Food Hydrocolloids( chất keo thực phẩm )

Exopolysaccharides from yoghurt fermented by Lactobacillus paracasei: Production,

purification and its binding to sodium caseinate (vi khuẩn sản xuất lượng lớn các phân tử
polysacarit trọng lượng phân tử cao từ sữa chua lên men bởi vi khuẩn lactobacillus: sản
xuất ,tinh chế và liên kết với natri caseinate)

tóm tắt

lactobacillus paracasei có thể giải phóng exopolysacarit (EPS), được sử dụng làm chất khởi
động để chuẩn bị sữa chua trong điều kiện lên men tối ưu. Người ta nhận thấy rằng độ nhớt
của sữa chua tăng theo cấp số nhân khi sản xuất EPS và để làm sáng tỏ hiện tượng này, sự
gắn kết của EPS-S11 được chiết xuất và tinh chế từ sữa chua với casein được đánh giá bằng
phân tích độ đục và kích thước hạt, nghiên cứu điện thế zeta, quét laze đồng tiêu mi -hình ảnh
nội soi (CLSM) và xác định phép đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt (ITC). Kết quả chỉ ra
rằng EPS-S11 có khối lượng phân tử trung bình là 1,68 �107 Da, được cấu tạo chủ yếu từ
mannose, glucose, galactose và axit glucuronic theo tỷ lệ mol là 0,87:0,92:1:0,24. Khi bổ
sung EPS-S11, cả độ đục và kích thước hạt của dung dịch casein đều giảm theo cách phụ
thuộc vào liều lượng, trong khi điện thế zeta tăng phụ thuộc vào liều lượng, điều này cho thấy
rằng EPS-S11 có thể ức chế sự tổng hợp của casein và do đó tăng cường hiệu quả của nó. sự
ổn định. Chuẩn độ ITC và hình ảnh CLSM đã xác nhận sự tồn tại của các tương tác giữa
EPS-S11 và casein, chủ yếu liên quan đến tương tác tĩnh điện cũng như tương tác kỵ nước.

1. Giới thiệu

Sữa chua, một loại sữa lên men quan trọng, được người tiêu dùng chấp nhận do các đặc tính
cảm quan độc đáo và lợi ích dinh dưỡng cho sức khỏe (Torriani, Gardini, Guerzoni, &
Dellaglio, 1996). Đã có báo cáo rằng các đặc tính kết cấu và đặc tính dinh dưỡng của sữa
chua có liên quan chặt chẽ với các chủng lên men và điều kiện lên men (Kumar & Mishra,
2003; Nguyen, Ong, Kentish, & Gras, 2014). Trong sản xuất công nghiệp, một số hợp chất
như natri carboxymethyl cellulose, gelatin, tinh bột biến tính, pectin, carra-geenan, xanthan,
karaya và guar gum thường được sử dụng làm phụ gia thực phẩm trong quá trình sản xuất sữa
chua. Người ta đã báo cáo rằng những chất phụ gia này có lợi cho việc cải thiện chất dẻo, kết
cấu, trạng thái và hương vị của sữa chua thông qua việc duy trì các điều kiện lên men (Kumar
& Mishra, 2004). Bên cạnh các đại phân tử này, một số poly-sacarit tự nhiên khác cũng đã
được chứng minh là có tính chất tương tự trong những năm gần đây. Người ta đã báo cáo
rằng một số chủng lên men sữa chua có thể tiết ra exopolysacarit (EPS). Strep-tococcus
thermophilus ASCC 285 và Streptococcus thermophilus ASCC 1275 đã được phát hiện giải
phóng EPS có thể ảnh hưởng đến kết cấu của sữa chua .Chủng vi khuẩn axit lactic DPC6532
cũng được báo cáo là giải phóng EPS và EPS có thể tăng cường khả năng giữ nước của sữa
chua (Costa et al., 2012). Những kết quả này cho thấy rằng EPS của các chủng có thể là một
yếu tố quan trọng cần thiết cho sự hình thành các đặc tính hóa lý và kết cấu của sữa chua.
Lactobacillus là tác nhân lên men không thể thiếu trong sản xuất sữa chua. Đã có báo cáo
rằng một số loài vi khuẩn axit lactic có khả năng tiết ra EPS vào dịch lên men. So với các
chủng không tạo EPS, sữa chua được lên men bởi các chủng tạo EPS có đặc tính kết cấu tốt
hơn .Một kết luận tương tự cũng thu được trong nghiên cứu điều tra ảnh hưởng của
Streptococcus thermophilus EPS lên các đặc tính cấu trúc và cấu trúc vi mô của sữa gầy lên
men (Zhang và cộng sự, 2012). Những kết quả này cho thấy rằng trong quá trình lên men,
EPS do vi khuẩn axit lactic tạo ra có thể cải thiện các đặc tính kết cấu của sữa lên men.
Lactobacillus thuộc chi lactobacillus, là loài vi khuẩn axit lactic điển hình và chiếm ưu thế và
đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất sữa chua (Tabasco, Paarup, Janer, Pel�aez, &
Requena, 2007). Được biết, Lactobacillus có khả năng giải phóng polysaccharid vào dịch lên
men (Robijn et al., 1996). Người ta cũng phát hiện ra rằng EPS do Lactobacillus NFBC 338
sản xuất sẽ cải thiện khả năng sống sót trong điều kiện căng thẳng, chẳng hạn như tiếp xúc
với nhiệt độ cao, axit, dịch vị và mật mô phỏng (Kearney và cộng sự, 2011). Ngoài các đặc
tính dinh dưỡng và chức năng, cần nghiên cứu vấn đề liệu EPS của Lactobacillus có thể cải
thiện đặc tính kết cấu của sữa chua trong quá trình lên men hay không. Do đó, mục đích của
nghiên cứu này là điều tra mối quan hệ giữa sản xuất EPS và các đặc tính kết cấu bằng cách
thay đổi điều kiện lên men.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguyên liệu

Sữa bột gầy và Lactobacillus paracasei H9 được mua từ Danisco Deutschland GmbH
(Niebüll, Đức). Natri caseinat được lấy từ Công ty TNHH Phát triển Công nghiệp Hóa chất
Tichia (Thượng Hải, Trung Quốc). Thuốc nhuộm huỳnh quang màu xanh sông Nile được
mua từ Tập đoàn công nghệ sinh học Trung Quốc (Thượng Hải, Trung Quốc). Tất cả các
thuốc thử khác là loại phân tích và được mua tại địa phương.

2.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp truyền
thống. Đầu tiên, sữa bột gầy được thêm dần vào nước cất với nồng độ cuối cùng là 10%
(w/w), nước này được gia nhiệt đến 40–50 �C và khuấy với tốc độ 100 vòng/phút trong 30
phút. Sau đó, dung dịch sữa được khử trùng ở nhiệt độ 95 °C trong 5 phút. Thử nghiệm đơn
yếu tố cho thấy 12% lượng cấy, nhiệt độ lên men 37 �C và thời gian lên men 8,0 giờ là phù
hợp để L. paracasei H9 sản xuất sữa chua. Dựa trên kết quả của thử nghiệm đơn yếu tố, các
thông số lên men được tối ưu hóa hơn nữa bằng cách sử dụng RSM. Phạm vi và giá trị điểm
trung tâm của ba biến độc lập (thời gian lên men, kích thước chất cấy và nhiệt độ lên men)
được trình bày trong Bảng 1. Mỗi biến được mã hóa ở ba mức (1, 0, +1). Thiết kế Box–
Behnken được thực hiện để xác định sự kết hợp tốt nhất của các biến lên men. Trong công
việc hiện tại, tất cả các kết hợp biến hứa 12 điểm giai thừa và 3 lần lặp lại điểm trung tâm
(Bảng 1). Theo kết quả của 15 thí nghiệm nhóm này, phân tích hồi quy bậc hai đã được thực
hiện để thu được một mô hình thực nghiệm để hình dung mối quan hệ giữa phản hồi và các
biến độc lập. Do đó, một điều kiện tối ưu có thể được suy ra từ mô hình này. Đối với mỗi thí
nghiệm, độ nhớt và hàm lượng EPS của sữa lên men được đo. 2.3. Xác định các đặc tính cấu
trúc Độ cứng, độ kết dính và độ nhớt của sữa chua được đo trong cốc 100 mL ở 4 °C bằng
Máy phân tích kết cấu (Stable Micro. System, UK) được trang bị đầu dò hình trụ đường kính
36 mm. Theo phương pháp trước đó (Yang et al., 2014), các tham số thử nghiệm được đặt ở
lực kích hoạt 10 g, tốc độ thử nghiệm trước 1 mm/s, tốc độ thử nghiệm 1 mm/s, tốc độ sau
thử nghiệm 10 mm/s và khoảng cách di chuyển của đầu dò 20,00 mm. 2.4. Chiết xuất và tinh
chế EPS Sữa chua được chiết xuất bằng nước cất (1/2,5, v/v) trong nồi cách thủy ở 95 °C
trong 15 phút, sau đó ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Các chất nổi phía trên được thu
thập và cô đặc thành 50 mL bằng thiết bị cô quay trong chân không. Chất cô đặc được trộn
với etanol ở nồng độ cuối cùng là 80% (v/v), để kết tủa qua đêm ở nhiệt độ phòng, tạo ra kết
tủa poly-sacarit thô. Các protein được loại bỏ khỏi kết tủa bằng phương pháp Sevag (Li và
cộng sự, 2017), được thẩm tách bằng túi lọc máu 3500 Da và làm đông khô, tạo ra EPS của
sữa chua. Để tinh chế EPS, 50 mg bột EPS được hòa tan trong 2 mL H2O chưng cất hai lần
và nạp vào cột sắc ký trao đổi anion DEAE Cellulose DE52 (1,6 ± 60 cm). Sau khi nhựa
anion được rửa giải bằng H2O chưng cất hai lần, phần còn lại của EPS được rửa giải tiếp
bằng NaCl 0,1M, tạo ra một phần polysacarit EPS-S1. Sau đó, EPS-S1 được tinh chế trên cột
Sephacryl S-500 (1,6 ± 120 cm), tạo ra phần EPS-S11 đồng nhất. Phương pháp phenol–axit
sunfuric được sử dụng để xác định hàm lượng poly-sacarit

2.5. Đặc tính hóa lý và đặc điểm cấu trúc của EPS-S11

2.5.1.Xác định độ tinh khiết và trọng lượng phân tử

Độ tinh khiết và trọng lượng phân tử tương đối của EPS-S11 được xác định bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC, 1260 In-finity, Agilent Technologies) ( Li và cộng sự, 2017). Các cột
là TSK G4000 PWxl (7,8 *300 mm) và TSK G5000 PWxl (7,8 *300 mm) được mắc nối tiếp.
Pha động là nước siêu tinh khiết, tốc độ dòng chảy được đặt thành 0,5 mL/phút, nhiệt độ cột
là 35 C và hể tích tiêm là 1 mg/mL EPS-S11 là 20 mL. T-series dextrans được sử dụng làm
tiêu chuẩn.

2.5.2.Phân tích chung

Hàm lượng carbohydrate được xác định bằng phương pháp axit phenol-sulfuric với glucose
làm chất chuẩn (Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers, & Smith, 1956). Axit glucuronic được sử
dụng làm chất chuẩn để định lượng hàm lượng axit glucuronic trong EPS-S11 bằng phương
pháp m-hydroxybenzene (Tong, Mao, Zhai, Zhang, & Jiang, 2015). Độ nhớt của EPS-S11
được đo bằng nhớt kế Ubbelohde (Liu et al., 2012). 2.6. Quang phổ hồng ngoại biến đổi
Fourier (FT-IR)

Quang phổ FT-IR được ghi lại bằng quang phổ Nicolet 6700 FT-IR (Thermo Electron Co.,
Madison, USA). Mẫu EPS-S11 đông khô được nghiền với bột KBr, sau đó ép thành viên để
đo FT-IR trong dải tần số 4000-400 cm1 (Li et al., 2017).

2.6.1.Phân tích quét tia cực tím (UV) của EPS-S11

Để xác định xem EPS-S11 có chứa axit nucleic hay protein hay không, dung dịch nước EPS-
S11 với nồng độ phù hợp được quét bằng máy quang phổ tử ngoại TU-1901 ở nhiệt độ phòng
(Bắc Kinh, Trung Quốc). Bước sóng quét nằm trong khoảng từ 190 nm đến 400 nm.

2.6.2.Phân tích nhiệt lượng kế quét vi sai (DSC) của EPS-S11 Dung dịch nước của EPS-S11
(10–15 mg) được niêm phong vào chảo DSC và được đo bằng nhiệt lượng kế Q2000 DSC
(TA, Hoa Kỳ). Sau khi cân bằng ở 20 �C trong 10 phút, mẫu được quét trong khoảng nhiệt
độ từ 25 �C–400 �C. Nhiệt độ tại mỗi đỉnh thu nhiệt đã được ghi lại.

2.6.3.Thành phần monosacarit của exopolysacarit bằng phân tích sắc ký khí (GC)

Theo các báo cáo trước đây của chúng tôi, GC đã được thực hiện để phân tích thành phần
monosacarit của exopolysacarit thô được giải phóng bởi L. paracasei H9 (Li et al., 2017;
Taylor & Conrad, 1972).

2.6.4.Phân tích quá trình methyl hóa và GC-MS của EPS-S11

Phân tích quá trình methyl hóa của EPS-S11 được thực hiện theo phương pháp tham chiếu
trước đó (Ciucanu & Kerek, 1984). Tóm lại, 4 mg bột EPS-S11 đã được hòa tan hoàn toàn
trong DMSO, sau đó được thêm vào 2 mL thuốc thử Natri Methylsulfinylmethyl bằng cách
siêu âm trong 30 phút, sau đó thêm 2 mL methyl iodide và khuấy liên tục. Cuối cùng, 4 mL
dung dịch axit formic 90% được thêm vào mẫu đã được metyl hóa hoàn toàn để khử trùng
hợp trong lò ở 100 �C trong 3 giờ. Sau quá trình thủy phân, khử oxy và acetyl hóa, các sản
phẩm cuối cùng được phân tích bằng GC-MS.

2.7. Tương tác giữa EPS-S11 và natri caseinat

Dung dịch gốc natri caseinat được điều chế bằng cách hòa tan 4 g casein trong 100 mL dung
dịch đệm axit axetic-natri axetat (1,0 M, pH 4,0). Bốn gam EPS-S11 được hòa tan hoàn toàn
trong 100 mL H2O chưng cất hai lần, thu được dung dịch gốc EPS-S11 4% (w/v). Để nghiên
cứu sự tương tác giữa EPS-S11 và natri caseinat, hai dung dịch so gốc được trộn đều. Đối với
tất cả các thí nghiệm, nồng độ natri caseinat cuối cùng được cố định ở mức 2% (w/v) và độ
pH được đặt là 4,0. Nồng độ của EPS-S11 được đặt ở các mức khác nhau (0,2%, 0,4% và
0,6%). Độ đục của hỗn hợp EPS-S11 và natri caseinat được đo trên thiết bị đọc UV-
Microplate (Thermo, Hoa Kỳ) ở bước sóng 600 nm. Nhiệt độ được tiến hành ở 25 �C. Thí
nghiệm được tiến hành trong ba lần. Kích thước hạt và tiềm năng zeta được xác định bằng
Nano-ZS90 zeta-plus (Malvern Instruments Ltd, Vương quốc Anh). Theo tài liệu tham khảo
(Emaga, Garna, Paquot, & Deleu, 2012), sự tương tác giữa EPS-S11 và natri caseinat được
phân tích bằng máy đo nhiệt lượng NANO ITC200 (Northampton, MA) ở 25 °C. Tế bào mẫu
chứa H2O chưng cất hai lần. Dung dịch EPS-S11 (6 μmo1/L) được tiêm vào tế bào mẫu qua
20 lần tiêm riêng lẻ bằng ống tiêm. Lượng mỗi lần tiêm là 1 μL và mỗi lần tiêm được lập
trình trong khoảng thời gian 120 giây. Tốc độ trộn của tế bào phản ứng được đặt ở 1000 vòng
/ phút. Sự thay đổi entanpy phân tử nội tại đối với liên kết (ΔH), hằng số liên kết (Kb) và
phép cân bằng hóa học liên kết (n) thu được bằng cách khớp dữ liệu chuẩn độ với một bộ mô
hình vị trí giống hệt nhau bằng phần mềm của nhà sản xuất (Emaga et al. , 2012). Để phân
tích cấu trúc vi mô, 80 μL thuốc nhuộm huỳnh quang màu xanh sông Nile 0,01% đã được
thêm vào hỗn hợp EPS-S11 và natri caseinat, được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ trong bóng
tối và được quan sát bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu LSM 880 (Nước Đức). Trong quá
trình thử nghiệm này, nguồn kích thích là He/Ne, bước sóng kích thích là 633 nm, mật độ
quét là 322 ± 322 và tần số quét là 400 Hz. 2.8. Xử lý dữ liệu Tất cả các thí nghiệm được
thực hiện độc lập trong ba lần. Dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình độ lệch chuẩn. Tất
cả dữ liệu được phân tích thống kê bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Các giá
trị có p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. RSM RSM là một
phương pháp tối ưu hóa hiệu quả và đã được thực hiện thành công để tối ưu hóa quy trình
công nghiệp hóa học, sinh học và kỹ thuật (Lu, Mo, Guo, & Zhang, 2012). Để thực hiện phân
tích chính xác hơn về mối quan hệ giữa sự hình thành kết cấu sữa chua và giải phóng EPS, do
đó, thiết kế Box-Behnken đã được sử dụng để đạt được điều kiện tối ưu cho sự hình thành
sữa chua trong công việc hiện tại. Dựa trên dữ liệu thử nghiệm đơn yếu tố, thí nghiệm được
thiết kế như Bảng 1. Điều thú vị là trong số mười lăm nhóm thử nghiệm, độ nhớt càng cao thì
càng có nhiều polysacarit được quan sát thấy trong sữa lên men (Bảng 1) . Các giá trị tối đa
của cả sản xuất EPS và độ nhớt đã được quan sát trong các điều kiện thời gian lên men 8 h,
kích thước incolum 14% và nhiệt độ lên men 37 °C. Theo các dữ liệu thử nghiệm này (Bảng
1), phân tích hồi quy bậc hai được thực hiện thêm để đánh giá mối quan hệ giữa các biến độc
lập và biến phản hồi thông qua việc thiết lập một mô hình thực nghiệm. Đúng như dự đoán,
hai mô hình đã thu được và được hiển thị trong phương trình (1) và phương trình (2)

Trong phương trình. (1) và phương trình. (2), Y1 và Y2 lần lượt đại diện cho sản lượng EPS dự đoán
(mg/L) và độ nhớt (g.sec) của sữa chua. A, B và C tương ứng là thời gian lên men (h), kích thước chất
cấy (%) và nhiệt độ lên men (�C). Hai mô hình được phân tích bằng phương pháp ANOVA. Như
được hiển thị trong Bảng s1 và Bảng s2 trong thông tin hỗ trợ, cả hai biểu thức. (1) vàphương trình
(2) có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% do giá trị p của chúng nhỏ hơn 0,05. Các hệ số xác định (R2) của
biểu thức. (1) và phương trình. (2) được xác định lần lượt là 0,9703 và 0,9936, cho thấy chỉ có 2,97%
và 0,64% tổng số biến thể không được giải thích bằng mô hình của chính chúng. Hơn nữa, không có ý
nghĩa quan trọng nào được quan sát thấy đối với việc thiếu phù hợp. Trong Bảng s1 về thông tin hỗ
trợ, chúng tôi thấy rằng tất cả các thuật ngữ tuyến tính về thời gian lên men (A), kích thước chất cấy
(B) và nhiệt độ lên men (C) đều có tác động đáng kể đến sự tiết polysacarit từ L. paracasei H9 (p
<0,05) . Tuy nhiên, cả hai thuật ngữ bậc hai (A �A, B �B và C �C) và các thuật ngữ tương tác (A
�B, B �C và A �C) đều có tác động tiêu cực đến sự bài tiết polysacarit (p >0,05). Đối với độ nhớt
của sữa chua, các số hạng tuyến tính A, B và C, số hạng tương tác của A �C và số hạng bậc hai của C
�C có ảnh hưởng đáng kể (p < 0,05), trong khi không có ảnh hưởng đáng kể nào được quan sát thấy
trong các số hạng tương tác của A �B và B �C, và các số hạng bậc hai của A �A và B �B (p >0,05).
Để chứng minh tính hiệu quả của các mô hình đã phát triển, hàm lượng và độ nhớt EPS dự đoán đã
được tính toán và so sánh với dữ liệu thực nghiệm. Như thể hiện trong hình. 1 trong thông tin hỗ
trợ, hầu hết dữ liệu thử nghiệm về hàm lượng EPS và độ nhớt có thể được dự đoán chính xác bằng
biểu thức. (1) và phương trình. (2), tương ứng, cho thấy các mô hình này đáng tin cậy. Độ nhớt là
một trong những chỉ số chính để đánh giá hương vị của sữa lên men và để mô tả khả năng chống
chảy của chất lỏng. Như đã biết, độ nhớt bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố, bao gồm kích thước phân
tử, hình dạng phân tử và tương tác của chúng (Dos Santos, Bannwart, Briceno, & Loh, 2011; Romero,
C�ardenas, Henrı ́;;quez, & Rivas, 2002). Đã có báo cáo rằng sự tương tác giữa EPS và protein sữa là
một yếu tố quan trọng để hình thành kết cấu sữa chua. Sự tương tác giữa EPS và protein sữa có thể
dẫn đến sự hình thành cấu trúc mạng dày đặc với độ đàn hồi cao hơn thông qua lực Van der Waals
và lực đẩy tĩnh điện (Ruas-Madiedo, Tuinier, Kanning, & Zoon, 2002). Theo mô hình của phương
trình. (2), độ nhớt cực đại của sữa chua được dự đoán là 1355 g s trong điều kiện lên men tối ưu với
thời gian lên men 8 giờ, kích thước chất cấy 14% và nhiệt độ lên men 39,98 �C trong khi sự tiết ra
polysacarit có thể đạt được ở mức 991,53 mg/L. Tương tự như vậy, hàm lượng EPS cao nhất có thể
đạt được là 991,57 mg/L từ biểu thức. (1) trong điều kiện tối ưu với thời gian lên men 8h, kích thước
dịch cấy 14% và nhiệt độ lên men 39,99 �C. Với điều kiện lên men này, giá trị lý thuyết của độ nhớt
sữa chua có thể đạt được là 1034,42 g·s. Điều thú vị là các điều kiện tối ưu thu được từ hai mô hình
là tương tự nhau. Hơn nữa, không có sự khác biệt đáng kể về giá trị lý thuyết của hàm lượng EPS thu
được trong điều kiện lên men tối ưu này. Tuy nhiên, khoảng cách khoảng 321 g·s đã được quan sát
thấy trong độ nhớt lý thuyết của sữa chua thu được từ hai mô hình trong cùng điều kiện lên men tối
ưu. Vì vậy, cần tiến hành thí nghiệm kiểm chứng. Để tạo thuận lợi cho việc kiểm soát các thông số thí
nghiệm này, điều kiện tối ưu được điều chỉnh là thời gian lên men 8 giờ, kích thước chất cấy 14% và
nhiệt độ lên men 40 °C. Sử dụng điều kiện này, thí nghiệm kiểm chứng được thực hiện năm lần để
đảm bảo kết quả dự đoán không sai lệch về giá trị thực tế. Kết quả cho thấy rằng độ nhớt trung bình
của sữa lên men và sản xuất polysacarit được quan sát lần lượt là 1351,9 g s và 1026,4 mg/L từ các
thí nghiệm thực, xác nhận mô hình của phương trình. (2) là thỏa đáng hơn để dự đoán sản lượng
sữa lên men. 3.2. Mối quan hệ giữa sự giải phóng polysacarit và sự hình thành độ nhớt của sữa chua
Từ phân tích các thí nghiệm RSM, chúng ta có thể thấy rằng sự hình thành độ nhớt của sữa chua có
mối tương quan thuận với sự tiết ra polysacarit. Trong mọi trường hợp, độ nhớt của sữa chua được
tăng cường cùng với sự gia tăng sản xuất polysacarit. Ngược lại, độ nhớt của sữa chua bị giảm khi
hàm lượng polysacarit bị giảm từ hỗn hợp sữa lên men. Khi chúng tôi khớp hai bộ dữ liệu thu được
từ các thử nghiệm trên (Hình 1), thật thú vị khi ết luận rằng độ nhớt tăng theo cấp số nhân với hàm
lượng EPS của sữa chua. Mối quan hệ đã được chỉ định trong biểu thức. (3). Hệ số tương quan (R2)
đạt 0,6907. Y¼127:68e0:0027X(3) Trong đó Y và X tương ứng đại diện cho độ nhớt và hàm lượng
EPS. 3.3. Các biến thể động của kết cấu sữa chua và quá trình sản xuất EPS trong điều kiện lên men
tối ưu Dựa trên các kết quả thí nghiệm trên, một điều kiện tối ưu (thời gian lên men 8 giờ, kích
thước chất cấy 14% và nhiệt độ lên men 40 °C) đã được áp dụng cho quá trình lên men sữa chua.
Hình 2 cho thấy quá trình thời gian điển hình của kết cấu sữa chua và quá trình sản xuất EPS. Như
thể hiện trong Hình 2A–C, độ cứng, độ kết dính và độ nhớt của sữa chua tăng mạnh từ khi bắt đầu
lên men đến khi kết thúc quá trình lên men (8 giờ). Đối với việc sản xuất EPS, hàm lượng EPS dự kiến
sẽ tăng từ 28,3 mg/L khi bắt đầu lên men lên 1026,4 mg/L khi kết thúc quá trình lên men (Hình 2D).
Những động lực này đã chỉ ra thêm rằng sự hình thành kết cấu sữa chua có liên quan đến việc giải
phóng polysacarit từ L. paracasei H9. 3.4. Quá trình tinh chế và đặc tính cấu trúc của EPS-S11 Sau khi
chiết xuất EPS từ sữa lên men, EPS thô được tinh chế thêm bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký
trao đổi anion DEAE Cellulose DE52 và sắc ký thấm gel Sephacryl S-500 lần lượt, tạo ra một phần EPS
đồng nhất -S11. Như được hiển thị trong Hình 3A, chỉ quan sát thấy một đỉnh đối xứng trên HPLC,
cho thấy EPS-S11 là một polysacarit tinh khiết. Theo đường chuẩn của tiêu chuẩn dextran, trọng
lượng phân tử trung bình tương đối của EPS-S11 được tính là 1,68 ± 107 Da. Độ nhớt nội tại được đo
là 10,37 dL/g. Hơn nữa, hàm lượng axit uronic của EPS-S11 được ước tính là 8,26%, cho thấy EPS-S11
là một polysacarit có tính axit yếu mang điện tích âm. Không tìm thấy các đỉnh hấp thụ đặc trưng ở
260, 280 và 400 nm trên quang phổ UV (Hình 3B), xác nhận rằng EPS-S11 không chứa axit nucleic,
protein và sắc tố. đỉnh nội nhiệt mạnh ở 110 °C và đỉnh tỏa nhiệt yếu ở 300 °C đã được quan sát trên
DSC, cho thấy độ tinh khiết của EPS-S11 cao (Hình 3). DSC cũng chỉ ra rằng EPS-S11 có độ ổn định
nhiệt tốt. Phổ hồng ngoại của EPS-S11 được hiển thị trong Hình 3D. Mẫu thể hiện cực đại hấp thụ
rung động kéo dài -OH mạnh ở 3413 cm1 và rung động kéo dài C-H yếu ở 2934 cm1. Rung động kéo
dài C¼O, -COOR hoặc -CHO được quan sát thấy ở 1648 cm1, cho thấy sự hiện diện của axit uronic
trong các phân tử EPS-S11. Sự hấp thụ từ 1443 đến 1398 cm-1 được cho là do dao động kéo dài của
C-O. Ngoài ra, dao động kéo dài của liên kết ether vòng pyran C-O-C cũng được quan sát thấy ở 950–
1200 cm1. Thành phần monosacarit của EPS-S11 được phân tích bằng GC. Sau khi EPS-S11 được thủy
phân trực tiếp bằng axit trifluoroacetic (TFA), mannose, glucose và galactose đã được quan sát thấy
trong dịch thủy phân. Theo đường chuẩn của các chất chuẩn monosacarit, tỷ lệ mol của mannose,
glucose và galactose được xác định là 0,87:0,92:1. Để phân tích loại axit uronic, khử cacboxyl của axit
uronic trong EPS-S11 thành rượu bậc một, thu được sản phẩm khử là EPS-S11R. Sau khi thủy phân
EPS-S11R, chúng tôi thấy rằng EPS-S11R chủ yếu bao gồm mannose, glucose và galactose trong
mộtlệ mol 0,94:1,16:1. So với thành phần của EPS-S11, tỷ lệ glucose được tăng lên trong EPS-S11R,
điều này cho thấy axit glucuronic có chứa trong EPS-S11. Do đó, chúng tôi kết luận rằng EPS-S11 chủ
yếu bao gồm mannose, glucose, galactose và axit glucuronic theo tỷ lệ mol là 0,87:0,92:1:0,24. Thí
nghiệm methyl hóa polysacarit được thực hiện để phân tích liên kết glycosyl của EPS-S11. Như thể
hiện trong Bảng 2, có ốn alditol axetat trong quá trình thủy phân của EPS-S11 đã metyl hóa, bao gồm
2,3,4,6-Me4-Glcp, 2,3,6-Me3-Manp, 2,3,4-Me3-Galp và 2,3-Me2 -Glcp với tỉ lệ mol là
2,12:1:2,19:3,15. Kết quả này chỉ ra rằng glucose, mannose, galactose và axit glucuronic có thể được
liên kết bằng liên kết glyco-sidic của (1 →), (1 → 4), (1 → 6) và (1 → 4,6), tương ứng. 3.5. Sự tương
tác giữa EPS-S11 và natri caseinat Trong nghiên cứu hiện tại, sữa chua được sản xuất bằng sữa bột
gầy. Vì casein là một thành phần quan trọng của sữa tách kem nên sự tương tác giữa EPS-S11 và
natri caseinat đã được nghiên cứu để làm sáng tỏ tác động của EPS-S11 đối với sự hình thành kết
cấu của sữa chua. Độ đục là một chỉ số quan trọng để phản ánh hành vi tập hợp và hiệu suất keo tụ
của protein (Anal, Tobiassen, Flanagan, & Singh, 2008). Như thể hiện trong Hình 4A, độ đục rất cao
trong dung dịch natri caseinat khi không thêm EPS-S11. Tuy nhiên, độ đục đã giảm khi bổ sung EPS-
S11 theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Biến thể tương tự cũng được quan sát thấy trong hiệu quả
của EPS-S11 đối với kích thước hạt của dung dịch natri caseinat (Hình 4B). So với độ đục và kích
thước hạt, thế zeta của dung dịch natri caseinat tăng phụ thuộc vào liều lượng khi tăng lượng bổ
sung EPS-S11 (Hình 4). Những kết quả này cho thấy rằng sự tương tác xảy ra giữa EPS-S11 và natri
caseinat, dẫn đến tăng cường độ ổn định của natri caseinat. Khi giá trị pH thấp hơn điểm đẳng điện,
natri caseinat thể hiện điện tích dương và có thể tương tác với EPS-S11 điện tích âm. Như vậy, có thể
kết luận rằng EPS-S11 là một trong những EPS quan trọng của L. paracasei H9 cần thiết cho việc hình
thành kết cấu sữa chua. Cũng có báo cáo rằng EPS có thể nâng cao khả năng giữ nước của sữa lên
men (Hassan, Ipsen, Janzen, & Qvist, 2003). Để chứng minh thêm về sự tương tác giữa EPS-S11 và
natri caseinat, vi cấu trúc của natri caseinat đã được quan sát với sự có mặt của EPS-S11 ở các nồng
độ khác nhau bằng cách sử dụng phương pháp nội soi cắt lớp vi tiêu điểm bằng laser. Trong tất cả
các hình ảnh, huỳnh quang màu xanh lá cây là khu vực làm giàu protein. Như được hiển thị trong
Hình 4D, sự kết tụ lớn đã được quan sát thấy trong dung dịch natri caseinat khi không thêm EPS-S11.
Tuy nhiên, huỳnh quang màu xanh lá cây dần dần phân tán với sự gia tăng của bổ sung EPS-S11, cho
thấy EPS-S11 đã ức chế sự tổng hợp của natri caseinat. Các kết quả tương tự cũng được quan sát
thấy trong sự tương tác của các polysacarit và protein khác (Liu và cộng sự, 2012). ITC là một
phương pháp quan trọng để mô tả sự tương tác liên kết giữa các phân tử sinh học thông qua xác
định nhiệt giải phóng hoặc hấp thụ trong quá trình liên kết phân tử (Velazquez-Campoy, Leavitt, &
Freire, 2004). Như được hiển thị trong Hình 5, chúng tôi quan sát thấy rằng đỉnh của đường cong
nhiệt đi xuống, cho thấy phản ứng thu nhiệt xảy ra trong quá trình liên kết của EPS-S11 và casein.
Trong khi đó, giá trị cực đại giảm dần khi tăng thời gian chuẩn độ và có xu hướng về không. Khi bắt
đầu chuẩn độ, giá trị của ΔH thấp hơn 0 và liên kết không cộng hóa trị của tương tác kỵ nước là lực
chính. Tuy nhiên, ΔH được tăng phụ thuộc vào liều lượng khi bổ sung EPS-S11, cho thấy tương tác
tĩnh điện bắt đầu đóng vai trò chủ đạo trong tương tác giữa EPS-S11 và casein. Các thông số nhiệt
động trong quá trình chuẩn độ EPS-S11 thành casein được tính toán bằng phần mềm Nano Analyse.
Kết quả cho thấy vị trí gắn kết n là 0,125 – 0,00487, cho thấy tỷ lệ gắn kết trung bình của EPS-S11 với
casein có thể là 1:8. ITC cũng cho chúng tôi biết rằng có các liên kết hydro và tương tác kỵ nước giữa
EPS-S11 và chất đạm (Dam & Brewer, 2002; Ye, 2008). Những kết quả này chỉ ra rằng EPS-S11 có thể
là một trong những EPS cần thiết để hình thành kết cấu sữa chua. Đã có báo cáo rằng hàm lượng và
cấu trúc của exopoly-sacarit (EPS) có liên quan nhiều đến kết cấu của sữa chua (Laneuville &
Turgeon, 2014). Như chúng ta đã biết, điều kiện lên men có thể ảnh hưởng đến năng suất, thành
phần, trọng lượng phân tử và cấu trúc của EPS do các chủng tạo ra (Mende, Rohm, & Jaros, 2015).
Với mục đích này, một phần chính của EPS-S11 đã được chiết xuất và tinh chế từ sữa chua được lên
men bởi Lactobacillus paracasei H9 trong một điều kiện tối ưu. Đã có báo cáo rằng EPS chiết xuất
dịch lên men của Strepto-coccus thermophilus chủ yếu bao gồm Galp được liên kết với (1 → 3), Glcp
được liên kết với (1 → 3, 6), Glcp được liên kết (1 → 4) và ( 1 → 3)-linked Glcp (Pachek-repapol,
Lucey, Gong, Naran, & Azadi, 2017; Ren et al., 2016; Zhang et al., 2017). EPS này cũng được quan sát
là có khả năng ảnh hưởng đến kết cấu của sữa chua. So với EPS của S. thermophilus, EPS-S11 thu
được trong nghiên cứu hiện tại có sự khác biệt lớn về thành phần mono-sacarit và liên kết glycosid.
Hơn nữa, khối lượng phân tử và độ nhớt nội tại của EPS-S11 do L. paracasei H9 sản xuất cao hơn so
với EPS do S. thermophilus sản xuất (Marshall et al., 2001; Vuyst et al., 2003). Một nghiên cứu khác
cho thấy rằng EPS có trọng lượng phân tử cao có ảnh hưởng nhiều hơn đến kết cấu của sữa chua so
với EPS có trọng lượng phân tử thấp. Lý do chính có thể là do EPS có trọng lượng phân tử cao có thể
dễ dàng thúc đẩy quá trình tổng hợp protein và hình thành mạng lưới khi so sánh với EPS có trọng
lượng phân tử thấp (Vaningelgem et al., 2004). Đã có báo cáo rằng độ đục và kích thước hạt trung
bình của phức hợp được hình thành bởi natri caseinat và EPS từ một loại vi khuẩn sinh học mới đã
tăng lên cùng với sự gia tăng hàm lượng EPS (Abid et al., 2018). Điều này khác với kết quả trong công
việc hiện tại. Lý do có thể là do EPS-S11 đã ức chế tương tác protein-protein, làm giảm sự tổng hợp
protein và dẫn đến giảm kích thước hạt và độ đục. Độ nhớt nội tại là một thông số hóa lý quan trọng
của polysacarit. Người ta đã báo cáo rằng độ nhớt của sữa lên men tăng lên cùng với sự gia tăng độ
nhớt nội tại của EPS (Ruas-Madiedo et al., 2002). Kết quả lại của chúng tôi đã xác nhận thêm kết luận
này. Trong công trình hiện tại, độ nhớt nội tại của EPS-S11 được tạo ra trong điều kiện lên men tối
ưu đạt 10,37 dL/g, trong khi độ nhớt của sữa chua đạt giá trị tối đa là 1355 g s. Lý do có thể là độ
nhớt nội tại cao có thể tăng cường sự tương tác giữa protein và poly-sacarit thông qua việc tăng diện
tích tiếp xúc của chúng, dẫn đến tăng cường độ nhớt của sữa chua. 4. Kết luận Công việc hiện tại này
đã cung cấp thêm bằng chứng để hiểu mối quan hệ giữa sản xuất EPS và sự hình thành kết cấu của
sữa chua. Kết quả cho thấy kết cấu sữa chua (ví dụ: độ nhớt) tăng theo cấp số nhân khi sản xuất EPS.
Trên cơ sở này, một phần chính của EPS-S11 đã được chiết xuất và tinh chế từ sữa chua lên men
bằng L. paracasei H9. Thành phần của monosacarit và liên kết glycosid khác với các EPS khác được
công bố trong tài liệu. Kết quả cũng cho thấy rằng độ đục và kích thước hạt của dung dịch natri
caseinat giảm phụ thuộc vào liều lượng khi tăng nồng độ EPS-S11, trong khi điện thế zeta tăng phụ
thuộc vào liều lượng. Phân tích chuẩn độ ITC cho thấy rằng tương tác giữa EPS-S11 và natri caseinat
chủ yếu liên quan đến tương tác tĩnh điện và ương tác kỵ nước. Những kết quả này gợi ý rằng EPS-
S11 có thể là một trong những yếu tố quan trọng cần thiết cho sự hình thành kết cấu của sữa chua
lên men bởi L. paracasei H9. Đóng góp của tác giả Tất cả các tác giả đều có màu đỏ và phê duyệt việc
gửi tác phẩm hiện tại này.