‫التفاعل المتسلسل بإنزيم البلمرة‬

‫(‪)PCR‬‬

‫مجموعـــه ‪19‬‬

‫تحــت اشــــراف‬
‫د‪ /‬شيماء محمد‬
‫تعد تقنية التفاعل المتسلسل بإنزيم البلمرة من اهم التقنيات في علم الحياة الجزيئي‬
‫الحديث ‪.‬ابتكرت هذه التقنية في منتصف الثمانينات واحدثت ثورة هائلة في‬
‫تجارب االستنسال وتشكيل التوليفات الجديدة من ‪Recombined DNA‬‬
‫‪Technology DNA‬‬
‫ابتكرت هذه التقنية من قبل العالم االمريكي ‪ Kary Mullis‬عام ‪1983‬‬
‫تهدف هذه التقنية الى مضاعفة قطعة من جزيئة ‪ DNA‬خارج الخلية لمرات عديدة‬
‫حتى تصبح في نهاية التفاعل بإعداد كبيرة وتسمى ‪Amplification‬‬
‫كل جزيئة تتكون من هذه التفاعالت سوف تصبح هي ايضا قالبا لجزيئة اخرى‬
‫يتم بنائها الحقا‪.‬‬
‫متطلبات تقنية ‪ PCR‬تتطلب العديد من اإلجراءات والتي تكون مشابه متطلبات‬
‫مضاعفة ‪ DNA‬في خاليا الكائن الحي‬
‫‪ .1‬القالب ‪ :Template‬يتمثل في ‪ DNA‬المراد تضخيمه وهذا التضخيم يشمل‬
‫على القالب بأكمله وانما جزء منه وهذا يسمى بالجزء المستهدف‪.‬‬
‫‪ .2‬البادئ ‪ :Primer‬يتمثل بقطعة صغيرة من ‪ DNA‬بشريط مفرد يكون مكمال‬
‫في تتابعاته للقواعد النيتروجينية على طرفي الجزء المستهدف‪ ،‬وهي ضرورية‬
‫للشروع بتضاعف ‪ DNA.‬يتطلب تحضير ‪ Primer‬معرفة بعض تتابعات القواعد‬
‫النيتروجينية على طرفي الجزء المستهدف من القالب‪ .‬تتراوح اطوال ‪Primer‬‬
‫المستخدمة في ‪ PCR‬ما بين ‪ 30 – 20‬قاعدة نيتروجينية‪.‬‬
‫‪ .3‬انزيم ‪ :polymerase DNA‬وهو اساسي في هذه التقنية اذ يحفز عملية‬
‫التضاعف وبالتالي عملية تضخيم ‪ DNA.‬ينبغي ان يكون هذا األنزيم مقاوم‬
‫لدرجات الحرارة‪ .‬يعد انزيم ‪ Polymerase taq‬المستخلص من بكتريا‬
‫‪ Thrums aquatics‬من اكثر األنواع استخداما‪.‬‬
‫‪ .4‬النيوكليوتيدات ‪ :‬يتم تجهيزها على شكل نيوكليوسيدات ثالثي الفوسفات‬
‫منقوصة األوكسجين )‪deoxynucleosidestriphosphate (dNTPs‬‬
‫وبأنواعها االربعة التي تدخل في بناء ‪DNA‬‬
 ‫‪ .5‬المحاليل المنظمة وملح كلوريد المغنسيوم ‪ :‬هناك العديد من المحاليل‬
‫المستخدمة في هذه التقنية مع ‪ Polymerase taq‬المنظم المحلول منها‬
‫)‪(Tris – HCL‬‬
‫‪ .6‬تقنية التفاعل المتسلسل بإنزيم البلمرة تحتاج الى جهاز يقوم تنظيم الحرارة‬
‫وبرمجتها في ضوء مراحل التفاعل المختلفة وعبر كل دورة يسمى جهاز التدوير‬
‫الحراري ‪Thermal cycler‬‬
‫خطوات التفاعل‬
‫‪ .1‬الدنترة ‪ :‬هي الخطوة األولى التي يتم صهر جزيئة ‪ DNA‬اي فصل الشرائط‬
‫المزدوجة وابعادها عن بعضها وذلك برفع حرارة التفاعل الى ‪ 90‬م او اكثر‬
‫بقليل لحوالي دقيقتين‪.‬‬
‫‪ .2‬ارتباط البادئات ‪ :‬تتم بخفض درجة الحرارة الى ‪ 60 – 50‬م تؤدي الى‬
‫تكوين اواصر هيدروجينية بين البادئات وبين التتابعات المكملة لها على اشرطة‬
‫القالب‪.‬‬
‫‪ .3‬االستطالة ‪ :‬تتم على درجة حرارة ‪72‬م وتعد هذه الدرجة مثالية لعمل انزيم‬
‫البلمرة‪ .‬تمتلك البادئات قوة جذب ايوني عالي تجاه ‪ DNA‬القالب اذا ترتبط‬
‫البادئات بالمواقع الخاصة بها على القالب ويباشر انزيم البلمرة ببناء شريط جديد‬
‫مكمل للقالب بإضافة القواعد النيتروجينية الى البادئات باتجاه ‪ 5‬الى ‪ 3‬وبانتهاء‬
‫هذه المرحلة يتم الحصول عل اعداد كبيرة من ‪ DNA‬قيد التضخيم‬

‫‪ .1‬تضاعف الـ )‪:DNA (DNA replication‬‬

‫تضاعف الـ ‪ DNA‬هو العملية الطبيعية التي يحدث فيها تكرار مضاعف للسلسلة‬
‫الـ ‪ DNA‬الموجودة في الخاليا الحية‪ .‬يحدث هذا العمل في فترة تكاثر الخاليا‪،‬‬
‫وهدفه الرئيسي هو أن يكون لدى الخلية نسخة مماثلة للـ ‪ DNA‬الموجودة فيها‬
‫لنقل المعلومات الوراثية إلى الخاليا االبنة‪ .‬يحدث تضاعف الـ ‪ DNA‬بواسطة‬
‫إنزيمات محددة تقوم بفصل السلسلة الـ ‪ DNA‬إلى سلسلتين وتبني السالسل‬
‫الجديدة بنا ًء على كل سلسلة معزولة‪.‬‬
 ‫‪ .2‬تضاعف )‪:PCR (Polymerase Chain Reaction‬‬
‫تضاعف ‪ PCR‬هو أداة تجريبية لتكرار فقط جزء محدد من الـ ‪ DNA‬وذلك‬
‫ألغراض التحليل والتشخيص‪ .‬يعتبر تضاعف ‪ PCR‬من أهم التقنيات الوراثية‬
‫المستخدمة في المختبرات البيولوجية‪ ،‬حيث يساعد في تضاعف الجينات والتحليل‬
‫الحمض النووي واكتشاف األمراض الجينية وتوجيه العالجات الدقيقة‪ .‬عملية‬
‫التضاعف تستخدم إنزيم البوليميراز (‪ )Polymerase‬لتصنيع نسخ متعددة من‬
‫الـ ‪ DNA‬المستهدف باالستنساخ المتسلسل والتكرار المتتالي لعدد محدد من‬
‫الدورات الحرارية‪.‬‬
‫باختصار‪ ،‬تضاعف الـ ‪ DNA‬هو عملية طبيعية تحدث في الخاليا الحية‪ ،‬في حين‬
‫أن تضاعف ‪ PCR‬هو تقنية مختبرية تستخدم لتكرار وتضاعف أجزاء محددة من‬
‫الـ ‪ DNA‬ألغراض التحليل والتشخيص‪.‬‬

‫غرض تقنية التضاعف )‪ PCR (Polymerase Chain Reaction‬هو تكرار‬

‫وتضاعف جزء محدد من الـ ‪ DNA‬ألغراض التحليل والتشخيص‪ .‬ومن بين‬
‫األهداف الرئيسية الستخدام تقنية ‪ PCR‬ما يلي‪:‬‬
‫‪ .1‬التشخيص الجزيئي‪ :‬يتيح تضاعف ‪ PCR‬للعلماء تكرار جزء محدد من‬
‫الجينوم الـ ‪ DNA‬المتواجد في الخاليا الحية أو في العينات المستخرجة للتشخيص‬
‫أو الكشف عن وجود أمراض معينة‪ .‬يمكن استخدام ‪ PCR‬للكشف عن اإلصابة‬
‫باألمراض الفيروسية أو البكتيرية أو الفطرية‪ ،‬أو الكشف عن الطفرات الجينية‬
‫التي تعزى إلى أمراض وراثية‪.‬‬
‫‪ .2‬الجينات الوراثية‪ :‬يمكن استخدام تقنية ‪ PCR‬لتكوين نسخ متعددة من الـ ‪DNA‬‬
‫المستهدفة مثل الجينات التي يرغب العلماء في دراستها وتحليلها‪ .‬وبالتالي يتيح‬
‫لهم فهم الوظائف الجزيئية للجينات المعنية‪.‬‬
‫‪ .3‬األبحاث الجينية‪ :‬يُستخدم تضاعف ‪ PCR‬بشكل شائع في األبحاث العلمية‬
‫لدراسة العالقات الجينية والوراثية‪ ،‬وفهم األسس الجزيئية للتطور البيولوجي‬
‫واألشكال التطورية للكائنات الحية المختلفة‪.‬‬
‫‪ .4‬تقنيات البصمة الجينية‪ :‬يمكن استخدام ‪ PCR‬إلنتاج نسخ متعددة من الـ ‪DNA‬‬
‫الموجودة في العينات البيولوجية مثل الدم أو البصمات ألغراض البصمة الجينية‬
‫والتحليل الجنائي‪.‬‬
‫تقنية ‪ PCR‬هي أداة فعالة ومهمة في البحوث العلمية والتشخيص الجزيئي والطب‬
‫الجيني‪ ،‬حيث تساهم في فهمنا األعمق للجينات وتحليلها وتطبيقاتها في مجاالت‬
‫متعددة‪.‬‬
‫الكائن الحي يعتمد في عملية التضاعف على الوراثة‪ .‬يحمل الكائن الحي‬
‫معلومات وراثية في جيناته التي تحدد صفاته الوراثية وتحكم في عملية‬
‫التضاعف‪ .‬وعادة ما يتم نقل هذه الجينات من األبوين إلى النسل عن طريق‬
‫عملية التكاثر الجنسي أو االختالط الجيني‪ .‬هذه الجينات تتحكم في نمو الخاليا‬
‫وتجزئتها وتقسيمها‪ ،‬مما يؤدي إلى تكوين أجسام جديدة وتضاعف الكائن الحي‪.‬‬
‫تضاعف الـ ‪ DNA‬وتضاعف ‪ PCR‬هما عمليتان مختلفتان ولهما أغراض‬
‫وتطبيقات مختلفة‪ .‬هنا هو الفرق بينهما‪:‬‬
‫عملية التضاعف تختلف قليالً بين اإلنسان والحيوان والنبات‪ .‬هنا هي بعض‬
‫النقاط المشتركة واالختالفات‪:‬‬
‫‪ .1‬التضاعف في اإلنسان‪:‬‬
‫‪ -‬يحدث التضاعف في اإلنسان عن طريق عملية التكاثر الجنسي حيث يتم‬
‫تكوين جنين عندما يلتقي الحيوان المنوي من الذكر مع بويضة من األنثى‪.‬‬
‫‪ -‬يتم تشكيل جنين جديد بعد دمج الحمض النووي (‪ )DNA‬من األبوين‬
‫المختلفين‪.‬‬
‫‪ -‬يتطور الجنين على مراحل معينة في رحم األم وينمو حتى يكتمل تكوينه‬
‫كجنين بشري‪.‬‬

‫‪ .2‬التضاعف في الحيوان‪:‬‬
‫ضا‪.‬‬
‫‪ -‬يحدث التضاعف في الحيوان عن طريق التكاثر الجنسي أي ً‬
‫‪ -‬يتم تكوين جنين جديد عندما يلتقي الحيوان المنوي من الذكر مع البويضة من‬
‫األنثى‪.‬‬
‫‪ -‬يشمل التضاعف في الحيوانات عمليات مختلفة مثل البويضة الخارجية‬
‫والحمل الداخلي والتكاثر الصخري (عند بعض الزواحف والطيور)‪.‬‬
‫‪ .3‬التضاعف في النبات‪:‬‬
‫‪ -‬يحصل التضاعف في النبات بطرق متعددة‪ ،‬يشمل التكاثر الجنسي وغير‬
‫الجنسي‪.‬‬
‫‪ -‬التضاعف الجنسي في النبات يشمل عملية تلقيح األزهار حيث يلتقي الحبوب‬
‫اللقاحية مع بيوضة األزهار ويتشكل بذرة جديدة‪.‬‬
‫‪ -‬التضاعف غير الجنسي في النبات يشمل االنتقال بطرق أخرى مثل الحقلة‬
‫والجذور والفرز والتقسيم اإلشعاعي‪.‬‬

‫عمو ًما‪ ،‬يعتمد نوع عملية التضاعف التي يستخدمها الكائن الحي على خصائصه‬
‫الجينية وظروف البيئة التي يتعايش فيها‪.‬‬
‫التضاعف في الحمض النووي (‪ )DNA replication‬طبيعية وتحدث في الخاليا‬
‫الحية أثناء االنقسام الخلوي‪ .‬تهدف عملية التضاعف إلى تكرار الحمض النووي‬
‫إلنتاج نسخ متطابقة من الجينوم األصلي‪.‬‬
‫أما التضاعف بواسطة تقنية )‪ PCR (Polymerase Chain Reaction‬فهو‬
‫عملية اصطناعية وتتم بالمختبر‪ .‬تستخدم تقنية ‪ PCR‬لتكرار جزء ثابت من‬
‫الحمض النووي بشكل كبير بحيث يمكن دراسته أو تحليله‪.‬‬
‫التشابه بين التضاعف في الحمض النووي و‪ PCR‬يكمن في استخدام نفس‬
‫دورا‬
‫األساسات األساسية وهي البرايمرز (‪ )primers‬واإلنزيمات التي تلعب ً‬
‫مه ًما في عملية التضاعف‪ .‬في كال العمليتين‪ ،‬يتم استخدام البرايمرز لتوجيه‬
‫االنتقاء وتكرار مقاطع محددة من الحمض النووي‪ .‬وكال العمليتين تحتاج إلى‬
‫إنزيمات ‪ DNA polymerases‬إلجراء التكرارات‪.‬‬
‫ومع ذلك‪ ،‬يوجد اختالف واضح في الطريقة والهدف بين التضاعف في الحمض‬
‫النووي و‪ .PCR‬التضاعف في الحمض النووي هو عملية بيولوجية تحدث طبيعيًا‬
‫في الخاليا الحية‪ ،‬بينما تقنية ‪ PCR‬هي تقنية مختبرية تستخدم لتكرار وزيادة‬
‫العناصر الجينية الهدف في ظروف محاكاة المختبر‪.‬‬