhất định; khí Irơ sẽ kéo theo hơi của ch ít thơm và
hơi của nhữiig chất này được ngưng tụ trong một ống làm lạnh bằng khí nitơ lỏng

( -196"C).
Phương pháp Head- space có ưu diểm là phân tích nhanh, thiết bị đơn giản

không đắt tiển. Nhim g phương pháp này khõng thích hợp với những chất bay hơi có

nồng độ rất nhỏ.

Hình 7.2.1. Lấy chất thơm ra ^ ^

khỏi cột hấp thụ;

1. cột hấp phụ chất thơm;

2. ống teílon;

3. binh chứa N2 lỏng (-196”C);

4. chất thơm ngưng tụ:

5. điện trở đun nóng :

6. phòng đun nóng.

189
 7.2.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT NHỮNG CHẤT BAY HƠI TRONG DUNG
DỊCH BẰNG CHƯNG CẤT

Nguyên tấc của phương pháp này rất đơn giản; tách những chất bay hơi cc
trong sản phẩm ra khỏi phần không bay hơi bàng chimg cất theo hơi nước. Đế’ trárứ
cho chất thơm khỏi bị biến đổi tính chất ở nhiệt độ cao, người ta thường tiến hànl
chưng câì ở nhiệt độ thấp tức là chimg cất ở áp suất chân không. Chimg cất theo hơ
nước có thể chưng cất ở áp suất thường như chưiig cất tinh dầu trong các cây, qu;
có chứa tinh dầu hoặc chimg cất ở áp suất chân không như chưng cất chất thơn
trong sản phẩm thực phẩm.

Chimg cất ở nhiệt độ cao thường làm cho những hợp chất thơm bị thay đổ
tính chất như chúng bị biến tính hoá học, bị oxy hoá để biến thành những hợp chá
khác. Chẳng hạn người ta thấy lượng mitxen trong tinh dầu chanh thu hồi bằnị
phương pháp chưiig cất ít hơn so với lượng tinh dầu chanh thu được từ bằnị
phương pháp ép lạnh, vì dưới tác cÌỊing của nhiệt m itxel có thể chuyển thành linalol
nerol và geraniol.

Có nhiều loại thiết bị chưng cất tinh dầu, sau đây là nguyên lý của một S(

thiết bị thường dùng.

Thiết bị chưng cất dạng quay (Rotavơpor) kiểu Biiclti (Hình 7.2.2a)

Dung dịch để cất (nếu mẫu phân tích là sản phẩm rắn, nghiền nhỏ và chí
thêm nước vào), được đặt trong bình cầu 4, bình cầu này quay được nhờ mô to
Bình cầu 4 được đặt trong nồi cách thuỷ giữ ở nhiệt độ 45-50"C. Để giữ cho thiết b
làm việc ở nhiệt độ thấp, áp suất ở trong thiết bị được điều chinh vào khoảnj
VOmmHg. Hơi cùa những chất thơm cùng hơi nước ở bình 4 bốc lên và được ngưn]
tụ trên thành ống sinh hàn 7 và được thu vào bình cầu 6 ; bình này được đặt tron]
chậu nước đá (để tránh sự bay hơi của các chất dễ bay hơi). M ột ống thu hồi 5 đượ
đặt trong bình chứa nitơ lỏng (-196"C) được lắp vào giữa rotavapor và bơm châi
không nhằm thu hồi những chất dễ bay hơi nhất.

190
 Hình 7.2.2a. Thiết bị
chưng cất dạng quay:
1. bình chứa N2 lỏng:
2. bơm chân không:
3. mô tơ;
4. 5, 6. bình cầu;
7. ống sinh hàn.

Sau khi kết thúc thí nghiệm, có thể phân tích riêng hai phần chất thcrm thu
được ở hai bình 6 và 5 hoặc trộn lẫn cả hai phần đem cô đặc và tiến hành phân tích
bằng sắc ký khí. Lượng những chất bay hơi thu được trong bình 6 thu được thường
bằng khoảng 80% so với lượng châì ban đầu. Hiệu suất của những chất bay hơi thu
được phụ Ihuộc vào thời gian chưng cất, lượiìg dung dịch ban đầu, nhiệt độ chưng
cất.

Thiết bị chưng cất chán không (Hình 7.2.2h)

191
 H ình 7.2.2b. Mô hình thiết bị chưng cất chân không:

1, bình đựng mẫu; 4. ống thu hồi chất bay hơl đặt trong N2 lỏng;
2 , bình chứa nước chưng; 5 . ống thu hồi dạng xoắn đặt trong lỏng
3, ống làm lạnh ở 0°C;

Mẫu phân tích được đặt trong bình cầu 1. Bình này được đun nóng trong bình
cách thuỷ ở nhiệt độ từ 40-50"C. Để tạo cho sự bốc hơi được đều, trong bình 1 đặt
một thanh từ vào nồi cách thủy được đun bằng máy điện lừ, thanh từ sẽ quay làm
cho dung dịch được khuấy trộn, hơi chất thcfm cùng với hơi nước bay hơi qua ống
sinh hàn 3, được ngimg tụ và rơi xuống bình cầu 2.
Những chất dễ bay hơi hơn lại tiếp lục qua ống sinh hàn thẳng đimg 3 và
được ngimg tụ trong cốc ống thu hồi 4, 5 đặt trong các bình chứa nitơ lỏng
(-196"C). Sau khi kếi thúc thí nghiệm đem trộn nước ngimg tụ tại bình 2 và 4 rồi
đem cô đặc và đem phân tích chất thơm bằng sác ký khí.

7.2.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY

Phương pháp trích ly là phirơng pháp cổ điển được dùng trong nghiên cứii
chất thcrm. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hoà tan của các hợp chất
có trong sản phẩm vào các dung môi hữu cơ.

192
 Phương pháp này thường được dùng đối với những sản phẩm đã được loại bỏ
lip it hoặc những sản phẩm không béo. Nó rất thích hợp trong việc nghiên cứii chất
thơm của các loại rượu. Tuy nhiên việc sử dụng dung m ôi để trích ly cũng có thể
gày ra sự không chính xác do trong quá trình trích ly có thế tạo ra những chất mới,
hoặc có thể làm cho mẫu phân tích bị nhiễm tạp chất, vì vậy dung môi đê trích ly
đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao.

Trong phương pháp trích ly việc chọn dung môi để chiết chất thơm rất quan
trọng. Nhiều nghiên cứu về trích ly những hỗn hợp chất thơm cho thấy hiệu suất thu
hồi đối với tìmg chất trong hỗn hợp thay đổi rất nhiều lu ỳ thuộc vào loại dung môi
để trích ly.

Dung m ôi trích ly chất thơm thường phải đảm bảo những yêu cẩu sau:

- Dung m ôi phải có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ sôi của những chất bay hơi
cần nghiên cứu, nhầm dễ dàng loại bỏ dung môi khi chưng cất và tránh sự tổn thất
của những hợp chất dễ bay hơi.

- Dung m ôi không hoà tan nước và rượii etylic.

- Tính có cực (hằng sô' điện môi) của dung môi phải phù hợp với những chất
thơm nghiên cứu, nhầm đạt hiệu suất trích ly cao, mỗi dung môi nhất định có tính
đặc hiệu đối với một số loại hợp chất hiìii cơ tạo thành chất thơm.

- Dung m ôi phải có khả năng dễ làm sạch.

- Dung m ôi phải có ít m ùi nhằm dễ dàng cho việc đánh giá mùi của chất
thơm sau khi trích ly (bảng 7.2.3)

Bảng 7.2.3. Những dung môi thường dùng trong trích ly chất thơm
Tên d u n g m ôi Nhiêt đò sôi °c Tỷ trọn g (d)
Dicloromethan 40 1,325
Ete dietylic 34 0,714
Hexan 69 0,659
Pentan 36 0,626
Trichloroíluoro methan 24 1,49
(Freon II)

193
 Hoặc dùng hỗn hợp hai dung m ôi để trích ly dichloromethane/penlan (1:2);
dichloromethane/penian (3:7); hoặc dichloromethane/hexan.

Thiết *bị dùng để trích ly các chất thơm có trong các dung dịch ihirờng dùng
là thiết bị kiểu Soxhlet. Có hai loại, loại dùng cho dung m ôi hCm cơ nặng hơn nước
và loại dùng cho dung m ôi hữii cơ nhẹ hơn nirớc.

Tlìiết bị trích ly dìiỉìg cho dung môi ỉỉhẹ lìơn nước

Bình mẫu 4 được đun nhẹ ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi của dung môi một
ít (40"C đối với ete diethyl). H ơi dung môi bay hơi và được ngưng tụ ở ống sinh hàn
1 rồi rơi vào một cái phễu dẫn xuống tận đáy của tháp trích ly 3, tại đây có chứa
chất lỏng cần trích ly. Dung m ôi nhẹ hơn nước sẽ nổi lên qua lớp dung dịch phân
tích, hoà tan nhữiig chất thcrm có trong dung dịch phân tích và rơi xuống bình cầu 4
qua ống thông 6 , và cứ tuần hoàn như vậy cuối cùng la thu được chất chiết trong
bình cầu 4.

Hình 7.2.3a, Thiết bị

trích ly lỏng:
1. ống sinh hàn;
2. nước vào;
3. tháp trích ly;
4. bình mẫu;
5. bể nhiệt;
6. Ống thông.

Tlìiết bị trích ly dùng cho dung môi tiặng lỉơti nước

Dung m ôi nặng hcm nước được đựng trong bình 4 và được đun nóng trong
nồi cách thuỷ 5 (45"C đối với diclorometan). H ơi bay lên ngưng tụ trên thành ống
sinh hàn 1 (ống sinh hàn được làm lạnh bằng nước đá 0‘’C) rồi rơi xuống tháp trích

194
ly 3 qua ống thuỷ tinh 2. Trong tháp có chứa dung dịch mẫu phãn lích, Dung môi đi
qua lớp dung dịch chứa chấl thơm, nó hoà tan chất thơm rồi lắng xuống đáy tháp và
lại chảy sang bình 4, và cứ tuần hoàn như vậy, cuối cùng thu được dung m ôi và chất
thơm tại bình 4.

Hinh 7.2.3b. Thiết bị trích ly

Ẳ
dùng cho dung môi nặng -2
hơn nước:

1. ống sinh hàn;

2. ống: 5 4 0 . . .

3. tháp trích ly;

4. nổi cách thuỷ;

o s
5. bể điều nhiệt.

7.2.4.PHƯƠNG PHÁP LIKENS - NICKERSON

Phương pháp L IK E N S - NICKERSO N là phưcmg pháp kết hợp đồng thời vừa
chưng cất vừa trích ly.

Thiết bị chiết Likens - Nickerson (hình 7.2.4). Dung dịch phân tích được đặt
trong bình cầu 1. M ộ t lượng nhỏ dung m ôi được đặt trong bình cầu 2. cả hai bình
này đều được đun nóng trên nổi cách thuỷ đến nhiệt độ sôi. H ơi dung m ôi ở bình 2
và hơi nước kéo theo chất thơm ở bình 1 sẽ gặp nhau ở buồng 3 và được ngưng tụ
trên ống sinh hàn rồi chảy xuống ống xiphông 5, ở đây do sự khác nhau về tỷ trọng,
dung m ôi sẽ hoà tan các chất thcnn và nước sẽ tách ra, dung m ôi chứa chất thcím sẽ
quay trở về bình 2 , còn nước quay về bình 1 .

195
 Thời gian chiết tuỳ thuộc vào mẫu phân tích, khoảng từ 30 phút đến vài giờ.
Thường phương pháp phân tích này hay thực hiện ở áp suất khí quyển, nhưng để
tránh hiện tượng các chất bị oxy hoá trong quá trình chiết, người ta thực hiện ở áp
suất thấp.

Hiệu suất tách chiết của phương pháp này tuỳ thuộc vào loại dung môi, vào
nhiệt độ và thời gian chưng cất, vào độ pH của dung dịch chứa các chất thơm.

Phương pháp chưng cất và trích ly đồng thời có ưu điểm nhanh, hiệu suất cao
(>95%), chiết được những chất bay hơi có trong dung dịch ờ nồng độ loãng và tốn
ít dung môi. Dung dịch chiết được nhiều khi không cần cô đặc.

Hình 7.2.4. Thiết bị chiết Likens-

Nickerson (loại dung môi nhẹ hơn nước):

1. bình cầu đựng dung dịch phân tích;

2. bình đựng dung môi;

3. buồng hỗn hợp hơi dung môi và hơi

nước kéo chất thơm;

4. ống sinh hàn;

5. ống xi phông.

7.2.5. CÔ ĐĂC

Sau khi chiết các chất thcrm bằng phương pháp chưng cất hoặc trích ly bằng
các đung môi hữu cơ, dung dịch thu được cần được cô đặc trước khi đưa vào phân
tích bằng máy sắc ký khí.

Thường đối với phương pháp chưng cất theo hơi nước, dung dịch nirớc có
chứa chất thcfm thường có nồng độ loãng, để cô đặc trước hết là tiến hành chiết lấy

196
những chất thơm trong dung dịch nước bằng dung m ôi hữu cơ, sau đó cấl cho bay
hơi dung m ôi bằng cột Vigreux.

Dung dịch sau khi trích ly được đựng trong bình cầu 2. Sau đó lắp thiết bị
như hình vẽ 7.2.5. Bình 2 được đun nóng đến nhiệt độ sôi, hơi dung môi sẽ qua cột
Vigreux rồi qua ống sinh hàn và được ngưng tụ rồi rơ i xuống bình thu hồi dung môi
4. Đun như vậy cho đến khi ở bình cầu 1 còn lại thể tích khoảng 2ml.

Hình 7.2.5. Hệ thống cô

đặc dung mòi sau khi
trích ly:
1. cột Vigreux;
2. bình cầu;
3. dung dịch để cô đặc;
4. binh thu hổi dung môi;
5. đường nước vào.

7.2.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĐOẠN VÀ NHẬN BIẾT

Dung dịch chiết được là hỗn hợp các cấu tử chất thcrn. Để tách được các cấu
tử chất thơm, người ta dùng phương pháp chưng cất phân đoạn, các phương pháp
sắc ký. Hiện nay để phân tách từng cấu tử chất thcfiĩi, phương pháp hay dùng nhất là
phương pháp sắc ký khí (hình 7.2.6a).

197
 C ó iiạ Ix n ii IU .H I

Hình 7.2.6a. Nguyên lý phương pháp sắc ký khí

Hỗn hợp chất thơm sau khi chiết được bằng các phương pháp trên được cô
đặc và được đưa vào máy sắc ký khí để tách tìmg cấu tử chất thơm. T iiỳ từng loại
hợp chất bay hơi mà người ta sử dụng các máy sắc ký có cột và detectơ khác nhau,
thông dụng nhất là loại detectơ ngọn lửa ion hoá.

Căn cír vào phổ sắc ký người ta định lượng được các hợp chất bay hơi có
trong dung dịch mẫu phân tích. Thành phần của hỗn hợp chất thơm được thể hiện
dưới dạng tín hiệu cùa detectơ hay còn gọi peak trên sắc ký đồ. Để xác định tên gọi
của từng peak, cần dựa vào thời gian luxi của chất chuẩn đã được phân tích trên
cùng chương trình phân tích. Định lượng thành phần trong hỗn hợp, có thể dựa vào
tỷ lệ phần trăm diện tích peak hoặc bằng phương pháp xây dimg đường chuẩn, kết
hợp với detectơ khối phổ (hình 7.2.6b).

198
 Hinh 7.2.6b Nguyên iý hoạt động của detectơ khối phổ

7.3. PHẦN THỰC HÀNH

Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu là chỉ số đặc trưng về chất lượng của
nguyên liệu đó. Để xác định hàm lượng tinh dầu có thể dùng phưcfng pháp chưng
cất với các loại thiết bị khác nhau.

Bài I. C h im g cất tỉnh dầu theo phương pháp Clevende

a. Dụng cụ, lioá chất

- Thiết bị Clevende

- Bếp điện

- Nước cất

b. Cách tiến liànlì

Mẫu nguyên liệu (hoa hồi đã được nghiền nhỏ hoặc lá hương nhu...đã được
thái nhỏ) được cân khoảng 25-50g (tuỳ thuộc vào lượng tinh dầu trong nguyên liệu
nhiều hay ít) cho vào bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3a. Đặt bình cầu lên
bếp điện. Qua ống sinh hàn 3 rót vào bình cầu 150-200ml nước cất rồi đun. Nước
trong bình sôi. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu sẽ theo ống dẫn hơi lên ống sinh hàn
và ngưng tụ lại chảy xuống ống thu tinh dầu, ở đây do tinh dầu không hoà tan trong

199
nirớc và tùy theo khối lượng riêng của nó lớn hơn hoặc nhỏ hơn khối lượng riêng
của nước mà chìm xuống dưới (hình 7.3a A ) hoặc nổi lên trên (hình 7.3a B), hoặc,
còn nước chưng theo ống xiphóng b hồi lini vào bình cầu 1. Thời gian chưng cất
kéo dài cho tới khi thấy lượng trong ống ihu c không đổi thì ngừng cất (khoảng 2-3
giờ tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu).

Sau khi chimg cất kết thúc, để nguội, đọc lirợiig tinh dầu trong ống thu.

a. Tính kết quả:

Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, tính theo % khối lượng nguyên liệu
được xác định bằng công thức sau:
a.7 .100
E% =
m

trong đó:

a: thể lích tinh dầu có trong ống thu;

ỵ: khối lượng riêng của rinh dầu;

m: khối lượng pơuyên liệu nghiên cứu.

Nếu tính hàm lượng tinh dầu theo khối lượng chất khô tuyệt đối thì:

200
 a.y.ioo
Et% =
m
(lOO- w)
100

trong đó:

W - hàm ẩm của nguyên liệu;

Các ký hiệu khác như trẽn.

Bài 2. Chưng cất tính dăii theo phương pháp Ghinbe

Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu
hoặc trong nước chưng, loại nhẹ hơn nước.

a. Dụng cụ, hoá clìấí

Bình cầu 500ml; Bếp điện;

Ống sinh hàn; Nước cất.

Ống Ghinbe;

b. Cách ĩiển lìàỉìlì

Cân 30-40g nguyên liệu đã nghiền nhỏ hoặc 250-300ml nước chưng cho vào
bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3b:

Hinh 7.3b. Thiết bị Ghinbe:

1. bình cầu;

2. ống Ghinbe;
ống Ghinbe
3. ống sinh hàn;

4. bếp điện.

201
 Nếu xác định hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, qua ống sinh hàn rót vào
bình cầu 250-300ml nước cất. Đun sôi bình cầu trên bếp điện. Hỗn hợp hơi nước và
tinh dầu bay lên ống sinh hàn 3 ngưng tụ lại chảy vào ống Ghinbe. Tinh dầu nằm ở
trên còn nước chưng theo ống xiphông chảy về binh cầu. Thời gian chimg cất kéo
dài khoảng 2-3 giờ. K h i thấy nước tinh dầu trong ống Ghinbe không thay đổi thì
ngừng cất, để nguội. Lấy ống Ghinbe ra đọc lượng tinh dầu.

d. Tíitli kết quả

Cách tính kết quả như bài 1.

Bài 3. Phân tích thành phần tỉnh dầu bằng phư ơng p h á p sắc ký khí

1. Nguyên tắc

K h i bơm mẫu vào buồng bơm mẫu, dưới tác dụng cùa nhiệt độ làm bay hơi
các cấu tử của dung m ôi và của các cấu tử cần phân lích. Dòng khí mang sẽ dẫn các
cấu tử bay hơi vào cột tách sắc ký, tại đày diễn ra sự tương tác giữa các chất hấp
phụ được phủ bên trong cột và các cấu tử nên các cấu tử bị giữ lại trên cột. Tuỳ theo
tính chất của các cấu tử mà tương tác với chất hấp phụ khác nhau nên thời gian lim
của các cấu tử cũng khác nhau. Dòng khi mang vẫn được đưa liên tục vào cột tách
và nó sẽ mang những cấu tử đã tách ra khỏi cột tách qua ngọn lửa hyđro do đó làm
thay đổi độ dẫn điện của ngọn lửa. Dctector sẽ ghi lại sự thay đổi này và đưa ra sắc
ký đồ của cấu tử cần phân tích

2. Dụng cụ, rliiết bị

a. Dụng cụ

Càn phân tích 10-4g; ố n g thuỷ tinh.

X ylanh 1 |,il;

b. Thiết bị

Thiết bị ký sắc ký kh í GC 2010, Shimadzu, Nhật Bản;

Điều kiện chạy máy ;

K h í mang: n it ơ ;

Vận tốc dòng: 1,25 m l/ p h ú t;

202
 Detector: detector ion hoá ngọn lửa (FID );
Cột tách: DB W ax, 60 m X 0,25 mm X 0,25 um;
Chế độ chia dòng: 1 :50;
Chương trình nhiệt độ: 70 "c (2 phút), 2"c/phút, 230 "c (20 phút);
Nhiệt độ injector và detector: 250 ”C;
Thể tích mầu: 0,2 |.il.

3. Hóa chất, thuốc thử

a. Hoá chất, thuốc thử

Q íc loại dung m ôi và chất chuẩn thuộc nhóm monoterpen, sesquiterpen độ

tinh khiết 99,9%;

K hí nitơ 99,999%.

1. Kết quả

lín hiọu săc ký

Hình 7.3.3. sẳc ký đổ tinh dầu Citrus kumquat

(DB Wax, 60m X 0,25 mm X 0,25 um)

203
 B ả n g 7.3.3. Một số thành phần tinh dẩu mẫu Citrus kumquat

Hàm lượng
STT Thành phần Thời gian lưu
(% diên tích peak)
1 p - Pinen 7,2 0,250

2 Sabinen 8,6 0,107

3 3 - Caren 8,8 0,192

4 Mycren 9,2 1,627

5 a -Phellandren 9,7 0,055

6 Limonen 11,5 94,817

7 p - Phellandren 11,9 0,101

8 z- |3 - Ocimen 13,0 0,013

9 Terpinolen 14,0 0,004

10 Octanal 14,5 0,172

11 Tetradecan 14,8 0,059

12 Z- Limonen oxyt 16,8 0 ,0 0 4

13 Menthon 17,6 0,010

14 Citronellal 20,0 0 ,0 3 5

15 Decanal 20,8 0 ,1 2 3

16 /7-Cubeben 23,3 0,012

17 Octanol 25,3 0,011

18 Terpinen - 4 - ol 27,4 0,029

204
 Chương 8
VITAMIN

8.1. GIÓI THIỆU

Các vitam in được chia làm hai nhóm

- Nhóm hoà tan trong chất béo gồm các vitamin A, D...

- Nhóm hoà tan trong nước gồm vitamin nhóm B ( B l, B2...) và vitamin c.

N ói chung các loại thịt, cá, trứrig, sữa có đủ các vitam in hoà tan trong chất
béo và vitam in hoà tan trong nước. Riêng gạo và trứng có chứa nhiều vitamin A, D
cũng như B l, B2... Ngũ cốc chủ yếu chứa vitamin nhóm B nhưng hoàn toàn không
có vitam in c . Trong ngũ cốc chỉ có ngô vàng chứa khoảng 0,4mg caroten trong
lOOg. Các loại hạt họ đậu là nguồn cung cấp vitamin nhóm B rất tốt và một lượng
nhỏ caroten, còn vitam in nhóm B và vitamin c ở hàm lượng rất thấp. Các loại rau
quả có đầy đủ caroten, vitam in nhóm B với lượng rất ít nhưng lại chứa khá nhiều
vitam in c.

Ngày nay một số vitam in còn được gọi theo bản chất hoá học của chúng, ví
dụ; Vitam in c là axit ascorbic, BI là thiamin, B2 là riboílavin...

Trong chương này, chúng tôi chỉ trình bày một sô' phưcmg pháp xác định
caroten, vitam in A , vitam in c và vitamin B l, B2.

205
8.2. CAROTEN VÀ VITAMIN A

V itam in A chỉ được tổng hợp trong cơ thể người từ caroten của thực vật do
thức ăn đưa vào cơ thể. Dưới tác dụng của men carotenaza, caroten tạo nên vitamin
A. Trong thực vật tồn tại cả ba loại đồng phân của caroten: a, p và y-caroten, trong

đó quan trọng nhất là P-caroten.

Do tác dụng của vitam in A và caroten đối với cơ thể rất giống nhau nên khi
phân tích cần xác định caroten riêng hoặc xác định lổng lượng caroten và vitam in
A. Thông thường đối với thực phẩm nguồn gốc thực vật người ta quy hoàn loàn ra
caroten, đới với thực phẩm nguồn gốc động vật thì quy hoàn toàn ra vitam in A trên
cơ sờ 3 caroten bằng 1 vitam in A.
Bài 1. Xác định caroten bằng phương ph áp sắc ký cột
a. Nguyên tắc
Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột

rồi đem so màu.

b. Dụng cụ, lioá chất

- Cân phân tích

- Bình định mức V = 50ml, lOOml
- Cối sứ
- M áy so màu
- Cột sắc ký: dài 30cm, o = Icm

- Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm. Rửa cát qua rây

bằng nước máy, rồi dùng HC l (tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm. Rửa
cát cho tới hết axit. Rửa lại bằng nước cất, sấy khô.
- Benzin: nhiệt độ sôi 70 - 80"C.
- Chấp hấp phụ; Nhôm oxyt (A I 2O,) loại dùng cho sắc ký, sấy ở 100"C

trong 1 giờ, bảo quản trong bình làm khô có chất chống ẩm silicagen.

- Natrisuníat khan (Na 2S0 4 ).

206
 - Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn: Cân chính xác 0,145g azobenzen cho
vào bình định mức dung tích lOOml, thêm rượu etylic 96% đến vạch mức, lắc kỹ.
K hi thí nghiệm, đem dung dịch này pha loãng gấp 10 lần bằng rượu etylic 96%.
Dung dịch này để ở chỗ tối, màu sẽ không biến đổi.
c. Cách tiến hành
Cân 5 gam mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ, nghiền kỹ với 5
gam cát sạch trong 30 phút. Đê làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10 gam Na2S0 4
khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa.

Phần dưới của cột sắc ký được nhồi bông thấm nước. Sau đó cột được nhồi
nhôm oxyt khoảng 2/3 cột. Dùng đũa thuỷ tinh nén nhôm oxyt cho chặt. Trên cùng
lại đặt 1 lớp bông dày 1 cm.

Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký. Cho benzin vào cột
đến khi thấy lớp bột không thấm benzin nữa. Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột
được rửa chầm chậm bằng benzin đến khi không còn thấy những giọt màu vàng
chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. Cần chú ý cho benzin phủ ngập lớp bột vì
caroten để bị oxy hoá bởi không khí.

Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc
lOOml (tuỳ thể tích nước hứng được) và thêm benzin đến vạch mức, lắc nhẹ. Dung
dịch caroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã
pha loãng 10 lần). Trong Im l dung dịch có mầu giống dung dịch azobenzen tiêu
chuẩn chứa 0,00235 mg caroten.

c. Tính kết CỊiiả

Hàm lượng caroten (tính theo mg trong lOOg sản phẩm) được tính bằng công
thức:
0,00235.lOO.V.D,,
x=
in

trong đó:

V - dung tích bình định mức chứa dung dịch caroten trong benzin, ml;

G - lượng mẫu cân, g;

207
 D,,. - mật độ quang hoặc chiều cao thước (trên máy Dubốt) của dung dịch
azobenzen tiêu chuẩn, mm;

D „ - mật độ quang, hoặc chiều cao thước (trên máy D iibốt) của dung dịch
caroten, mm.

Hình 8.2. Cột sắc ký xác định caroten

B à i 2 . X á c đ ịn h v ita m ỉn A b ằ n g p h ư ơ n g p h á p s o m à u

a. Nguyên tắc

V itam in A là một alcohol cao cấp chưa no có công thức hoá học như hình
sau và thường kết hợp với axil béo (palinitic và stearic) tạo thành este phức tạp. V ì
vậy khi muốn xác định vitam in A phải xà phòng hoá các sản phẩm, rồi xác định
vitam in A trong phần không xà phòng hoá. Vitam in A được tách ra khỏi dung dịch
không xà phòng hoá bằng cloroform khan và nó cho phản ứng với antimon (III)
clorua tạo sản phẩm màu xanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn.
HsC^ ^CHa

/^ \
H2C ọ ----- (CH=CH-CCH3=CH)2-CH20H
H2Ò^ c— CH3
c
H2 V it a m in A

208
 iì. Dụiiị’ cụ, lioá chất

- Cân phân tích;

- Bình nón dung tích 250ml;

- Phều chiết;

- Ông làm lạnh;

- Nồi cách thiiỷ, cốc thuỷ tinh dung tích 250ml, bình định mức dung tích
25ml, 500ml;

- Ong nghiệm dung tích lOml, 22 cái, giá để ống nghiệm;

- Dung dịch màu tiêu chuẩn được chuẩn bị như sau: cân 75g đồng sunfat
(CUSO4.5 H 2 O) và 3,5g coban nitrat Co(NO ,)2 cho vào bình định mức dung tích
500ml, thêm nước đến vạch mức, lắc kỹ cho tan hết. Từ dung dịch này tạo dãy màu
tiêu chuẩn theo bảng 8.2.4.

Bảng 8.2.4. Dãy dung dịch màu tiêu chuẩn

SỐ ống sốm l Sô đơn Số ống Số ml Số đơn

nghiệm DD gốc Nước vi màu Nghiệm DD gốc Nưóc vi màu
1 20 0.0 9.2 12 20 31,6 4.0
2 20 0.4 9.0 13 20 41.2 3.5
3 20 1.6 8.5 14 20 55.4 3.0
4 20 3.0 8.0 15 20 742 2.5
5 20 4.5 7,5 16 20 104,2 2.0
6 20 6.3 7,0 17 20 131,0 1,75
7 20 8.7 6.5 18 20 175,0 1.5
8 20 11.6 6.0 19 20 190,0 1,25
9 20 14,6 5.5 20 20 240,0 1.0
10 20 19,0 5.0 21 20 330,0 0,75
11 20 24,4 4,5 22 Nước cất - -

- Giấy quì, natri suníat khan: đã sấy ở 100"C trong 1 giờ

- C loroform (C H C l,): Rửa 5 lần bằng nước cất tỷ lệ 2 nước : 1 cloroíorm

trong phễu chiết rồi làm khô bằng natri simfat khan sau đó chưng cất để thu dịch
tinh chế.

209
 Dung dịch antimon ( III) clorua (SbClO bão hoà: SbCl, được rửa bằng cách
khuấy trong cloroíorm đến khi nuớc rửa không màu, SbCli đã rửa được để trong
bình làm khô (có chứa axit suníuric đặc) qua 2 ngày, sau đó hoà tan SbCl, trong
cloroform đến bão hoà.

- Ete etylic tinh khiết

- K ali hyđroxit dung dịch 20% trong rượu etylic

b. Cách tiến hành

Cân 10 đến 20 g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung
dịch kali hyđroxit 20% trong rưcru etylic. Đậy bình bằng nút bấc có gắn ống làm lạnh
và đun hồi lưu trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 85 - 90"C trong 2 giờ để xà phòng hoá.
Dung dịch đã xà phòng hoá được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu
chiết. Thêm vào phễu chiết 50ml ete etylic và lắc kỹ (để tránh tạo huyền phù, cần
chiết dịch lúc nguội và lắc mạnh) chiết phần không xà phòng hoá ra (lớp trên) vào
một phễu chiết thứ hai. Lại thêm 25ml ete etylic vào phần xà phòng hoá, tiếp tục lắc
và chiết lấy lớp trên vào phễu chiết thứ hai. Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3 - 4
lần m ỗi lần 2 0 m l nước cất cho đến khi nước rửa có phản ứng trung tính (thử bằng
giấy quỳ). Làm khô nước chiết đã rửa bằng 6 gam natrisunfat khan trong 30 phút.
Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đun đuổi ete trên nồi cách thuỷ.

Hoà tan cặn không xà phòng hoá thu được bằng cloroform (sau khi đã đuổi
hết ete) và chuyển vào bình định mức dung tích 25m l, thêm cloroíonn cho đến
vạch, lắc nhẹ.

Cho vào 1 ống nghiệm (khô, sạch, cùng màu, cùng kích thước như ống
nghiệm chứa dung dịch tiêu chuẩn) đúng 0 ,2 m l dung dịch trong bình định mức
trên, thêm vào 1 - 3 giọt anhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl, bão hoà lắc nhanh và
để không quá 1 0 giây đem đo màu với ống tiêu chuẩn trong 2 0 giây.

c. Tính kết quả

Hàm lượng vitam in A tính theo đơn vị màu của ống tiêu chuẩn có màu trùng
với màu của ổng nghiệm chứa dung dịch mẫu. Nếu màu của ống mẫu nằm giữa
màu của 2 ống tiêu chuẩn thì lấy trị số trung bình. Cuối cùng hàm lượng vitam in A
(mg trong lOOg sản phẩm) tính bằng công thức:

210
 n .v
X=
G.4

n - số đơn vị màu tìm được khi so màu;

V - dung tích bình định mức chứa dung dịch không xà phòng hoá trong
cloroíorm , ml;
G - lượng mẫu cân, g;
4 - hệ số thực nghiệm để tính ra mg%.

8.3. NHÓM VITAMIN c, BI VÀ B2

B ài 3 . Xác định vitamin c

a. Nguyên tắc
V itam in c (axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật. Nó
tham gia vào nhiều quá trình oxy hoá khử xảy ra trong cơ thể người. Trong phân tử

ascorbic chứa nhóm dienol (-C O H =C O H -) có tính khử mạnh. V itam in c dễ bị oxy
hoá thành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch.
0 = c -------- 0 = 9 ------
■2H 1
c — OH ò= 0
Ó o
c — OH c

HỌ---------- HC

HO— ỘH
I. HO— CH
L
CH2OH CH2OH
Axit ascorbic Axit dehydro ascorbic

A x it dehydroascorbic cũng như axit ascorbic là chất hoạt động sinh học
mạnh và chống xuất huyết.

Dựa trên tính khử-m ạnh của axit ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt
phương pháp hoá học để định lượng nó. Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và
hay dùng nhất là phương pháp cho axit ascorbic khử m uối natri của 2 ,6
diclophenolindophenol. Màu xanh đen của chất chỉ thị này (dạng oxy hoá) khi gặp
axit ascorbic sẽ chuyển thành không màu (dạng khử).

211
 Xác định vitam in c dựa trên nguyên tắc: vitam in c được chiết ra khỏi lương
thực, thực phẩm bàng axit axetic hoặc axit clohydric. Các chất khử khác và chất
màu khác phải được tách ra khỏi nước chiết bằng chì axetat. Sau đó chuán độ nước
chiết trong m ôi trường axit (pH = 3-4) bằng 2,6 diclophenolindophenol, rồi tính ra
lượng vitam in c .

b. Dụng cụ lioủ chất

- Cân phân tích;

- Bình định mức dimg tích lOOml, lOOOml;

- Cốc dung tích lOOml;

- Bình nón dung tích 200ml;

- Pipet các loại;

- M icroburet;

- Giấy lọc;

- Phễu thuỷ tinh, cối chày thuỷ tinh hoặc sứ, bột thuỷ tinh hoặc cát sạch;

- HC l 1% hay CH,COOH 5%, axit metaphotphoric 2% hay axit oxalic 1%;

- Dung dịch oxalat amoni bão hoà, dung dịch hồ tinh bột 1%;

- K I tinh thể, H2SO4 2% , axit ascobic tinh thể (tinh khiết);

- Dung dịch muối natri 2,6 diclophenolindophenol 0,001 N.

Cho 0,15g 2,6 diclophenolindophenol vào bình định mức dung tích 500ml,
thêm 350 m l nước cất và tiếp đó dung dịch đệm photphat có pH = 6,9-^7,0 cho tới
vạch mức. V ì trong dung dịch nước thuốc thử này bị phá huỷ rất nhanh nên phải
pha trong dung dịch đệm. Dung dịch đệm có pH = 6,9-^7,0 được pha như sau: trộn 2
thể tích K H 2PO 4 (9,078 gam trong 1 lít) và 3 thể tích Na 2HP 0 4 (11,867 gam
NÍI2HPO 4.2 H 2O trong 1 lít nước) với nhau trước khi đem dùng.

Thuốc thử 2,6 diclophenolindophenol được bảo quản trong bình có màu ở nơi
tối.

212
 c. C á c h tiế n h à n h

- Chuẩn bị mẫu thử: Tất cả các sản phẩm dạng lỏng hoặc bột đểu phải trộn
đều nhưng không lắc để tránh lên bọt khí.

Lượng cân sản phẩm lấv tiiỳ thuộc vào hàm lượng vitam in c của nó. K hi hàm
lirợng ít thì lấy mầu nhiều hoặc ngược lại. Theo kinh nghiệm thì nên lấy lượng cân
các sản phấm như sau 8.3a.

Báng 8.3a. sản phẩm và lượng mẫu tương ứng

Mầu Lưọng cản

Thực vật tươi (rau, quả) 10 - 50 g
Nước ngọt (cam, chanh... 1 - 50 g
Đổ hộp 5 - 10 g
Quả khô 10 g
Chuẩn độ đối với xán plìẩiìi lỏng

Lấy một lượng cân chất lỏng nhất định cho vào bình định mức dung tích
lOOml, thêm vào bình 20ml dung dịch axit clohydric 1% hoặc axit axetic 5% thêm
nước cất đến vạch mức lắc kỹ. Nếu thấy có cặn cần lọc lấy dịch trong. Hút lOml
dịch trong và đem đi chuẩn độ bằng dung dịch 2 ,6 diclophenolindophenol.

Clniẩii độ đối với sản pliẩiiì dạng kììác

Cân vào cối sứ lượng mầu như đã nêu ở trên, thêm H C l 1% hoặc axit axetic
5% cho ngập mẫu. Nghiền cẩn thận mẩu, tiếp đó chuyển hoàn toàn hỗn hợp vào
bình định mức dung tích lOOml. 'riiêm vào bình định mức dung dịch axit
metapholphoric 2% (25m l) để loại bỏ prolein và giúp cho quá trình lọc được dể
dàng, rồi thêm H C l 1% đến vạch mức.

Có thể dùng axit oxalic 1% dếtráng cối và thèm đến vạch mức, hoặcdùng
axetat chì 5% (5m l) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố.

K h i thí nghiệm với các phẩm vật có nguồn gốc dộng vậtthì dùng axit
tricloaxetic 20% sao cho nồng độ cùa nó đạt 5% trong dimg dịch (25 ml).

Trường hợp không có axit metaphotphoric hoặc oxalic, có thể chi dùng riêng
một mình H C l 1% hay axit axetic 5%. Sau khi để yên 10 phút, lắc cẩn thận và lọc.

213
 Dùng pipel hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin c ,
ihẻm 5ml dung dịch oxalat amoni bào hoà, lOml nước cất và định phân bằng dung
dịch 2,6 diclophenolindophenol 0,001N từ microburei cho tới xuất hiện mầu hồng
bền (không mất mầu trong 1 phút). Trường hợp dùng axit oxalic thì không cần cho
thêm oxalat amoni nữa.

Chú ý

K hi xác định vitam in c irong một phẩm vật nào đó phải tiến hành phân tích
ít nhất là 2 mẫu thí nghiệm, đối với mỗi mẫu - 2 lần xác định. Kết quả định phân
không được sai lệch nhau quá 0,03ml 2,6 diclophenolindophenol 0,001 N. Phải
dùng microburet để định phân.

Thời gian định phân không kéo dài quá 2 phút và lượng 2,6
diclophenolindophenol dùng trong định phân nên ở trong khoảng l - 2 m l (không quá
2 ml).

c. Tính kết quả

Hàm lượng vitamin c (mg %) tính theo công thức:

^ _ ( a - b ) f.V .1 0 0
X —----------------------
5.m

trong đó;

a: sô' m l 2, 6 diclophenolindophenol dùng định phân dịch chiết vitam in C;

b: sô' m l 2 , 6 diclophenolindophenol dùng định phân mẫu kiểm chứng (hỗn

hợp các thuốc thử đem dùng);

f: số mg axit ascorbic ứng với 1 m l dung dịch 2 ,6 diclophenolindophenol;

v: tổng thể tích pha loãng;

m: lượng mẫu cân, g:

5: 5ml dịch lọc hút đem chuẩn độ.

Để xác định hệ số f ta tiến hành như sau:

Hoà tan 1 - l,5m g (lấy ước lượng không cần cân) axit ascobic tinh khiết trong
50ml H2SO4 2%. Lấy cnính xác 5ml dung dịch đó và chuẩn độ bằng dung dịch 2,6
diclophenolindophenol cho đến màu hồng bền (không mất màu sau 1 phút).

214
 I.ấy vào một bình khác 5ml dung dịch axit ascorbic tinh khiết trên, thêm l
vài hạt tinh thể K I (3 - 5mg) và 5 giọt 'dung dịch hồ tinh bột 1% rồi định phân bằng
dung dịch K IO , chính xác 0,00 IN cho đến khi xuất hiện màu xanh.

Hệ số f được tính theo công thức:

^ 0,08 8 .a
b

trong đó:

0,088 - số mg axit ascobic ứng với Im l dung dịch K IO , 0,001N;

a - sô' m l K IO , 0,00IN dùng định phàn 5ml dung dịch axit ascobic;

b - sô' m l 2,6 diclophenolindophenol dùng định phân 5ml dung dịch axit
ascorbic tinh khiết trên.

Bài 4. Xác định vitamỉn B ị bằng phương pháp đo màu huỳnh quang

V itam in B i (thiam in) có công thức cấu tạo như sau:

.N H ị CI CH3
H2
c —c — C H 2O H
H2 H2
H 3C — c ■ c— c •
Cl
CH HC'

V itam in B| ở dạng este pirophotphoric là một tiền men cacboxylaza tham gia
vào sự trao đổi gluxit.

Thiam in là chất kết tinh không màu. Trong môi trường trung hoà và kiểm, nó
rất nhạy với nhiệt ciộ cao (dễ bị phân huỷ hoặc tự phân huỷ). Vitam in B| bền trong
môi trường axit, ở pH = 3 nó không bị phân huỷ khi đun nóng tới 120"C. Thiamin
dễ tan trong nirớc, trong rượu etylic loãng, trong rượu m etylic, trong axit axetic và
không tan trong cloroíorm , rượu butylic, isobiitylic, isoaniylic ete petrol, ete
suníuric. Thiam in rất nhạy với chất oxy hoá và chất khử. M ộ t điểm đặc biệt là khi
bị oxy hoá nó biến thành thiocrom. Chất này dưới ánh sáng tử ngoại có màu huỳnh
quang xanh. Đây là cơ sở của phương pháp xác định vitamin B| vì phản ứng oxi hoá
thiamin thành thiocrom xảy ra theo đúng tỷ lệ đương lượng; một phân tử thiamin
tạo thành một phân tử thiocrom.

215
 Để phán ímg trên có thể xảy ra. trước hết phải giải phóng thiam in ra khỏi
mẫu bằng ch ế phẩm men.

b. Dung cụ, lioá chất

- Cân phân tích; - Nồi cách thiiỷ;

- Ông nghiệm; - Phều thiiỷ tinh;

- Cối thuỷ tinh; - Phếu chiết, bình định mức, máy huỳnh quang.

- Rượu biitylic, isob u tylic hoặc isoam ylic. Các rirợii này phải không phát
h uỳ nh quang. Có thể k h ử chất ph át h u ỳ n h q u a n g b ằ n g than hoạt tính (15 g a m than
cho Iml rượu): rượu trộn với than lắc 30 phút trên máy lắc, làm khan bằng CaCl2 và
cất ở nhiệt độ thích hợp.

- Chế phẩm men của khuẩn ti penicilliiim , khiiẩn li penicillium được sấy khô
ở nhiệt độ dirới 40"C rồi chiết lấy men bằng cách nghiền khuấn ti với một ít dung
dịch natri axetat.

- Dung dịch vitamin B| tiêu chuẩn

- Dung dịch cơ sở (a) được pha như sau: hoà tan 10 gam tiiih thế thiamin vào
lOml axit clohydric ciiing dịch nồng độ O.OOIN, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình
định mức dung tích lOOml. Thêm nước cất đến vạch mức, lác kỹ, Iml dung dịch
này chứa 100|.ig thiamin. Dung dịch này được đựng trong chai màu, đế' chỗ mát
trong 1 tháng không bị hỏng.

Lấy Iml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm nước
cất đến vạch mức, lắc kỹ, Iml dung dịch này chứa 1 fig thiamin.

Dãy tiêu chuẩn (b) được chuẩn bị như sau: từ dung dịch trên, lấy vào một dãy
ống nghiệm lần lượi 0,5; 1; 1,5; 2m l... (chứa 0,5; 1; 1,5; 2 y... thiamin) rồi thêm vào
3, 5; 5; 2,5; 2,0m l... nước cất và Iml K,Fe(CN)fi dung dịch 1% (vừa điểu chế). Cuối
cùng cho vào mỗi ống 3ml natri hydroxit dung dịch 15%, lắc nhanh. Mỗi ống lại
được cho vào lOml rượu butylic, lấc kỹ. Đ ể yên 2 phút, dung dịch sẽ tách thành 2
lớp, tách bỏ lớp dưới. Cho vào đó Ig natri suníat khan. Dung dịch rượu khan chứa
thiocrom được cho vào dãy ống nghiệm khác. Ta đirợc một dãy màu tiêu chuẩn bền
trong 2 - 3 ngày.

216
 r . C á ch liế n lià iili

Cân 5 - lOg mẫu, nghiền kỹ trong cối sứ với 10 - 15ml H2 SO 4 0,1N. Chuyên
cả vào bình đ ịn h mứ c, th ê m H 2S O 4 đến 75ml. ỉ)ặi bình vào nồi c á c h tliiiý sôi trong
45 pliút, lác đều. Đ ế nguội bình và cho ch ế pliárn men vào (cứ 2 gam inảii cân 0,03
g a m khuẩ n ti k h ô ) b ằ n g cách: c â n k h u á n ti penicillÌLim, tán nhỏ trong cối thiiỷ tinh
với 2 - 3ml natriaxetat dung dịch 30% rồi chuyến \’ào bình định mức thêm nalri
axetat đến p ll = 5. Đặt bình vào máy điều nhiệl ở 4Ơ"C trong 12 giờ. Sau đó lấy
bình ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc.

Hút lấy lOml nước lọc cho vào phều chiết, thêm \'ào 20ml rượu butylic, lắc
mạnh 1 - 2 phút. Chiếl, tách lớp rượu ra. 'rhêm vào Im l K,Fe(CN)fi dung dịch 1% và
3ml natri hydroxit diing dịch 15%, lắc nhanh hỗn hợp và thêm vào lOml rượu butylic,
lại iắc. Tách bỏ lớp nước, còn lớp rượu cho qua giấy lọc chứa NÍI2SO4 khan.

Sau đó chuyển dung dịch vào ống nghiệm có cùng kích thước, cùng dung
tích và màu thuỷ tinh giống Iihir dãy ống tiêu chuẩn.

Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thử - so với dãy tiêu chuẩn trên máy
huỳnh quang.

Đo cường độ huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh ihuỷ
ngân 71 K-4, dùng kính lọc màu đen.

d. Tíiili kết q u ả

Hàm lượng vitamin B| (mg%) tính bằng công thức

a.V.IOO
X -
V, .0 .1 0 0 0

trong đó:

a- lượng thiarnin có irong ống tiêu cliuẩn có màu huỳnh quang trùng với ống
chứa mẫu thử, |.ig;

V - dung tích bình định mức, ml;

V| - thể tích dung dịch thử lấy để oxi hoá, ml;

Ci - lượng mẫu cân, g.

217
 1 0 0 0 - giá trị chuyển đổi từ ng sang mg.

V’/' dụ tíiili toán

Giả sử càn 10 gam gạo, sau khi nghiền và định mức trong bình địiih mức
dung tích lOml đem oxi hoá. Cuối cùng đo cường độ huỳnh quang màu của ống
chứa mẫu thử trùng với màu của ống chứa 1,5 |.ig dãy thiamin chuẩn. Vậy hàm
lượng thiamin (mg% ) trong gạo là:

1 ,5 .1 0 0 .1 0
X = — = 0 ,1 5m g%
10 . 10.1000

G hi chú

1. Đ ây là phương pháp xác định lượng nhỏ vitamin B| nên các thao tác cần
phải làm tỉ m ỉ, thận trọng, nhất là quá trình chiết.

2. K,Fe(CN)fi trong m ôi trường NaOH là chất oxi hoá thiamin thành

thiocrom.

B ài 5. X ác định vitam in B 2 bằng phương ph áp huỳnh quang

a. Nguyên tắc

Vitamin B 2 (RiboAavin) chứa nhiều trong men bia, gạo, bột m ì, khoai tây và
trong các sản phẩm lương thực, Ihực phẩm khác.

Công thức hoá học của ribofIavin như sau

H2C---- (CHOHla-CH^OH
H 1
H3 C.
^9=0
1 ĩ I I,
^NH
H II
0

R iboílavin là chất kết tinh màu vàng, vị đắng. RiboAavin liên kết với axit
photphoric trong thành phần của men gọi là men ílavin thuộc vào nhóm dehydraza
hiếu khí. D o vậy vitamin B2 tham gia vào quá trình oxi hoá khử. Khi bị khử dạng
màu vàng của vitamin B2 chuyển thành dạng không màu. Riboflavin có màu huỳnh
quang vàng xanh trong dung dịch nước trung tính. Khi bị axit hoá hoặc kiềm hoá,

218
màu huỳnh quang của riboAavin giảm dần rồi mất hẳn. RiboAavin bị phân huỷ
trong môi trường kiềm , bền trong axit.

Đặc tính phát huỳnh quang của riboflavin là cơ sở của phưcfng pháp định
lượng vitamin B 2 . Dựa vào việc đo cường độ huỳnh quang của dung dịch vitamin B 2
ta có thể xác định được hàm lượng của chúng chứa trong thực phẩm.

Nhược điểm của phương pháp này là trong nước chiết các sản phẩm thực
phẩm ngoài vitamin B2 còn chứa một sổ các chất khác cũng phát huỳnh quang.
Nhimg nhược điểm này có thể khắc phục được bàng cách đo huỳnh quang các chất
trong mẫu thử sau khi đã khử riboAavin bằng natri dithiosunfat.

b.D ụng cụ, Ììoá clìất

- Pipet, buret; - Cốc thiiỷ tinh;

- Cân phân tích; - Bình nón;

- Cối thuỷ tinh; - Nồi cách thuỷ;

- Bình định mức lOOml, - Máy huỳnh quang HcpM ;

- K M 1 1 O 4 đung dịch 4%.

- Phễu thuỷ tinh;

- Natri axetat dung dịch 2,5M : hoà tan 340g natri axetat trong lOOOml nước
cất.

- Dung dịch thiếc clorua: lOg SnCl^ hoà tan trong 25m l axit clohydric đậm
đặc (đ = 1,19). Dung dịch này được đựng trong bình màu nâu. Từ dung dịch này
điều ch ế dung dịch mới bằng cách pha 0,2m l với nước cất thành lOOml.

- Dung dịch natriciithiosiinfat: 0,25g N a 2 S2 0 4 .2 H 2 0 hoà tan trong lOml

N a 2 C 0 , dung dịch 2 %.

- Dung dịch K 2 HPO 4 4M: 69,6 gam K 2 HPO 4 hoà tan tỏng lOOml nước cất

- Dung dịch đệm photphat (pH = 7 - 8 )

- C hế phẩm men tripsin hoặc pancreatin tinh khiết

- Dung dịch riboflavin tiêu chuấn; cân 10 gam riboflavin tinh thể cho vào
bình định mức dung tích 250m l thêm axit clohydric dưng dịch 0 ,0 IN đến vạch

219
mức, lắc kỹ cho tan hết riboílavin (Im l dung dịch này chứa 4ơy riboAavin). Dung
dịch này giữ ở chỗ mát, tối trong 1 tháng không bị hỏng. Sau đó lấy Iml dung dịch
này cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào đó 37,5 axit tricloaxetic
dung dịch 20% và 25m l dung dịch K2HPO4 4M , thêm nước cất đến vạch mức, lắc
kỹ.

c. Cáclì tiến hàn lì

Cân 5 - lOg sản phẩm lưcnig thực, thực phẩm (gạo, quả...) nghiền kỹ trong
cối thiiỷ tinh với 20m l dung dịch đệm photphat (pH = 7 + 8 ). Chuyển toàn bộ vào
bình định mức dung tích 250m l, rồi thêm lOOml dung dịch đệm nữa. Hỗn hợp được
để đúng 40 phút trong nồi cách thiiỷ đang sôi. Sau đó lá'y ra làm nguội dến 30"C rồi
đo pH bằng giấy thử pH. Nếu pH < 7 thì phải đưa về pH = 7,8 ^ 8 bằng dung dịch
đệm photphat. Cho vào hỗn hợp này Ig ch ế phấm men tinh khiết tripsin và để vào
tủ ấm ở t" = 37"C trong 10 giờ. Men sẽ thuỷ phàn protein và phá vỡ m ối liên kết bền
của riboAavin với protein. Lấy bình định mức ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc
kỹ, lọc qua giấy lọc khô. Dùng pipet hút lấy lOml nước lọc vào bình nón, thêm vào
5ml axit tricloaxetic dung dịch 20% và để hỗn hợp 10 phút trong nồi cách thuỷ
đang sôi để giải phóng hoàn toàn riboflavin ra khỏi hỗn hợp ở dạng lự do. Sau khi
làm nguội, thêm vao dung dịch m ột lượng H 2 HPO 4 4 M để đưa pH về 6 .

Tiếp đó nhỏ vào bình nón từng giọt KMnƠ 4 dung dịch 4% đến có màu hồng
nhạt. Đ ể yên 10 phút, nhỏ vào bình nón vài giọt H 2 O 2 dung dịch 3% đến mất màu
hồng hoàn toàn. Cuối cùng thêm vào 0,2m l dung dịch thiếc clorua và 0,1 ml dung
dịch natri dithiosuphat, lắc mạnh 20 phút. Lọc lấy dung dịch qua giấy lọc khô cho
vào 1 cốc khỏ sạch.

Đem nước lọc đo cường độ huỳnh quang trên máy huỳnh quang HOM. Dung
dịch mẫu thử và dung dịch riboflavin tiêu chuẩn được cho vào ciivet 0 , Ig N a 2 C0 ,
và 0 ,lg Na 2 S2 0 4 .2 H 2 0 và lại đo cường độ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang
chính xác của riboflavin đo bằng hiệu số.

220
 d. Tíỉììì kết quả:

ỉ làm lượng viiamin B2 (mg%) tính bằng công thức:

_ ( a - b ) .0 ,4 .V .1 0 0
C .V ,.G .1000

trong đó:

a: trị sô' máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch thử;

b: trị số m áy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch đã khử riboílavin;

c: trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch tiêu chuấn chứa
0,4 |jg riboAavin trong Iml;

0,4: lượng riboílavin của Iml dung dịch tiêu chuẩn, |ig;

V: dung dịch bình định mức, ml;

v,: thể tích dung dịch mẫu thử hút từ bình định mức để thí nghiệm , ml;
G: lượng cân mẫu, g;

1 0 0 0 : giá trị để chuyển từ Ị,ig sang mg.

221
 Chương 9
ALCALO IT V À PHENOL

9.1. CÁC CHẤT ALCALOIT

9.1.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA

Hợp chất alcaloit là một nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có chứa nhân dị
vòng và có tính kiềm, một sô' các chất trong nhóm này là những chất lưỡng tính.
Nitơ trong phần tử alcaloit tạo nên dặc tính cơ bản của loại hợp chất này.

A lcaloit có chứa trong nhiều loại cây. Chính các alcaloit này tạo ra tính chất
dược liệu hoặc tạo ra tính chất kích thích gây “nghiện” cho người sử dụng khi dùng
các sản phẩm ch ế biến từ các loại thực vật có chứa nhóm hợp chất này.

N ói chung các alcaloit có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, hoạt
động của tim, hoạt động của các cơ bắp và tàng cường sự hô hấp... Trong các
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật dùng để ch ế biến thực phẩm có chứa các alcaloit
khác nhau có thể kể đến: chè, cà phê, cacao, thuốc lá, côca, thuốc phiện...

V iệc xác định hàm lirợng alcaloit không những có ý nghĩa xác định chất
lượng sản phẩm mà còn phát hiện việc làm giả và trộn lẫn hàng giả vào các sản
phẩm nguyên gốc.

222
 9.1.2. NGUYÊN TẮC và các phương pháp tác h CHIẾT ALC ALO IT
TỪ THỰC VẬT

Các alcaloit do có tính kiềm nên trong thực vật chúng thường tổn tại ở dạng
muối với axit hĩai cơ. Do vậy có thể tách chúng ta ở dạng muối alcaloit hay ở dạng
bazơ alcaloit,

9.1.2.1. C hiết rút các alcaloit ỏ dạng muối

Chiết nguyên liệu thực vật có chứa alcaloit bằng nước hoặc rượu đã được
axit hoá bằng axit tactric (muối của alcaloit với axit tactric tan khá Irong rượu và
nước). Bước này tiến hành trong các dụng cụ chiết rút thông thường trên nồi đun
cách thuỷ.

Tiếp theo loại tạp chất và thu nhập alcaloit. Trong dung dịch chiết ở bước

một, ngoài alcaloit ở dạng m uối, còn chứa một lượng khá lớn tạp chất kèm theo như
protein, chất nhựa, tanin... Do đó phải loại bỏ tạp chất để có alcaloit tinh khiết hcm.

Cách tiến hành như sau: Kiểm hoá dung dịch đã chiết ra được sẽ làm cho
các m uối alcaloit chuyển thành bazơ alcaloit và dùng dung m ôi hữu cơ thích hợp để
trích ly sẽ loại bỏ được một số tạp chất nằm lại trong nước. Tuy nhiên trong dịch
chiết bằng dung m ôi hữu cơ này, ngoài bazơ alcaloit vẫn còn tạp chất. Đ ể tiếp tục
loại tạp chất, người ta loại axit hoá dung dịch bằng cách cho thêm dung dịch axit
tactric 1 - 5%. Lúc này toàn bộ bazơ alcaloit lại chuyển thành muối alcaloit và tan
vào lớp nước axit, tạp chất nằm lại trong lớp dung môi hữu cơ. Tách lấy lớp nước
axit, một lần nữa lại kiềm hoá dung dịch rồi trích ly lấy bazơ alcaloit bằng dung
m ôi hữu cơ. Đ ó là do các muối alcaloit dỗ tan trong nước còn bazơ alcaloit dễ tan
trong dung m ôi hữu cơ.
Sau bước này, các bazơ alcaloit đã tương đối tinh khiết, làm bay hơi dung
m ôi hữii cơ, phần còn lại ở dạng bột hoặc tinh thể, đó chính là các bazơ alcaloit
tổng số.
Muốn tách riêng từng cấu tử alcaloit phải xử lý qua các cột hấp phụ và
dùng các dung môi cơ thích hợp không tan lẫn nhau để tách tìmg loại alcaloit hoặc
bằng các phưcmg pháp hoá học khác.

223
 9.1.2.2. C h iế t r ú t các a lc a lo it ở dạng bazơ

a. X i’( ỉ ý nguyên liệ ii

Các chất alcaloit trong thực vật chủ yếu tồn tại ở dạng m uối. Muốn tách
chúng ở dạng bazơ phải xử lý nguyên liệu thực vật bằng kiềm.
Trong thực tế, thường dung các loại kiềm như: NH4OH, NaHCƠỊ,... Nếu
dùng kiềm mạnh có thể phân huỷ một sô' alcaloit. Tuy nhiên có một số alcaloit là
những bazơ khá mạnh, ở trường hợp này dùng kiềm yếu để tách chúng ra khỏi dạng
muối là chưa đủ, có khi phải dùng tới M gO hoặc NaOH. Vì vậy việc chọn dùng loại
kiềm nào, ở đây giữ vai trò quan trọng.
b. C ách tiến hành

Sau khi xử lý nguyên liệu thực vật bằng kiềm , dùng dung m ôi hữu cơ để

chiết rút lấy bazơ alcaloit, có kèm theo các tạp chất khác.
Làm sạch bazơ alcaloit và loại bỏ tạp chất bằng cách cho thêm vào đó một
lượng dung dịch axit để chuyển bazơ alcaloit thành muối alcaloit tan trong

nước - axit, tạp chất sẽ nằm lại trong lớp dung m ôi hữu cơ.
Tách lấy lớp nước - axit, sau đó lại kiềm hoá để chuyển m uối alcaloit thành
bazơ alcaloit và dùng dung môi hữu cơ để chiết rút lấy bazơ alcaloit, còn tạp chất sẽ

nằm lại trong lớp nước - axit.

Lặp đi lặp lại các bước trên nhiều lần cho đến khi thu được m ôi hữu cơ có

chứa bazơ alcaloit tương đối tinh khiết thì làm bay hơi dung m ôi hữu cơ sẽ thu được

bazơ alcaloit tổng số.

M uốn tách riêng từng cấu tử alcaloit ra khỏi hỗn hợp có thể dùng phương

pháp chưng cất phân đoạn hoặc các phương pháp khác.

9.1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ALC A LO IT

Trước khi phân tích định lượng phải chuẩn bị dịch chiết chứa alcaloit từ

nguyên liệu thực vật hoặc từ các hỗn hợp phức tạp, sau đó làm sạch, loại bớt tạp

chất, cuối cùng mới chọn phương pháp thích hợp để phân tích.

224
 9.13.1. Phương pháp trọng lượng

Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng cùa bazơ hay muốn alcaloit
sau khi loại bỏ dung m ôi.

Cáclì tiến lià iili: lọc dung dịch đã trích ly các alcaloit bằng clorofooc hoặc
ete vào bình đã biết uư ớc tr ọ i^ teọmgvTtòro sấy k b ô ipỊíiần còn lại
đến trọng lirợng không đổi, để nguội và cân.
9.1.3.2. P hư ơng p h á p th ể tích

Trong phương pháp này, phương pháp trung hoà được dùng phổ bịến hơn cả.
Cần chú ý các trường hợp sau đây: !

a. C huẩn độ các bazơ a lc a lo it I

Siiu khi trích ly các bazơ alcaloit bằng dung m ôi hữu cơ, làm ba^ hơi dung
m ôi, sau đó cho thêm vào m ột lượng dư dung dịch axit đã biết dung tíệh và nồng
độ. Các b azơ alcaloit sẽ bị hoà tan và chuyển thành m uốn alcaloit tương ệiig.
ỉ

Luợag axit dư đươc chuẩn đô bằng dung dịch kiềm với chất chỉỊthị mầu là
phenolphtalein (cách chuẩn độ này được gọi là chuẩn độ ngược hay chlịẩn độ gián
tiếp). Ị
I

Người ta còn có thể tiến hành chuẩn độ trực tiếp phần alcaloit còsị lại sau khi
đã làm Imy h ơ i dung m ô i bằng dung dịch a x it với chất chỉ th ị màu là im e ty l - da
cam.

h. C huẩn độ các m u ố i a lc a lo it

C íc dung dịch nước rượu của các m uối alcaloit được tạo thành từpác alcaloit
có tính bazơ yếu c ó đặc tính là không phản ứng với phenolphlalein vì có hằng số
phân ly rất nhỏ. Hơn nữa, khi có mặt rượu hằng sô' phân ly này còn thấp hcm. D o đó
có thể chuẩn độ chúng bằng kiềm với chỉ thị màu phenolphlein. Màu củà dung dịch
sẽ xuất hiện khi tất cả các bazơ được giải phóng ra khỏi m uối alcaloit, còn axit
được tạo ra từ m uối sẽ kết hợp với kiềm đã dùng để chuẩn độ, giọt kiềnị dư sẽ hiện
màu với thtiốc thử. ______1

Nếu bazơ alcaloit trong dung dịch nước - rượu có phản ứng với
phenolphtalein (ví dụ atropin) thì việc chuẩn độ các m uối bằng kiềm phải tiến hành
với sự có mặt của clorofooc vì cloroíooc sẽ hòa tan các bazơ alcaloit được tách ra

225
khỏi dung dịch muối alcaloit và một giọt kiềm dư sẽ phản i'nig màu với
phenolphtalein dấu hiệu kết thúc sự chuẩn độ.

9 .ỉ . 3.3. P h ư ơ n g p h á p k ết tủ a

Dùng các chất kết tủa khác nhau (thuốc thử Maier: H gl 2 + KI hoặc dung dịch
I2 trong KI) để chuẩn độ.

V í dụ: Cho dung dịch I2 đã biết nồng độ vào dung dịch chứa alcaloil trong
môi trường trung tính hoặc axit yếu, I2 sẽ tạo thành kết tủa với các alcaloit. Chuẩn
độ lượng I2 dư bằng dung dịch Na 2 S2 Ơ, với chất chỉ thị màu là hồ tinh bột.

Ngoài các phương pháp đã nêu ở trên, người ta còn định lượng alcaloit bằng
phương pháp đo độ hấp phụ ánh sáng. Trong trường hợp này thường dùng các phản
ứng màu được tạo thành do đặc tính của các nhóm chức khác nhau của các alcaloit.

9.1.4. PHẦN THỰC HÀNH

Bài I: Xác định cafein trong chè bằng phương ph á p trọng lượng

a. N gitvêii lắc

Caíein có trong chè thường tồn tại ở dạng muối với các hợp chất hữu cơ. Khi
xử lý nguyên liệu bằng NaOH hoặc NH 4 OH, cafein được giải phóng ra dưới dạng tự
do (dạng bazơ), đồng thời cũng tác chác hợp chất khác ra dạng tựdo. Sau khi dùng
KMn 0 4 để phá bỏ tạp chất, loại tanin, dựa vào tính hoà tan của caíein dùng
clorofooc để chiết lấy caíein. Dùng cloroíooc có thể làm cho một sô' chất khác, như
clorophin cũng bị chiết ra, cho nên phải dùng A 1 K(S 0 4 ) 2 để kết tủa và dùng vazơlin
để cuộn lấy kết tủa này và khi làm lạnh dung dịch chúng sẽ bám chặt vào thành
bình. Phẩn dung dịch còn lại là cafein hoà tan trong clorofooc, sau khi đuổi hêt
dung môi sẽ thu được cafein ở dạng tinh thể.

b. Hoá chất, dụng cụ

- Cát sạch hoặc bột thuỷ tinh

- Clorofooc tinh khiết

- Muối K A 1 (S 0 4 ) 2 tinh thể - chì axetat 10%

226
 - Vazơlin - 7’han hoạt tính - H 2 SO 4 20%

- KOH 25% - NH 4 OH 25%

- NaOH 10% - K M n 0 4 2%

- Bột chưng cất tuần hoàn và bộ thu hồi dung môi

- Nồi đun cách thuỷ - Phễu chiết loại 500 ml

- Bình tam giác 2 5 0 ml đã biết trọng lượng

- Ống đong loại lOOml

- Phễu lọc, bông hoặc giấy lọc

- Các dụng cụ thòng thường khác.

c.Tiến hành

Cân chính xác 2 hoặc 3 gam chè đã sấy khô, nghiền nhỏ cho vào bình tam
giác đã rửa sạch sấy khô. Cho thêm vào đó 4 - 5 gam cát sạch, khô hoặc bột thuỷ
tinh, lắc đều để bột chè và cát trộn lẫn nhau, phân phới đều trènđáy bình.

Dùng dung dịch NH4OH 25% nhỏ giọt tẩm ướt bộl chè (khoảng 5 - lOml),
sau đó đặt bình đun trên nồi cách thuỷ để tăng cường quá trình giải phóng cafein ra
dạng tự do và kết hợp đuổi hết N H 4 OH.

Sau khi đuổi hết N H 4 OH dư, cho thêm vào bình 90m l clorofooc, tiếp tục đun
trên nổi cách thuỷ có lắp ống sinh hàn trong 25 - 30 phút để cloroíooc chiết rút hết
caíein trong bột chè. Sau đó dùng bông để lọc lấy dung dịch, giữ bã lại trong bình
và dùng cloroíooc tráng rửa nhiều lần, dịch lọc tập trung vào bình tam giác dung
tích 500 ml (bình tam giác này đã có sẩn vazơlin) và4 - 5g K A 1 (S 0 4 )2 .Sau đó lắp
bình tam giác này vào bộ chưng cất đun cách thuỷ để thu hồi lại clorofooc, sau khi
đuổi hết dung m ôi, cho thêm vào đó 125ml nước cất, tiếp tục đung trên nồi cách
thuỷ cho vazơlin tan chảy hoàn toàn cuộn lấy tạp chất.

Sau đó làm lạnh dung dịch dưới vòi nước lạnh, khi làm lạnh chú ý nghiêng
xoay bình để vazơlin đã cuộn tạp chất bám chắc vào thành bình, lọc dung dịch sang
phễu chiết dùng nước cất tráng rửa bình và lọc tập trung vào phễu chiết.

227
 Sau khi lọc xong, cho thêm vào phễu chiết 3 - 5 ml KOH 25%, lắc đế kết tỉia
các tạp chất còn lại. Tiếp tục dùng KM 1 1 O 4 25% nhỏ giọt, khử tanin cho đến khi mất
màu vàng. Sau đó cho ihêm 25ml cloroíooc vào phẽu chiết, lắc dều trong 3 phút, lúc
này dung dịch có thể chuyển từ màu hồng nhạt sang màu xanh lơ, để yên cho dung
dịch phân lớp. Lóp dưới là lớp cloroíooc chứa cafein, gạn lớp này vào bình tam giác
dung tích 2 ỈOml đã biết trước trọng lượng. Tiếp tục dùng cloroíooc để chiết 'ửa dung
dịch còn lại nhiều lần và gạn lớp clorofooc tập trung vào bình tam giác.

Bình tam giác đựng cloroíooc có chứa caíein được lăp vào bộ chứng cất, đun
cách thuỷ thu hồi dung môi. Sau khi đuổi hết dung m ôi (dung dịch còn lạ 1 - 2 ml)
thì lấy bình, ra, để yên cho cafein kết tinh, sau đó đưa đi sấy khô ở nhiệt đ< 100"C -
1500"C tro ịg 2 giời. Cần và tính kết quả.

cl. T í ììì kết quả

trong đó:

a - t^ n g lượiig cafein thu được (g);

A - tịpng lượng chất khô của mău chè (g).

G hi đlìú: Các phương pháp tro n g lương khác

a. D m g dung dịch chì - axetat đ ể kết tủa tạp chất

Cân Bhính xác 5g chè đã sấy khô nghiền nhỏ ch o vào binh tam giá( 250m l,
cho thêm lOOml nước sôi và đun trên nồi cách thuỷ 4 5 phút. Sau đó lọc, phần bã
còn lại cho thêm 80 ml nước cất dun sôi, đun cách thuỷ thêm 30 phút. Cho thêm
vào đó 16 Ịnl dung dịch chì axetat kiềm tính 1 0 % để kết^tủa tạp chất, l l : đẻu và
dùng nước cất diều chỉnh đến vạch quy định (250m l). Sau khi lọc, lấy 200 Til dung
dịch cho vào bình chiết, dùng H2SO4 20% để khử lượng chì axetat dư. Sau 00 lọc và
đùng nước cất rửa kết tủa nhiều lần, lọc và tập trung dung dịch lọc sang bàt sứ, cô
đặc trên nồ cách thuỷ cho đến dung dịch còn lại khoảng 15 - 2 0 ml thì chuỵển sang
phễu chiết (qua phễu lọc), cũng tráng rửa bẳng nước cat hoặc clorofooc chiết rút
nhiều lần như bài một. Sau khi đuổi hết dung m ôi, ch o kết tinh, sấy khô và cân
lượng cafein.

228
 Tính kết quả.

cafein(% ) = ~ . I O O
V.A

trong đó:

a ^ trọhg íưỢng caíein thu được (g);

V - tổng thể tích dung dịch chè (ml);

V thể tích dung dịch đem phân tích (ml);

A - trọng lượng chất khô của chè (g).

b. D ù/Ig N a O H đ ể g iả i phóng cafein và khử tạp chất than hoat tín ề

G í i chính xác 3g chè đã sấy khô, nghiển nhỏ, cho vào bình tam giệc có dung
tích 150 m l, lắc nhẹ cho bột chè phân phối đều trên đáy bình. Dùng 5m l dung dịch
NaOH 10% nhỏ giọt thấm ướt bột chè. Đ ể yên 15 phút, sau đó cho ^ ê m 60m l
clorofooe, đun trên nồi cách thuỷ có ống sinh hàn trong 30 - 40 phút.

Sau khi đun xong, lọc qua bông hoặc giấy lọc thuỷ tinh, dùng clcaòĩooc tráng
rửa nhiểịl lần và lọc tập trung sang bình có dung tích 250 - 300 m l, lắc ^ều và cho
vào đó 1 - 2 g than hoạt tính (ở dạng bột và khô), tiếp tục lắc để khử tỊ|p chất cho
đến khi M i mầu clorophin. Ị

Sí,u đó lọc sang bình tam giác đã biết trọng lượng, dùng clorof 0 Ot tráng rửa
nhiều lu^ và lọc tập trung vào bình tam giác trên. Lắp bộ chưng cấl có thiu hồi dung
m ôi đun trên nổi cách thuỷ, sau khi đuổi hết dung m ôi, để yên cho cafeịn kết tinh,
sấy khô, cân và tính kết quả như bài 1 .

B ằi 2. Đ ịnh lượng cafein bằng phương pháp th ể tích

a. Nguyên tắc

Kqì dung dịch chứa cafein, nếu có mặt HCl thì dung dịch I2 tronệ KI có thể
làm cho toàn bộ cafein chuyển thành chất kết tủa ở dạng có công thú^ tổng quát
CfiH|||N4 K l 4 . Sau dỗ dung natrithiosiiníat (N a 2 S2 0 ,) đã biết nồng độ chTian lượng I2
biết được lượng I2 đã tham gia phản ứ:ig, từ đó tính ra lượng caíein có mặt trong
dung dịch thí nghiệm.

229
 b. H oá chất, dụng cụ

- Chì axetat kiềm tính d = 1,25 pha bão hoà trong nước;

- Dung dịch N aiSiO , 0,1N;

- Dung dịch I2 pha trong KI 0,1N;

-H C l tinh khiết d = 1,18;

- Dung dịch H 2 SO 4 20%;

- Hồ tinh bột 0,5% ;

- Nồi đun cách thuỷ ;

- Bình cầu các loại 250 m ỉ, 500ml;

- Bình định mức các loại: 250m l, 500 ml (5 chiếc);

- Pipet các loại: 10, 25, 50 ml;

- Buret và ống đo các loại 25, 10 ml;

- Các dụng cụ thông thường khác.

c. Tiến hành

Cân chính xác 5g chè đã sấy khô, nghiền nhỏ cho vào bình cầu dung tích
250m l, cho thêm vào đó 150 - 200 ml nước cất đun sôi và tiếp tục đun cách thuỷ
trong 45 phút cho đến khi bột chè lắng xuống hết đáy bình. Lọc dung dịch qua
phếu lọc bông, tráng rửa bã chè nhiều lần bằng nước cất đun sôi và lọc tập trung
vào bình định mức 500 m l, cất giữ làm dung dịch thí nghiệm.

Lấy chính xác 200 ml dung dịch chè cho vào binh định mức tích 250 ml, cho
thêm vào đó 4 - 5 ml dung dịch chì axetat kiềm tính d = 1,25 pha bão hoà trong nước,
dùng nước cất điều chỉnh đến vạch quy định, lắc đều , để yên trong 5 phút, lọc.

Lấy 200 ml dung dịch lọc cho vào bình định mức 2 (dung tích 250 m l), cho
thêm vào đó t^mg giọt H 2 SO 4 20% (khoảng 1,2 - 1,5 m l) cho đến khi không còn tạo
ra kết tủa trắng mới thôi.

Tiếp tục lấy 200 ml dung dịch lọc (lần thứ 2), cho vào bình định mức thứ ba
(dung tích 250 m l), cho thêm vào đó 10 ml HCl tinh khiết (d = 1,18), cho thật chính

230
xác 25 ml dung dịch I2 0,1N vào bình định mức, lại cho thêm 20 ml nước cất, lắc
đều đề yên 25 phút ở nhiệt độ 15“C, sau đó lấy ra dùng nước điều chinh đến vách
quy định, lắc đều và lọc.

Lấy lOOml dung dịch lọc lần Ihứ ba, nhanh chóng dùng Na 2 S2 Ơ 3 chuẩn lượng
I2 dư khi dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt, cho thêm vào đó 2 ml dung dịch
hổn tinh bột mới pha 0,5% , tiếp tục chuẩn độ bàng Na 2 S2 0 ^0,1N đã dùng bằng B.

Plìáỉì tícìì kiểm cììửng:

Lấy 203m l nước cất thay cho dung dịch chè và tiến hành các bước tương lự
như trên, bắl đầu từ lúc cho thêm HCl. Lượng Na 2 S2 Ơ 3 0,1N đã dùng ở thí nghiệm
phân tích kiểm chứng ký hiệu là A.

d. Tính kết quả.

( A - B ) .2 ,5 K .0 .0 0 5 2
c a fe in (% )= . 1 0 0

'2 5 0 '2 5 0 '2 5 0

trong đó;

A - sô' ml N a 2 S2 0 , 0,1N đã dùng trong phân tích kiểm chứng;

B - sô' tnl N a 2 S2 Ơ , 0 ,1 N đã dùng trong phân tích caíein;

K - hệ số điều chỉnh nồng độ của N a 2 S2 0 ,;

Nồng độ chuẩn
K= ---------- ^ ^ --------------------
Nồng độ pha thực tế

G - trọng lượng chất khô của mẫu chè;

2 , 5 - hệ số tính lượng dung dịch thí nghiệm so với lượng dung dịch chè đã
pha ch ế 0 ,0052 - Sô' g caíein ứng với 1 ml N a 2 S2 Ơ, 0,1N đã dùng dể chuẩn lượng I2
tham gia kết tủa caíein.

23
9.2. HỌP CHẤT PHENOL THỰC VẬT

9.2.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA CỦA HỢP CHẤT PHENOL THựC VẬT
• • •

Hợp cliấl phenol thực vật là một nhóm hợp chất tự nhiên có phổ biến trong
thực vật. Cfeúng quyết định đến hương vị, làm thay đổi màu sắc tự nhiên cịủa nhiều
loại sản pHẩm có nguồn gốc thực vật, ngoài ra chúng còn tham gia tạo hương thơm
đặc trưng àho một số sản phẩm thực vật.

Hợp chất phenol tạo vị đắng chát ở mức độ khác nhau của sản phẩm chè, bia,
vang quả óác loại rau quả và cả ở một số rượu đặc sản có sử dụng nguyên liệu thực
vật. Đặc biỂt hợp chất phenol thực vật, sau các phản ứng hoá học còn tạo ra màu sắc
đặc tnmg cịho thực phẩm: màu đỏ tươi của chè đen, màu xanh vàng của các loại quả
ép, màu \'ầaig nâu của thuốc lá, song hợp chất phenol thực vật cũng ỉàm 'thay đổi
màu sức tự nhiên của sản phẩm thực phẩm do quá trình oxy hoá tạo thành màu hoặc
do kết hợpỊvới các kim loại nặng. Trong quá trình ch ế biến thực phẩm có nguồn gốc
thực vật, cấc hợp chất phenol thường tham gia vào quá trình tạo chất thơni với các
axit amin và đường khử để tạo thành aldehyt bay hơi có mùi thơm.

Do l ó việc xác định hàm lượng các hợp chất phenol thực vật trong nguyên
liệu, sản pbẩm và theo dõi sự biến đổi hàm lượng của chúng qua các giai đoạn chế
biến, bảo cịuản có ý nghĩa quan trọng đối với việc thiết lập các ch ế độ công nghệ và
bảo quản thực phẩm cũng như đối với việc kiểm tra và đánh giá chất lượng sản
phẩm.

9 .2 .Í. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT PHENOL

9.2.Ỉ.Ỉ- Phương ph áp vật lý

ThirộBg sử dụng hai phương pháp phổ biến dựa trên các nguyên tắc:

a) L^ng dung m ồi hữu cơ thích hợp để chiết hợp chất phenol trực tiếp tìr
nguyên liệu ỔaỊC vậe hcổc chuyển hoàn toẳn các hợp chất phenol từ dung dịch chiết
bàng nước sang dung môi hữu cơ sau khi đã loại bỏ hợp chất, cho dung môi bay hơi
sẽ thu được hợp chất phenol ở dạng tinh khiết, sấy khô, cân sẽ thu được hàm lượng
của chúng.

232
 b) Dùng dung dịch các muối kim loại nặng (thường dùng chì - axetat) để kết
tủa hợp chấl phenol từ dung dịch chiết bằng nước thực vật, lọc lấy kết tủa, làm sạch
tạp chất sấy khô kết tủa, cân, từ đó suy ra trọng lượng hợp chất phenol và tính ra
được hàm lượng của chúng.

9 .2 .2 ^ Phượng p h á p hqá học __________

a) Cfeuẩn độ trực tiếp các hợp chất phenol trong dung địch chiết fa được từ
thực vật bằng dung dịch KM nƠ 4 trong môi trường axit với chất chỉ t|iị màu là
indigocacỊãB.

b) (phuẩn độ gián tiếp lượng iod dư sau khi tác dụng với hợp c|(ất phenol
trong dun^ dịch bằng NaiSỊƠ , trong môi trường kiềm với chất chỉ thị mà |à hồ tinh
bột. '

9.212.3. Phương p h á p hoá lý

ThiỆBg dùng phương pháp sắc ký trên giấy. Phương pháp này chủỊyếu dùng
để tách riệng từng cấu tử trong hỗn hợp các chất phenol thực vật và xác Ịđịnh hàm
lượng riên^ của từng cấu tử.

Ngiịllyên tắc chung là dùng etanol tinh khiết chiết lấy hợp chất pẳienol thực
vật, sau đ|s c ố định chúng trên giấy sắc ký, dùng hỗn hợp dung môi thíf h hợp để
tiến hành ly từng cấu tử của hợp chất phenol, sau khi tách riêng được từng cấu
tử người xác định hàm lượng của chúng bằng phương pháp so màu. i

9.2.^. PHẦN THỰC HÀNH

1ị
; '
ị
Trobg phần này giới thiệu các bài thí nghiệm xác định hàm lượnậ các hợp
chất phemil, các cấu tử của hỗn hợp các hỢp chất phenol và các sản phÉii oxi hoá
có màu ciịa chúng vẫn còn bản chất plieiiol, ớ d áv lấy nguyèn liêu ban đáu la cliè tlế
làm v í dụ.ị I

Bàầ 3 . Đ ịnh lượng tanin chè bằng phương ph áp trọn g lượng I

Ị (
a. Ĩ^Miiyên tắc i

Tanin chè có tính tan trong etylaxetat không tan trong cloroíorm và benzen,
còn nhữiig chất khác trong chè như caíein... lại không tan trong etylaxtat hoặc chí
tan rất ít. Dựa vào các tính chất này, người ta dùng etylaxetat đế’ chiết lấy tanin chè.

233
Sau đó làm sạch dung dịch chiết bàng cách cho thêm vào đó một lượng cloroíorm
(cloroíorm không tan trong etylaxetat) để chuyến caíein tan trong cloroíbrm mới
cho thêm. Đ ể yên cho phân lớp và tách lấy etylaxtat có chứa tanin chè, sau khi đuổi
hết dung m ôi sẽ thu được tanin chè ở dạng tinh khiết.

b. Dụng cụ, ìioá chất

- Cối nghiền chè hoặc cối xay cà phê;

- Rây số 4 (đường kính lỗ 0,25 mm);

- Cân phân tích;

- Bình cầu dung tích 500ml;

- Bình định mức, dung tích 250 ml và 500 ml;

- Phễu lọc và giấy lọc (hoặc bông trắng);

- Bình tam giác các loại;

- Nồi đung cách thuỷ và ống sinh hàn;

- Bình gạt dung tích 1000 ml;

- Bình nước đá, tủ lạnh, tủ sấy, máy cất hơi nước trong dụng cụ chưng cất,
máy lọc chân không;

- Etylaxetat tinh khiết;

- Cloroíorm, benzen tinh khiết;

- Natri sunfal tinh thể.

í'. Tiến lùinlì

Chuẩn b ị lioá chất và dung d ịc ìi:

- Đ ể đảm bảo độ tinh khiết cao của các hoá chất đem dùng, cẩn phải đem
etylaxetat và benzen đi làm khô hết nước bằng natri sunfat tinh thể. Cír 100 gam
natri suníat cho vào 1 0 0 0 ml dung dịch trên, để một ngày đêm cho híu hết ẩm, sau
đó gạn lọc lấy dung môi.

- Pha ch ế dung dịch chè: Lấy 30 gam chè đã nghiền nhỏ và sấy khô, dùng
nước số pha chè trong bình cầu, đun tiếp trên nồi cách thuỷ 45 phút, cứ 10 phút lắc

234
Iihẹ một lần cho đến khi bột chè lắng hết xuống đáy bình (lượng nước cất đun sôi
ban đầu để pha ch ế khoảng 800 ml).

Lọc diiỊig dịch chè qua phều lọc, tráiig bã chè nhiều lần bàng nước cất đun
sôi, lập trung các dung dịch chè đã lọc pha thành 1 2 0 0 ml dung dịch, sau đó cất giữ
dung dịch để tiến hành các bước sau.

ĩ i ế i i hanh:

Lấy chính xác 6 0 0 ml dung dịch chề đã pha ch ế ở trên cho vào bình chiết gạn
có dung tích 1 0 0 0 m l, cho thêm vào đó 1 0 0 ml beiizen để loại bỏ chất béo và các
chất khác có trong chè. Sau khi cho benzen, lớp dung dịch còn lại được đổ ra chén
sứ đun cách thuỷ đuổi hết benzen còn sót lại sau đó đổ lại dung dịch vào bình chiết
gạn, cho thêm vào đó 100 ml etylaxetat để chiết lấy tanin chè. Lắc nhẹ bình chiết
gạn và đều tay trong 5 phút. Đ ể etylaxetat tiếp tục chiết lấy tanin chề còn lại trong
lớp nước từ 5 đến 6 lần cho đến khi dung dịch etylaxetat gạn ra có độ trong suốt
như ban đầu.

Tập trung tất cả các dung dịch etylaxetat có chứa tanin chè vào bình cầu, đun
cách thuỷ đuổi dung m ôi và khi thấy dung dịch chi còn lại 1/5 thể tích ban đầu thì
chuyển sang bình đã chứa sẩn cloroíorm, tráng rửa bình cũ nhiều lần bằng
etylaxetat. Sau đó lắc đều để cloroĩorm , chí lấy lớp etylaxetat có chứa tanin đưa đi
lọc qua máy lọc chân không. Sau đó đun cách thuỷ hết dung môi sẽ thu được tanin
chè.

Tanin chè thu được ở dạng bột màu vàng nhạt. Sau đó đem ch ế biến đi sấy
khô ở 60"C trong 30 phút, rồi nâng dần nhiệt độ lên 90 - 95‘’C cho đến khi trọng
lượng không đổi. M uốn tránh cho tanin chè khổng bị oxi hoá phải sấy khô irong tủ
sấy chân không.

d. T íiili kết c/iiả:

Hàm lượng tanin chè theo % trọng lươiig chất khô tính như sau:

X = ^ .lõ o
A.v

trong đó:

235
 a^trọng lượng lanin chè thu được trong mẫu đem phân tích (g);

A - trọng lượng chất khô của mẫu đem phân tích (g);

V - thể tích dung dịch chè đem phân lích (ml);

V - tổng thể ích dung dịch chè pha ch ế (ml).

B ^ 4 : Đ ịnh lượng tanin chè bàng phương ph á p chuẩn độ KM ìĩú^

I

a. ^Nguyên tốc

TsỊiÉi chè là một hỗn hợp phức tạp gồm các hợp chất phenol ỔCKIi giản phân
tử thấp \% hợp chấl poliphenol phân tử lớn. Tanin chè rất dễ bị o x i hoá ^ởi KMĨ1 O 4
trong mcỊi trường H 2 SO 4 có mặt chất chí thị màu indigocam in. Sau khi o x ỵ hóa hoàn
loàn, cácỊ hợp chất phenol tiếp xúc oxy hoá chất chỉ thị màu làm mất mằị\ xanh của
dung áịcÍL
\ '
b. B ụ n g cụ, lio á chất
I

- ( iđ ĩ nghiền xay chè hoặc cối xay cà phê, rây số 4 (0,25m m );

- (ịlitai phân tích, tủ sấy;

- l|Ếnh cầu dung tích 500 ml;

- m định mức loại 250 ml và 500 ml; ;

lọc và giấy lọc (hoặc bông trắng); I

- t e tam giác các loại;

- ỉ^ồi đun cách thủy và ống sinh hàn;

I 1

- sứ tráng m en loại 1 0 0 0 ml; ị

- I ^ e t đựng KM nƠ 4 0 ,1 N , inđigocamin; ỉ

- ĩ^ìpet 1 0 ml;

- l ỉ U g dịch indigocam in 0,1N trong H 2 SO 4 (cứ 1000 ml dung d ịth chất chỉ
thị 0 , 1

236
 c. Tiến hành

C litiẩ ii b ị d iiììg d ịclì chè:

Mẫu chè đem phân tích được sấy ở nhiệt độ 50‘’C - 60"C cho đến khô, nghiền
hoặc xay nhỏ và rãy qua rây tiêu chuấn.

Tỷ lệ pha c h ế ; 2g ch è/250 ml nước cất

i

hoặệ : 3g ch è/500 m l nước cất

i

Chd 3 gam chè đã nghiền nhỏ và bình cầu dung tích 500m l, cho thê n vào đó
300 ml n ir ^ cất đun sôi, đun tiếp trên nồi cách thuỷ khoảng 45 phút, tron|> khi đun
cứ 1 0 phúỊ lấc bình m ột lần, đun cho đến khi toàn bộ chè lắng chìm xuống đáy
bình. I

Diinịl dịch chè đang còn nón g được lọc bằng g iấ y lọc hoặc bông B ắn g sang
bình định ^ ứ c 5 0 0 m l, dùng nước cất đun sôi tráng rửa bã chè nhiều lần v | lọc sang
bình định taức, cuối cùng dùng nước cất điểu chinh mức dung dịch đến ịvạch quy
định. Cất á ữ dung dịch chè để đưa đi phân tích.

C ln Ỉấ ii độ kiểm chứng:

Cho vào bát sứ to một lượng nước 750 ml và 25 m l dung dịch indiậocacm in
0,1% tro n í m ôi trường axit. Dùng dung dịch KMnƠ 4 0 ,1 N chuẩn độ ch() đến khi
mất màu x Ịm Ii. G h i kết quả (k ý hiệu A m l K M n Ơ 4 0,1N )

Chaẩn độ tanin trong chè

Cho vào bát sứ to; 7 5 0 ml nước, 25 ml dung dịch indigocam in 0,1 % trong
môi trườriị[ axit và lOml dung dịch chè đã chuẩn bị ở trên. Dùng dung dịcn KM n 0 4

0 , 1 N chuấÌB đô chính xác đến mất màu xanh của dung dịch (lúc này dung dịch
chuyển saỊig màu vàng nhạt), ghi lại kết quả (k ý hiệu B m l dung dịch K M n 0 4
0,1N )

d. T hh kết quả

HàmTỮOTĨ^tãHn cHẽ tuiTi ĩĩiẽõ ^ lrộ n g lữợĩĩg chấrKHỗ

V .K .M .(B -A )
x= .100
V.G

237
trong dó:

V - tổng thể tích dung dịch chè đã pha ch ế (ml);

V - thể tích dung dịch chè đem phân tích;

K - hệ số tính tanin tương líng với 1 ml KMnƠ 4 ;

K = 5,83 m g /lc c KMnO^ 0,1N hay K = 0,00583 g / / ;

M = nồng độ thực / nồng độ chuẩn;

G - trọng lượiig chất khô của mẫu chè đem pha ch ế dung dịch (g);

(B - A) - hiệu số lượng KMnƠ 4 dùng để chuẩn độ dung dịch chè và dung

dịch kiểm ch ứ n g.

B à i 5 : Đ ịn h lư ợ ng calechỉn tro n g hỗn hợp ta n in chè

Tanin chè là một hỗn hợp chất phenol chiếm khoảng 30% trọng lượng chất
khô của chè. Tanin chè gồm các nhóm catechin, antoxantin, antoxianidin, các axit
phenol cacboxylic v .v ... Trong đó nhóm chất catechin chiếm trên 90% tổng lượng
các hợp chất phenol của chè. Người ta có thể tách riêng từng chất catechin bằng
phương pháp sắc ký trên giấy và định lượng chúng bằng phương pháp xác định mật
độ quang học của chúng.

a. Nguyên tắc

Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: cân chính xác Ig chè đã sấy khô và nghiền
nhỏ cho vào bình cầu có dung tích 100 m l, cho thêm 20 - 25 ml etanol 96% đun
tuần hoàn trên nồi cách thuỷ trong 45 phút. Sau đó lọc qua giấy lọc, dung dịch thu
được chuyến sang bình định mức có dung tích 25 m l, làm nguội, dùng etanol 96%
điểu chỉnh đến vạch quy định. Lắc đều, cất giữ làm dung dịch thí nghiêm.

Chuẩn b ị giấy và cììấm m ẫu:

Giấy sấc ký dùng để chấm mẫu thường gồm hai loại:

- Loại thứ nhất: cắt theo hình chữ nhật, dùng trong phương pháp treo đứng.
Kích thước giấy có thể thay dổi phụ thuộc vào yêu cầu thí nghiệm và kích thước
thùng sắc ký. Nói chung thường dùng loại kích thước 8 X 60 hoặc 10 X 60 cm.

238
 - Loại thứ hai: Cắt theo hình tròn trong pliirơng pháp đặt nằm ngang. Thường
dùng kích thước của giấy có đường kính 20 - 25 cm.

Trên mỏi loại tờ giấy sắc ký có thể chấm mẫu tại điểm đối với loại treo và 8

điểm mẫu đối với loại nằm ngang, mỗi điểm chấm 0,025 ml dung dịch thí nghiệm.
Để bảo toàn phân ly và tách biệt được các cấu tử trong hỗn hợp tanin chè cần chấm
mầu gọn trong phạm vi hẹp với đường kính điểm chấm 0,5 cm , cần phải tiến hành
chấm nhiều lần cho một điểm mẫu, vì vậy phải dùng micropipet loại 0,005 ml và
khi châìn mầu phải liên tục thổi khô mẫu chấm bằng luống không khí lạnh khô, tốt
nhất là luồng khí nitơ.

Chú ý: V ị trí chấm mẩu trên giấy sắc ký quy định như sau:

- Loại giấy treo đứng: cách biên ngang > 10 cm và cách biên dọc > 2cm

- Loại siấ y đặt nằm ngang: cách tâm > 5 cm, tại tâm của tờ giấy có rạch một
vạch dài 1 - 1,5 cm để cắm bấc hút dung môi khi tiến hành phân tích.

h. Tiến hành

Bình sắc ký hoặc thùng sắc ký nên tạo độ chân không là 240 mm thuỷ ngân.
Cho dung dịch đã bão hoà dung m ôi vào đáy bình hoặc đáy thùng sắc ký, sau đó đổ
dung môi vào hộp chứa hoặc máng chứa.

Hỗn hợp dung m ôi có tỷ lệ như sau:

- 80 ml butylic 95%;

- 2 0 ml axit axetic 1 0 0 %;

- 25 ml nước cất.

Sau đó đặt giấy sắc ký dạng tròn đã cắm bấc chạm hộp chứa dung môi hoặc
treo giấy sắc ký dạng hình chữ nhật nhúng vào máng dung m ôi, đậy kín nắp bình
hoặc thùng sắc ký, sau khi rút không khí ra và cho ngay khí nitơ vào thì quá trình
phân tích được bắt đầu. T h ờ i gian phân tích được kéo dài từ 8 - 12 giờ, trước khi
dung m ôi thấm đến gần mép giấy thì kết thúc và thổi khô giấy sắc khí ngay ở nhiệt
độ cùa phòng.

239
 XÍIC đ ịiili các cấu tử cutecliiii

Sau khi phân tích xong, tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm mà tiến hành phân
tích định tính hay định lượng catechin.

Nói chung, mỗi lần thí nghiệm đều tiến hành cả định tính và định lượng
catechin. V ì vậy, ngữời ta đem gỉấy sấc klíí đã ttó i vào soi duới (lén tluỳnh quang,
dùng bút chì khoanh lại hình dáng của các nhóm điểm mà qua phân tích sắc ký đã
phân lý địíỌC. Dựa vào hình đã khoanh được bằng bíit chì, cắt riêng từng ihành giấy
chứa mẫu để dùng vào việc xác định catechin sau này. 1

Đ ịnh tính catechin

Từng loại catechin sau khi đã được phân tích sắc ký trên giấy sẽ íiọp thành
từng nhóm điểm riêng biệt, vị trí của từng nhóm điểm đó phục thuộc vào' giá trị R|
của từng loại catechin (Rf là tỷ sô' giữa khoảng cách tính từ điểm chấm ban đầu
đến mép cuối của dung m ôi đã thấm ra). -

NhẸtog nhóm điểm này có thể hiện màu với dung dịch m uối sắt hệá trị cao,
vanilin liQậc hỗn hợp dung dịch H N O rA g-A m oniac cho kết tủa tốt nhất.

ở bặi thí nghiệm này, người ra phun hỗn hợp dung dịch H N O rA gịA m oniac
lên giấy sắc ký, sau khi các nhóm điểm đã hiện màu đen xám rõ rệt, nguệi ta đem
giấy sắc k ý đi sấy khô ở nhiêt đô 80"C, cuối cùng dung dịch natri thiosunịfat 1% để
rửa bằng cách ngâm trong dung dịch này 2 - 3 phút, sau đó dùng nước cấtỉrửa nhiều
lần. Sau Iđú sấy khô sẽ thu được ảnh của các catechin. Những nhóm điểnị màu này
khi đã khộ sẽ có màu đen thẫm, có thể chụp ảnh được để làm tài liệu.

Đ ối VỚI dung dịch chè, nói chung, trên m ỗi điểm mẫu chấm ban dMu, sau khi
phân tích sắc ký, phân ly ra dược và hiện lên 5 nhóm điểm, lần lượt tương LÌmg với:

D í , - Epicatechingalat có Rr = 0,85 ị

2) L - Epigalocatechingalat có R| = 0,73

3) L - Epicatechin + D, L - catechin có Rị = 0,61

4) D, L - galocatechin có R| = 0,51

5) L - Epigalocatechin có R| = 0,43

240
 Chương 10
MỘT SỐ CHẤT VÔ C ơ G Â Y ĐỘC
■ ■

10.1. GIÓI THIỆU

Các chất độc hoá học gây độc với cơ thể con người có thể có trong lương
thực, thực phẩm thường phải kể đến các kim loại nặng như: đồng, chì, kẽm, thiếc,
các hợp chất chứa asen, các hợp chất chứa flo ......

Thực phẩm có thể bị nhiễm các chất độc nói trên từ nhiều nguồn khác nhau:
nguồn nhiễm độc đầu tiên là do trong quá trình sản xuất hoặc bảo quản thực phẩm
đã sử dụng không đúng nguyên tắc các dụng cụ chứa đựng, hoặc các thiết bị ch ế tạo
từ sắt được tráng kẽm và đồng. Đặc biệt là đối với những thực phẩm chứa một
lượng khá lớn axit hữa cơ như các loại rau quả muối chua, nước quả, bột quả, các
đồ hộp quả, nước uống lên m en ...

Các đồ sành sứ, tráng men chứa lượng chì m onooxyt cao dễ gây nhiễm độc
chì cho thực phẩm nếu chúng được dùng để chứa đựng thực phẩm. Các đường ống
dẫn thường được phủ một lớp chì để chống gỉ, lượng chì này có thể đi cùng với
nước vào thực phẩm ....

V iệc sử dụng các bình mạ thiếc trong sản xuất thực phẩm cũng dễ gây nhiễm
độc thiếc cho thực phẩm, ở các xí nghiệp bánh kẹo, đồ hộp .... có những bộ phận
sản xuất các sàn phẩm thực phẩm có độ axit cao do vậy bình mạ thiếc rất dể bị phá
huỷ là cho thiếc lẫn vào thực phẩm.

Trong nông nghiệp, việc sử dụng các thuốc trừ sâu là hợp chất chứa asen và
các thuốc diệt côn trùng trong các kho thóc, gạo....cũ n g có thể là nguồn asen đưa
vào lirơng thực, thực phẩm

241
 Những nhà m áy sản xuất nhôm , phân lân (supepliotphat), thuốc Irừ s â u ....
thường thải khí hydro tlorua (IỈ2F). Chất H ịP này dề bay hơi làm nhiễm bẩn m ôi
trường nước đất, cây cối bao quanh khu vực nhà m áy. D o đó sản phẩm lương thực,
thực phẩm của các vùng xung quanh các nhà m áy nói trên có thể bị nhiễm độc flo.

N ói chung, các luơng thực, thực phẩm nhiễm các chất độc trên thường c ó vị
tanh kim loại. N gười ăn phải các sản phấm chứa chất độc sẽ gặp những triệu chứng
như: xám lợi, nôn mửa, nhức đầu, rối loạn tiêu hoá nặng. Trúng độc liều cao c ó thể
gây nguy hiểm tới tính mạng.

Hàm lượiig tối đa cho phép của một số kim loại nặng hoặc dư lượng thuốc trừ
sâu ch o phép được nêu trong tiêu chuẩn và an toàn thực phẩm . Sau đây là đặc điểm
của m ột số chất vô cơ gây độc :

Đ ồn g (Cu) là một thành phần cần thiết của khẩu phần ăn với liều lượng hàng
ngày 0 ,0 3 3 m g đến 0,05m g/k g thể trọng. V ới liều lượng này không thấy tích luỹ
đồng trong cơ thể. Với liều lượng lớn hơn có thể gây những triệu chứng ngộ độc
cấp tính nhimg không c ó dấu hiệu gì đồng gây ung thư ch o con người, ở nồng độ
nào đó có thể làm ảnh hưởng tới vị và giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Hàm lượng
đồng tối đa trong thực phẩm qui định tạm thời là 0 ,0 5 m g /k g thể trọng trong một
ngày.

Chì (Pb): là một thành phần không cần thiết của khẩu phần ãn. Trung bình
hàng ngày trong khẩu phần ăn có lẫn từ 0 ,0 0 3 - 0 ,0 0 5 m g ch ì/k g . N goài ra có thể có
thêm khoảng 0 ,0 0 13m g chì/kg từ không khí bị nhiễm bẩn. T h eo nhiều tác giả luợng
chì gây độc tích liiỹ từ l-2 m g . Với liều lượng cao hơii ch ì sẽ g â y n gộ độc cấp tính.
V ới liều lượng thấp hơn, nhưng ăn rải ra nhiều ngày dễ bị n g ộ đ ộc hơn. Liều lượng
chì tối đa có thể chấp nhận hàng ngày do thực phẩm đưa vào c ơ thể quy định tạm
thời là 0,005rr.g/kg thể trọng.

T hiếc (Sn): là thành phần bình thường của khẩu phần ăn, không c ó chức năng
sinh lý gì, tính độc hại thấp, ở châu Âu và Bắc M ỹ người ta tính ra rằng : một người
m ột ngày c ó thể ăn từ 2-4 m g thiếc. Với liều lượng này, hầu như không có sự tích
luỹ thiếc trong cơ thể và không có dấu hiệu gì chứng tỏ về lâu dài thiếc gây độc hại
với cơ thể con người.

242
 Kẽm (Zn) là thành phần lự nhiên của thức ãn và cần thiết cho đời sống con
người. Một kháu phần cung cấp hằng ngày lừ 0,17-0,25m g kẽin/kg thế trọng. Nói
chung cOng chưa có số liệu cụ thể về liều lượng kẽm gây nhiễm độc cho cơ thể
người.

Asen fA s) còn gọi là thạch lín, có tự nhiên trong thực phẩm. Nhưng các hợp
châì vô cơ cLÌa asen với liều lượng cao rất độc. Nếu ăn phải loại thực phấm nhiẻm
asen hoặc do tiếp xúc với asen thì có thể bị nhiễm độc mãn tính. Do vậy nhiều nước
trên thế giới đã qui định giới hạn liều lượng sen tối đa trong thực phẩm. Người ta
xác định rằng nếu hằng ngày hấp thụ vào cơ thể từ 0,007-0,6 mg asen/kg thể trọng
thì không bị nhiềm độc. Nếu nhiễm asen qua máu sẽ độc hơn rất nhiểu so với qua
đường tiêu hoá. Liều asen gây chết người sau 24 giờ là 2m g/kg Ihể trọng.

Các kim loại nạng trong lương thực thực phẩm thường đựơc xác định theo
phương pháp "Ditizon". Ditizon (diphenyl thiocacbazon) có công thức:
H
N -N --C H ,
H ^ '
s=c

Ditizon tan trong cacbon tetraclorua và cloroíorm tạo thành dung dịch có
màu xanh lá cây, ở dạng phân tử trong môi trường axit hoặc trung tính ditizon rất
khó tan trong nước. Dung dịch càng có phản ứiig kiềm thì độ tan của dilizon càng
tăng do tạo thành anion Dz

HDz = Dz+H^

(dung m ôi) (nước)

Ditizon tạo với ion nhiều kim loại những ditizonat có màu ít tan trong nước
trong cacbon tetraclorua hay cloroíorm.

Các ditizonat có thể tồn tại dưới hai dạng, tiiỳ vào độ axit của môi truờng:

- Trong m ôi trường axit hay trung tính chúng tồn tại dưới hai dạng xeto;

- Trong môi trường kiềm chúng tồn tại dưới dạng enol.

243
 H
N N N N CaHs

s c M, M. s c M.

N N N N C ^H j

Dạng xeto Dạng enol

Dạng enol thường ít tan trong cacbon tetraclorua hay cloroữorm .

Phản ứng cân bằng chính xảy ra khi chiết:

M"* + nHDz = MDz + nH"

(nước) (dung môi) (dung m ôi) (nước)

Ngoài ra còn phản ứng:

+ Dz = HDz pK, = 8,7

(nước) (dung môi)

Hiện nay phương pháp ditizon được dùng rộng rãi để xác định các độc tố kim
loại trong lương thực thực phẩm;

Bảng 10.1 ghi các giá trị pH chiết được hoàn toàn các ditizonat của một vài
kim loại thường có thể lẫn trong thực phẩm.

Bàng 10.1. Nguyên tố kim loại và pH dung dịch chiết

pH
Nguyên tố Điểu kiện màu của ditỉzonat Dung môi chiết
chiết hoàn toàn

Đổng (Cu++) Môi trường axit, đỏ, tím. 2-5 CCl,

sắt (Fe++) Môi trường kiềm, đỏ, tím. 7-9 CCI,

Chì (Pb++) Đỏ 7-10 CCI,

Thiếc (Sn++) Đỏ 5-9 CCI4

Kẽm (Zn++) Đỏ 6-9 CCI4

244
 Các giá trị pH chiết hoàn toàn ditizonat nói trên chỉ là gần đúng vì pH này
phụ thuộc vào các điều kiện chiết như: tỷ số thể tích hai dung môi chiết, lượng
thuốc thử dư, các anion có lẫn trong dung dịch và lực ion của dung dịch.

10.2. THỰC HÀNH

B à i 1. C hẩn bị d u n g dịch đê xác đ ịn h đổng, chỉ, kẽm, thiếc

Đồng, chì, kẽm, thiếc có trong thực phẩm với lượng nhỏ nên muốn xác định
chúng cần phải vô cơ hoá mẫu thực phẩm. Có hai phương pháp vô cơ hoá mẳu.

Phương pháp khô

a. Dụng cụ, lioá chất

- Capxun dung tích 250m l - Bếp cách cát

- Pipet lOOml - Bếp điện

- Bình định mức 250m l - Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (600-700"C)

- Cân kỹ thuật - Magie dioxyt (M g 0 2 )

- Phễu - Canxi axetat CaíCH^COO) 2

- Giấy lọc - Axit nitric đậm đặc (d = 1,4)

b. Cách tiếu hành

Dùng pipel lấy chính xác lOOml thực phẩm (nếu là sản phẩm lỏng), hoặc cân
lấy lOOg thực phẩm (nếu là sản phẩm khô) cho vào capxun. Thêm vào capxun 0,5g
M gƠ 2 và 0,5g Ca(CH.,C0 0 ) 2 để tăng tốc độ vô cơ hoá và chống việc tạo thành các
hợp chất bay hơi của kim loại nặng khi vô cơ hoá mẫu. Các chất này nhất thiết
không được chứa thiếc, đồng, chì. Đạt capxun lên bếp cách cát, đốt cho thực phẩm
cháy thành than. Đặt capxun vào lò nung ở nhiệt độ 600 - 700"C đến kh i thực phẩm
biến hoàn toàn thành tro xám (mất khoảng 3 giờ). Lấy capxun ra khởi lò nung để
nguội. Cho vào capxun 20m l axit nitric đậm đặc (tuyệt đối không chứa đồng và chì)
và 50ml nước cất hai lần. Đặt capxun lên bếp điện đun cho tan hết muối bám ở
capxun đun sôi thêm 10 phút nữa (tiến hành trong tủ hút). Chuyển toàn bộ dung
dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250m l. Tráng rửa capxun nhiều lần

245
bằng nước cất hai lần, nước tráng cũng chuyển vào bình định mức. 'rhêm nước cất
đến vạch mức lắc kỹ.

Phương pliáp ướt

a. Dụng cụ: Như đã nêu ở phần trên

b. Hoá chất :

- Axit nitric đậm đặc (d = 1,4)

- Axit suníuric đậm đặc (d = 1,84)

- Am oni axetat NH^CHiCOO

c. Cách tiến lìà iìli:

Lấy lượng mẫu như trên cho vào capxun. Thêm vào capxun 3ml axit nitric
đậm đặc và 50ml axit sunĩuric đậm đạc. Đặt capxuii lên bếp điện, đun xôi dung
dịch trong capxun. Vẫn tiếp tục đun và cứ mỗi phút lại nhỏ thêm 5-20 giọt axit
nitric đậm đặc. Quá trình phải làm trong tủ hút bởi khí mầu nâu sẽ thoát ra.

Nếu thấy mầu dung dịch trong capxun thẫm lại thì phải tăng tốc độ nhỏ axit
nitric đậm đặc. Khi dung dịch trở lên nhạt màu thì giảm tốc độ nhỏ axit nitric cho
đến khi dung dịch trở thành không màu thì dừng lại. Tiếp tục đun cho khói trắng
bốc đi hết rồi lại tiếp tục đun sôi thêm 10 phút nữa. Nếu sau đó dung dịch vẩn giữ
không màu thì việc vô cơ hoá mẫu đã xong. Nếu dung dịch đen trở lại thì lại tiếp
tục nhỏ thêm axit nitric cho đến khi dung dịch trở lại không màu. Lấy capxun ra
khỏi bếp điện cho vào capxun 0,2g amon axelat, khuấy cho tan hết. Chuyển toàn bộ
dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250m l thêm nước cất hai lần đến
vạch mức, lắc kỹ. Nếu dung dịch trong capxun bị clục ihì phải lọc trước khi chuyển
vào bình định mức.

G hi chú: Phưcmg pháp đốt khô nói trên có thể xác định được đồng và chì
cũng được thừa nhận đế xác định thiếc. Dùng MgƠ 2 để giải phóng ra oxi hoạt động,
giúp oxi hoá nhanh các chất hữu cơ. Ca(CH,C 0 0 ) 2 đóng vai trò phá vỡ M gƠ 2 , làm
tăng lượng oxi hoạt động phóng vào chất hữu cơ do đó làm tăng tốc độ đôì. Cũng
có thể dùng M g(CH 3 COO)j và NaCl, M g(CH,C 0 0 ) 2 và Ca(CH,CO O ) 2 ; NH,C1 và

246
NaCl; (N H 4 )2 C O ,...T u y vậy hổn hợp MgOs và Ca(CH,COO ) 2 với tỷ lệ 1:1 làm cho
tốc dộ đốt chất hữu cơ nhanh nhất.

Nếu đốt khô không dùng hỗn hợp MgO; và canxiaxelat, thì muối thiếc dễ
bay hơi và một phần Sn nằm dưới dạng không tan là axit P-metastanic. Sự mất thiếc
trong đốt khô như vậy có thè’ từ 2,7-77,6% .

B à i 2. X ác d ịn h c h i bằng ph ư ơ n g pháp chiết chu ẩn độ

a. Nguyên lắc

Trong m ôi trường trung tính hoặc kiềm, ion chì (Pb^"^) tạo với ditizon thành
chì ditizonat màu đỏ tím trong dung dịch dung môi hữu cơ

Pb'" + 2 H 2 Dz = Pb(HDz ) 2 + 2 i r

V ì Pb(H Dz ) 2 tan rất ít trong dung môi hữii cơ, khi đó khi dùng môi trưòng
trung tính thì tốt nhất nên dùng nồng độ của ditizon trong cacbontetra clorua là
SOịì.M (microphân tử gam: 12,81m g/lít). Trong clorofom, Pb(H Dz ) 2 tan gấp 17 lần
trong cacbon tetraclorua. Do đó để xác định chì, người ta thường dùng cloroform để
hoà tan ditizon . lon chì cũng tác dụng với ditizon trong môi trường axit yếu. ở
pH>7 thì việc thu vào dạng Pb(HDz ) 2 là hoàn toàn. Dung dịch Pb(HDz ) 2 trong
clorofom bị phân huỷ ở pH >9,5.

Trong dung dịch, sau khi vô cơ hoá thực phẩm, có thể cũng có mật các ion
Sn^'"' Cu^^, Zn^*, ...... các ion này có thể liên kết (bị che giấu) bằng kalicyanua
(KCN) nhưng không bị che bởi KCN nên tách ra khỏi dung dịch trước khi
xác định chì. Phương pháp tách như sau:

Lấy 25m l dung dịch từ bình định mức cho vào cốc có dung tích 250m l. Cho
vào cốc lOOml brom lỏng (B ĩi) và đun trên bếp diện để đuổi hết hơi SnBr4 .

Tiếp tục đun, thêm nước cất vào, rồi lại tiếp tục đun cho đến khi dung dịch
không còn màu đỏ của brom. Lúc này dung dịch chi chứa các ion Pb"^, Cu^^,
Zn'^Fe^^...

b. D ụng cụ, lio á chất

- Cân phân tích; - Bình định mức lOOOml;

- Cốc dung tích 250m l;

247
 - Phiễu chiết dung tích lOOml; - Buret lOml;

- Giấy thử pH; - Kalicyaniia tinh Ihể;

- Hydroxylamin hydroclorua tinh thể (N H 2 OH.HCI).

- Dung dịch chì tiêu chuấn 25 |.iM : Hoà tan 8,28m g P b(N 0,)2 tinh khiết loại
I trong nước cất 2 lần thành lOOOinl (trong bình định mức lOOOml). 1 ml dung dịch
này chứa 5,175 Y chì.

- Dung dịch ditizon tiêu chuẩn : Ditizon trong clorofom dung dịch 50,0ụM .
Cân tính xác trên cân phân tích 12,81mg ditizon tinh khiết loại I cho vào cốc. Cho
200m l cloroíom (CHCl,) vào cốc khuấy nhẹ cho tan ditizon. Chuyển dung dịch vào
bình định mức dung tích lOOOml. Thêm cloroíom vào vạch mức lắc kỹ.

- Am oniac dung dịch 2N; lấy 150ml amoniac dung dịch 25% cho vào bình
định mức dung tích lOOOml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ.

- Axit nitric dung dịch 2N : Hoà tan 128 ml H N O ,đ ặc (d =1,4) với nước cất
thành lOOOml.

c. Cách tiế ii hành

Dung dịch loại ở trên được chuyển vào phễu chiết. Cho vào phễu vào
tinh thể NH 2 OH.HCI lắc cho tan hết. Cho vào phễu m ột lượng (bằng hạt ngô) tinh
thể KCN và lắc cho tan hết. Điểu chỉnh pH > 7,5 (theo giấy đo pH) bằng NH 4 OH
2 N h o ặ c H N O , 2N.

Nạp ditizon dung dịch 50 vào trong lOml. N hỏ Iml dung dịch ditizon
vào phều thuỷ chứa dung dịch mẫu trên, lắc 30 giây. Nếu có thì trong phần
dung môi cloroữom sẽ hiện rõ màu đỏ tím của chất chì ditizonat. Chiết bỏ phần đỏ
tím đi (phải chiết thật cẩn thận để phần dung dịch màu không chảy ra). Lại cho
thêm Iml dung dịch ditizon vào phễu chiết, lắc 30 giây và lại tách bỏ phần màu đỏ
tím. Cứ tiếp tục như trên cho đến khi màu của phần dung môi trong phễu chiết kém
đỏ, tức lượng trong dung dịch giảm đi nhiều thì phải giảm lượng dung dịch
ditizon nhỏ vào phễu chiết xuống đến 0 ,2 ml, lại lắc và tách như trên đến khi nhỏ
ditizon vào phểu chiết, ditizon vẫn giữ màu xanh sau khi lắc 30 giây thì thôi ghi
tổng số ml dung dịch đitizon đã dùng để chiết chuẩn độ ion chì.

248
 Cần phải xác định độ chuẩn chính thức của dung dịch ditizon trong clorofom
50,0 ị-iM như sau : ỉấy chính xáclO m l dung dịch chì tiêu chuẩn vào phễu chiết sạch.
Nạp dung dịch diiizon 50,0|_im vào burei. Tiến hành chuẩn độ như trên. Chắng hạn
hết 15ml dung dịch ditizon. Căn cứ vào độ chuấn của của dung dịch ditizon này,
tính kết quả xác định chì.

(I. Tính kết quả

Trước hết lính xem 1 ml dung dịch ditizon ứng với bao nhiêu chì. Ta biết
1 ml dung dịch Pb(N 0 0 2 25 )LiM chứa 5,175 I-Ig chì. Vậy 1 ml dung dịch ditizon
ứng với số Ị.ig chì:

5,175.10
— = 3,45 ịig chì

Hàm lượng chì tính bằng Ị.ig có trong 1 lít hoặc 1 kg thực phẩm là:

^ 3 ,4 5 .a .V .1 0 0 0 ,

'^1 '^0

trong dó:

3,45: số chì ứng với 1 ml dung địch ditizon ;

a : thể tích dung dịch ditizoii đã dùng để chuẩn độ;

V : dung tích bình định mức, ml;

V, : thể tích hút ra từ bình định mức để phân tích, ml;

v„ : thể tích thực phẩm lỏng lấy dể vô cơ hoá, ml.

Kết quả được tính ra |.ig /kg. Nếu hàm lượng chì lớn hơn 1000 yigjl thì kết
quà được tính ra m g// ( 1 |ig = 1 0 '^ mg).

V í dụ lính toán

V í dụ lấy 100 ml dung địch thực phẩm đem vô cơ hoá, sau đó đem định mức
trong bình dung tích 250m l. Hút 25m l dể loại rồi dung dịch (sau khi loại Sn^^)
được cho vào phều chiết đủ và chuẩn độ chì hết lOml ditizon.

Hàm lượng chì tính ra mg/1 là

249
 3 ,4 5 .1 0 .2 5 0 .1 0 0 0 ..
X= — — - — — — = 3 ,4 5 m g //
2 5 .1 0 0 .1 0 0 0

G hi chú:

1. Nếu trong dung dịch (sau khi vô cơ hoá thực phẩm) để xác định chì có
chứa các cation và anion sau đây thì việc ảnh hưởng của chúng đến việc xác định
chì như sau:

- A g^ Zn^^ Ni"* không cản trở đến việc xác định chì vì
chiliig đều bị che giấu bởi KCN;

- PO 4 ' nồng độ cao có thể thu ở dạng Pb,(P 0 j 2 ;

- SO 4 có thể tạo với thành PbS 0 4 có thể hoà vào dung dịch bằng
NH,CH,COO;

- SiOs.nHiO ở dạng kẹo, gây khó khăn cho việc chuẩn độ bằng ditizon.
Cần lắc mạnh phều chiết khi chuẩn độ. Tốt hơn là nên đuổi SÌO2 đi bằng cách cho
HF vào để SÌO2 bốc hơi dưới dạng axit flo silix ic ... Tuy nhiên trong đa số thực
phẩm, lượng các ion trên là rất nhỏ.

2. Phương pháp xác định kim loại nặng bằng ditizon là phương pháp lượng
nhỏ, nê n c ác hoá chất d ù n g là hoá chất tinh kh iế t loại I; c ác d ụ n g CỊI phải đư ợ c rửa
sạch, kỹ, dùng nước cất hai lần tráng lại nhiều lần và trong quá trình tiến hành luôn
luôn phải dùng nước cất hai lần.

3. Dung dịch ditizon tiêu chuẩn phải pha trong clorofom . Clorofom là loại
dung môi dẻ bay hơi nên nếu không có điều kiện bảo quản lạnh, dung dịch ditizon
rất dễ tăng nồng độ. Vì vậy tốt nhất m ỗi lần sử dụng cần xác định độ chuẩn của nó
bàng dung dịch chì tiêu chuẩn.

4. Phương pháp chuẩn độ chì (và kim loại nặng khác) bằng dilizon, nếu
không được tiến hành cẩn thận, dễ mắc sai số do việc nhỏ giọt ditizon dễ bị dư ở
giọt cuối cùng dùng phương pháp so màu sẽ cho kết quả chính xác hơn.

5. Xác định chì bằng phương pháp so màu xem tài liệu chuyên môn.

250
 B à i 3, X á c đ ịn h đồng bằng p h ư ơ n g p h á p chiế t chu ẩn độ

a. Nguyẽìì tắc

Khi phản ứiig với ditizon, ion đồng thay thế một của diiizon tạo thành
phức chất màu đò tím (phương trình I); m và thay thế hai của ditizon tạo thành
phức chất màu vàng nâu (phương trình Ila và llb)

Cu'" + 2 = C u(H D z ) 2 + 2H" (I)

Cu'" + C u(H D z ) 2 = 2CuDz + 2H" (Ila)

+ H 2 Dz = CuDz + 2H" (Ilb)

Cả hai lớp chất C u(H D z ) 2 và CiiDz đều tan trong m ôi triròng dung môi hữii
cơ nhưng không tan được trong nước. V iệc tạo thành C ii(H D z ) 2 xẩy ra thuận lợi
trong m ôi trường axit yếu và có dư ditizon. Trong môi trường trung tính ihấy xuất
hiện đồng thời các phản ứng ( 1 , Ila, Ilb).

ở nồng độ cao và pH = 2 việc tạo thành CuDz xảy ra thuận lợi

Trong vùng dung m ôi hữu cơ, Cu(H Dz ) 2 dễ phân li tạo thành CuDz:

C u(H D z ) 2 = CuDz + H 2 Dz

Do vậy, để xác định đồng bàng ditizon người ta thườiig tiến hành phản ứng ở
pH = 3 -4 .

b. Dựng cụ, lio á chất

+ Dụng cụ: Sỉr dụng các loại như đã nêu ở mục trên

+ Hoá chất:

- Amorãac dung dịch 2N ;

- A xit í-unruric dung dịch 2N: Hoà 55ml H 2 SO 4 (d = 1,84) vào nước cất, chỉnh
đến V = 1000 ml;

- Dung dịch ditizon trong clorofom 50 |iM;

- Dung dịch đồng tiêu chuẩn: Hoà tan 19,64 mg CUSO4.5H2O tinh khiết loại I
trong nước cất đến thành lOOOml (trong bình định mức), 1 ml dung dịch này chứa
5,0 ng đồng.

251
 c. Tiến hành

Cũng sử dụng dịch đã loại Sii^'' (như khi xác định chì), cho vào phễu chiết.
Điều chinh pH của dung dịch đến pH = 3 h-4 bằng dung dịch am oniac 2N hoặc axit
suníuric dung dịch 2N với giấy thử pH. Chuẩn độ lượng đồng bằng dung dịch
ditizon đã dùng.

d. Tính kết quả

Tương tự như tính kết quả khi xác định chì bằng phương pháp chiết chuẩn độ

G hi chú:

1. Ag'" cũng tác dụng với ditizon tạo thành A gH D z do đó cản trở việc xác
định đồng, Có thể che giấu Ag^ bằng KBr.

2. Zn^'^ cản trở việc xác định đồng bằng ditizon. Nhưng nếu giảm pH xuống
còn pH = 1 thì không cản trở.

3. cản trở xác định đồng. Dùng amoniac tạo kết tủa Fe(O H ),. Lọc bỏ kết
tủa này, nước lọc được cho vào phễu chiết để xác định đổng.

4. CO^'^ và Ni^'^ nồng độ cao, có thể phản ứng với ditizon đồng thời với .
Nhưng nếu giảm pH nhỏ hơn 2 thì không cản trở.

5. Các ion S2 O / , [Fe(CN)fi]'^ cản trở xác định với bất kỳ lượng nào
CNS vừa phản ứng với Cu^^, vừa phản líng với ditizon, nên cản trở việc xác định

6. Xác định bằng phương pháp so màu: thu toàn bộ phần dung môi màu đỏ
tím khi xác dinh đồng (bằng phương pháp chuẩn độ) vào bình định mức dung tích
25 111 I, tliêm cloroíom cỉến vạch inức, lắc kỹ. Đ o màu dung dịcli Irèn rnáy ệaK-M
(tương tự như việc xác định chì).

B à i 4. X ác đ ịn h kẽm bằng phương ph áp so m àu

a. Nguyên tắc

Trong lương thực, thực phẩm, lượng kẽm thường rất nhỏ nên có thể xác định
được bằng ditizon. Trong m ôi truờng trung hoà hoặc hoặc có tính kiềm ít (thích hợp
nhất là ở nồng độ pH = 8,3 và trong dung dịch có chứa chất đệm xitrat) Z v ĩ* phản
ứng với ditizon tạo phức chất màu đỏ.

252
 + 2 H 2 D z = Z n(H D z ) 2 + 2H*

chú ý là phải loại các ion đồng, chì có trong dung dịch trước khi xác định kẽm

h. Dụng cụ, hoá chất

+ Dụng cụ như đã nêu ở phần trên

+ Hoá chất:

- Dung dịch am oniac 2N

- Dung dịch kali-natri tactrat (KNaC 4 H 4 0 fi.4 H 2 0 ) 20%: hoà tan 20g kali-
natritactrat trong lOOml nước cất.

- Dưng dịch ditizon trong cloroíom 50|iM

- Dung dịch natrisunfua (N a 2 S) bão hoà

- Dung dịch kẽm tiêu chuẩn: cân 43,97m g kẽm suníat (ZnSƠ 4 .7 H 2 0 ) tinh
khiết loại I cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào lOml axit suníuric
dung dịch 2N , rồi thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. Iml dung dịch này chứa 10
|ig kẽm.

c. Tiến Ììành

Lấy 25m l dung dịch đã vô cơ hoá (bằng phưcmg pháp khô và ướt) cho vào
phễu chiết. Trung hoà bằng dung dịch amoniac 2N đến pH=7 (thử với giấy pH), để
yên cho phân lớn. Tách,bỏ lớp dưới có phức chất đồng - ditizonat màu đỏ tím. Lại
thêm ditizon và tiếp tục lắc cho tới khi không còn màu đỏ tím ở phần ditizon.

Trút phần dung dịch ditizon vào một cốc. Cho 3ml kali-natritactrat dung dịch
20% để chống kết tủa các hydroxit kim loại. Trung hoà bàng dung dịch amoniac
2N.

Chuyển toàn bộ dung dịch từ cốc vào phễu chiết lắc kỹ. Dung dịch sẽ có lớp
màu đỏ của kẽm ditizonat. Cho vào phễu chiết lOmlnatrisufua dung dịch bão hoà
(để loại chì và ditizon dư), lắc kỹ. Đ ể yên phễu cho tách lớp. Tách bỏ lớp dưới. Tiếp
tục rửa N hịS cho đến khi lớp dưới không màu thì thôi.

253
 Chuyển dung dịch kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25m l,
thêm clorofom tới vạch mức rồi lắc kỹ đem dung dịch này đo màu trên máy (ị)3 K-
M.

Đ ồng thời cũng lấy lOml dung dịch kẽm tiêu chuẩn vào phễu chiết khác.
Tiến hành chuẩn độ trong dung dịch này với ditizon và cũng thu phần dung
môi chứa kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25m l. Đem đo màu
trên máy ệaK-M .

r. T inh kết qitả

V í dụ, trị sô' mật độ quang đọc được đối với 10 ml dung dịch kẽm tiêu chuấn
là: 0,752; 0,751; 0,753. Tính trung bình 0,752.

Trị sô' mật độ quang đọc được đối với 25m l dung dịch là: 0,502; 0,504;
0,505. Trung bình 0,504.

Được biết rằng trong 10 ml dung dịch kẽm tiêu chuẩn có chứa; 10.10 = 100
Ị.ig kẽm.

Vậy lượng kẽm có trong 25m l mẫu đem phân tích là:

10 0.0,504
— — ------- = 6 6 ,9 4 |ig
0,752

Từ đó tính ra lượng kẽm có trong llít hoặc Ikg lương thực, thực phẩm.

Bài 5. X ác định thiếc bằng phương ph á p iod

a. Nguyên tắc

Sau khi vô cơ hoá lirơng thực thực phẩm ta được dung dịch chứa thiếc ở 2
dạng là và Sn'*^. Dùng hydro khử toàn bộ lượng sang dạng rồi cho iod
tác dụng với . Từ lượng iod đã dùng suy ra, tính được lượng thiếc có trong mâu
thử.

b. Dụng cụ, hoá chất

- Pipet 50m l và 2 5 m l ; - Bình kíp ;

- Bình đốt Kendan dung tích 500ml; - Nút tinh ;

- Bình nón dung tích 500 ; - Biiret ;

254
- Cân kỹ thuật ; - Axit clohydric đặc (d =1,19);

- Axit siinfiiric đạc (d =1,84); - N h ô m kim loại (hạt hay bột);

- Axit Iiitric đặc (d =1,14); - Canxi cacbonat CaCO,;

- Amon axala' NH4C2O4 tinh thể; - lot dung dịch 0.0 IN;
- Natri thiosuníat N a 2 S2 0 , dung dịch 0,01 N;

- Tinh bột hoà tan, dung dịch 1%: Hoà tan Ig tinh bột trong lOOml nước cất; đun
nhẹ cho tan hết.

h. Tiến lià iilì

Dùng pipet hút 50m l lương thực, thực phẩm (nếu là sản phẩm lỏng) hoặc cân
lOOg (nếu ià sản phẩm khô) cho vào bình đốt Kendan. Thêm vào bình 50ml axit
suníuric đặc và lOml axit nitric đặc, lắc đều. Dung bếp điện đun cho dung dịch
trong bình sôi mạnh để hơi nước và khói trắng bốc lên (tiến hành trong tủ hút). Sau
đó cho axit nitric vào thêm tìmg giọt một cho đến hết một lượng khoảng 3-4ml và
tiếp tục đun cho tới khi dung địch trong bình có màu vàng nhạt, lúc để nguội không
màu mới thôi.

Cho vào bình 5g amoni oxalat tinh thể để khử hết các tạp chất chứa nitơ. Đun
tiếp trên bếp điện cho tới khi có khói trắng bốc lên.

Sau kh' dể nguội chuyển toàn bộ dung dịch từ bình đốt sang bình nón dung
tích 500ml

Dùng nirớc cất tráng bình đốt nhiều lần, nước tráng cũng cho vào bình nón
30inl axit clohydric đặc.

Đậy bình nón bằng nút caosu có hai lỗ. Một lỗ cắm ống thiiỷ tinh để dẫn khí
CO 2 vào, ống này cắm sát xuống đáy bình nón (xem hình 10.2.5). Lỗ kia cắm một
ống thuỷ tinh khác dài lOcm và sâu xuống quá niit 3cm. Cho nhanh 0,5g nhôm
(không chứa thiếc) vào bình nón và bắt đầu dẫn khí CO 2 từ bình kíp vào (xem hình
10.2.5), CO 2 đuổi oxi của không khí khỏi bình Iión, chống sự oxit hoá Sn^^. Đun sôi
dung dịch trong bình nón, nếu thấy có kết tủa Sn thì đun kỹ cho tan hết. Đ ể nguội
bình xuống đến nhiệt độ 15-20"c (dùng nước đá), trong lúc này vẫn tiếp tục dẫn khí
CO 2 vào bình nón.

255
 Nhanh chóng tháo bình nón ra 'khỏi bình kíp, m ở nút và cho nhanh 25ml
dung dịch iod 0 ,0 IN (chứa trong buret) lắc mạnh và đều. Dùng nước cất tráng tất cả
chất lỏng dính ở nút, ống thuỷ tiiih và thành trong của bình nón. Cho vào bình nón
Iml dung dịch tinh bột tan 1%. Chuẩn độ iod dư bằng natri thiosunfat 0,0 IN cho
đến khi dung dịch mất màu xanh. Phải chuấn thật nhanh, tránh oxi không khí vào
nhiều ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Hình 10.2.5. Bộ sinh khí CO2

Phải là.n một mẫu trắng: Lấy 25m l dung dịch iod 0,01N vào bình nón sạch,
thêm lOOml nước cất và 1 ml dung dịch tinh bột tan 1%. Chuẩn độ iod bằng natri
thiosunfat dung dịch 0,01 N đến khi dung dịch mất màu xanh.

c. Tính kết quả

Hàm luợng thiếc (theo m g//) tính bằng công thức:

0,5935 ( a - b ) . 1000
x=
V

trong đó:

0,5935 : lượng Sn, tính bằng mg ứng với 1 ml dung dịch iot 0,01 N;

a : thể tích NasSiO, 0,0 IN dùng chuẩn mẫu trắng, ml;

b : thể tích N a 2 S2 0 , 0,0 IN dùng chuẩn mẫu thử, ml;

V : thể tích mẫu lấy để phân tích, ml.

256
 G h ì chú:

í - Khi đốt mẩu HNO^ và H2SO4 lác dụng với nhau tạo axit nylrozynsunfuric,
chất này có tác dụng oxi hoá mạnh các chất hỮLi cơ và cả Sn^''. Chất này trong dung
dịch nước dễ phàn giải thành

HO.
2 ^so + HOH = 2 H 2S O 4 + N O + N O 2
ONO'^

NO và N O 2 khi đun mạnh sẽ bốc hơi, khi đun nóng với sự có của các chất
hữu cơ, H N O , sẽ phân giải theo phương trình

2 H N O , = H 2O + 2 N 0 + 3 0

Oxi hoạt động này sẽ oxi hoá các chất hữu cơ thành nước và CO 2 , CO 2 sẽ bị
bay hơi khi đốt mẫu.

H2SO4 hút nước và phá huỷ các liên kết phức tạp của protit, lipit, gluxit.
N goài ra nó cũng bị khử một phần thành SO 2 :

H2SO4 = H2O + SO2 + o

O xi này giúp vào việc oxi hoá các chất hữu cơ, còn SO 2 sẽ bị bốc hơi khi đun
nóng.

2- Khi nhôm gặp axit clohydric sẽ có phàn ứng:

AI + 3HC1 = A lC l, + 3H

Hydro này sẽ chuyển thành

S1 1 CI4 + 2H = SnCl2 + 2HC1

hoặc thành thiếc kim loại: SnCl2 + 2H = Sn + 2HC1

Sn kim loại này tan được trong HCl

Sn + 2HC1 = SnClj + 2H

3- Khi CaCO, gặp HCl sẽ tạo ra CO 2

CaCO., + 2HC1 = CaCl2 + CO 2 + H 2 O

257
 Phản ứng này được thực hiện trong bình kip

4- Sn^'" oxy hoíí bởi I2 trong môi trường axit clohydric

SnCl2 + I2 + 2HC1 = SnCU + 2H1

5- Phản ứng chuẩn độ I2 bàng NaịSiO,:

Ỉ2 + 2 Na 2 S, 0 , = 2NaI +Na 2 S,Ofi

B à i 6. X á c đ ịn h Asen

Phương pháp đo màu bàng giấy tấm thưỷ ngân (II) clorua

Các hợp chất chứa asen bị khử bởi hydro tạo thành asen hydrua. Chất này
phản ứng với thuỷ ngân (II) clorua (HgCl 2 ) tẩm trên giấy lọc tạo thành hợp chất
màu nâu. So sánh độ đậm màu của giấy này với dãy giấy tấm HgClí tiêu chuẩn sẽ
tính lượng asen có trong mẫu thử.

a. D ụng cụ, lio á chất

- Ống đong 25m l; - Bê'p điện ;

- Pipet lOOml, 25m l, 5ml; - Bê'p cách cát ;

- Bình định mức 250m l; - Lò nung điều chinh nhiệt độ 400-50ơ’C ;

- Cân kỹ thuật; - Giấy lọc cắt thành dải chữ nhạt;

- Cân phân tích; - Bình nón dung tích 100 ml;

- Ống thuỷ tinh: dài 30cm, đường kính 0,7cm; có một lỗ đường kính 0,3m l cách
đầu dưới ống 22cm , ống được cắm qua lỗ của nút caosu 3cm. Giấy lọc tẩm HgCli
đựơc đặt ở trong ống ở khoảng giữa nút và lỗ.

- Axit nitric đậm đặc (d =1,14); - Kẽm hạt không chứa asen;

- Axit clohydric đặc (d =1,19); - Asen trioxyt, tinh khiết loại I;

- M agie oxyt (M gO ) bột;

- Thuỷ ngân (II) clorua, tinh khiết loại I, dung dịch 5%;

- Axetat chì Pb(CH,C 0 0 ) 2 dung dịch 3%;

258
- Giấy tấm thuỷ ngân (II) clorua: nhúng ngập tấm giấy lọc ( 0 ,5 x l5 c m ) và HgCls
dung dịch 5%. vớt ra ép vào giữa hai tấm giấy lọc cho khô và phảng;

- Giấy tám axetat chì: nhúng ngập tấm giấy lọc (lx 8 c m ) vào P b(C H ,C O O )2 dung
dịch 3% vớt ra. đế khô. Cuộn tròn giấy thành ống hình trụ, ch o vào đầu trên ống
thiiỷ tinh.

h. Tiến liàiìli

Chuẩn bị duiig dịch thứ

D ùng pipet hút lấy .lOOml sản phẩm lỏng (hoặc lOOg sản phẩm khô) ch o vào
capxiin dung lích 2 5 0 m l. T hêm vào capxun Ig inagie ox y t (M gO ) và lOml axit
nitric đậm đặc (d = 1,4); khuấy đều. Đạt capxuii lên bếp cách cát, đung dung dịch
trong capxiin ch o tới khô. Đưa capxun vào lò nung, nung ở nhiệt độ 400-500"C để
các chất trong capxun hoá thành tro. Đ ể nguội, cho vào capxim lOml axit clohydric
đậm đặc (d =1 , 1 9 ) và 20m l nước cất. Đặt capxiin lên bếp điện đun ch o sôi dung
dịch đến khi lớp tro tan hết. Đ ể nguội, lọc lấy dung dịch từ capxiin vào bình định
mức dung tích 5 0 m l, thêm nước cất đến vạch mức và lắc kỹ.

Cách xác định

D ùng pipet hút lấy 2 5 m l dung dịch trong bình định m ức, ch o ''ào bình nón
dung tích lOOml, thêm vào đó 5m l nước cất. Cho tiếp vào bình nón lOml HCl đậm
đặc và 3g kẽr.i. N hanh ch ón g đậy nút lại. Nút caosu có gắn ố n g thuỷ tinh chứa tấm
g iấy tẩm ílg C li dung dịch 5% đã sấy khô và giấy tẩm axetat chì P b(C H ,C O O )2
dung dịch 3% (x e m hình 10.2.6). Đổ ch o asen phản ihig với hydro mới sinh trong
đúng 30 phíil (kể từ khi đậy nút). Trong quá trình này g iấ y tẩm HgCls sẽ c ó mầu
nâu nếu mẫu c ó asen. Sau dó m ờ nút ra kliòi bình nón, lấy g iấ y m àu đem so màu
với g iấy tẩm H gC l2 tiêu chuẩn, nếu màu của giấy làm mẫu và của g iấ y tiêu chuẩn

trùng nhau.

Chuẩn oị giấ y tẩm H gC l2 tiêu chuẩn:

Càn chính xác l,3 2 g trioxyt (AS2O ,) tinh khiết loại I, ch o vào bình định mức
dung tích lOOOml. T hêm vào bình định mức lOml axit sunfuric đậm đặc (d = 1 ,8 4 ),
thêm nước cất đến vạch mức lấc kỹ.

259
 Dùng pipet hút lOml dung dịch đã pha ở trên, cho vào bình định mức dung
tích lOOOml khác, thêm nước cất đến vạch mức rồi lắc kỹ. Iml dung dịch này chứa
1 0 |.ig asen.

Lần lượt cho vào 10 bình nón dung tích lOOml: bình thứ nhất 4m l dung dịch
trên ứng với 40 |.ig asen, bình thứ 2-6ml ímg với 60 ng asen, bình thứ 3-8m l ứng với
80 |.ig asen ....bình thứ i0-20m l líiig với 200 |,ig asen. Sau đó thêm nước cất vào
tìmg bình nón cho đủ 30ml và cho vào mỗi bình lOml axit clohydric đậm đặc
(d =1,19), 3g kẽm. Đ ậy nút bình, nút có gắn ống thuỷ tinh chứa tấm giấy tẩm
Pb(CH,COO). , rồi làm như cách làm ở mẫu thừ. Sau đúng 30phút, các tấm giấy
HgCl2 hiện màu đầy đủ. Tháo nút, lấy các tấm giấy ra, ghi lượng asen ứng với mỗi
giấy lên từng giấy, được dãy màu tiêu chuẩn. Tùy lượng asen tăng dần mà các tấm
giấy khi đó có cường độ màu tăng dần (từ vàng đen nâu và nâu đậm) và chiều dài
đoạn màu tăng dần từ 0,5-5cm .

c. Tính kết quả

Giả sử tấm giấy màu thu được khi thí nghiệm với mẫu thử có màu (và chiều
dài đoạn màu) trùng với màu tấm giấy ghi lượng 60 |ig asen của dãy tiêu chuẩn thì
lượng asen có trong mẫu thử là 60 |ag.

Nếu tấm giấy màu thu được khi thí nghiệm với mẫu thử có màu (và chiểu dài
đoạn màu) nằm trung gian giữa màu (và chiều dài đoạn màu) của hai tấm giấy ghi
lượng 50 và 60 |.ig của giãy giấy tiêu chuẩn thì lượng As có trong mẫu thử là 55 ng.
Từ đó tính ra lượng asen có trong một lít hoặc Ikg sản phẩm lương thực thực
phẩm...

260
 Hình 10.2.6. Dụng cụ để xác định asen:

1 . bình nón ;

2 . nút caosu ;

3. ống thuỷ tinh ;

4. tấm giấy tẩm HgCl 2 ;

5. lỗ;

6 . tấm giấy tẩm Pb(CH,C 0 0 )2 .

G hi chú

- Khi đốt mẫu lương thực thực phẩm asen ở dạng kim loại hoặc oxyt đều
được chuyển sang dạng ion As'*:

6 A s + lOHNO, = 3 A s A + lONO + SH^O

AS2O, + 3H2O - 2 H ,A sơ 4

2 H ,A s ơ 4 + 2M gO = 2M gH AsO , + 2 H 2 O

- Khi kẽm gặp dãy HCl sẽ có phản ứng

Zn + 2IICl = ZnCl2 + 2H

Hydro này tác dụng với các muối asẹn tao thành asen hydrua:

H,AsO- + 8 H = A sH , + 4 H 2 O

và A sH , phản ứng với HgCls:

A sH , + HgCl^ = Hg,,As.3 HgCl2

màu nâu

- Đáy ia phương pháp xác định lượng nhỏ Asen và vì A sH , là chất dễ bay hơi
nên dụng cụ để xác định asen phải thật kín, nếu không sẽ làm giảm kết quả phân
tích. Nút caosu không đậy kín bình nón thì phải trát một lớp parafin.

261
 B à i 7. X ác đ ịn h J ĩo bằng phư ơng pháp th o rin itra t

a. Nguyên lắc

Dùng canxi hydroxit chuyên flo sang dạng canxi Aorua (Caĩ-^) rồi cất lấy flo
dưới dạng axi> riosilisic (HịSìPs). Chuẩn độ axit này bằng thoriiiitrat (T h(N 0 ,) 4 ).

b. D ụ n " cự , Itoá cliấl

- Pipet, buret, capxun, bếp cách cát, lò nung;

- Máy cất lôi quấn bằng hơi nước (hình 10.2.7);

- Canxi hydroxyt rắn Ca(0 H) 2 :

- Natri hydroxyl dung dịch 0,1N;

- Axit clohydric dung dịch 0,1N;

- Silic oxit bột (SÌO 2 );

- Axit photphoric đậm đặc (d =1,69);

- Thori nitrat dung dịch 0,00 IM: Cân chính xác 0,13805gam T h(N 0 ,) 4 .4 H 2 0

hoà tan với nước cất tạo thành lOOml, trong bình định mức dung tích 1000 ml;

- Dung dịch đệm: 200m l axit cloaxetic IM, trung hoà bằng NaOH 0,1N rồi
thêm vào 225m l axit cloaxetic, thêm nước cất thành 1000 ml;

- Chi thị (a): Hoà tan 0 ,1 25g natri alizarin suníonat lOOml nước câì khi dùng
pha loãng 5 lán;

- Chỉ thị (b): Hoà tan 0,01g metylen xanh trong lOOml nước câì, khi dùng
pha loãng 5 lần.

c. Cách tiến lià iilì

Dung pipel híit lấy lOOml, nếu là sản phẩm lỏng (hoặc cân lOOg nếu là sản
phẩm khô) cho vào capxiin dung tích 250m l. Thêm vào capxiin 2g canxi hydroxit,
khuấy đều. Đặt lên bếp cách cát, đun dến khô. Đưa capxiin vào lò nung, nung ở
nhiệt độ 400-500'’C để đốt hết các hợp chất hữu cơ thành thành tro trắng. Lấy
capxun ra để nguội. Chuyển tất cả tro từ capxun vào bầu cất (2) của máy cất lôi
quấn hơi nước (hình 10.2.7). Rửa capxun bằng 25ml nước cất nóng. Cho vào bầu

262
cất 3g silic oxyl (SÌO 2 ) và 25ml axii phoiplìoric dạm (tặc. Đun sồi irong bình ( ỉ ) rồi
dun bầu cất (2) . Thu sản phẩm cất vào bình (4) có chứa sán 50m ỉ nirớc cất. Cất đến
khi d u n g dịch tr o n g binh nón có thể lích được lOOnil thi ngìnig lại. Lấy bình nón ra,
thêm vào bình nón Iml natrializarìn suiìíonat dung dịch 0.125 (đã pha loãng 5 lẩn).
Trung hoà bằng dung dịch NaOH 0 , i N đến chuyển màu chí thị thành đỏ. Tiếp đó
nhò vào bình nón Iml metylen xanh dung dịch 0,01% (đã pha loãng 5 lần) và 10
giọl dung dịch đệm. Kiểm tra pH bàng giấy thử pH. Nếu pH chưa đúng
thì nhỏ Ihêm 1IC1 0, 1N hoặc NaOH 0,1N đế diéu chinh. Chuấn độ bàng thoriniirai
0,001 M đến kJii dung dịch chuyển từ màu xanh lá cây sang tím.

Làm một mẫu trắng: Câì nước cất (không có mảii) tiến hành điều chinh và
chuẩn độ như trên.

cL T íiỉlì kểĩ quả

Màm lượng flo (theo mg F/lít) tính bằng công thức

0,019.(a-b).1000
X — ----------------------------
V

trong đó:

0,019: lượng flo tính bằng mg, ứng với Inil thorinitrat dung dịch 0,01 N;

a : thể tích Th(N 0 , ) 4 0,001 M đã dùng chuấn mầu Ihử, ml;

b : thể tích T 1 i(N 0 , ) 4 0 , 0 0 1 M dã dùng chuán mẫu trắng, ml ;

V : thể tích mầu để lấy phân tích, ml.

G hi chu

1. Dung dịch đệm axit cloaxetic pH = 3,5^3 , 8 tạo mòi trường i>xit thích hợp
cho việc chuẩn độ hợp chất flo bằng ihorinitrat.

2. Cất lôi quấn có tác dụng tách biệt flo khỏi các chất cản trờ. Tuy vậy các
BF, A sF ,, MiiF 4 cũng bay hơi khi cất.

3. Chỉ thị hổn hợp natri alizarin suníonat và metyleii xanh là nhạy nhất đối
với ihorinitral.

263
 H inh 10.2.7 Máỵ chưng cất lôi quấn hơi nước

10.3. XÁC ĐịNH KIM LOẠI NẶNG BẰNG p h ư ơ n g p h á p c ự c PHỔ

Xác định kim loại nặng bằng phương pháp ditizon có nhược điểm là khi xác
định, kim loại dễ bị cản trở bởi nhiều ion khác nên ảnh hưởng một phần đến độ
chính xác của phép phân tích. Đ ối với những cơ sở có thể trang bị máy cực phổ, nên
dùng phưcmg pháp cực phổ để xác định kim loại nặng.

10.3.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP c ự c P H ổ

Phương pháp cực phổ có thể định tính và định lượng nhiều ch ít bằng cách
điện phân dung dịch phân tích trên điện cực giọt thuỷ ngân rồi sau đó vẽ đường
biểu diễn dòng-thế, ghi sự biến đổi cườiig độ dòng theo sự biến dổi Ihế diện cực của
sự thuỷ phân.

10.3.2. NGUYÊN TẮC

- Đặt các thế khác nhau vào điện cực để khử các ion khác nhau vì mỗi ion có
một thế khử tuơng ứng xác định. Do đó qua thế khử của ion có thể định tính được
ion đó.

264
 - Nếu tăng dần thế của điện cực nhúng vào dung dịch chất cần xác định thì
cường độ dòng sẽ tăng đồng thời cho đến khi đại được ih ế khử của ion trong dung
dịch. Trong các điều kiện nhất định, Cuờng độ dòng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ
ion khử. Do phụ thuộc giữa cường độ dòng và nồng độ mà định lượng được ion đó.

10.3.3. CÁCH TIẾN HÀNH

Dung dịch phân tích được nạp vào bình điện phân có điện cực thiiỷ ngân.
Anot là lớp thuỷ ngân ở đáy bình (cOng có truờng hợp dùng anol là điện cực
C a lo m el), catot là giọt thuỷ ngân rơi liên tục từ một mao quản.

Đặt vào điện cực thế tăng dần sẽ tạo được dòng điện có cường độ tăng dần,
cường độ này được điều chỉnh bằng một điện k ế sau đó sẽ thu được một đường phụ
thuộc dòng-tliế (đường cong von-ampe).

Dòng khuếch tán là dòng lạo được do sự khử của ion trên điện cực giọt thuỷ
ngân.

Dòng khuếch tán được tính theo công thức của Incovit:

1, = 605 . z . 0'^^. m '''. t''" . c

trong đó;

Ij: cường độ dòng khuếch tán;

Z: hoá trị ion bị khử;

D: hệ số khuếch tán, hoặc số phân tử gam ion khử, khuếch tán qua bề mặt 1
cm^ trong một đơn vị thời gian để cho gradien nồng độ bằng đơn vị;

C: nồng độ ion khử, m ili-ion g//;

m: khối lượng thuỷ ngân rơi khỏi mao quản, trong đơn vị thời gian, tính ra
mg/giây;

t: thời gian giọt thuỷ ngân rơi khỏi mao quản, giây.

Trong thực tế, khó xác định được hệ số khuếch tán D, nên người ta đo song
song dung dịch chất tiêu chuẩn và chất phân tích, rồi thiết lập đường cong von-
ampe của cả 2 dung dịch và tính nồng độ (X) chất cần phân tích theo côn g thức :

265
troim đó:

a: khối lượng châì trong dung dịch tièu chuẩn ;

h, và Iv-: chiều cao sóng của dung dịch phân tích và dung dịch tiêu chuẩn.

Phương pháp cực phổ khòng chỉ xác định được các cation, nó có ihể xác định
dược các anion và phân tử có khả năng khử trên điện cực giọi tỉuiỷ ngân. Trong
phân tích thực phẩm, phương pháp cực phổ dùng dế xác định các kim loại nặng,
muối ăn, đườag frucíoza, saccaroza, các viiamin c , B| xác định hoạt tính các men
và các chất độc hiìii cơ khác.

10.3.4. CHUẨN BỊ DUNG DỊCH XÁC ĐỊNH

Cân 10-50g sản phẩm (hoặc nguyên liệu) vào bát sứ rồi đem sấy khô (với đồ
h ộ p hoặc n g u v ê n liệ u rắ n ), v ớ i đ ồ h ộ p lỏ n g hoặc rau quả n h iề u n irớ c th ì d e m cô trên

n ổ i cá ch t h iiỷ đến cạn k h ô , sau đ ó cho th ê m vào b ál sứ 10-12 g iọ t a x it su n ĨL iric đậm

đặc (d =1,19) và cô tiếp đến khô trên nồi cách tliuỷ.

Cặn trong bát được hoà lan bàng axil clohydric loãng (1/1), đun nhẹ irong
nổi cách llìuỷ, chuyến tất cả vào bình định mức dung tích 50m l (dung dịch chì
chiếm nửa thể lích ciia bình). Trung hoà axit bang am oniac đạc cho đến dư
am oniac, thêm nirớc cất đến \'ạch mức lác kỹ rồi lọc. Giữ lấy kết tủa của chì và
ihiếc trẽn giấy lọc. Nước lọc 1 dùng để xác định đồng.

Kết tủa Irên giấy lọc dược hoà lan bằng lOml axil clohydric (1/1) nóng, thêm
vào 2-4g axil lactric, inộl lượng natri sunfit và đun irên nồi cách ihuỷ cho bốc hêì
SO 2 đi. Sau khi làm lạnh, dimg dịch được chuyển vào bình địnlì mức dung lích 50
m l, trung hoà axil dir bàng amoniac đặm đặc dến dư, thêm nước cất đến vạch mức,
lấc kỹ rồi lọc. Nước lọc II dùng để xác định chì. Kc'l tủa hycỉroxit thiếc được hoà tan
trong HCl (1/1) trong bình định mức 50ml thcm 0 , l g canxi hypophotphit
(CaH 2 P 0 2 ) thêm axit clohydric (1/10 đôn vạch. Lọc dung dịch này, nước lọc III
dỉing xác định lliiêc.

266
 G hi chú:

Phưưng pháp cực phổ có ưu điếm:

- Độ nhạy cao: Có thế xác định chất có nồng độ 10' - 10 '’ phân tir gam/lít

- Có iliể đồng thời xác định nhiều chất mà k h ô n g phui tách biệt chúng

- Nhanh, chi tốn vài phút để xác định nồng độ chát trong dung dịch

Các m áy cực phó có thế dùng: LP.55A; Lí^.60; E 'L .l...

B à i 8. X á c d ịìih thiế c

a. D ụ iìí’ cụ, lioủ chút

- Máy cực phổ

- Dung dịch nền: HCl (1/1)

- Dung dịch gelatin 1 %

- Dung dịch thiếc tiêu chuẩn: hoà tan 25mg thiếc kim loại linh kniết trong 25
ml axit clohydric đậm đặc, đun nóng cho tan hết, cho dung dịch vào bình định mức
đun tích 25m l, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. khi dùng pha loãng 10 lần (0,1
mg / ml )

b. C úcli tiến hành

Hút 20m l nước lọc 111 cho vào cốc thuỷ tinh, ihêm 5ml HCl (1/1), 10 giọt
gelatin dung dịch 1%, khuấy kỹ, cho toàn bộ vào bình điện phân và làm cực phổ.
Đặt độ nhạy điện kế 1/100. Sóng khử của thiếc nằm trong khoảng 0,2-0,6 V.

Làm cực phổ dung dịch thiếc liêu chuấn:

L ấ y 2 0 m l dung dịch tiêu chuẩn (2,0m g) 5ml HCl (1/1), 10 giọt gelatin và
làm cực phổ trong điểu kiện giống như trên.

c. Tính kết c/itcỉ

Theo chiều cao cCia sóng vẽ trên giấy kẻ ô vuông, cạnh Irnm, thể lích các
dung dịch và nồng độ dung dịch chuẩn. Tính hàm lưOTig thiếc (X), thành mg trong
Ikg sản phám theo công thức:

^ C,.V,.H,.V„.1000
H. V. . G

267
trong đó:

Q., : nồng độ dung dịch tiêu chuẩn lấy làm cực phổ, mg/ml;

v „ .: thể tích dung dịch tiêu chiián lấy làm cực phổ, ml;
H| : chiều cao sóng cực phổ mảii thử, mm;

H 2 : chiều cao sóng cực phổ dung dịch tiêu chuẩn, mm;

v „ : thể tích toàn bộ nước lọc 111, m l ;

V| : thể tích dung dịch thử lấy làm mẫu thử, ml;

G : lượng cân mẫu thử, g.

V í dụ tính toán

Trong cách tiến hành trên, ta cân 50g mẫu (G), thu được 50m l dịch lọc III
(V„), lấy 20m' làm cực phổ (V |), được sóng cao 9mm.

Lấy 20m l dung dịch tiêu chuẩn (V |J có nồng độ 0,1 m g/m l (C|Jlàm cực phổ
được sóng cao 20m m (H 2 ).

0,1 .2 0 .9 .5 0 .1 0 0 0 ,,
X = .. .........= 4 5 0 0 m g / k g
2 0 .2 0 .5 0

B à i 9. X ác đ ịn h c h i

a. Dụiiy, cụ lioá chất

- Máy cực phổ

- Dung dịch gelatin 1%

- Dung dịch chì tiêu chuẩn: Hoà tan 0 ,3996g chì nitrat trong nước cất và Iml
axit nitric đặc trong bình định mức dung tích 250m l. Khi dùng pha loãng 10 lần để
Iml chứa o . l g chì.

b. Câch tiến hành

Dùng pipet hút 20m l nước lọc II, thêm 3ml nước cất, cho vào một cốc, thêm
8-10 giọt gelatin dung dịch 1%, khuấy kỹ. Chuyển toàn bộ vào bình định phân của
máy cực phổ ở 2 thế 2 V và đặt độ nhạy điện k ế 1/10-1/25.

268
 Sau đó lại hút 20m l nước lọc II, thêm vào Iml dung dịch chì tiêu chuẩn (0,1
mg chì trong Iml), 4m l nước cất và 8-10 giọl gelatin dung dịch 1% khuấy kỹ cho
vào bình điện phân. Làm cực phổ như trên.

c. Tíỉìlì kết quả

Hàm luợng chì, tính thành mg trong Ikg sản phẩm được tính theo công thức

C,.V,.H,.V„.1000
( H , v , - H , v , ).V,.G

trong đó;

Q .,: nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ( 0 , 1 mg/ml);

v„. : thể tích dung dịch tiêu chuẩn thêm vào, ml;
H, : chiều cao sóng cực phổ dung dịch mẫu thử, mm;

V| : thể tích dung dịch thử lấy làm cực phổ, ml;

V(,: thê tích toàn bộ nước lọc II, ml;

H2 : chtóu cao sóng cực phổ dung dịch mầu và chì tiêu chuẩn, mm;

V 2 : thể tích dung dịch mẫu và chì tiêu chuẩn, ml;

G : lượng cân mẫu, g.

G hi chú

I. Phương pháp thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch mẫu thứ để làm cực
phổ ở đây gọi là "phương pháp thêm". Phương pháp này có ưu điểm là khắc phục
được những knác nhau về lượng và chất lạ có trong dung dịch mẫu thử và dung dịch
chuẩn, nên độ chính xác cao hcfn.

2. Khi xác định thiếc cũng có thể dùng phương pháp thêm này tính kết quả
theo công thức ở phần thêm ( 2 )

B à i 10. X ác đ ịn h đổng

a. D ụng cụ ÌÌO Ú clìất

- M áy cực phổ;

269
 - Dung dịch n ề n : h o à lan 0 , 8 g am oni clorua v à lO m l a m o n ia c đ ậ m đ ặ c ;

- Dung dịch gelatin ỉ% :

- Nalri sunfit khan;

- Dung dịch đồng tiêu cỉiLián: hoà tan 3,9283g dồng suníat tin h thể
(Q1SO4.5H2O) trong 1 lít nước cất, Iml dung dịch này chứa Img đổng. Khi dùng
pha loãng 10 lần đế c ó 0,1 m g đồng trong Iml.

h. Cíicìì ĩiếìi liànlì

Dùng pipet hút lấy 20ml nước lọc I, thêm vào 5ml dung dịch nén vào 1 cốc,
thêm vào một liiợng nalri sufit (N a2S0 j và 10 g iọ l gelatin dung dịch 1% khuấy kỹ.
C huyển loàn bộ vào bình điện phân. Làm cực phổ với thế 2 von và đặt độ nhạy điện
k ế 1 /1 0 0 -1 /4 0 0 . Sau đó cũng lấy 20inl nước lọc I, thêm Im l dung dịch đ ồn g tiêu
chuẩn , 4m l dung dịch nền, m ột lượng natrisunfit và 10 g iọ l g ela lin , -làm cực phổ
như trên.

r . Túìlỉ kết qu ả

H àm lượng đ ổ n g , m g /lk g sản phẩm tính tư ơ n g tự n h ư c ô n g thức (2),

270
 Chương 11
TỒN Dư VÀ NHIỄM TẠP
■
ĐỘC
■
TÔ

n . l. G I Ó I THIỆU

V ệ sinh an toàn thực phẩm đang tạo nhiều lo lắng ch o người dân. Thực tế,
việc sử dụng những hoá chất cấm dùng trong nuôi trồng, c h ế biến nông thủy sản,
thực phẩm, việc sản xuất m ột sô' sản phẩm kém chất lượng hoặc do quy trình c h ế
biến hoặc do nhiễm độc từ m ôi trường, đang gây ành hirởng xấu đến xuất khẩu và
tiêu dùng. Các vụ ngộ độc thực phẩm do một số bếp ãn tập thể cung cấp, nhiều
thông tin liên tục về tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm ở một vài nước trên thế
g iớ i, cộn g thêm dịch cúm gia cầm, bệnh lợn tai xanh càng làm bùng lên sự lo âu
của m ọi người.

Vấn đề then chốt là làm thế nào quản lý được lốt chất lượng nống thủy sản
thực phẩm V iệt N am không nhiẻm vi sinh, không chứa hóa chất bị cấm , hóa chất
ngoài danh m ục ch o phép, hay bị nhiềm hóa chất quá giới hạn ch o phép nhằm nâng
cao năng lực cạnh tranh doanh nghiệp, bảo đảm an toàn ch o người tiêu dùng, đóng
góp dược phần quan trọng vào phái Iriển kinh lế-xả hội của dấl nước.

n .2 . Dư LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

11.2.1. GIỚI THIỆU

Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) còn gọi là thuốc trừ dịch hại (thuốc trừ sâu)
hoặc sản phẩm nôn g dược, bao gồm những c h ế phẩm dùng để phòng trừ các vi sinh

271
vậi gây hại tài nguyên thực vật, các ch ế phẩm có tác dụng điều hòa sinh trưởng thực
vật, các c h ế phẩm có tác dụng xua đuổi hoặc ihu hút các loại sinh vật gây hại tài
nguyên thực vật đến để tiêu diệl.

Dựa vào đặc tính tiêu diệt dịch hại, thuốc BVTV có thể chia thành; T huốc trừ
sâu: là những thuốc phòng trừ các loại côn trùng gây hại cây trồng, nông sản, gia
súc, con người; Thuốc trừ bệnh: là những thuốc phòng trừ các loại vi sinh vật gây
bệnh ch o cây (nấm , vi khuẩn, tuyến trùng); Thuốc trừ cỏ: là thuốc phòng trừ các
loại thực vật, rong, tảo m ọc lẫn với cây trồng, cản trở sự sinh trưởng của cây trồng;
Các loại thuốc diệt chuột, nhện, ốc sên ...rất độc hại đối với người; Th.uốc điểu tiết
sinh trưởng cây trồng: còn gọi là thuốc kích thích sinh trưởng. Tồn dư cùa chúng có
ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con ngirời.

11.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Phương pháp chính thức xác định dư lượng thuốc BVTV phải đảm bảo cho
phép định lượng toàn bộ dư lượng thuốc có trong dịch chiết của m ẫu. Số lần chiết
thường phụ thuộc vào khả năng chiết của dung m ôi được dùng. Phần lớn thuốc
BVTV đều tan trong các dung môi hữu cơ và độ hòa tan của chúng có thể khác
nhau trong các trường hợp. Hơn nữa nhiều chất trong đó lại tan trong nước và
không được chiết bằng dung m ôi hữu cơ. Thêm vào đó dư lượng thuốc B V T V trong
mẫu lại thường rất nhỏ c ỡ ppm thậm chí ppb, đòi hỏi phương pháp xác định cần có
độ chính xác cao.

Đ ường hirớng chung của các phương pháp xác định gồ m hai bước: Tách
chiết, tinh sạch và cô đặc dịch chiết; Tách phân đoạn và xác định các loại thuốc
BVTV.

11.2.2.1. Tách chiết và làm sạch

Các phương pháp được dùng không làm hư hỏng cấu trúc của chất cần phân
tích và phải tránh: nhiệl độ cao quá, môi trường axit hoặc bazơ mạnh. Quá trình
chiết tuân theo các nguyên tắc chung phù hợp với sản phẩm n gh èo hoặc giàu chất
béo.

272
a. Chiết bằng dung m ôi liCúi c ơ

- Mải' ít chất béo (rau, hoa quả...). Các dung môi thường dùng: A xeton tiếp
theo là C H 2CI2; Hỗn hợp A xeton/H exan; Axetonitril tiếp theo Ete petrol;
A xetonitril tiếp theo CHCl,; Izopropanol tiếp theo Ete petrol; Izopropanol
tiếp ìh eo Benzen; CH 2CI2; Hỗn hợp Ete etylic/E te petrol (1 /1 V).

- Mẫu nhiều chất béo. Cơ sở phương pháp dựa trên tính tan trong chất béo
của các h óa chất BV TV cho phép chiết đồng thời chất béo và chất BVTV
bằng dung m ôi hữii cơ.

b. Cliiêì bằng chưng cất citốn theo hơi nước

Thiết bi chư ng cất gồm 1 bình cầu chứa mẫu, trên đó lắp hệ thống phân tách
hỗn hợp chưng cất thu được, thiết bị này hay đirợc dùng trong chưng cất tinh dầu
(bộ chưng cất Dean-Stark).

c. Phương p lìá p “H e a d sp a c e ”

Mầu (gạo hoặc bột m ì) đirợc đặt trong thiết bị ổn nhiệt 70"C trong 30 phút.
T iến hành phùn tích pha hơi thu được bằng sắc ký khí. Phircíng pháp “H eadspace”
đcfn giản hơn nhiều so với phương pháp chiết, nó cho phép phát hiện chất ở nồng độ
tương đối thấp, ví dụ Etylendibrom ide được phát hiện với nồng độ 0 ,001m g/k g.

1 1 .2 .2 .2 . X á c đ ị n h d ư lư ợ n g t h u ố c B V T V

a. Phương p h á p h óa sinh

- Phương p h á p eitzỵni

C holinesteraza (ChE) là enzym thủy phân các E steaxyl của C holin, nó đóng
vai trò quan trọng trong hoạt động thông tin giữa các tế bào trong cơ thể sống, đặc
biệt là các tế bào của hệ thần kinh. ChE bị kìm hãm bởi các nhóm thuốc Lân hĩai cơ
và Carbamat, nhờ đó người ta đã xây dựng các phương pháp xác định dư lượng
thuốc BVTV trong thực phẩm với độ nhạy từ / / g-ng. Phương pháp dựa trên cơ sở

ức c h ế đặc hiệu giữa nhóm Lân hữu cơ hoặc Carbamat với ChE. X ác định sự giảm
hoạt độ của ChE (% ức chế) khi c ó mặt của chất độc từ đó c ó thể tính được hàm
lượng chất đ ộc c ó trong mẫu.

273
 - Phương p h á p G T-test K it

N guyên tắc của phương pháp dựa vào đặc tính ức c h ế axetylcholinesteraza
của các loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm Phospho hữu cơ và Carbamat. Phần
A xetylcholinesteraza tự do (không bị ức chế) sẽ thủy phân a x ety lch o lin tạo axit
A xetic và cholin. Dựa vào phản ứng tạo màu giữa A x ety ch o lin còn thừa với thuốc
thử GT ta xác định lượng thuốc BV TV trong rau quả.

b. Phương p h á p siitlì ỈIỌC

Đ ây là các phưcfng pháp được sử dụng để kiểm tra đ ộc tô' và côn trùng. Trong
phần lớn trường hợp chúng được coi như các phép thử định tính. Các phương pháp
này được sử dụng khá phổ biến.

c. Phương p h á p hóa lý

- Phương p lìá p cực p h ổ

Đ ây là phưcmg pháp c ó độ nhạy cao.

- Phương p h á p quang p h ổ

Các phương pháp quang phổ hấp thụ IR, U V -V IS thường được sử dựng để
nghiên cứu và định lượng các chất BV TV . N guyên tắc ch u n g của các phưcmg pháp
quang phổ là chúng đòi hỏi mẫu c ó độ tinh sạch thích hợp.

- Phương p h á p so màu

C a sở của phưcmg pháp dựa vào phản ứng tạo phức m àu đặc trưng cho các
chất BVTV.

- Phương p h á p sắc ký:

Các phưcmg pháp hay dùng: Sãc ký giấy, sá c ký bản m ỏ n g , Sắc ký khí (G C),
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC ), đây là phương pháp định lượng m ới, nó được
ứng dụng cho nhiều loại hóa chất BV TV khác nhau. T rong sô' đó được dùng phổ
biến hơn cả là GC

- C á c phương p h á p khác

Đ ây là các phương pháp dùng xác định các chất p olych lorob ip h en yl (PCB);
Sắc ký khí/khối phổ (G C /M S), C ộng hưởng từ hạt nhân, Phương pháp m iễn dịch
học (ELISA) dựa trên nguyên tắc phản ứng kháng ngu yên -kh áng thể.

274
 11.2.3. THỰC HÀNH

B à i 1. X á c d ịn h h à m lư ợ n g h ó a c h ấ t B V T V th u ộ c n h ó m lá n h ữ u c ơ

ỉ . Ngiivê/I rắc

Dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong mẫu được chiết bằng axeton. Sau khi
được tách chiết, hoá chất bảo vệ thực vật photplio-nitơ hữu c ơ được xác định bằng
sắc ký khí (GC) trực tiếp với detector FPD.

2. H ó a chất

A xeton , diclom etan , ete petrol tinh khiết phân tích

Natri suníat khan tinh khiết

Chất chuẩn của nhóm chất BV TV nhóm photpho hữu cơ.

3. Thiết bị, dụ n g cụ:

Cân phân tích d=10'^g; M áy nghiền mẫu;

Cân kỹ thuật d = 10^ g; M áy cô quay chân không;

Hệ thống sắc ký khí (GC) với Phễu chiết,

detector FPD;

4. C ách tiến hành

4.1 . X ây dựng đường chuẩn

a. Dung dịch chuẩn gốc 100 ppm.

Cân 0 ,0 1 g chất chuấn ch o vào bình định mức lOOml, thêm //-hexan đến vạch

m ức.

b. Dung dịch chuẩn làm việc

Hút 0,5; 1,0; 2 ,0 m l chuẩn gốc ở trên cho vào bình định mức lOml và pha
loãng tới vạch bằng /ỉ-hexan được các nồng độ chuẩn tircnig ứng là 5; 10 và 2 0 ppm.

Bơm vào m áy, th eo hướng dần của phần m ềm để lập đường chuẩn và xác
định thời gian lưu, diện tích pic.

275
 4.2. T iến hành chiết mẫu

Mẩu được thái nhỏ và trộn đều cẩn thận. Cân chính xác lOOg m ẩu cho vào
bình nón 2 50m l, thêm 200m l aceton nghiền đồng n h ít trong 1 phút. L ọc qua thiết
bị lọc hút chân không, thu dịch chiết trong bình hút 5 0 0 m l. C ho 80m l dịch lọc mẫu
vào phễu chiết llít, thêm lOOml ete petrol và lOOml diclom etan , lắc m ạnh trong 1
phút. Lớp hữu cơ bên trên của phễu chiết ban đầu được iàm khô bằng cách cho chạy
qua phễu lọc đường kính lOcm có chứa natri siinfat khan bên trên g iấ y lọc, thu
dịch lọc vào bình c ô quay. Rửa lớp natri sunfat bằng 5 0 m l diclom etan . Cô đặc và
bay hơi chậm bằng m áy cô quay chân không à 45"c. K hi c ô đặc còn khoảng 2m l,
thêm lOml axeton và lại cô đến còn khoảng 2m l. Lặp lại v iệc c ô đặc hai lần với
lOml axeton. K hông c ô khô để tránh phân huỷ mẫu.

4.3. PhẠn tích hỗn hợp photpho hữu cơ và nitơ hữu cơ

Hoà tan cặn dịch c ô đến lOml bằng axeton

Bưm 1 Ị.1 1 dung dịch này vào m áy sắc ký khí, sử dụng detector FPD với các
điều kiện sau: Cột SPB-5 (30m X 0,25m m X 0 ,2 5 /^ m ). N hiệt đ ộ cột: 50"c (1 phút),

tăng 20"c/phút “^120"c, tăng 50"c/phút 250"c. C h ế độ bơm: K hông chia

dòng, tốc độ Im l/ phút. N hiệt độ buồng bơm mẫu 250"c. Á p suất k h í m an g lOOkPa.

5. K ế t qu ả

So sánh thời gian lưu của m ỗi đỉnh so với chất chuẩn để định tính.

So sánh diện tích hoặc chiều cao của m ỗi pic với pic chuẩn để dịnh lượng

Hàm lượng cùa từng loại hoa chất BVTV được tính theo cô n g thức:

c,.v.s,
“ í
trong đó:

Xị! hàm lượng hóa chất BV TV “i” c ó trong Ikg m ẫu (m g/kg);

s,: diện tích pic tương ứng mẫu chất “i”;

s,„; diện tích pic tương ứng mẫu chuẩn có chất “i” ;
Q: hàm lượng chất “i” có trong Im l dung dịch chuẩn ( / / g/m l);

V: thể tích dịch chiết mẫu cuối cùng (ml);

m: khối lượng mẫu lấy phân tích (g).

276
n .3 . CHẤT KÍCH THÍCH TẢNG TRƯỎNG

11.3.1. GIỚI THIỆU

C lenbuterol, Salbutam ol là một loại hoocrnôn tăng trirởng tổng hợp hóa học
c ó tác dụng kích thích gia súc, gia cầm tăng càn nhanh. C lenbuterol, Salbutamol
cũng là chất thuộc nhóm Ị3-agonist có tác dụng giãn phế quản, giiĩn cơ trơn ở cuống
phổi, điều khiển các chất dinh dưỡng hướng tới m ô cơ, tăng sinh quá trình tổng hợp
protein để tích lũy nạc và giảm tích lũy m ỡ trong cơ thể.

11.3.2. PHƯƠNG PHÁP PHẢN TÍCH

Phân tích định tính: các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích định tính
chung cho các chất thuộc nhóm p-Agonist hoặc định lính riêng cho từng chất
Clenbuterol, SiUbutamol nhằm loại bỏ những mẫu âm tính. Các mẫu c ó kết quả
dương tính được tiếp tục phân tích định lượng.

P h àn tích đ ịn h lượng: trước hết định lượng Clenbuterol, Salbutamol theo

phương pháp sử dụng KIT- ELISA. Nếu mẫu thức ăn cho kết quả âm tính thì khẳng
định là mầu thức ăn đó không chứa các hoạt chất trên. Trong trường hợp mẫu thức ăn
cho kết quả difcfng tính với Clenbuterol, Salbutamol thì tiếp tục phân tích các chất này
theo một trong các phưcmg pháp sau; Sắc ký khí/khối phó - GC/M S (Gas
Chromatography / M ass Spectrometry); sắc ký khí / khối phổ / khối phổ -GC/M S/M S
(G as Chromatography / M ass Spectrometry / Mass Spectromctry); sắ c ký lỏng / khối
phổ - LC/M S (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry); sắc ký lỏng / khối phổ /
khối phổ - LC /M S/M S (Liquid Chromatography / M ass Spectrometry / Mass
Spectrometry). Kết quả phân tích bàng một trong các phương pháp trên sẽ kliẳng định
hàm lượng Clenbuterol, Salbutamol trong mẫu thức ãii chăn nuôi.

11.3.3. THỰC HÀNH

B à i 2 . X á c đ ịn h h à m lư ợ n g C le n b u te r o l

1. N guyên tắc

Thủy phân mẫu bằng HCl, tiến hành chiết Clenbuterol bằng ete etylic.
C lenbuterol được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng ca o (HPLC) với detector
U V -V IS hoặc P D A đo ở bước sóng 2 1 0 nm và 2 4 0 nm.

277
 2. H ó a chất

H óa chất sử dụng c ó độ tinh khiết phân tích (TKPT); dung m ôi là dung m ôi

dùng ch o sắc ký;

Chất chuẩn C lenbiiterol; HiPO^, dung dịch 17m M pH4;

A cetonitril dùng ch o sắc ký; H C l, dung dịch IM;

Ete etylic; N aO H , dung dịch lOM.

3. Tliiêt bị, dụng cụ

H ệ thống sắc ký lỏn g (HPLC) với detector U V -V IS hoặc PDA;

Cân phân tích d = 1 0 g; M áy lắc V ortex ;

M áy nghiền mẫu; Bê'p cách thủy;

M áy c ô quay chân không; Pipet Pasteur;

M áy ly tâm; Phễu chiết.

4. C áciì tiến liànlì

4 .1 . X ây dựng đường chuẩn

T iến h?nh pha m ột dãy dung dịch C lenbuterol chuẩn c ó nồn g độ ppm, và cho
chạy HPLC với điều kiện đã được thiết lập, dựng đường chuẩn của C lenbuterol với
nồng độ jU g/m l.

4 .2 . Chuẩn bị m ẫu

Cân chính xác khoảng 5-lO g mẫu vào ố n g ly tâm 50m l, thêm 15m l HCl IM ,
lắc trên m áy V ortex 1 phút (riêng với mẫu thịt phải nghiền kỹ trước đó bằng m áy
nghiền m ẫu). T hủy phân trong bếp cách thủy ở nhiệt độ 70"C trong 30 phút, sau đó
để nguội đến nhiệt độ phòng. Ly tâm 10 phút với tốc độ 6 0 0 0 vòng/phút, gạn lấy
dịch phía trên, thêm vào lOml HCl IM , khuấy kỹ và tiến hành ly tâm như trên. G ộp
dịch thu được vào m ột ốn g ly tâm khác, thêm lOml ete ety lic, ly tâm 10 phút với
tốc độ 6 0 0 0 vòng/phút, dùng pipet Pasteur hút bỏ lớp ete phía trên. Lặp lại quá trình
chiết trên hai lần, m ỗi 'ần lOml ete. Chỉnh pH về đúng 11.6 bằng dung dịch N aO H
lOM. Bổ sung 5m l ete vào ống ly tâm , ly tâm 10 phút tốc độ 6 0 0 0 vòng/phút,
chuyển lớp ete vào bình cất quay. Lặp lại quá trình ch iết như trên hai lần, m ỗi lần

278
5m l ete. G ộp tất cả dịch chiết ete vào bình cất quay. Cất quay chân không ở 4 0 ‘’C
đến cạn, hào cặn bằng 2m l pha độn g sắc ký và bơm vào HPLC.

4.3 . Chạy sắc ký

Bơm 2 0 fẨ 1 mẫu chuẩn bị ở trên vào HPLC với điều kiện sau:

Cột C 18 (1 5 0 m m X 4,6m m X 5|am ). N hiệt độ cộ t 40'’C. D etector U V -V IS

hoặc PDA đo ở bước sóng 210nm và 240nm . Pha động: H3PO4 17m M
pH 4/A xetonitril (9 0 /1 0 , v/v) với c h ế độ đẳng dòng. T ốc đ ộ dòng: Im l/phút.

5. K ế t qu ả

Hàm lượng C lenbuterol trong mẫu (m g/lO O g) được tính như sau:
^ c„,v.k
lO.m

trong đó;

c „ : nồn g độ C lenbuterol của dịch chiết tính theo đường chuẩn ( ụ g/m l);

V; thể tích dịch chiết cu ối chạy m áy, ml;

m: khối lượng mẫu phân tích, g;

k: hệ s ố pha loãng (nếu có ).

11.4. CHẤT KHÁNG SINH

11.4.1. GIỚI THIỆU

Chất kháng sinh là nhữiig chất c ó nguồn g ố c tự nh iên , bán tổng hợp hoặc
tổng hợp c ó óặc tính kháng khuẩn. Sự c ó mặt của chúng trong thực phẩm chủ yếu
do hai con đường: hoặc do quá trình điểu trị bệnh các g iố n g vật nuôi hoặc do nguồn
thức ăn gia súc c ó bổ sung chất kháng sinh. Sự c ó mặt của chất kháng sinh trong
thực phẩm c ó thể gây ra các tác đ ộn g không c ó lợi ch o sức khỏe con người hoặc có
thể tác đ ộn g đến c h ế độ công nghệ. Ả nh hưởng đến sức kh ỏe con người: có thể gây
ra các hậu quả không c ó lợi: gây dị ứng, tạo chủng vi sin h vật c ó khả năng kháng
kháng sin h , tạo ra sự mất cân bằng trong quá trình tiêu hóa thức ăn (n guồn g ố c thực

279
vật). Ảnh hưởng đến côn g nghệ: sự có mặt của chất kháng sinh trong sữa và thịt có
thể gây các tác động không c ó lợi cho quá trình sản xuất phom át và c h ế biến thịt.

Các phương pháp xác định chất kháng sinh hay dùng c ó thể xếp thành ba
nhóm: phương pháp vi sinh, phương pháp điện di, phưcrng pháp hóa-lý

11.4.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1 L 4 2 . L P h ư ơ n g p h á p vi s in h

Là nhóiĩi phương pháp được dùng phổ biến nhấl d o c ó độ nhạy cao trong phát
hiện chất kháng sinh. Cơ sở lý thuyết của phương pháp là dựa vào sự kìm hãm phát
triển các vi khuẩn của chất kháng sinh trong m ôi trường lỏng hoặc rắn.

a. C á c phương p h á p trong m ô i trường lỏng

Đ ảy là kỹ thuật được sử dụng nhiều trong xác định các chất kháng sinh trong
sữa. Mẫu sau khi thanh trùng sẽ được cấy các chủng vi khuẩn nhạy với chất kháng
sinh (như Bacilliis, Sĩreptocociis.,.). Sau thời gian nuôi cấ y , nếu nhir có tạo ra axit
lactic thì đó là bằng chứng ch o việc không có mạt chất kháng sinh hoặc c ó ở một
giới hạn xác định. V iệc xác định có thể được tiến hành bằng cách đo pH hoặc đông
tụ sữa. Sự lăng tế bào vi khuẩn có Ihể được xác định bằng “néph élom étrie” (đ o độ
đục)

b. C á c phương p h á p trong m ô i trường thạch

Các chất kháng sinh ở dạng dung dịch khi tiếp xúc với m ôi trườiig thạch sẽ
lan tỏa trong đó. Sự lan tỏa tuân theo hàm logarit của nồn g độ kháng sinh. Sự phát
triển của vi sinh vật trong m ôi trường thạch sau thời gian nuồi cấy ch o phép xác
định sự có mặt của chất kháng sinh.

c. C á c phương p h á p khác

- Sự thay đổi hình thái học: V i sinh vật sau khi nhuộm m àu xanh m ethylen
có thể sẽ thay đổi về hình thái học khi có m ặt chất kháng sinh, điều này
thấy rõ ở m ột vài chùng vi sinh vật.

- Phưcmg pháp K osikow ski: các đĩa giấy lọc được tẩm các bào tử Bacillus
subtilis, m ôi trường dinh dưỡiig và CTT (Chlorure de

280
 iriphényltétrazoliuni) và được làm đóng khô. T iếp theo tẩm thêm 1 ml
sữa. Sự thay đổi màu của đĩa giấy phụ thuộc sự táng hoặc không tăng số
bào tử, điều đó ch o biết sự có mặt hay không có mật của chất kháng sinh.

1 1 .4 .2 .2 . P h ư ơ n g p h á p đ iệ n d i

Mẫu được đưa vào các lỗ đục trên mặt thạch. Sau khi tiến hành điện di trẽn
tấm thạch các chất kháng sinh sẽ được phân tách và nhờ đó định tính dược, ngoài ra
còn loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác. Tấm thạch thứ hai được cấy một
hay nhiều chủng vi sinh vật khác nhau tùy từng loại kháng sinh. Sau khi nuôi cấy
tiến hành đo đường kính kháng khuẩn từ đó có thể định lượng được loại kháng sinh
có trong mẫu.

Phương pháp này c ó các ưu điểm: Loại trừ được ảnh hưởng của các chất
khác; X ác định đirợc các loại chất kháng sinh; Đ ịnh lượng kháng sinh.

1 1 .4 .2 .3 . P h ư ơ n g p h á p h ó a - lý

- Plỉif 7iig p h á p p h ó n g xạ-enzym

Dựa trên phản ứng sinh hóa giữa phân tử chất kháng sinh và m ột coĩacter có
gắn đồng vị c 14. Quá trình định lượng được tiến hành trong 10-15 phút, giới hạn
phát hiện đạt 0 ,0 5 U I/m l đối với penicillin (Charm test).

- Phương p h á p p h ó n g xạ-miễn nhiễm

N hiều cô n g ty đã sản xuất “Kit” có gắn dồng vị I 125 ch o phép xác định
nhiều kháng thể và chất kháng sinh. M ặc dù độ nhạy về mặt lý thuyết cao, nhưng
Ihực tế kỹ thuật này kh ông ch o phép đạt được giới hạn phát hiện thấp hơn 1 / / g/m l

(đối với sữa).

- Pìutơng p h á p miểiì nliiễni-eiìzỵm

Cơ sở phương pháp dựa trôn việc đo sự thay đổi hoạt độ của một enzym dưới
ảnh hưởng của m ột kháng thể thích hợp. Phương pháp này có thuận lợi là không
phải sử dụng chất đồn g vị phóng xạ và có độ nhạy gần với các phương pháp hiện
hành. Phương pháp còn có tên “E nzym e m ultiplied, im m uno assay technique” -
EM IT.

281
 - Phương p h á p huỳnh quang

Phương pháp dựa trên việc gắn chất phát quang lên phân tỉr chất kháng sinh
và tiến hành đo bởi m áy huỳnh quang dùng ánh sáng phân cực hoặc k h ôn g phân
cực. Phương pháp này dùng xác định tetracyclin, sau khi đun nóng trong môi
trường trung tính hoặc kiềm tạo thành phức chất phát quang. G iới hạn phát hiện của
phương pháp 2 ụ g/g.

- Phương p h á p quang sinh học

ATP tạo ra bởi vi khuẩn được chuyển thành A D P dưới tác dụng của enzym
Luciferaza, kèm theo đó là quá trình phát quang và được đo bằng trắc quang kế.

- Phương p h á p quang p h ổ

D ùng thiết bị quang phổ U V -V is và IR cho phép xác định và định lượng
penicillin (giới hạn phát hiện 1 0 / / g/g), streptom ycin, tetracyclin...

- Phương p h á p sắ c ký

Sắc ký lớp m ỏng; dùng xác định dư lượng kháng sinh trong sữa. Đ ịnh lirợng
có thể dùng phương pháp huỳnh quang. G iới hạn phát hiện của phương pháp:
T etracyclin 0 ,0 2 5 / / g/m l; Chloram phenicol 1 / / g/m l; N e o m y cin 15 //g /m l;
Streptom ycin 0 ,5 / / g/m l. s ắ c ký khí: áp dụng trong sữa. G iới hạn phát hiện:
Tetracyclin 0.5 - 10 / / g/m l; Chloram phenicol 0,01 / / g/m l; P en icillin 0 ,0 0 5 U l/m l.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC) đây là phương pháp hiện nay được dùng rất phổ
biến để định tính và định lượng chất kháng sinh.

11.4.3. TH ựC HÀNH

B à i 3 . X á c đ ịn h d ư lư ợ n g S tr e p to m y c in

I. N guyên tắc

Thuỷ phân streptom ycin bằng kiềm ch o m altol là m ethyl-3-h yd.'oxy-7p yron .
Sự tạo thành m altol xảy ra hoàn toàn cho phép xác định được streptom ycin.

M altol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thuỷ phân bằng cách dùng clo ro ío o c
để chiết khỏi dung d ịch mẫu trong m ôi trường axit,saii đó g iả i chiết m altol bằng
dung dịch kiềm trong nước. Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) am onium , dung

282
dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía dặc irưng và đo mật độ CỊuang của phức này ở
sóng 525 nm để xác định streptom ycin. Nồng độ của sireptom ycin được xác định
theo phương pháp đường chuẩn.

2. H ó a chất

Dùng hoá chất c ó độ tinh khiết phân tích;

'rhuốc thử: phèn sắt (III) am onium , dung dịch 2% trong axit siiníuric IN;

Dung dịch gốc tiêu chiiấn streptomycin siiníat nồng độ 1 m g/m l;

A xit cloh yd ric, dung dịch IM; CIorofooc;

Natri hydroxyt, dung dịch IN; Nước cất 2 lần.

3. D ụ n g cụ, thiết bị

M áy trắc quang U V -V IS ; Bình định mức các loại;

Cuvét thuỷ tinh c ó chiều dày 2 cm ; Pipet các loại;
M áy xay sinh tố ; Phều chiết cỡ 2 5 0 ml;
M áy ly tâm ; Một số dụng cụ khác.
4. C á ch tiến hành

4.1. Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghién mịn, trộn đều và cân m ột lượiig
a = 2 0 g ch o vào m áy xay sinh tố. Thêm 10 ml nước cất và ch o m áy chạy trong 5
phút. Cho 5 ml axit clohydric IM vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất. Đun
trong bếp cách thuỷ sôi trong 10 phút. Đ ể nguội, ly tâm lắng cạn, lấy dung dịch
nước trong ch o vào phễu chiết, thêm 10 ml cloroíooc, lác trong 10 phút sau đó để
yên trong 15 phút ch o phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu
cơ ch o vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natri hydroxyt IN và 4 ml thuốc thử phèn
sắt (III) am oni 2% trong axit và nước cất đến 20 ml. Lắc mạnh trong 30 phút, sau
đó để yên trong 2 0 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước. D ung dịch này dùng để
đo mất độ quang, xác định streptom ycin ở birớc sóng 525 nm.

4 .2 . Pha dãy chuẩn

Dùng dung dịch g ố c chuẩn của streptomycin suníat nồng độ 1 m g/m l, tính
toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 - 0,5 - 1,0 - 1,5 -

283
2,0 - 2,5 / / g/m l trong các bình định mức có thể tích 2 0 ml sau đó thuỷ phân bằng

kiềm , đun cách thuỷ ch o sôi 10 phút, để nguội rồi ch o 2 ml thuốc thử phèn sắt (III)
am oni 2%, định mức bầng nước cất đến 2 0 ml rồi để sau 2 0 phút m ới tiến hành đo.
Mẫu trắng: mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điểu kiện như mẫu phân tích
nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho c ó cùng thể tích.

4.3. Tiến hành thử

Đặt sóng đo và bật cho m áy chạy ổn định (5 phút). Đ o mật độ quang của
mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng cuvét c ó chiều dày 2 cm .
D ùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo m ỏi m ẫu 3 lần. Lập đồ thị
đường chuẩn theo hệ toạ độ D-C. Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu
chuẩn c ó nồng độ c tương ứng. X ác định nồng độ c , của chất phân tích th eo đường
chuẩn đã dựng được.

5. K ế t quả

Hàm lượng của streptom ycin trong mẫu phân tích ( /V g /g ) được tính theo

côn g thức sau:

trong đó:

a; lượng mẫu cân (ở đây a = 2 0 g);

V: thể tích pha mẫu (V = 20 ml);

Q : nồng độ streptom ycin xác định đirợc theo đường chuẩn.

C ách p h a d ã y cliiiổii:

Sử dụng dung dịch gốc chuẩn của streptom ycin c ó nồng độ 1 m g/m l (g ọ i là
dung dịch A )

+ Pha dung dịch streptom ycin nồng độ 10 / / g/m l: Lấy 1 m l dung dịch A pha

loãng và định mức bằng nước cất đến 100 ml (dung dịch này g ọ i là B)

+ Pha dãy dung dịch chuẩn : Lấy 6 bình định m ức có thể tích 2 0 ml ch o lần
lượt vào các bình từ s ố 1 đến số 6 một lượng như sau: 0 ,2 - l,0 - 2 ,0 -3 ,0 -4 ,0 -5 ,0 ml
dung dịch B. Thêm vào m ỗi bình 2 ml natri hydroxyt IN và lượng nước đến 10 ml.

284
Đun cách thuỷ ch o sôi để thuỷ phân trong 10 phút. Đ ể nguội ở nhiệt độ phòng,thêm
4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amoni 2% trong axit lắc kỹ và (lịnh m ức bằng nước cất
đến 2 0 ml. N hư vậy, ta đã được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ là : 0 ,1 - 0 ,5 - 1 ,0 -
1 ,5 -2 ,0 - 2 ,5 / í g / m l .

1 Ì.6 . CHẤT DIỆT KHUẨN

11.5.1. GIỚI THIỆU

Các chất c ó đặc tính diệt khuẩn thường có với lượng rất lớn. Sự có mặt của
chúng trong thực vật là do nhiều con đường khác nhau: D o yêu cầu côn g nghệ
nhằm làm tăng độ bền vững của một số sản phẩm (anhydric suníuric trong rượu
vang, biphenyl trong rau quả...). Trong trường hợp này thường phải đưa ra giới hạn
tối đa không được phép vượt qua để đảm bảo an toàn thực phẩm. D o tiếp xúc sản
phẩm với bề mặt không được rửa sạch sau khi dùng chất diệt khuẩn (N aO C l,
HCHO...)- D o bổ sung chất diệt khuẩn nhằm ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật,
m ặc dù điều này bị cấm bởi luật.

Sự có mặt của chất diệt khuẩn trong thực phẩm cũng đặt ra các vấn đề tương
tự như chất kháng sinh: ảnh hirờng đến sức khỏe của người tiêu dùng do độc tính
của chất diệt khuẩn, ảnh hưởng đến ch ế độ công nghệ (như kìm hãm quá trình lên
m en lactic trong sản xuất sữa).

11.5.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1 1.5.2.1. P h ư ơ n g p h á p vi sinh

a. Phương p h á p biển đ ổ i s ự chuyển hóa của nấm men

Phương p h á p thường dùng: test quá trình lén men

Thực phẩm được đưa đi lên men có bổ sung một lượng chuẩn nấm men
S a c c h a ro m yc e s c e r e v is ia e rất hoạt động. Sau khi nuôi cấy kiểm tra thể tích khí CO2
tạo thành ch o phép kết luận có hay có mặt chất diệt khuẩn.

285
h. Pììương pììáp phát triển trong mỏi trường thạch

Cơ sở phương pháp là ch o mẫu vào trong m ôi trường thạch. N ếu m ẫu c ó chất

diệt khuẩn sẽ ngãn cản sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt thạch, được so sánh
với mẫu kiểm chứng tiến hành trong cùng điều kiện. Phương pháp hay dùng:
Phương pháp D rieux và Thierry áp dụng ch o tất cả các sản phẩm , ngoại trừ bơ.
Phương pháp M ossel và Eijgelaar áp dụng ch o phân tích bơ.

1 1.5.2.2. P h ư ơ n g p h á p h ó a -lý

N gày càng c ó nhiều chất hóa học c ó tác dụng diệt khuẩn, đòi hỏi c ó nhiều
phưcfng pháp thích hợp xác định chúng. Trong phần này chỉ giới thiệu cá c phương
pháp nghiên cứu và định lượng các chất diệt khuẩn thuộc phạm vi: Chất diệt khuẩn
chính được phép sử dụng rộng rãi trong thực phẩm; Các chất có tác dụng diệt khuẩn
như chất tẩy rửa, chất khử trùng; M ột vài chất diệt khuẩn được dùng kh ông chính
thức.

a. Axit so rb ic và so rb a t

Các phương pháp hay dùng: phương pháp so m àu, phương pháp quang phổ
hấp thụ tử ngoại, phương pháp sắc ký khí (G C ), phưcmg pháp sắc ký lỏ n g hiệu năng
cao (HPLC).

b. A kìí b en zo ic vờ ílẫn xuất

Dẫn xuất của benzoic có nhiều loại: axit orth oclorob en zoic,
paraclorobenzoic, sa iicy lic, parahydroxybenzoic và các ester m e ty l, propyl, butyl
cùa axit parahydroxybenzoic. Phương pháp thường dùng: sắc ký g iấ y , sắc ký bản
m ỏng, phương pháp HPLC.

c. A nliydrìc suiìfitrơ và suiifit

A nhydric sunfurơ được đưa vào thực phẩm lỏng dưới dạng k h í suníurơ, nó sẽ
kết hợp với đường, etanol và các chất màu. N ó thường tồn tại m ột phần dưới dạng
SO2 tự do c ó mùi đặc trưng và c ó tính diệt khuẩn.

Sau khi đốt nóng mẫu và bổ sung nước, axit photphoric, c ó thể xác định
anhydric sunfurơ th eo hai cách: N hận biết m ùi; C on đường h óa học: dùng bãng
giấy am idon c ó tẩm kali, khi c ó mặt SO2, băng g iấ y sẽ hiện m àu xanh. Có nhiềụ
phưcfng pháp kỹ thuật dùng định lượng.

286
d. Biplienvl và ortlìopheiìyỉ-pheiìoỉ

Các hợp chất này được sử dụng trong xử lý bề miặt caim, quýt...C húng được
xác định theo phương pháp Gunther, Blinn và Barkley:

N ghiền quả, xử lý bằng hơi nước thu p h á n cHiưing bằng xyclohexan.

O rthophenyl-phenol được chiết bằng dung dịch xút loàmg,, biipihenyl vẫn còn trong
xyclohexan. Tiến hành so màu ở 248nm

e. Dẩn xuất lialogen của axit axetic

C ông thức chung C H 2X C O O H . Trong đó axit miomobromaxetic được dùng

nhiều hơn cả. C ó nhiều phương pháp được dùng; PhưcíngỊ p)háp Florentin-M unch,
C ristol-B enezech, ia u ln e s, V ivario.

/ . Axit b o ric

Có nhiều phương pháp xác định axit boric trong thụrc phẩm , ta c ó thể kể tới
hai phưcmg pháp chính: Phưcmg pháp chuẩn độ, Phương phiáp so màu.

g. Poì m a ld eh yt và d ẫ u xuất

D iem air và P ostel đưa ra phương pháp kiềm hóa fo)rmol bằng phản ứng với
axit crom otropic với sự có mặt của H2SO4. Nếu có t b m o l sẽ xuất h'ên màu tím.
Censi và C rem onini đưa ra phương pháp định lượng fomnO'l hằng cách dùng 2,4-
dinitrophenylhydrazin.

/ỉ. A x itỷ o n n ic

Phưcmg pháp L ecoq: Chiết bằng ete petrol, sau đó phđn chiết eie được kiểm
hóa bằng dung dịch xút 0 ,1 N . Tách pha nước và tiến hành ax.it hóa bằpg H2SO4 IN ,
sau đó chưng cất đến khi ch ỉ còn khoảng vài ml dịch ch iếit. G ia nhiệt phần nước
chưng 15 phút bằng đun cách thủy, bổ sung vài hại tinh thiể PígCla- N ếu c ó mặt axit
íorm ic, sẽ tạo kết tủa trắng. G iới hạn kiểm tra của phưo^ng pháp hàm lượng axit
íorm ic > 300n ig//.

i. H ợ p chất f l o

Phương pháp Truhaut: sau khi tro hóa, chuyển toàn bộ flo thành axit
hydroA osilic bằng cách ch o tác dụng với H2SO4 với sự có nmặt của silic. Chưng cất
cuốn hơi nước, thu axit Aohydric (d o thủy phân axit hyd roA osilic). Chuẩn độ flo

287
bằng dung dịch thori nitrat với chỉ thị natri alizarin-siilfonat hoặc parasulíbphenyl-
azo-dihydroxynaphtalen-disulfonic (SP A D N 3).

j. H ợp clỉất amonium

Phương pháp D iem air-Postel: chiết am oni bằng hỗn hợp nước-axeton, tiếp
theo bằng dicloetan, thu bằng brom ophenol. Các hợp chất am oni tạo phức màu
xanh với brom ophenol và được định lượng bằng cách so m àu ở bước són g 608nm
(xây dựng đường chuẩn). Phirơng pháp Miller-XVildbrett: cải tiến từ phương pháp
trên, hợp chất am oni tạo phức màu với eosin và so màu ở 542n m .

k. H y d ro p e ro x yt

Đ ược áp dụng nhiều trong công nghiệp sữa.

- Phương pháp hóa học: Phương pháp Pien, D esirant và L aíontaine; Phương
pháp Rouquette; Phương pháp A m in và O lson; Phưcfng pháp Peưier;
Phương pháp Gupta.

- Phưcmg pháp enzym : Có độ nhạy cao hơn phương pháp hóa học

/. H y p o clo rit và cloram in

- Phương pháp hồ tinh bột: H ypoclorit phân giải iodua tạo iod c ó màu xanh
với hồ tinh bột.

- Phương pháp huỳnh quang; trộn 3m l mẫu với hỗn hợp H2SO4 (3 + 1 ) chứa
0,025% clorua thiếc, giữ ở nhiệt độ 0-5"C. L y tâm 3 phút tốc độ 2 5 0 0
vòng/phút. Thu kết tủa soi đèn tử ngoại (3 6 5 n m ), nếu thấy màu lục nhạt
thì mẫu c ó hypoclorit hoặc cloram in.

11.5.3. THựC HÀNH

B à i 4 . X á c đ ịn h h à m lư ợ n g a x it b e n io ic

1 . N guyên rắc

Làm đồng nhất hoá sản phẩm, sau đó pha loãng và axit hóa phần mẫu thử,
chiết axit benzoic bằng dietyl ete, sau đó chiết lại axit này bằng k iém và tinh c h ế

288
bàng cách o x y hoá kali dicromat đã được axit hoá. Xííc dịrih bằng cách đo quang
phổ của axit b enzoic tinh khiết được hoà tan trong dictyl ete.

2. H ỏ a chất

Tất cả các thuốc thử phải thuộc loại tinh khiết phân tích. Phải sử dụng nước
cất hoặcrntrớc c ó đ ộ tiirir khiết taơng điiơng.

A x it tactaric tinh thể N aO H IN; A xit suníric (2+ 1);

K^ili dicrom at, dung dịch 33 - 34g//; Dietyl ete mới được ^ất;

A ỉtit b en zo ic, dung dịch chuẩn 0 ,1 0 0 g /l trong dietyl ete. I

!
3. D ụ n g cụ, thiết bị !

B ình định mức 5 0 m l; I

C ốc c ó m ỏ , 5 0 m l và lO O m l; Phễu chiết 5 0 0 m l ; I1

Pipe, 20m l; Máy làm đồng nhất ;

C ân phân tích; Bếp c á c h th u ỷ ; I

B ìn h cầu 2 5 0 m l c ó nút m ài, được làm bằng thuỷ tinh b o ro silica t. Ị

M á y đ o q u a n g p h ổ x á c dịnh trong phạm vi tia cực tím , ph ép đ o clỊính x á c tới

0,5n m , c ó cuvet thạch anh bề dày lOmm hoặc 20m m (20m m thì tốt hơnj để tãng độ
nhạy) c ó nút thuỷ tinh nhám . i

4. C á cti tiên hành

\
4 .1 . Chuẩn bị m ẫu thử

4 .1 .1 . C ác sản phẩm lỏng (dịch quả, các sản phẩm có thịt quả, lịiro) và các
sản phẩm đặc: mứt cam , míri nhuyễn). ị

L à m đ ồ n g nhất m ẫu th í nghiệm sau khi trộn. Ị

4 í l .2 . Sản phẩm rắn (rau, quả).

c ẩ t mẫu th í nghiệm ra thành nhiều miếng nhỏ, bỏ hạt, k tio iu g l i noãn nếu
cần, và ngh iền trộn đồn g nhất một cách cẩn thận khoảng 4 0 g mẫu.Đ ể sản phẩm
đôn g lạnh tan giá trong m ột bình kín và cho dịch tan chảy này vào sản phẩm trước
khi nghiền trộn mẫu.

289
 4.2. Phần mẫu thử

4 .2.1. Các sản phấm lỏng

Dùng pipet, lấy 20ml mẫu thử, không có các chất ớ dạng huyền phù, pha
loãng với khoảng 50m l nước và chuyên vào một phễu chiết dung tích 500m l (phều
chiết A ).

Chú thích; phần mẫu thử này cũng có thể được lấy th eo khối lượng, bằng
cách cân xấp xí 20g mẫu thử chính xác đến 0 ,0 Ig.

4 .2.2. Các sản phẩm lỏng chứa thịt quả

Lấy 20m l mẫu thử cho vào cối và nghiền với 2 0 0 m l nước. L ọc chất lỏng sau
khi gạn. Làm hai lần liên tiếp, cho bã vào 2 0 0 m l nước rồi gạn, lọc lấy chất lỏng.
Thu toàn bộ dịch lọc trực tiếp vào phễu chiết dung tích 5 0 0 m l (phễu ch iết A ).

Chú thích: Phần mẫu thử này cũng c ó thể được lấy th eo khối lượng, bằng
cách cân xấp xỉ 20g m ẫu thử chính xác đến 0 ,0 Ig

4 .2 .3 . Các sản phẩm rắn hoặc đặc

Cân khoảng lOg mẫu thử chính xác đến 0 , 0 Ig , và dùng 30 - 40m l nước,
chuyển mẫu vào bình cầu 250m l. Thêm khoảng 5 0 m g Iiatrihydrocacbonat (xem chú
ihích). Lắc, rồi đặt lên nồi cách thuỷ, điều chinh nhiệt độ 7 0 - 80"c, và để trong
1 5 - 3 0 phút. Lọc phần chứa trong bình cầu và tráng hai lần bàng nước, m ỗi lần
díing 15 - 20m l. Tliu toàn bộ dịch lọc vào phễu ch iết du n g tích 500niJ (phều chiết
A ). Đ ể ch o nguội.

Chú thích: việc ch o thêm natrihydrocacbonat là đ ể trung hoà axit b en zoic, vì

một phần nhỏ cìia axit này c ó thể bị mát do bay hơi.

4.3. Chiết axit benzoic

Cho 1 g axit lartaric vào phễu chiết (A ) chứa phần mẫu thử đã được pha
loãng (4 .2 ), thêm 60m l dietyl ete và lấc kỹ. Đ ể ch o tách lớp, rồi hứng lớp ete vào
phễu chiết thứ hai dung tích 500m l (phễu chiết B). Sau đó rửa phần dịch trong phễu
chiết ihứ nhất (A ) bầng 60m l dietyl ete. Đê’ tách lớp, rồi hứng ete vào phễu chiết (B)
có chứa lớp ete thu được lần thứ nhất. Tiếp tục tương tự lần chiết thứ ba bằng 30m l
dietyl ete và dồn lớp ete thu được vào cùng hai lần đầu trong phễu ch iết (B). Chiết

290
axit benzoic từ dung dịch ete bàng cách théin licn liếp lOml và tiếp 5m l dung dịch
natri hydroxit, và sau đó hai lần, mỗi lần lOinỉ nước. Sau m ỗi lần ch o thèm lắc, rồi
đế cho lách lớp và hứng lấy phần dịch. Mứng dịch vào một đĩa. Đạt ctĩa lên nồi cách
ihuỷ, điều chinh nhiệt độ 70 - 80"c, và dể đó cho dến khi ihể tích dung dịch kiềm
giám klioáiig một Iiửa, lấy phần dietyl cte đã hoà lan còn SÓI lại.

4.4. Tinh c h ế axit benzoic

Sau khi đế n gu ội, rót dịch ở đĩa vào một bình cầu dung tích 250m l có chứa
hỗn hợp 20m l dung dịch axit .sunfuric và 20m l dung dịch kali dicromat. Đ ậy Iiắp
bình cầu, lắc và để đó ít nhất 1 giờ.

Chú thích:

1) Các chất bảo quản khác có nguồn gốc từ axit benzoic c ó thê có mặt. Trong
trường hợp này đ ể bình cầu ít nhất 3 giờ, đè’ oxy hoá hoàn toàn ba axit
liydroxybenzoic và loại trừ bất cứ sự cản trở nào trong việc xác địiih. Sự kéo dài
thời gian phản ứng tạo ra không ảnh hưởng gì vì axit benzoic chịu được hỗn hợp
ox y hoá này.

2) Khi sản phẩm ban đầu cũng chứa axit sorbic, thì cán phải kéo dài thời gian
o x y hoá 24 giờ nhàm đảm bào phân huỷ hoùa loàn axit này.

4.5. Chiết axit b enzoic tinh khiết

Chiết axit b en zoic bằng cách xử lý duag dịch trên (4.4) hai lần với 2 0 - 25m l
dietyl ete, thu lấy dung dịch ete. Rửa dung dịch ete hai lần bàng một vài m ililít
nước. Sau khi gạn rất cẩn thiỊn, lọc qua giấy lọc khô và Ihu dịch lọc vào bình định
mức dung tích 5 0 m l. Sau đó rửa giấy lọc bằng một vài m ililit diety ete, thêm ciủ
dung m ôi rửa này vào (iịch lọc đê’ pha loãng tới vạch.

4.6. X ác định

Dùng m áy đo quang phổ, đo độ hấp thụ của dung dịch ete (4 .3 ) liên quan đến
độ hấp thụ của dietyl ete tinh khiết ở bước sóng 267,5iim đến 272nm và 2 7 6 ,5nm
(x em chú thích). Đ ộ hấp thụ do axit benzoic được tính bằng côn g thức chung đo sự
chênh lệch xuất hiện ở bước sóng 272nm .

291
trong đó:

Aj - độ hấp thụ ở 2 6 7 ,5nm;

A 2 - độ hấp thụ ở 272nm ;

A , - độ hấp thụ ở 276,5nm .

Chú thích: V iệc xác định quang phổ hấp thụ của dung dịch ete cịhứa axit
benzoic tinh khiết ch o phép biểu thị đặc điểm của sản phẩm này bởi sự có mặt của
hai đinh ở Ỉ7 2 n m và 279nm .

A xit benzoic đã được ch iết bằng dietyl ete được x á c định bằng cách áo chiều
cao của đìiw (p ic) ở bước són g 272nm liên quan tới đoạn thẳng nối các « é 'm trên
trục hoành giữa 267,5n m và 2 7 6 ,5nm.

4.7. 9 S lầ n xác định

Tiến hành hai lần xác định trên cùng m ột mẫu thử (4 .1 ).

4.8. )ự n g đường chuẩn

Lấy một loạt 6 bình định mức dung tích 50m l, lần lượt ch o vào t mg bình
5 - 7,5 - i pI -- 12,5
12,5 -- 15
15 -- 20m
20mll dung
dung dịch
dịch chuấn
chuẩn axit
axit bben
enzo
zoic.
ic. Pha loãng tới vạch
Pha loãng
bằng dietyl ete. Các dung dịch thu được chứa tuần tự 10 - 15 - 2 0 - 25 - 3C - 4 0 mg
axit benzoiB/lit. T iến hành đo sự chênh lệch độ hấp thụ của các dung dịch này theo
trình tự đ ư w m ô tả ở 4.6. V ẽ đường co n g biểu thị cá c lần đ o sự ch^.nh ệch liên
quan đến sa m iligam axit benzoic/lit nêu trên.

5. K ễ t qu ả

5.1. fhần mẫu thử được lấy bằng cách dùng pipet

Hàrn lượng axit benzoic sản phẩm tính bằng m ilig a m /lit theo cô n g th Jc:

50
iBaX — = 2 ,5 rĩi2

trong đó, n 2 là lượng axit benzoic đọc trên đồ thị chuẩn (4 .8 ) tính bằng m iljgam .

5.2. Phần mẫu thử được lấy bằng cấch cân

Hàm lượng axit benzoic tính bằng m iligam trên k ilo g a m sản phẩm theo cô n g
thức;

292
 . 50
ni2 X —
m,

trong đó:

rĩìi - khối lượng của phần mẫu thứ (4 .2 .), g;

m ị - khối lượng của axit benzoic đọc trên đồ thị chuẩn (4 .8 ), m e.

11.6 . Đ Ộ C TỐ Vỉ NẤM
1

1 Ì6 .1 . GIỚI THIỆU ^

Đ (^ tố vi nấm (M ycotoxin ) là các độc tô' thưcmg nhiểm vào thựe phẩm và
gây ra c Ị c hiện tượng nh iễm độc ở người và động vật. Đ ộ c tố vi nấm l ĩ sản phẩm
của các (|uá trình trao đ ổi chất bậc hai và đây không phải là những đặc ti1ih c ố định
của m ỗi Ịoài.
1
C i^ phương pháp phân tích độc tố vi nấm hay dùng: sắc ký bản m ộng, sắc ký
lòng h iệil năng ca o (H PL C ) với các detector có độ nhạy c a o có thể tiến tới tự động
hoá quá trình phân tích, sắc ký khí-lỏng được sử dụng trong phân tích hầu hết các
độc tố. í^ây là kỹ thuật cần thiết trong phân tích các hợp chất không phát quang với
ngưỡng ^hát hiện thấp như epoxytrichothecen. Trong m ột s ố trường hạp được gắn
với thiết bị khối phổ.

G ịhi đây cá c phương pháp m iễn dịch được ứng dụng để xác định độc tố vi
nấm vớiị cá c ưu điểm nhạy, nhanh và sỉr dụng đơn giản. N guyên tắc của phương
pháp ciựẰ trên sự tương tác giữa các kháng nguyên (dộc tò' vi nấm ) và c á c kháng thể
đặc hiệu của đ ộn g vật. Đ ó là: m iễn nhiễm -phóng xạ, m iỗn nh iễm -enzyiĩi, sắc ký ái
lực-m iễri nhiễm .
í

11.6.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

i
I_ _ _
1 1 .6 .2 .1 . P h á n tíc h a fla to x in

Thực phẩm c ó thể bị nhiễm nhiều loại độc tố aAatoxin như các aAatoxin B l,
B2, G l, G 2. C húng c ó nguồn gốc từ nấm sợi và có trong các thực phấm bị nhiễm

293
tạp trực tiếp, nghĩa là chủ yếu c ó Irong các thực phẩm c ó nguồn g ố c thực \'ật. Trong
thực phẩm c ó Iigiiốn g ốc dộng vật mà đặc biệl là các sán phấm từ sữa Iihiềrn tạp
ihứ cấp do vậl chủ ãn phải thức ăn có chứa aílaloxin . cầĩi phái kể đến aílatoxin M l.
T heo quy định của Pháp, hàm lượng aflato,xin BI là ihôn g số duy Iiliãt cán xem xét
khi dánh giá độc tính của thực phám, trong khi đó pháp c h ế cúa M ỹ lại quy định
hàm lượng aflatoxin nhiẻm tạp phải là tổng hàm lượng của a n a to x in B l, B2, GI và
G 2.

u. Clniđii bị m ầu

D ung dịch aílatoxin loãng kém bền, nó bị phán hiiỷ dưới tác d ộn g của ánh
sáng nên cần được pha mới thường xuyên. N goài ra aflatoxin còn là chất gây ung
thư mạnh nên thao tác phải được tiến hành cẩn thận và tuân thủ cá c n gu yên tắc. Pha
dung dịch aflatoxin trong benzen-axetonitril (9 0 + 10), đạt nồng độ 10p.g/m l.

b. Phiừtng p h á p nliaiìlì sử dụng cột nlicSi â p dụng cho sân p h ẩ m run quủ

C ó nhiều phương pháp định phân aílatoxin. Đáy là phương pháp với các lai
điểm nhanh, đơn giản, kinh tế, c ó khả nãng áp dụng trên hầu hết các nguyên liệu và
ch o phép phân tích định tính bước đầu, nliưiig không thể áp dụng trong trường hợp
mẫu phân tícli c ó chứa chlorophyl.

c. Phương p lú ip s ắ c ký bcỉit lìiỏiig - Plìươiìg p h á p C E E ( rcni qitả)

V ới những sán phẩm “đơn giả n ” thì việc phân tích sử dụng sắc ký đơn chiều
cũng đủ ch o kết quả đáng tin cậy. Song dối với m ộl số sản phẩm c ó cluíra các chất
c ó khả năng làm rối loạn quá trìiih phân tích (ví dụ các dạng thực phẩm từ gia súc
có chứa ch lo roỊ)hyl) ihì cần có sự can thiệp của sắc ký bản m ỏng 2 chiều.

d. Phương p h á p IIP L C

Mẫu phân tích được chiết, lọc, pha loãng và ch o di qua cột ái lựr m iền nhiẻm
c ó chứa kháng thể dơn dòng. Kháng thể dơn dòng này đặc hiệu với các độc tô'
aAatoxin B l , B2, G l , G 2. Đ ộc tố dược tách, làm sạch , làm giàu trên cột, sau đó
được tách khỏi cột bàng m etanol. Đ ộc tố aflaioxin tổng sô' được x á c định bằng máy
đo huỳnh quang sau khi đã clio phản ứng với dung ciịch brom (plurơng phá|) SFB).
Các aílatoxin riêng biệt được xác định bằng phương pháp sắc ký lò n g hiệu năiig cao
với pliủn lìnig iod sau cột (pliirưng pháp PCD).

294
 I I . 6.2.2. Phán tích epoxy-tricotecen

Fipoxy-tricotecen là các độc tố gây ra bởi các loài iliLiộc chi Fiisariiifìì,
Síacliỵhotrvs và nhiều chủng nấm m ốc khác. C'hĩmg Ihirừng đươc tìm thấv trong
ngũ cốc mà đặc biệt là trona ngô. Hiện tượng nhiễm dộc g a y ra bới các độc tố này
tươnií dối ngh iêm trọng do con người rất nhạy cảm \'ới d ộc tính cùa cliiìiig: cỉộc tô'
nhóm này là các tác nhân A T A (A leu cie Toxique A lim entairc), các 'ác nhân làm
suy giàin khả năng m iễn dịch gây ra hiện tượng suy giám bạch cầu.

Các phương pháp phân tích hiện có đều dựa trên kv thuật sác ký khí-lóng.
D esoxyn ivalen ol (vom itoxin ) là độc tố duy nhất có thế xác định bằng sắc ký bán
m ỏng.

a. C á c test sinh học

- Úc c h ế quá trình sinh trưởng của ỉym phom cytes tnuriiis in vitro: ch o biết
kết quả sau 48 h và đo trực tiếp được khả năng su y giảm m iễn dịch cùa
dịch ch iết phân tích.

- Đ ặc tính hoại da: chất chuẩn được chọn có thế là độc tố T -2. Đ ộ n g vật sử
dụng trong thí nghiệm có thể là chuột do phản ứiig của chúng với độc tố
tươpg đối ổn định

b. K ỹ thuật R O M E R , B O L ỈN G vù M c D O N A L D

Phương pháp này sử dụng kỹ thuật sắc ký khí-lỏng, với các mầu nhiễm độc
ở mức thấp m uốn xác định cần phải sử dụng thêm một detector c ộ n g kết điện tỉr.
Với detector cộn g kết điện tử, c ó thể phái hiện ở mức 100 ppm với T -2 và 25 ppm
với d iaxetoxyscirp en ol, c ó thể tăng độ nhạy hơn nữa trong Irường hợp cần thiết. Với
detector ion hóa ngọn lửa không vượt quá Iigưững 250 ppin dối với T-2 và 150 ppm
với d iaxetoxyscirp en ol. N gưỡng phát hiện này có áp dụng được trong kiểm tra thức
ăn gia siic s o r g không thể áp dụng với thức ăn cho người.

c. Phân tích deoxxiiÌYuleiioí ( D O N )

Phương pháp dựa trên việc xác dịnh các vết huỳnh quang trên sắc ký bản
m ỏng tạo ra bởi các dẫn xuất từ phản ứng giữa DON và N H 4CI ở 120"C. G iới hạn
xác định của phương pháp là 100 ng/g (hay 100 ppb).

295
 11.6.2.3. Phân tích learalenon

Zcaralenon là đ ộc tô' c ó hoạt tính oestrogen không m ong inuốii, nó thường

nhiễm vào ngũ cố c inà đặc biệt là n gô với hàm lượng đôi khi lất lớn. Phương pháp
m ô tả dưới đáy ch o phép đạl mức tối ưu giữa hai tiêu chí: "dộ cliíiih xác của phép
địnli phân/ .nức dộ dan giản-jýài-4p d ụ Ạ f e ’V C Q £ ^ d Q ạ g pháp
c ó thể tiến hành trên T L C hay trên HPLC. G iới hạn dirới của phương phẩp là 0,01
m g/k g hay 10 ppb khi sử dụng HPLC và 0 ,0 2 m g /k g hay 2 0 ppb với TLC.

ỉ 1 .6 2 .4 . C á c p h ư ơ n g p h á p m i ễ n d ị c h h ọ c

Troi g rố các phương pháp hóa-m iễn dịch, phương pháp m iễn dịch ịphóng xạ
hay radio- m m u n o-assay (R IA ), phương pháp en zym h ọ c m iễn dịch h a y ien zy m e-
linked-im rL uno-sorbent-assay (E L ISA ) và ái lực m iễn nhiễm (im m im o affinity)
đirợc sử d ụ og trong định phân độc tò' vi nấm.

Hai phương pháp R IA và ELISA dưa trên sự cạnh tranh liên kết gili'a độc tố
chưa biết (Ịua mảu phân tích vớ i độc tố đã biết cùa mầu chuẩn trên VỊ trí Ịđặc hiệu
cùa kháng |h ể .

Á i lipt m iỗn nhiễm (im m u n o-affin ity) là kỹ thuật sắc ký dựa Irực tiếp trên sự
liên kết giĩỊỉt kháng n gu yên (đ ộc tố) với kháng thế dược c ố định trên cột. ■

a. Phương pháp RIA

Phưciig pháp này cần c ó sự tiếp xúc đổn g thời giữ a mẫu phân tích Ịhay mẫu
chuẩn với ịlàm lượng đ ộc tô' dã biết không đ ổ i và kháng thể đặc hiệu. Độcị tỏ' tự do
và độc tố ìên kết với kháng thể sau đó được phân tách và tiến hành đo hoạt tính
phóng xạ c ua từng phàn đoạn. N ồn g đ ộ độc tố của m ẫu phân tích được xác clịiih dựa
trẽn đường chuẩn xây dựiig bởi ti lệ giữa hoạt tính phóng xạ của phân đoạlỊ liên kết
và hoạt tíi ,h phóng xạ của phân đoạn tự do với logarit nồng đ ộ độr tố củ a mẫu
chuẩn.

h. Phương lá p E L IS A

Phương pháp ELISA có hai dạng;

- V ới kỹ thuật trực tiếp, kháng thể đặc hiệu với hàm lượng xác dịnli đirợc cố
định irên bản sắc ký. Dung dịch mẫu phân lích và m ột Lrợng đã biết

296
 không đổi của liên hợp “độc tổ -en zy m ” được ủ đồiig thời với nhau. Sau
khi lửa, liên hợp độc tố-en zym giữ lại trên bản sắc ký thông qua kháng
thể được tách ra bằng cách sử dụng một cơ chất tạo m àu đặc hiệu với
enzym . Đ o cường độ màu bằng m áy hoặc đánh giá bàng rnắt thường.

- Vótt-kỹ thuật-g iá u úép , d ệ e tế é u ợ e c ố đ ịn h irên bản sắ c ký thôt^ qua một

lìén hợp đ ộc tố-polypeptit. Sau đó dung dịch m ẫu phân tích và Ểriột lượng
xác định kh ôn g đổi kháng thể được ủ đổn g thời với nhau. Sau íịông đoạn
lượng kháng thể gắn kết vào bản sắc ký sẽ được x ác định tằ n g cách
sử dụng m ột liên hợp enzym “en zy m -im m u n o g lo b iilin (kháng thể đặc
hiệu)”. Cường độ m àu tạo thành sau khi c h o c ơ chất sinh m àii đặc hiệu
yới enzym được đo bằng máy hoặc đánh giá bằng mắt thường. I

c. Sắc kỷ ậi lực m iễn nhiễm (iiìimiino-affiiiity)-ỈAC

V i (ĩột c ó chứa silic hay sắc ký bản m ỏn g kết hợp với quan sát duì® đèn ư v ,
sắc ký lỏiỊg hiệu năng ca o H PLC kết hợp đo cường độ huỳnh quang, teật RIA và
test ELIS/V. Với các sản phấm rau quả và ngũ c ố c thì cần phải tiến hành iẩông đoạn
tách chiếti trước khi ch ạy lA C . N gư ợc lại với các chất lỏ n g sin h học tìhir huyết
Ihanli, nưcisc.tiểu hay sữa thì hai công đoạn tách chiết và tinh ch ế độc tô' từ mẫu phân
tích clirợc ^ến hành dồn g thời. '
i

I 1 Ị . 3 .THỰ C HÀNH

lỉà tị 5 . X á c đ ị n h h ù m lư ợ n g a f l a to x i n
1
l . ỉígityêii lắ c

A fl4toxin được ch iết tìr mẫu thử bằng các hệ dung m ôi hữu c ơ kỊiác nhau.
D ịch c h iế i được lọ c , m ột phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicage® (florisil,
SPE). Làii^ bay hơi dung dịch rửa giải và hòa tan cặn với dung m ôi pha động rồi
bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng ca o (H PLC).

2 . ỉĩế a ch ấ Ị,thì(ổ ờ th ở

Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích sắc ký nếu không có
các chi dẫn riêng nào khác.

297
 Các chiián allatoxin B I . B2, G 1, G2; A xetonitril;

M etanol; T oluen;

Hexan; Natri siilíat khan;

C lorofooc; C elit 545;

E te e ty lic ; K hí N 2 tinh khiết.

S ilicagel G -6 0 (hoặc ílorisil) dùng cho sắc ký cộ t, cỡ hạt 0 ,0 6 3 -0 ,2 m m . Hoạt

hóa bằng cách sấy khô ở 10íĩ"C trong một g iờ , sau đó trút vào bình tam g iác nút
m ài, thêm nước với tỷ lệ Im l nước cho lOOg silic a g e l, đậy nút, lắc đến khi trộn
hoàn toàn đềi', bảo quản 15 giờ trong bình kín.

Chuẩn bị dung dịch aAatoxiii chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát,
tránh ánh sáng): D ung dịch aflatoxin chuẩn B l, B2, G l , G 2 (dung dịch A ) lán lirợt
lấy ống chuẩn Im g m ỗi loại cho vào 4 bình định mức lOOml và định mức đến vạch
hỗn hợp toIi'en-axeton iư il 98:2 (v/v) (nồng độ dung dịch aA atoxin chuẩn là
10).ig/ml).

D ung dịch aA atoxin chuẩn làm việc (dung dịch B): C ho vào bình định mức
lOml lần lượt 0 ,5 m l aflatoxin B l, 0,5m l aflatoxin G ! , 0 ,l m l aílatoxin B2, 0 ,lm l
aílatoxin G 2 (dung dịch A ở trên), định mức đến lOml bằng hỗn hợp toluen-
axetonitril 98:2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0 ,5 ụ g /m l đối với B l, GI và 0 ,l|j,g /m l
đổi với B2, G 2.

Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflaloxin chuẩn (dim g dịch A , X ụ g/m l)
bàng quang phố hấp thụ phân tử U V -V IS, bước sóng từ 35 0 n m , so với mẫu tráng
(tolu en /axeton itril), tính kêì quả theo công Ihức:

lOOO.m.A
X (|.ig/m l) = ------ — —
c

trong đó :

m - khối lượng phân tửaflatoxin;

A - mật độ quang ớ bước sóng hấp phụ cực đại;

e - độ hấp thụ phân tử của allatoxin.

298
 B ả n g 11.6.3. Độ hấp thụ phân tử của aílatiOxin
r......
Aílatoxin m Dung môi toluen-axetonitril )jr»ax c

(v/v) (nm) (cm mol)

BI 312 98 :2 350 19800

B2 314 98 :2 350 20900

GI 328 98 ;2 350 17100

G2 330 98 :2 350 18200

Bào quản:

Bào quản ở 0"c, dung dịch A để được 6 tháng và đu n g dịch B đ ể được hai
tuần.

D ụng cụ, thiết bị

HPLC với đrìii dò ƯV; lỉơm hút chân không;

Càn phan tích lO^g; Pipei cá c loại;

M áy nghiền; Pipet Pasteur;

Cất qiir.y chân không; Giấy lọc;

M áy ly tâm ; Xvlanh;

Máy kliLiấy từ ; Bộ phcii hút chân không.

Cột sắc ký thủy tinh, đường kính trong 22m m , dài 3C)0mm, c ó khóa nút mài
thủy tinh hoặc teílo n và bình đựng dung m ỏi phía trên, dung lích 2 5 0 m l.

4. C ách tiên hành

4.1. Chuẩn bị mẫu

(Đ iều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng).

Chiết Xiiất:

Càn 5Ca m ầu đã nghiền Iihò ch o vào bình nút mài 5 0 0 m l. C ho tiếp 25m l
nước, 25g celite 54 5 , 2 50m l clo ro ío o c, đậy nút chạt. Lắc trong 30 phút bằng m áy
lắc quay tròn hay m áy khuấy từ (hoặc lác kỹ bàng lay) rồi lọc qua giấy lọc gấp

299
cạnh, bỏ lOml dịch lọc dầu sau đó lấy 50inl dịch lọc tiếp theo (tương đương lOg
mẫu thử), N ếu tốc độ dịch lọc xuống chậm , ch u yển sang phều Biichner c ó chứa 1
lớp celite 545 dày 5m m trên g iấy lọc và dùng hút chân không.

Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký:

C ltu É I b ị SẮC i£ỹ: Q i o m ộ Ị íf B ỡng vậio đ a ỹ ^ ^ sắc k ý tìíSm ỗ g l ia tr i sunfat

khan. Đ d c lo r o ío o c đến 2 /3 c ộ t, sau đó ch o lOg silic a g e l dùng ch o sắc l;ý cột, vừa
ch o vừa nhẹ thành cột ch o silic a g el lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khặiấy nhẹ để
tránh bọỊl khí. M ở khoá ch o clo ro ío o c chảy xu ốn g từ từ. Khi tốc đ ệ lắng của
silic a g el Ịchậi.i lại, rút hết clo ro ío o c ch ỉ đ ể m ột lớp 5cm phía trên Idp silica g el.
Thêm từịtừ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clo ro ío o c đ ến gần sẩỊt lớp natri
su n íat klian trên. C ột s ilic a g e l thu đư ợc p h ải m ịn , k h ô n g c ó b ọt k h í và c^ú ý không
để cột bị khô k ể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 5 0 m l dịch lọ c trênlvới 150ml
/;-hexan,ịđổ cẩn thận vào cột sắc khí đã chuẩn bị như trên. L oại bỏ dung dịch chảy
ra. Cho tịếp 150m l ete ety lic khan, loại bỏ dung dịch ch ảy ra. Chú ý kh ôiịg đ ể cột bị
khô, lưii ìượng dòng chảy khoảng 8-12m l/phút. '

R ỉ a g iai aA atoxin bằng 150m l hỗn hợp m eta n o l-clo ro fo o c (3:97Ji. Lấy toàn
bộ dịch (ỉhảy ra k ể từ khi bắt đầu ch o dung dịch rửa g iả i ch o đến hết. ịLiru lượng
dòn g chả^ như trên. L àm bay hơi dung dịch rửa bằng m á y cất quay chân ịkhông cho
đến khi pòn khoảng 2 -3 m l ỏ nhiệt đô thấp hcm 50" c. C huyển sang ố^ g nghiệm
lOml, trííịng rửa bình cầu bằng clorofocx: và làm bay hơi đến khô trên n ồ í cách thuỷ
ờ nhiệt (|õ thấp hcm 50" c, tốt nhất dưới luồn g khí nitơ nhẹ. H òa tan cặiị bàng Iml
dung m ô ị pha đ ộn g và bcím vào HPLC. I
i I

4 . Ị Đ iể u k iệ n c h ạ y m á y Ị

Cệịt C -i8 (25cm X 4,6mm X 5f.im); Tiền cột C-18 (2cm X 4,6mm X ỹỊ-im);

N l|iệt độ cột 30”C; ị

Phịl động: M eian ol/H sO (5 0 /5 0 );

1
CliíHIỘ điạy fíftng, tốc độ đồng 1mVmin:

D electer U V ; 365nm ; 0,02A Ư F S .

300
 4.3. Tiến hành phân tích

Bơm 20 ịi\ mẫu phùn tích vào m áy HPLC và chạy th eo c h ế độ ở trên.

5. K ếỉ q u ả

So sánh thời gian lưu của m ỗi đinh so với đỉnh chất chuấn để định tính.

S o í ánh ch iều cao (h) hoặc diện tích của m ỗi pic (S|) với pic chất chuẩn tương
ứng (S,„) đ i tính định lượng.

Hàrp lượng aA atoxin từng loại trong mẫu (m g /k g ) được tính th eo c ô Ig thức;

s,-c,.v
X. =

trong đó:

Si diện tích pic tương ứng của mẫu phân tích c ó chất “i” ;

s,, ; diện tích pic tương ứng của m ẫu chuẩn c ó chất “ i”;

Ci I nồng độ chất “i” c ó trong m ảu chuẩn, (^g/ml;

V th^ tích dịch ch iết m ẫu cu ối cù n g , ml;

m : khối lượng m ẫu phân tích, g.

11.7. MỘT SỐ THÀNH PHẦN KHÁC

11.7 .1. GIỚI THIỆU

N g c li những đ ộ c tố thường xu y ên được kiểm soát, thì trong thời gian vừa
qua nh iềa chất gây đ ộc được phát hiện trong thực phẩm . Đó là chất
3 -m o n o c h p r o p r o p a n -l,2 -d io l (3-M C P D ) trong nước tương, x ì dầu; chất m elam in
trong sữa bột và sản phẩm từ sữa (nhập từ Trung Q u ốc); hàn the trong I)ánh phở,
bún; dư l ư « g nitrat, nitrit trong sản phẩm thịt.

Trong phảiTnaỹT cKung^tSTcHiTỹHrgĩớI thĩệu cấc~]^ữỡng phân tích m ấy

nhóm chất sau: Chất tạo ra trong qui trình cô n g nghệ như 3-M C PD ; Chất bổ sung
vào thực phẩm nhằm m ục đ ích tăng “hàm lượng đạm tổn g s ố ” nhưng lại gày độc

301
Iihir m elam in; N hóm ptui gia tạo màu và ốn định màu \'ượt quá giới hạn ch o phép
như nitrit, nitrat trong báo quán, c h ế biến thịt; Chất tây trắng, khử trùng dùng trong
công nghệ c h ế biến, Iihim g không được loại bỏ triệt dế trong sản phẩm cuối cùng
như SO2.

11.7.2. CHẤT 3-MCPD VÀ MELAMIN

11.7.2.1. C h ấ t 3 - M C P D

a. K hái niệm

Chấl 3-M C PD thuộc nhóm hóa chất gây độc có tên g ọ i chung là
chloropropanol, côn g thức phân tử C,H7C102, khối lượng phân tử 110,5.
OH

,CH
H^C CH,

OH Cl

3-M onochIoropropan-1,2-d iol (3-M C P D )

Cliloropropanol c ó các dẫn xuất 1,3-DCP; 2-M C PD ; 2 ,3 -D C P và 3-M CPD.

Trong đó, 3-M C PD có hàm lượng cao nhất và tồn tại dưới dạng hỗn hợp racem ic
của 2 đồng phân (R ) và (S) (hàm lượng của 2 đồn g phân đối quang bằng nhau
50:50).
OH C1 Cl

.C H .CH CH
H^C ^C H , H2C '^CK H2C CH,

Cl OH OH OH Cl
Cl

.3-dichloro-2 propanol 2-monochloropropan-1,3-diol 2,3-dichloro-2-propanol

(1.3-DCP) (2-MCPD) (2.3-DCP)

b. Sự hình thànỉi troiig thực plìẩm

Chất 3-M C PD được hình thành qua phản img giữa chất b éo với các chất có
chứa Clo thường xảy ra irong quá trình thủy phân chất đạm thực vật bằng acid

302
clohidric. Phản ứng được thúc đáy nhanh h(ín khi \á y ra ò nhiệt dộ cao. D o dó
thường gặp trong nước tưưng, bánh rnì, phomat, xúc xích ... nhất là troiig lurớc
tương, do nhà sản xuất dùng protein thực vật thủy phàn bàng axit clolivdric dể làm
tăng hưửiig vị trong quy trình sún xuấl nước tương, dây là khâu thủy phân đạm
trong khô dầu đậu nành.

c. T ác hại của 3 - M C P D

Các nghiên cứu \ ’ề độc tính của 3-M C PD dã được tiến hành từ những nám
1994 và đến nay đã cho thấy 3-M C PD có khả Iiăng gây ung ihư nếu sứ dụng dài
ngày. N guy hiểm hơn nữa, 3-N4CPD có thể chuyển hóa thành 1,3-DCP là chất gãy
kliối u thận, gan, luyến giáp và biểu hiện ung thư do biến đổi g e n ... trêii chuột cống
nếu sử dụng dài ngày với liều lượng 19m g/kg thể trọng/ngày. N hữiig nghiên cứu
trên vi sinh vật và dòn g tế bào ch o thấy 3-M C PD có thể làm thay đổi quá trình nhân
bản gen.

d. G iới hạn c h o p h é p

N ồng độ tối đa 3-M C P D ch o phép trong một kg nước tương của các nước
Iihư sau:

. Canada, Phần Lan, Á o, Các tiểu vương quốc Ảrập: im g /k g

. Mỹ: 1m g /k g ch o 3-M C P D và 0,0 5 m g /k g cho 1,3-D C P

. Ú c và N iiidilân; 0 ,2 m g /k g ch o 3-M C PD và 0 ,0 0 5 m g /k g ch o 1,3-D C P

. Liên hiệp Châu  u . í ỉà Lan, Hy Lạp, Bổ Đ ào Nha, M iilaysia, Thụy Điển:

0 ,0 2 m g /k g

. Anh: 0 ,0 1 m g /k g

• JECFA ( ủ y ban hỗn hợp chuyên ngành về Phụ gia thực phẩm): 0,4m g/k g

. V iệt Nam: Im g/k g

e. Phươníị p h á p Xíĩc địiili

Phương pháp phân tích 3-M C PD ở tất cả các phòiig xét nghiệm được cấp
g iấy phép hoạt độn g đểu kiểm nghiệm theo một phương pháp thống nhất: đó là
phương pháp Sắc ký k h í/ Khối phổ (G C /M S).

303
 Ỉ L 7.2 .2 , M e l a m i n

a. K hái niệm

M elam in là một bazơ hữu cơ ít tan trong nước c ó cô n g thức hóa học là
danh pháp theo lU P A C là l,3 ,5 -tria zin '2 ,4 ,6 -tria m in , khối lượng phân tử
126. ------------------ -------- -------- ----------- '■
NH2
Meỉamine

X N (M = 126)

M eiam in là trime của cyanam id, g iố n g như cyanam id , phân tử < ủa chúng
chứa 66% nitơ theo khối lượng. M elam in được ch u y ển hóa từ cyrom azilỊ trong cơ
thể của động thực vật. M elam in kết hợp với axit cyanuric tạo thành m elam in
cyanurat.

b. ứ n g dụng c ủ a nielamiii và axit cyanuric

M elam in được dùng rất nhiều trong cô n g nghiệp sản xuất k eo dán l^^ong công
nghiệp đổ g ỗ , dụng cụ đựng thức ăn, m iến g ch ố n g ch á y , thuốc trừ sâu, bhân bón.
A xit cyaiỊuric là m ột chất c ó cấu trúc tương tự với m ela m in , thường c ó Ịĩiặt trong
bột m elam in không tinh khiết. Chất này được Cục Q uản lý thuốc và T liực phẩm
Hoa K ỳ (|FĐA) chấp nhận được thêm vào trong Ihức ăn của độn g vật n h » lại. A xit
cyanuric còn có trong nước của các hồ bơi được khử IrtỊng bằng
dichloroisocyanurat.

c. Sựliẩp'tlụi m eìam in và axit cyaniiric ở người

D o m elam in được sử dụng rộng rãi trong đời số n g nên n goài v iệc tiệ'p xúc với
dư chất nielam in qua đường hô hấp do hậu quả của sự ch u y ển h óa (^flOBiazin (m ột
loại thuốcí trừ sâu), con người còn c ó thể bị n gộ đ ộc d o thôi nhiễm m ellỊn in từ các
dụng cụ đhứa đựng thức ăn (m à không phải là sự trộn lẫn m elam in vào tlự c phẩm)
bởi các tiiực phẩm có chứa axit như nước chanh, nước cam hay sữa djỊng cục, ở
nhiệt độ cao. Hàm lượng m elam in được hấp thu qua đường ãn uống từ tất cả các
nguồn thôi nhiễm trên ước tính vào khoảng 0 ,0 0 7 m g /k g cân nặng/ngày (O E C D -
Tổ chức hợp tác và Phát triển kinh tế, 1998).

304
cl. T á c h ạ i c ủ a nìelatìiin

M elam in có đ ộc tính thấp, nhim g khi chúng kết hợp với acid cyanuric sẽ gây
nên sỏi thận do tạo thành hợp chất không tan m elam in cyanurat. Khi đưa m elam in
vào cơ thể có thể dẫn đến tác hại về sinh sản, sỏi bàng quang hoặc suy thận và sỏi
thận, c ó thể gây ung thư bàng quang. Trẻ em Trung Q uốc dùng sữa có chứa
m elam in đã ch o thấy tác độn g cỉia hóa chất này đới với con người cũng giống với
nhiều kết quả thử nghiệm lâm sàng trên súc vật. Một số nghiên cứu trên súc vật cho
thấy m elam in c ó khả năng gây ung thư. M elam in không được chuyển hóa và nhanh
chóng đirợc đào thải trong nước tiểu với thời gian bán hủv trong huyết tương là 3
giờ. M elam in có độc tính thấp, liều uống gây chết LDsii ở chuột là 3161 m g/kg thể
trọng (O E C D 1998).

Hiện tại chira có nhiều nghiên cứii về nhiễm độc m elam in ở con người qua
đường ãn uống. Các khảo sát trên chuột, chó cho thấy tác hại chủ yếu do nhiễm
m elam in qua đường ăn uống là sự hình thành sỏi bàng quang, viêm bàng quang, phì
đại bàng quang. Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy m elam in trong nước tiểu của chó
và ghi nhận tình trạng tiểu ra máu ở chuột. Phân tích các sỏi bàng quang cho thấy
chúng được cấu tạo bởi m elam in và axit uric, hoặc bởi m elam in trong một hỗn
hợp protein, axit uric và photphat (O E C D 1999).

M elam in không có tác dụng gây độc cho gen ở in vitro lẫn in vivo. Theo
nghiên cứu của lA R C (Chi nhánh quốc tế nghiên cứu vể U ng thư) của W HO,
m elam in có khả năng sinh ung thư trên các động vật thí nghiệm nhưng chưa có
chứiig cứ đầy đủ về khả năng sinh ung thư ở người (lA R C 1999).

e. G iới liụii clìo p h ép

N gày 1 2 /1 2 /2 0 0 8 , Bộ Y tế V iệt Nam đã ban hành quy định 3 8 /2 0 0 8 -Q Đ -

B Y T “Q uy định m ức giới hạn tối đa cùa m elam in nhiễm ch éo trong thực phẩm”.
T h eo đó, hàm lượng m elam in trong thực phẩm không được vượt quá 2,5m g/k g thực
phẩm . R iêng đối với thực phẩm dành cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi, không được
vượt quá 1,0 m g/k g thực phẩm. G iới hạn trên sẽ được thay đổi khi có cơ sở khoa
học về độc tính của m elam in và các chất liên quan do W H O và FA O côn g bố.

305
/. PliươiiịỊ pháp .xác dịiili

C ơ quan 1’hanh tra \'à An toàn thực phắm (Í-SIS) thuộc Ỉ3ộ N ô n g nghiệp l ỉoa
Kỳ (U SD A ) dã đưa ra phương pháp phân tích xác dịuh cyrom azin và inelaniin trong
tế bào động \'ật. Năm 2 0 0 7 , cơ quan PDA của M ỹ dã bắt đầu sử dụng HPLC để xác
định m elam in, am inelin, am iĩielid, và axit cyan iư ic c ó trong thực phám. Một sô'
phương pháp !;liác được sử dụng là phổ Raman (SER S) hoặc L C /M S /M S ...

11.7.3. NITRIT, NITRAT VÀ SO2 ,

Nitrit và nitrat chủ yếu dừng tạo màu và giữ ổn định màu trong sản phẩm thịt.
SO2 dùng tẩy trắng nước mía trong sản xuất đường, đồn g thời là chất diệt khuẩn.

11.7.4. THỰC HÀNH

B à i 6 . X á c đ ịn h 3 -M C P D

1. N guyên tắc

Mầu được ch o hấp phụ qua cột extrelut, tiến hành rửa g iả i 3-M C P D bằng
dietyl ete. Sau đó ch o tạo dẫn xuất với dung dịch acid to lu en -4 -su lfo n ic trong
axeton thành 4 -(clo m ety l)-2 ,2 -d im ety l-l,3 -clio x o la n , phản ứiig này được thực hiện
tại 40"C, trong 9 0 phút. Sau đó đo trên m áy sắc ký khí với detector khối phổ
(GC/M S).

2. D ụng cụ, tliiêt hi

a. Dụng cụ

Cân phân tích 10"*g ; Pipet Im l, 2 m l, 3m l, 4m l, 5ml;

Bình định mức các loại; ố n g n gh iệm c ó nắp 3m l, lOml;

Bình cầu cất 250m l; X ylanh , đũa thủy tinh;

C ốc thủy tinh 10, 50, lOOml; Phễu lọ c , g iấ y lọc.

b. Thiết bị

Bộ cất quay chân không ;

Hệ thống m áy sắv ký khí khối phổ.

306
 Y êu cầu đối với hệ thống sắc ký khí khối phố (GC7MS): Có thể sử dụng hệ
thống Trace G C -Trace M S Pliis (hãng sản xuất Thermo Pinigan) hoặc các hệ thống
máy sắc ký khí khối phổ tương đương với cấii hình kỹ thuật tối thiểu: Đ ầu dò khối
phổ; Bộ phận tiêm mầu ch ia/ không chia dòng (Split/ Splitless Injector), chương
trình nhiệt độ (PTV Injector: Programmed Temperature Vaporation Iiijector); Cột
sắc ký m ao quản SPB - 1701, dài 30m , đường kính 0,25m m , lớp film 0 ,2 5 ụ in .

Đ iều kiện chạy m áy

Đ iều kiện sắc ký: Chương trình nhiệt độ cột: nhiệt đ ộ đầu 45"C ( l phút), sau
đó tãng lên 120"C(6'’C / phút), tiếp tục tăng nhiệt độ lên 250"C (1 5 ‘’C / phút), giữ ờ
nhiệt độ này 5 phút; T iêm mẫu: với c h ế độ không chia dòn g, nhiệt độ bộ phận tiêm
mẫu: 250"C, thể tích mẫu tiêm: 2 |il; Tốc độ khí mang He: 1,5 ml/phút.

Đ iều kiện khối phổ

M S Tune file: N gu ồn ion hóa: EI; N ăng lượng ion hóa: 70eV ; N hiệt độ
nguồn ion: 180‘’C; N hiệt độ Interĩace: 20Ơ ’C, Giá trị của bộ khuếch đại Miiltiplier;
3 0 0 - 5 0 0 V.

M S m ethod: C h ế độ quét Piillscan: thời gian quét; 5 - 1 5 phút, khoảng khối

quét: 35 - 150 amu; C h ế độ quét ion chọn lọc SIM ( Selected lon M onitoring): số
khối lựa chọn dể quét: 135, thời gian quét: 6 - 1 0 phút.

3. H ó a chất, tììitốc thử

a. Hoá chất, thuốc thử

H óa c h ít sử dụng c ó độ tinh khiết phân tích (TKPT), dung m ôi là dung môi

dùng ch o sắc ký.

Chất chuẩn 3-M C PD ; Ethyl axetat dùng cho sắc ký;

D ieth yĩ ete dùng ch o sắc ký; Natri clorua bão hoà;

A ceton dùng ch o sắc ký; Khí nitơ 99,999% ;

A cid toluen -4-su lfon ic; Khí heli 99,999% .

307
 Cột Extrelut: D ùng xylanh 6 0 m l, nhồi bông thủy tinh vào đầu ố n g xylanh.
Sau đó ch o tìr từ lOg hạt Extrelut vào xylanh , dùng đũa thủy tinh g õ nhẹ vào thành
ống ch o hạt xu ốn g đều và chạt.

b. Pha c h ế dung dịch

D ung dịch acid tolu en - 4 - su lío n ic trong A x e to n (I g //): cân chính xác
0 ,1 0 0 0 g axit toluen - 4 - su lío n ic ch o vào bình định mức lOOml, định m ức đến vạch
bầng axeton, lắc đểu. D ung dịch chuẩn 3-M C P D lOOppm: cân chính xác 0 ,0 1 0 0 g
3-M C P D ch o vào bình định m ức lOOml, định m ức đến vạch bằng ethyl acetat, lắc
đều. D ung dịch chuẩn 3-M C P D lOppm: hút Im l dung d ịch 3-M C P D lOOppm vào
bình định mức lO m l, định m ức đến vạch bằng ethyl axetat, lắc đều. D ung dịch
chuẩn 3-M C P D 200ppb: hút Im l dung dịch 3-M C P D lOppm vào bình định mức
5 0 m l, định mức đến vạch bằng ethyl axetat, lắc đều. D un g dịch chuẩn 3-M C PD
20ppb: hút 2m l dung dịch 3-M C P D 200ppb vào bình định m ức 2 0 m l, định mức đến
vạch bằng ethyl axetat, lắc đều. Các dung dịch chuẩn này được bảo quản trong tủ
lạnh.

4. C á c h tiến hành

a. Chuẩn bị mẫu

Cân 4 g m ẫu, chính xác đến O.OOlg vào cố c thủy tinh 5 0 m l. T hêm vào 8g
dung dịch N aC l bão hòa, khuấy đểu. Cho toàn bộ dung dịch trên vào cột extrelut.
Đ ể ổn định 15 phút ch o toàn bộ nước và chất trong dung dịch phân bố đều trên bề
mặt của hạt cxtrelut. Rửa giải 3-M C P D bằng 150m l d iety l ete. Thu dịch rửa giải
vào bình cầu cất. Sau đó đem c ô quay chân không đến gần cạn, rồi dùng khí nitơ
thổi khô.

b. D ẫn xuất hóa

D ùng pipet hút chính xác 2m l dung dịch axit to lu en -4 -siilfo n ic trong axeton
(I g //) vào bình cầu cất, lắc đều rồi ch u yển toàn bộ dung dịch này vào ống nghiệm
c ó nút. Đật ốn g n gh iệm vào bếp cách thủy ở 40"C trong 9 0 phút, lấy ra để ngu ội ở
nhiệt độ phòng, sau đó ch u yển vào chai l,5 m l đ ể đo trên m áy G C /M S (dịch thử).

308
 c. Chuấn bị mẫu chuẩn

Các mẫu chuẩn theo từng nồng độ xác định được chuẩn bị cụ thể theo các
bước trong bảng 1 1 .7 .3 .6

Bảng 11.7.3.6. Chuẩn bị dung dịch 3-MCPD

Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4

3-MCPD chuẩn (20ppb) Im l 2ml 4ml 6ml
cho vào côt extrelut
Dung dịch sau rửa giải Cô quay chân không đến gần cạn, làm khố bằng N,
Dung dịch axit toluen-4-
2 ml
sulfonic/axeton (1g/Q
Lắc đều, đặt các ống nghiệm vào bếp cách thủy ở
4 0 ° c trong 90 phút.____________________________________
Để nguội ở nhiệt độ phòng, chuyển vào lọ 1,5ml để
đo trẽn máy GC/MS
3-MCPD chuẩn (ppb) 10 20 40 60

d. X ây dựng đường chuẩn

K iểm tra thiết bị đã được chạy ổn định theo các điều kiện đã được m ô tả, lần
lượt tiêm các mẫu chuẩn đã được chuẩn bị ở trên. Ghi lại diện tích pic tương ứng
với tìmg nồng độ. Dựa vào nồng độ và diện tích pic chuẩn, thiết lập phương trình
biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ chuẩn và d iện tích pic.

e. T iến hành phân tích

T iến hanh tiêm m ẫu phân tích vào m áy, ghi lại sắc ký đồ m ỗi lần tiêm mẫu.
Ghi lại diện tích c ó thời gian lưu và phổ khối tương ứng với thời gian luii và phổ
khối của chất chuẩn. Dựa vào phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa
nồn g độ chuẩn và diện tích pic, tính nồng độ 3-M C PD c ó trong dịch thử.

5. K ế t I/U C Ỉ

Hàm lượng 3-M C P D trong mẫu thử được tính theo c ô n g thức sau:

C ..V .P
c (ppm ) =
m

309
trong đó:

c ,; nồng độ 3-M C PD trong dịch thử, ppm;

m: khối lượng mầu đem phâii tích, g;

V: thể tích cu ối, ml;

F: hệ sò pha loãng khi đo (F = l: không pha loãng).

B à i 7. X á c địn h m e la m in

1 . Ngitvêii tắc

M elam in trong sữa được chiết bàng dung dịch axit tricloacetic ở pH=l-ỉ-2.
Dịch chiết sau đó được làm sạch qua cột chiết plia rắn trao đổi cation và phân tích
bằng m áy sắc ký lỏng khối phổ (LC/M S/M S).

2. D ụiig cụ, thiết hị

M áy sắc ký lỏng gh ép khối phổ LC-M S/M S;

Cột sác ký C18 (150m m X 4,6m m X 5 m cm ) và tiền cột C18 (2 0 mm X 3,9 mm

X 5 fim) của hãng W aters. Cột sắc ký HILIC (1 5 0 m m X 4 ,6 mm X 5 tim ) và tién
cột;

M áy ly tâm ; Bộ chiết SPE với hút chân không ;

M áy lắc V ortex ; Cột SPE scx 500m g/3m l;

M áy rung siêu âm ; Bộ lọc dung m ối sắc ký.

Dụng cụ thủy tinh cần thiết;

3. H ó a ^luĩt, ditng m ôi, lliiiấc thử

Chất chiiấn m elam in (Dr. Erhentoffer) ;

N ội chuẩn C '’N ''-m elam in (Cambridge Isotope) ;

A xit pentafloropropionic (PFPA) khi sử dụng cột C 18 ;

A xetonitril (M erck); A m o n i hydroxyt;

M etanol (M erck); A m on i axetat;

Nước cất 2 lần; A x it tricloacetic (TC A ).

310
 4. C á c h íiếỉì lìàtili

4.1. Chuấn bị dung dịch chuấn

Dung dịch chuẩn gốc m elam in 100 ịag/inl: câii chính xác: khoảng 10 m g chất
c h u án m elam in, hò a lan vào nước, siêu âm cho tan hốt và dịnh r.Tiức đ ến lOOml bằng
nước cất. D ung dịch chuấn trung gian m elamin 1 i-tg/ml: hút chính xác Iml dung
dịch chuẩn gốc ở trên ch o vào bình định mức lOOml, cỉịiih m ức đến vạch bằng hỗn
hợp nước cất. D ung dịch nội chuẩn gốc 100 i-ig/ml: mua từ nhà sản xuất, bảo quản ở
4*’c tránh ánh sáng. D ung dịch nội chuẩn 1 i-ig/ml: hút 0,25 ml dung dịch nội chuẩn
gốc 100 Ịig/m l vào bình định mức 25m l, định mức đến vạch bằng nước cất. Dãy
dung dịch c h i’ẩn trong bảng 11.7.3.7 phải chuẩn bị mới hàng ngày.

Bảng 11.7.3.7. Dây dung dịch chuẩn chạy sắc k;ý

Nống độ Dd chuẩn melamin 1ng/ml Nội chuẩn lỊng/ml Nước cất

(ppb) (ml) (ml) (ml)

10 10 50 940

20 20 50 930

50 50 50 900

100 100 50 850

200 200 50 750

500 500 50 450

4.2 . Chuẩn bị mầu

Cân chm h xác 3 -5 g mẫu đã đirợc đổng nhất vào ống ly tồm , thêm 200|.il dung
dịch nội chuẩn l|ig /m l và 20m l dung dịch TCA 1% lác bảng siêu âm 30 phút. Tiếp
lục ly tâm 5 phúl với lốc độ 5 000 vòng/phiìl. Tácli lớp irCn và lọc qua giấy lọc.
C huyển toàn bộ dịch lọc vào cột SPE s c x 500 mg/3ml (cià được hoạt hóa trước
bằng 6m l m etanol và 6m l TCA 1%), rửa bàng 3ml TCA 1% và 3m i Tietanol. Hút
khô cột 1 phút. T iến hành rửa giải 2 lần mỗi lan 2nil hỗn Ihợp m etanol/N H 4 0 H

(9 5 /5 ).

311
 4.3. Đ iều kiện chạy m áy

Đ iều kiện LC:

- Cột: C18 (1 5 0 mm X 4 ,6 mm X 5 Ịim), tiền cột C 18 (2 0 mm X 3,9m m ).

N hiệt độ cột: 30'’C. Pha động: A-dung dịch PFPA 0 ,5 m M ; B -A xetonitril.
C hế độ chạy chia dòng: 0 phút: A/B (9 5 /5 ) đến 3 phút: A /B (9 5 /5 ) đến 5
phút: A /B (5 /9 5 ) đến 7 phút: A /B (5 /9 5 ) đến 9 phút; A /B (9 5 /5 ) đến 12
phút; A /B (9 5 /5 ). T ốc độ dòng 0,5 ml/phút.

- Cộl: HILIC (1 0 0 m m X 4,6 mm X 5 I^m) và tiền cột. N hiệt độ cột: 30"C.

Pha động: A -du ng dịch amoni axetate 2 0 nriM; B -A xetonitril. C hế độ chạy
chia dòng: 0 phút: A /B (1 0 /9 0 ) đến 0,5 phút: A /B (1 0 0 /0 ) đến 6 phút: A /B
(1 0 /9 0 ) đến 12 phút: A /B (10/90). Tốc độ dòn g 0 ,4 m l/phút.

Đ iều kiện khối phổ: N gu ồn ion: ESI (+) 4 0 0 0 V; Cột m a o quản: 2 7 0 " c, 46V ;
K hí phun (N 2): 4 0 đơn vị; K hí bổ trợ (N 2): 10 đơn vị; C h ế độ chạy: SIM 127, SRM
127 ^ 85 (CE: 4 0 V ), SRM 127 ^ 68 (CE: 46V ).

4.4. X ây dựng đường chuẩn

Lập đường chuẩn dựa vào tỷ lệ diện tích hoặc chiều ca o của pic m elam in
chuẩn so với ngoại chuẩn.

4.5. T iến hành phân tích

Bơm 2 0 mẫu phân tích vào m áy LC và chạy theo c h ế độ ở trên. Dựa vào
đường chuẩn tính nồng độ của m elam in trong dung dịch phân lích.

5. K ết q u ả

Hàm luợng m elam in (|ig /k g ) trong mẫu phân tích được tính như sau:

c V
x=
m

trong đó:

c ,: nồng độ melamin trong dịch phân tích, ppb;

V: thể tích dịch phân tích, ml;

m: khối lượng mẫu phân tích, g.

312
 l ì à i 8. X á c đ ịn h h à m lượng nitrit

1. N g u yên tắc

Phương pháp này dựa trẽn việc đo cường độ màu tạo ra khi nitrit tác dụng với
suníatnilam it và N -1 naphtyletylendiam indihydroclorua trong dịch lọc không chứa
protein.

2. H ó a chất

K ali íeroxian u a, dung dịch được chuẩn bị như sau: Hòa tan 106g kali
íeroxianua ng'ậm ba phân tử nước (K4[Fe(CN)is]3H20) trong nước cất, đổ nước đến
dung tích 1 lít. D ung dịch được bảo quản trong bình thủy tinh sẫm màu. Thời hạn
bảo quản không được quá 30 ngày.

K ẽm axetat, dung dịch được chuẩn bị như sau: H oà tan 2 2 0 g kẽm axetat
ngậm hai phân tử nước [Z n (C H ,C 0 0 )2 .2 H 2 0 ] và 30m l axit axetic băng, thêm nước
đến dung tích 1 lít. Thời hạn bảo quản không quá 30 ngày.

A xit axetic băng (CH^COOH)

Natri tetraborat (borac), dung dịch bão hòa được chuẩn bị như sau: Hòa tan
50g natri tetraborat (N a 2B407.10 H2O) trong 1 lít nước cất ấm.

Natri nHrit (N aN O s)

A xit clnhydric (H C l) dung dịch 12,50 m ol/ lít; khối lượng riêng l,1 9 g /m l

Suníatnilam it (NH2QH4SO2NH2)

N - 1 naphtyletylendiam indihydroclorua (CK1H7NHCH2CH2NH2.2 H C l)

D ung dịch để tiến hành phản ứng màu.

D ung dịch I được chuẩn bị như sau: Hòa tan 2g suníanilam it trong 400m l
dung dịch axit clohydric (1 + 1) đổ thêm cùng dung dịch axit clohydric đó đến thể
tích 1 lít.

D ung dịch II được chuẩn bị như sau: hoà tan Ig N-1 naphtyletylendiam in
dihydroclorua trong lOOml nước và thêm nước đến thể tích llít.

Cả hai dung dịch trên được để trong tủ lạnh trong bình thủy tinh sẫm màu,
nút kín. ở điểu kiện trên dung dịch giữ bền trong 7 ngày.

313
 H2SO4, dung dịch 2 ,0 4 m ol/lít (1+4)

Kali pecm anganat (KMnO^) dung dịch 0 ,0 2 rnol/lít, (0,1 N )

3. D ụng cụ, thiết bị

Cối nghiền ,m áy trộn hay m áy xay thịt dùng trong sinh hoạt c o đường kính
các lỗ dưới không lớn hơn 3 mm;

Q uang phổ k ế hay m áy soi màu điện ; Bếp cách thủy ;

Bình địiih mức 100, 200, 1000 inl; Bình nón 2 0 0 ml;

Pipet 2, 5, 10, 2 0 và 25 ml; Buret 2 và 10 ml;

Phễu thủy tinh d= 5 cm; Cân phân tích lO^^g.

Ố ng đong 25 và 50 ml;

4. C á ch tiến lìànli

a. Chuẩn bị thử

Cân lOg lượng mẫu cân, sai số không quá 0 ,0 0 1 g cho vào bình định mức thể
tích 2 0 0 m l, thêm 5 ml dung dịch borac bão hòa và 100 ml nước nón g, lắc đều khi
các m iếng thịt rã ra rồi đun nóng đồng thời thỉnh thoảng lắc trên bếp cách thủy
đang sôi trong 15 phút. Sau khi để nguội bình đó đến nhiệt độ phòng, lại thêm tiếp
lần lượt m ỗi loại 2 m l dung dịch kaliíeroxianua và kẽm axetat để kết tủa protein.
M ỗi lần cho inột loại dung dịch phải lắc đểu, giữ trong khoảng 3 0 phút ở nhiệt độ
phòng, cho thêm nước đến vạch mức, khuấy và lọc qua giấy lọc gấp vào bình tam
giác khô. D ịch lọc dùng để xác định hàm lượng nitrit và nitrat.

Đ ể xây dựng đồ thị chuẩn, hòi\ tan l.OOOOg natri nilrit với nước trong bình
định mức dung tích 100 m l, thêm nước đến vạch mức (dung dịch A ). D ung dịch này
chuẩn bị sau khi đã xác định trước hàm lượng natri nitrit trong c h ế phám , phép xác
định này được tiến hành như sau: cho lOml dung dịch kali pecm anganai (0 ,0 2
m ol//) đã pha loãng bằng lOml nước và axit hóa bằng 2m l dung dịch axit siinfuric
( 1+ 4 ) được đpm chuẩn độ với đung dịch natri nitrit có chứa 0 ,2 g natri nitrit trong
100 ml dung dịch. Im l dung dịch (0,02 mol/l) kali pecm anganat tương img

0 ,0 0 3 4 5 g natri nitrit.

314
 Cho 5ml dung dịch A vào bình định mức dung tích llít và thêm nước đến
vạch mức (dung dịch B). Từ dung dịch B chuẩii bị một loạt dung dịch natri nitrit
chiiấn. Đ ể chuẩn bị các dung dịch chuẩn này, dùng pipet ch o 5, 10, 2 0 ml dung
dịch B Iđn lưđt vào các bình dịnh mức dung tích 100 ml rồi ch o nước đến vạch mức,
lắc đều. Các dung dịch này chứa tương ứng 2,5; 5,0 và 10,0 |0.g nitrit trong Iml
dung dịch. Từ các dung dịch trên lấv mỗi loại lOml cho vào bình địi.h mức dung
tích 100 ml.

Dùng nước cất làm dung dịch kiểm tra.

Cho vào m ỗi bình dịnh mức 10 ml dung dịch 1, lắc đều và để dung dịch vào
ch ỗ tối trong 5 phút. SíUi đó cho vào m ỗi bình 2ml dung dịch II, lắc đều và lại giữ
trong chỗ tối từ 3 đến 10 phút. Cho thêm nước đến dung tích 100 m l, lắc đều và đo
mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 53-8nm, so sánh với dung dịch kiểm tra.

Dựa vào các giá trị thu được xây dựng đồ thị chuẩn trục tung là mật độ
quang, trục hoành là nồng độ nitrit trong dung dịch đã nhuộm màu, tính bằng
ụg/m l.

b. T iến hành thử

D ùng pipet ch o 25m l dịch lọc chuẩn bị theo mục 4 (hoặc ít hơn nhim g dung
tích đo chính xác) vào bình định mức dung tích lOOml, ch o thêm nước đến dung
tích xấp xỉ 60m l và lOml dung dịch I, lắc đều, sau 5 phút ch o tiếp 2m l dung dịch II
và lại lắc đều. Sau m ỗi lần cho một loại dung dịch thì đặt bình vào ch ỗ tối. Sau 3
đến 10 phút ch o thêm nước đến 100 rnl, lắc đều và đo mật độ quang như mục 4.

5. K ế t aiúi

Hàm lượng nitrit (X ), biểu thị bằng sô' m iligam Iiatri nitrit trong 1 kg sản
phẩm, ttược tính th eo cô n g thức sau :

20000
x =c*
m *v

trong đ ó ;

C; nồiio độ natri nitrit, đọc được trên đồ thị chuán tương ứng với mật độ
quang của dung dịch mẫu thử, ụg/m l;

315
 m: khối lượng m ẫu, g;

V: thể tích dịch lọ c, dùng cho phản ímg so m àu. m l.

B à i 9. X á c đ ịn h h à m lư ợng n itra t

1 . Ngiiyéit tắc

Phương pháp dựa trên việc khử nitrat thành nitrit bằng cột ca d im i, đo trác
quang cường độ màu tạo thành khí suníanilam it và N-1 naphtyletylen
díam indihydroclorua tác dụng với nitrit và xác định lượng nitrit đê tính ch u yển ra
nitrat sau khi đã trừ đi lượng nitrit chứa trong sản phấm.

2. H ó a chất

Cadim i suníat (CdS0 4 .8H 2 0 ); D ung dịch được chuẩn bị như sau: H oà tan
37g cadim i siinfat ngậm 8 phân tử nước trong nước và thêm nước đến 1 lit.

Dinatri etylen diam in tetraaxetat (d i-N a-E D T A )

[C H 2N (C H 2C 00H )C H 2C 00N a]2.2H 20

Natri nitrit (N aN O s)

K ali nitrat (K N O ,)

D ung dịch đệm c ó pH từ 9 ,6 đến 9,7 được chuẩn bị như sau: 2 0 m l axit
clohydric, 12,50 m o l// (l,1 9 g /m l), pha loãng bằng nước đến 500m l; s-^.u khi khuấy
đều ch o thêm lOg [C H 2N (C H 2 C 0 0 H )C H 2 C 0 0 N a ]2 .2 H 2 0 , và 5 5m l am oniac
17,75m ol// (0 ,8 8 g/m l). D ung dịch được thêm nước đến llít và chuẩn độ pH.

K ẽm thanh.

T huốc thử và dung dịch chuẩn bị theo bài trên

3. D ụng cụ, thiết bị

M áy trọn; Pipet;

T hiết bị kết tinh; Cột thủy tinh (x e m hình vẽ);

316
 Cột để khửni trat

Hình 11.7.3.9. Cột thủy tinh:

1- binh chứa 50ml ;
2- nút;
3- lớp cadimi ;

4- bình thủy tinh;

5- ống caosu.

4. C á ch tiến hành

a. Chuẩn bị thử

C ho 5-7 thanh kẽm vào cốc có chứa sẫn lOOOml dung dịch cadim i sunfat.
Khi cadim i tạo thành bám vào thanh kẽm , gạt cadimi vào cốc khác. Cadim i thu
được đem rửa 2 lần bằng Ilít nước, sau đó dùng 400m l dung dịch axit clohydric
0,1 m ol// ch u yển cad im i vào m áy trộn, nghiền trong 10 giây. C huyển tất cả từ m áy
trộn sang c ố c phân tích, để lắng, thỉnh thoảng khuấy bằng dũa thủy tinh. N gày hôm
sau khuấy m ột lần nữa để bọt khí lên. Chắt chất lỏng ra sau đó rửa cadim i 2 lần
bằng Hít nước. Đ ể m ột m iếng bông thủy tinh vào dáy cột thủy tinh đã nút sẩn một
đẩu ống, sau đó ch o cadim i vào cột bằng cách đố cùng với nước đến khi được một
lớp cao khoảng 17cm , thinh thoảng vặn cho nước chảỵ ra nhimg không được để lớp
cadim i bị lộ ra. Rửa cộ t cadim i lần lirợt bằng 25m l axit clohydric 0,1 m o l// và 50m l
dung dịch đệm am oniac đã hòa tan với nước theo tỷ lệ 1+9. Tất cả các chất lỏng
trên, được đưa vào qua bình chứa 1.

Đ ể kiểm tra khả năng khử của cột cadim i, cần chuẩn bị các dung dịch sau:
D ùng nước hòa tan 1,4 6 5 g kali nitrat đã sấy khố đến khối lượng không đổi ở nhiệt
độ 103"C trorg bình định m ức dung tích lOOml, đổ nước đến vạch mức (dung dịch
B). Lấy 5m l dung dịch B ch o vào bình định mức dung tích 1000 ml và đổ nước cho
đến vạch (dung dịch C). D ung dịch c có chứa 73,25 Ị.ig/ml kali nitrat. Cho vào bình

317
chứa đồng thời dung dịch c và 5 ml dung dịch đệm , sau đó rừa thành bình bằng
nirớc hai lần, m ỗi lẩn 15 ml và cho thêm nước vào bình chứa, dịch rửa giải tìr cột
lấy vào bình định mức dung tích 100 m l, tốc độ chảy của dịch rửa giải không được
quá 3 ml/phíit.

Sau khi lấy được khoảng lOOml dịch rìra giải, lấy bình ra đổ nước cho đến
vạch rồi lắc dều. D ùng pipét lấy 10 ml dịch rửa giải ch o vào bình định mức dung
tích 100 m l, sau đó tiến hành như chỉ dần ở điều 4 của bài trên. N ếu nồng độ của
nairi nitrit (tính theo đồ thị chuẩn) nhỏ hơn 0,9|.ig/m l thì cột đó không dùng được.

Cadim i trong cột này phải được giữ dưới dung dịch axit clohydric 0,1 m ol//.

Khả nãiig khử cùa cột cadim i phải được kiểm tra cho từng loại m ẫu thử.

b. T iến hành thử

Cho vào bình chứa đồng thời 20 ml dịch lọc được chuẩn bị th eo điều 4 bài
trên và 5m l dung dịch đệm . Rửa thành bình hai lần bằng nước, m ỗi lần 15m l, cho
đẩy nước vào bình. Thu eliiat vào bình định mức dung tích lOOml. Đ ổi với m ỗi loại
thử đều tiến hành phép thử kiểm tra bằng cách ihay dịch lọc bằng nước.

Hàm lượng natri nitrit được xác định theo điều 5 bài trên.

5. K ế t cntủ

Hàm lượng nitrat (X |), biểu thị bằng số m g kali nilrat trong Ikg sản phẩm,
được tính theo côn g thức sau:
í
X, = 1,465*
m, * v ,

trong đó:

C: nồng độ nitrit, đọc được trên đổ thị chuẩn, tương ứng với mật độ quang
của dung dịch, ịig! ml;

m,: khối lượng mẫu. g;

V ,: thể tích eluat, dùng cho phản ứng so màu. mí;

X: lượng nitrit, xác định trong cùng mẫu thử đó theo bài trên, m g/k g.

318
 Màm luợng nitrat được biểu thị bằng kali nitral có thể tính chuyển sang natri
nitrat và ngược lại như sau;

N aN O , = 0 ,8 4 K N O ,

K N O ,= 1,19 N aN O ,

Bài 10. X á c đ ịn h d ư lư ợng so,

Ị . N guyên tắ c

C huyển anhydric sunfurơ (SO2) tự do và kết hợp sang dạng m uối natri sau đó
chuẩn bằng iod. So sánh với mẫu đối chứng có íorm aldehyt kết hợp với SO2.

2. H ó a chất

Natri cloriia, dung dịch 10%; Porm aldehyt, dung dịch 40%;

lốt, dung dịch 0,02N ; A xit clohydric 6 N;

Hồ tinh bột, dung dịch 0,1%; Natri hydroxit IN;

D ung dịch đệm có pH 4,2- 4,6: Hoà tan 11,87 g Na^HPO^^H^O vào llít
nước được dung dịch 2 /15 N. H oà tan 9 ,0 7 8 g K H 2PO4 vào 1 lít nước, được dung
dịch 1/15 N. Trộn đểu 0,1 phần dung dịch 2 /1 5 N với 9,9 phần dung dịch 1/15 N
được 10 phần dung dịch đệm.

3. Ditng cụ, thiết bị

Cân phân tích lO^g; ố n g đong 5, 10, lOOml;

Bình định m ức 250m l; Biiret 25nil.

Bình tam g iá c nút mài 250m l;

4. C á ch tiến hành

4.1. Đ ối với các mẫu ở dạng rắn, đặc

Cân 25 g m ẫu, chính xác đến 0,001 g, chuyển toàn bộ vào cối nghiền bằng
9 0 - 100 ml natri clorua 20% , thêm 5m l dung dịch đệm , nghiền toàn bộ hỗn hợp
trong cối vào bình định mức 2 5 0 m l, tráng cối nhiều lần bằng NaCl 20% và định
mức tới vạch, lắc kỹ, lọc. D ùng pipet hút vào 2 bình tam giác m ỗi bình 50 ml dịch

319
lọc thêm vào m ỗi bình 2 ml HCl 6 N , thêm vào bình số hai 2 m l form aldehyt 40% .
Chuẩn độ 2 bình bằng dung dịch iod 0 ,0 2 N với 1 ml chì thị hồ tinh bột.

4.2. Đ ối với mẫu ở thể iỏng

Hút vào 2 bình tam giác, m ỗi bình 50m l m ẫu, 2 m l N aO H IN rồi làm tiếp
như điều 4.1

5. K ế t quả

Hàm lượng anhydric suníiirơ (X ) tính bằng % th eo cô n g thức;

^ ^ _ (V,-V,).0.00064.V
m.v„

trong đ ó :

V(|- thể tích dịch lọc lấy chuẩn độ, ml;

V - thể tích bình định mức pha loãng m ẫu, ml;

V |- thể tích dung dịch iod 0 ,0 2 N dùng chuẩn bình thứ nhất, ml;

V ị- thể tích dung dịch iod 0 ,0 2 N dùng chuẩn bình thứ hai c ó form ald eh yt, ml

0 ,0 0 0 6 4 - lượng SO2 tương ứng với Im l dung dịch iod 0 ,0 2 N , g;

m - khối lượng mẫu cân, g.

320
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
■

Bộ N ông nghiệp và Phát triển nông thôn (2003). Tuyển tập tiêu clniẩii nông nghiệp
Việt NíHìu tập 4, 5. 6 , Hà Nội.

Bộ Y tế (2 0 0 3 ). Q u y định b ổ sung vi chất dinh dưỡng vào thực ph ẩ m . Ban hành

kèm theo Q uyết định sô' 6289/2003/Q Đ -B Y T ngày 9 tháng 12 năm 2 0 0 3 của Bộ
trưởng Bộ Y tế.

Hoàng M inh Châu, Từ Văn M ặc, Từ V ọng Nghi (2002). C ơ s ở lìoá học pìiăn tích.
N X B Khoa học và K ỹ thuật.

N guyền Hữu Chấn (2 0 0 0 ). N hững vấn đê' lioá sinh học hiện d ạ i. N X B K hoa học và
Kỹ thuật.

N guyễn Thị H iền và cộ n g sự (2007). K hoa học - Công nghệ M a lt và Bia. N X B

Khoa học và Kỹ thuật.

N guyễn C ông K hẩn & Hà Huy Khôi (2007). Chityéu tiếp dinh dưỡng ở V iệt N am.
Tình hình dinh dưỡng \’â clừến lược can thiệp Ở V iệt Nam. N X B Y học.

Từ Vãn M ặc và c ộ n g sự (2 0 0 3 ). Phân tíclì lioú lý: phương p h á p p h ổ Iigliiệin nghiên

cứu cấu trú c p h â n tử. N X B Khoa học và Kỹ thuật.

Lê Thanh M ai và cộ n g sự (2 0 0 5 ). C ác phương p h á p phún tích ngành công nghệ lên

men. N X B K hoa h ọc và K ỹ thuật.

N guyễn V ăn M ùi (2 0 0 1 ). Thực hành hóa sinh học. N X B Khoa học và K ỹ thuật.

T ổng cục T iêu chuẩn - Đ o lường - Chất lượng (2008). Danh m ục tiêu chuẩn quốc
gia - T C V N 2 00 8.

Lê N gọc T hạch (2 0 0 3 ). Tinh dầu. N X B Đại học Q uốc gia 'IP. H ồ Chí Minh.

Phạm Trương Thị T họ (2 0 0 1 ). G iá o trình lioá học rác' hợp ch ấ t tự Iiliiéii. N X B G iáo
dục.

Lâm Xuân Thanh (2 0 0 4 ). G iá o ràiilì C ông nghệ các sản p h ẩ m sữa. N X B Khoa học
và K ỹ thuật.

N gu yễn Đ ìn h Thưởng và cộn g sự (2000). Công nghệ sản x u ấ t và kiểm tra cồn
etylic. N X B K hoa học và K ỹ thuật.

321
Đặng Thị Thu, N gu yền Thị Xuân Sâm, T ô Kim Anh (1 9 9 7 ). T h í nghiệm hóa sinh
công nghiệp. Trường Đ H Bách Khoa Hà N ội.

Lê N gọc Tú và cộn g sự (2 0 0 0 ). H oá sinh công nghiệp, N X B K hoa học và Kỹ thuật.

Lê N gọc Tú và cộn g sự (2 0 0 1 ). H oá học thực p h ẩ m , N X B K hoa học và Kỹ thuật.

Hà D uyên Tư (2 0 0 6 ). K ỹ tìiiiật plìáii tích cả m quan thực p h ẩ m , N X B Khoa học và

Kỹ thuật.

Hà D uyên Tư (2 0 0 6 ). Q uản lý chất lượng trong công n g h iệp thực p h ẩ m . N X B Khoa

học và Kỹ thuật.

Lê Bạch T uyết (2 0 0 0 ). Kiểm tra vờ quản lý chất lượng nhà m á y cíườiig. Chương
trình M ía Đường Đ H Bách Khoa.

V iện Dinh dưỡng (2 0 0 1 ). Chiểu lược quốc g ia dinh dưỡng. N X B Y học.

Phạm Hùng V iệt (2 0 0 3 ). C ơ s à lý thuyết của phư ơng p h á p sắ c k ỷ khí, N X B Khoa

học và K ỹ thuật.

A F N O R -D G C C R F (1 9 8 9 ). C oiitrôle d e la qu a lité cles p r o d iiits alim eiitaires.

M éth odes d 'analyses officielles.

A nalytica M icrob iologica, EBC, Bios, V ol 8, N o 4 , 1977.

Ann-Charlotte E liasson (2 0 0 6 ). C iirb oh ydra tes in F o o d , Second ed ition . U SA .

A O A C (2 0 0 0 ;. O fficial M etliods.

AOCS (1 9 9 7 ). OịỴiciaỉ m elhods a n d r e c o m m e iìd e d p r a c ti c e s o f the A O C S , 5th

edition.

Badal. c . Saha, Shelby. N. Freer, R odney. J. Bothast (1 9 9 4 ). Procìiiciioii,

piirificafioii, aiưl p r o p e r tie s o f a Th erm ostable /3-glt(cosidase f r o m a c ơ lo r V ariant
Straiii o f A u reo b a sid iu m piilỉitlans. A pplied and E nvironm ental M icrob iology,
pages 3 7 7 4 -3 7 8 0 .

c . B. Spricigo, A . B olzan, L. T. Pinto (2 0 0 1 ). M a tlie m a tic a l m o d e lin g o f initmeg

essential oil extraction b y Uqiiid cơrbon dioxide. Latin A m erican A pplied R esearch
31: 397-401.

322
Carolyii Pisher & T hom as Scott (1998). F ood Pldvor, lỉiừlogỵ a n d C lìem isírỵ. The
Royal Society o f C hem istry.

Ernest Gucnther. T h e essentÌLil oil, V oliim c 4, ỉiidividiiíil Es.seiitiaỉ oils o f llie plaiìt
/aiììilies. Robert E. K rieger Publishing Company, Malabar, Plorida.

E vgiienie G eorgu iev (1 9 9 5 ). Công nghệ các chất thơm tỏ'ii,í> hợp \'ù lự nliiéiì. N X B
Zem izdat (Sách tiếng Bulgaria).

R IPAC (1 9 8 7 ). Staiidai d nieìliocừ f o r llie íiiialyỵis o f o iìs ,f a ís a n d d eriva tives, 7th

edition.

J.L.M iilton (1 9 9 1 ). T ec lm iq iie s d'íiiiíil\se et de controlc clưiis les indiistries agro-

alÌDieiiíiares, V olu m e 1, V olum e 2, V olum e 4. Lavoisier-Tec& D oc.

Jam es c .p C H E N & C hung Chi CHOU (1993). Caiie Sỉigar H aiu lbook (1 ,2 ). N ew -
York.

R. M. F. V a r g a sl, E. C a ss e ll, G. M. F. G o m esl, L. G. s. L o n g h il (2006).

S u p ercritica l e.xtractioii o f C arqu eja essential oil: Experim ents a n d inocleliiig.
Brazilian journal O f ch em ical Engineering vol. 23, no. 03, pp. 375 - 382.

Richard M olard D. & L esaga L. (1985). F ood M icìo b io ỉo g y a n d w a te r activity.

Centre de R ech erch es en A gro-A lim entaire de Nantes, Prance.

R odney F. B oyer (1 9 9 3 ). M o d en i Experimentaỉ hioclieriiistry, Second edition.

C alifornia, 1993.

R oy T eraiiishl, E m ily L. W ick , Irvvin Hornstein (1998). Plcivor C ìiem istry - Thisty
years o f Progress. K liiw er A cadem ic, Plenum Piiblislier.

W H O (2 0 0 1 ). N u tritioii f o r lieallli and deveỉopmcnt.

323