Vékonyréteg kromatográfia - alapismeretek

v 1.0 (2010-09-24)

A vékonyréteg-kromatográfia (VRK) a növényi hatóanyagok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatának

egyik máig igen elterjedt eszköze. Ez nemcsak annak köszönhető, hogy olcsó, egyszerűen
kivitelezhető és egyszerre nagy számú minta analizálható párhuzamosan, hanem igen széles
polaritási tartomány vegyületei vizsgálhatóak ezzel a technikával. Ezen kívül számos előhívási
módszerrel nagy szelektivitással detektálhatóak a számunkra érdekes vegyületek.
Minthogy a VRK technikát e gyakorlatokon növényi hatóanyagok elválasztására, kimutatására
használjuk, e kézirat nem törekszik a technika teljes áttekintésére.

1. Elmélet
1.1. Az alapjelenség, a VRK helye az elválasztási technikák között

A kromatográfiás eljárások különböző kémiai tulajdonságuk alapján választják el a vegyületeket

egymástól az eredeti keverékből (mátrix). A VRK esetében a szelekciós tényező egyedül a polaritás,
így a különböző polaritású vegyületek elválasztása lehetséges a rétegeken.

A kromatográfia közben folyamatosan zajlik a rétegre (állófázisra) való adszorpció és az oldatba

való oldódás (deszorpció). Az adott rendszerben különböző polaritású vegyületek esetében a mozgó
ás álló fázison eltöltött idő eltér (mivel egyesek könnyebben kötődnek az állófázisra, és nehezebben
mennek újra oldatba mint mások stb.).

Ez a rétegen Rf érték formájában manifesztálódik. Az Rf érték a megtett út, az oldószer által

összesen megtett távolság %-ában, általában törtként fejezzük ki Rf = 0.50, vagy ennek 100-
szorosaként: hRf = 50. Kiszámítása így: folt távolsága a start ponttól / front távolsága a start ponttól.

A 0.50 Rf pl. úgy jön létre, hogy a futás ideje alatt az adott komponens pontosan ugyanannyi időt
töltött az álló, mint a mozgófázison, de ez nagyon sok adszopció-deszopció ciklus végeredménye
(nem pedig „viszi” az oldószer és 0.50-nél „leteszi”).

1.2. Polaritás és következményei

Egy (szerves) vegyület polaritását bizonyos funkciós csoportok meglétével, ezek számának,
méretének stb. molekulán belüli arányával lehet definiálni. Általában minél több H-kötést tud
kialakítani egy vegyület, annál polárosabbnak tekinthető. Az -OH, -COOH, -NH 2, -OCH3, stb.
csoportok, de a szervesen kötött halogének (-F, -Cl) is képesek H-kötések kialakítására. Rendkívül
erősen polárosak azon vegyületek is, melyek konstans (vagy átmeneti) töltéssel rendelkeznek (pl.
kvaterner N vegyületek, disszociált karbonsavak stb.). Gyengébben, de polárosak a
szénhidrogénekhez képest azon vegyületek, melyekben az elektroneloszlás inhomogén, még
gyengébben azok, melyek elektroneloszlása viszonylag homogén, de polarizálhatóak.

Belátható, hogy mivel számos funkciós csoport képes disszociációra (-COOH <-> -COO - + H+ vagy
R3N + H+<-> R3NH+), ezek a növényi mátrixban különböző formák egyensúlyi elegyeként lehetnek
jelen, nem beszélve a sóképzés lehetőségéről a növény többi metabolitjával. Minél több
disszociábilis csoport van, annál több forma lehet jelen, amely egy egyébként igen egyszerű
flavonoidnál is igen sok variáció. Mivel ezek töltése, nemkötő elektropárjaik száma és így
polaritásuk is durván eltér, ezért ha stabil kémiai formák lennének (nem alakulnának egymásba),
akkor eltérő Rf értékük lehetne, mivel különböző sebességgel haladnának. Mivel azonban futás
közben is történik átalakulás, ezért a jelenség „csak” a zónák kiszélesedéséhez vezet.

A probléma kiküszöböléséhez a komponenseket egy, jól definiált kémiai formában kell tartani. Ez a
savas pH-n disszociáló vegyületek (pl. alkaloidok) esetén lúg (tipikusan cc. NH3), a lúgokban
disszociáló vegyületek (pl. fenolos vegyületek, karbonsavak, általában a polifenolok) esetén sav
(áltlában HCOOH, AcOH vagy cc. HCl) eluensbe keverésével érhető el. Elméletileg
alkalmazhatnánk puffereket is, de ezek használata e technikában visszaszorult. Logikus, hogy a
disszociációra képtelen funkciós csoportokat tartalmazó vegyületek R f-jét (és felbontását) sav és lúg
csak olyan mértékben befolyásolja, amennyire a savakkal/lúgokkal az eluensbe bevitt új funkciós
csoport.

1.3. Az elválasztás mechanizmusa, elúciós erő, szelektivitás

Azon helyeket, ahol a szilikagél (vagy bármilyen állófázis) tulajdonképpen megköti az

elválasztandó molekulákat, aktív helyeknek nevezzük. Egy állófázis g-ra vetített aktív felszíne
fontos paraméter az elválasztás hatékonyságának szempontjából. Az aktív helyek sok szempontból
jelentősek, leginkább az esetleges telíthetőségük miatt. Belátható, hogy ha az összes aktív hely
„megtelik” a minta molekuláival, akkor a maradék vagy kötődik a már kötődött molekulákhoz
valamilyen kölcsönhatással, vagy az oldószerben marad és halad tovább. Ez a gyakorlatban
hosszirányban elnyúlt sávokat, csóvákat, vagyis a felbontás drasztikus romlását idézi elő.

Minél jobban hasonlít (funkciós csoportjaiban és polaritásában) az oldószer az állófázisra, annál

több vegyületet old le róla, adott vegyületek emiatt annál nagyobb R f értékekig jutnak el a rétegen.
Azt a tulajdonságot, hogy egy oldószer milyen nagy Rf-ig tudja elvinni az adott komponenst,
elúciós erőnek nevezzük. Minél nagyobb egy oldószer elúciós ereje, annál magasabb R f-ig viszi el
ugyanazt a komponenst és annál több féle komponenst gyűjt a frontvonalba.

Mivel a leggyakrabban használt szilikagél fő funkciós csoportjai az -OH és az -O - (a pH-tól

függően), ezért a legnagyobb ún. elúciós erővel a víz, utána pedig a kis szénláncú alkoholok és kis
szerves savak (MeOH, AcOH, HCOOH) rendelkeznek szilikán. Már H donorként nem tudnak
viselkedni, de még jó H-akceptorok és „viszonylag” polárisak a következők: aceton, etil-acetát, éter
és a kloroform. Még kevésbé polárisak és még gyengébb elúciós erejük van szilikán a
szénhidrogéneknek, pl. toluol, míg leggyengébbek a petroléter és a hexán.

Eluenst általában úgy választunk, hogy az elválasztani kívánt anyagainkat közepes mértékben oldja,
(így nem maradnak a startnál, de nem is gyűlnek össze a fronton) illetve fontos, hogy különböző
mértékben legyenek képesek eluálni a szilikáról a komponenseket. Ez utóbbit nevezzük az
oldószerelegy szelektivitásának. Emiatt állnak tipikusan egy-két fő-, és egy-három kis
komponensből az eluensek: a főkomponensek a rendszer elúciós erejét határozzák meg, a kis
komponensek pedig a szelektivitást biztosítják, pH-t állítják be vagy elegyíthetővé teszik a két nem
elegyedő főkomponenst. Vegyük észre, hogy pl. az AcOH bevitele a pl. egy MeOH-CHCl 3
mozgófázisba nem csak savanyítást jelent, hiszen az ecetsav oldószer is egyben! Az AcOH-al az
oldószerbe egyúttal beviszünk egy új funkciós csoportot is, a -COOH csoportot. Azon vegyületek,
melyek különböző erősséggel képeznek komplexet stb. e csoporttal, jobb elválasztást fognak
mutatni az új AcOH-os eluensben, akár függetlenül is attól, hogy disszociációjuk milyen.

1.4. A fizikai hajtóerő

A felszálló (az alapértelmezett eset) VRK esetén csak a kapillárishatás a fizikai hajtóereje az
áramlásnak, ezért ez a technika a leglassabb, ugyanakkor műszert vagy speciális kádat nem igényel.
Mivel a gravitáció és a kifelé történő párolgás a felfelé való haladás ellen dolgozik, általában az idő
előrehaladtával a sebesség (távolság/idő) exponenciálisan csökken. Utóbbi nagyban csökkenthető
egy, a réteggel szembefordított másik réteg párhuzamos futtatásával (ún. counter-plate).
1.5. NP, RP

A mozgó és állófázis polaritási viszonyaitól függően két alaptípust különítünk el a kromatográfiás

technikákon belül: Normál fázisú (normal phase, NP) és fordított fázisú (reverse phase, RP)
kromatográfia. Normál fázisban az állófázis polárisabb, mint a mozgófázis. Emiatt, minél
polárisabb egy vegyület, annál kisebb távolságot fog megtenni. Nagyon fontos, hogy a komponens
polaritása itt az adott eluens rendszerben értendő!!

Fordított fázisban az állófázis a kevésbé poláros. Ezt általában ún. C-18 rétegeken végzik, amelyben
szilikagél hordozóra kovalensen kapcsolt 18 szénatom hosszúságú szénhidrogén láncok jelentik az
állófázist. Az elúciós sorrendek itt megfordulnak, azaz a legapolárosabb vegyületek mozognak a
leglassabban. Az oldószerek elúciós ereje is fordított, az egyre apolárosabb oldószerek egyre jobban
mozgatják az adott komponenseket és egyre több vegyületet képesek eluálni (hiszen egyre jobban
hasonlítanak az állófázisra!). Tipikusan alkohol-víz, vagy alkohol-puffer keverékekkel dolgoznak e
rétegeken. Apoláros szerves oldószerek a C-18 oldalláncokat tönkreteszik ezért nem használhatóak.

1.6. Állófázisok; mozgófázisokkal, előhívószerekkel szemben támasztott követelmények

Értelemszerűen mind NP, mind RP technikában alapfeltétel, hogy a mozgófázis ne oldja és

szuszpendálni se tudja az állófázist, ez az állófázis tönkremeneteléhez (felszálló VRK-ban
egyszerűen lecsúszik a hordozóról) vezet, ilyenkor nincs elválasztás.

Állófázis számos fajta lehet a VRK technikában. Az esetek túlnyomó többségében normál fázisú
elválasztást, azon belül is szilikagélt használunk, ez kovasav oldatokból készül dehidrációval,
funkciós csoportjai Si-OH és Si-O- (pH-tól függően). A szilika legnagyobb előnye, hogy nagyon
nagy elválasztó kapacitással rendelkezik, viszonylag olcsó és nagyon sokféle előhívószerrel lehet
dolgozni rajta, mert elég inert. A szerves oldószerek nem oldják, a tiszta víz azonban szuszpendálja,
ezért a legpolárosabb rajta alkalmazható oldószerek a víz-szerves oldószer keverékek (pl. MeCN,
MeOH, AcOH vízben). A réteg használat előtt aktiválandó, ami a gyártási technológia során a
rétegen maradt megkötött víz eltávolítását jelenti, gyakorlatilag hevítés 60 percig 105 °C-on. Ez
azért jelentős, mert az aktiválatlan szilikán ugyanazok a komponensek Rf-je nagyobb lehet, mint az
aktiválatlanon, mivel a maradék víz az oldószerbe lépve az eluens polaritását nagyobb elúciós erő
irányába elviheti. A szilika ugyanakkor egyensúlyban van a tároló laboratóriumban lévő levegő
páratartalmával, így 0%-os víztartalmat elérni szinte lehetetlen.

Gyakran használnak még cellulózt is (szintén NP), mely hasonló funkciós csoportokkal és
tulajdonságokkal bír, mint a szilika, de királis. Cukor oldalláncokban, konfigurációban eltérő
vegyületek elválasztásában lehet kedvező. Kapacitása kisebb.

Készülnek impregnált szilikagél rétegek is. Ez valamilyen olyan vegyület belekeverését jelenti az
állófázisba, amely plusz szelektivitást adhat a kromatográfia során. Nagyon fontos, hogy a majdani
eluensben az impregnálószer elúciója nulla legyen, különben nem tekinthető az állófázis részének.
Ugyancsak fontos, hogy ne reagáljon a mozgófázissal, és az elválasztandó komponensekkel (ne
okozzon műtermékeket). Emiatt leggyakrabban szervetlen vegyületekkel impregnálnak. A szilika
szuszpendálása során használt oldatba is keverhető az ágens, de készülhet impregnált réteg ún.
előfuttatással is, amikor az impregnálószerből valamilyen oldatot készítünk (pl. 1% AgNO 3 MeOH-
ban), és azzal felfuttatjuk a réteget. Összevetve ugyanazt a réteget az impregnált párjával
ugyanabban az oldószerben, azonos mátrixot vizsgálva azt figyelhetjük meg, hogy egyes vegyületek
Rf-je változatlan, (ezek nem léptek kölcsönhatásba az impregnálószerrel), mások az eredetihez
képest teljesen más értékeket is felvehetnek (hiszen számukra az állófázis tkp. a szilika + az
impregnálószer molekulái). Impregnálószerek között a leggyakoribb az AgNO 3, de használnak pl.
koffeint is, vagy felfogható ilyennek a szilikába kevert fluoreszcens festék is, amelyet az UV 256
nm előhívási technikában használnak.

A mintát mindig olyan oldószerben kell feloldani, ami az állófázist nem oldja és nem szuszpendálja.
Szilikára való vizes minta közvetlen felvitele a cseppentés helyén megváltoztatja a szilika
szerkezetét, és valószínűleg tönkreteszi az elválasztást. Szilikán a leggyakoribb választás a MeOH,
de EtOAc, CHCl3, hexán vagy bármi más is használható, amiben a kromatografálni kívánt anyag jól
oldódik.

Az előhívószerek oldószere is mindig olyan kell legyen, ami az állófázist nem oldja és nem
szuszpendálja. Ez sokszor nehezen megoldható, mivel tömény szervetlen sóoldatok az
előhívószerek. Ezek többnyire úgy készülnek, hogy a szervetlen sót feloldjuk vízben, majd
meghígítjuk alkohollal. Általában elmondható, hogy a szilikagél állófázist nem roncsolják a
legalább 25% alkoholt tartalmazó oldatok, de igazán 100% alkohol (pl. technikai EtOH) a
biztonságos ilyen szempontból. A nagy víztartalom ugyanis további problémát okoz az előhívás
után igen gyakori hevítés során, az alkohol elpárolgása után visszamaradó víz megduzzaszthatja az
állófázist, ami a réteg értékelhetőségét csökkenti. Mivel leggyakrabban alkoholban vannak feloldva
az előhívószerek, amelynek szilikán nagy az elúciós ereje, sok permet esetén a lefolyó előhívószer
rövid távú „kromatográfiát” végezve lemossa a komponenseinket, értékelhetetlenné téve a
kromatogramot. Ez elkerülhető lenne minél apolárosabb oldószer választásával, azokban azonban
szinte semmilyen előhívószer nem oldható föl. A problémára csak a finom porlasztás és az
óvatosság a megoldás.
2., A technika

A réteg kezelése

A szilikagél (és minden más állófázis) igen érzékeny. A réteg homogenitása a jó elválasztás
alapfeltétele, ezért karcolástól, nyomástól stb. óvni kell. A rétegeket a hordozójuknál fogva fogjuk
meg (üveg vagy Al-fólia), és mindig csak azon az élükön, ahol a sérülés nem jár következménnyel a
kromatográfiára (majdani front). A réteg esetleges megjelölése karcolással történjen, ez mindig a
majdani front oldalán történik, jellemzően a minták kódjait tüntetjük fel. A többi részre (pl.
startvonalat stb.) karcolni tilos.

Mintafelvitel

Automata pipettával felszívva a mintát, a réteg fölött 0,5-2 mm-rel tartva a pipettahegy
végét, a pipettát lassan megnyomjuk, majd leérintjük a hegy végén kibukkanó cseppet. A
pipettaheggyel nem érünk hozzá az állófázishoz. Egy mintát egymás mellé, részben átfedő
cseppekként viszünk fel a rétegre, hogy sávot alkossanak. Ha nagy mennyiséget kell felvinni (50
μl), az soha nem egyszerre történik, hanem pl. 5x10 μl formájában, ami azt jelenti, hogy 10 μl
felvitele után az oldószert hagyjuk megszáradni és a száraz foltra visszük fel a következő, majd
újabb száradást követően az azt követő mintát. 20 μl-esnél nagyobb pipettát és 200 μl-esnél
nagyobb pipettahegyet nem érdemes használni. Különösen óvatosan járjunk el a felvitellel, ha a
minta oldószere vizet is tartalmaz!

Mintafelvitel helye

A mintákat sávok formájában kell felvinni, a réteg szélétől és egymástól is megfelelő

távolságban (min. 1,5, ill. 0,5 cm, 10 cm széles rétegen).

A réteg széle az öntési technikából adódóan általában vastagabb, ezért a futtatószer

gyorsabban áramlik benne, ami torz Rf értékekhez vezet a nagyon szélre cseppentett mintákban. A
repedt szélű réteg ugyancsak eltérítheti az egyenes irányból a minta futását, értékelhetetlen Rf-eket
okozva.

A minta foltjai nem érhetnek bele az oldószerbe, mert akkor beleoldódnak az oldószerbe,
ami veszteségként jelentkezik. Emiatt megfelelő (a gyakorlatokon kb. 2 cm) magasságra kell
felvinni a mintákat.

Minta mennyiségének hatásai

A felvitt minta mennyisége döntően befolyásolja az értékelhetőséget.

Nagy mennyiségű minta annyira telítheti az állófázis aktív helyeit, hogy nem jön létre
elválasztás (a telített aktív helyektől nagyobb Rf-ek felé továbbviszi az oldószer a kötődni nem
képes anyagokat), a kromatogramon elvált foltok nem vagy alig láthatóak.

Túl kis mintamennyiség esetén esetleg nem minden vagy egyik vizsgált vegyületre sem
érjük el a detektálási határt.

Túl nagy méretű foltban felvitt (egyébként a réteget nem telítő) minta a felbontás romlását
okozza, főleg 0-0.5 Rf foltok esetében (e tartományban ugyanis gyenge a fókuszálás jelensége).
Réteg inhomogenitás hatásai

Mivel a rétegben a kapillárishatás hajtja előre az oldószert, a folytonossági hiányokat az

oldószer megkerüli. Ezáltal a folytonossági hiányok nemlineáris futási irányhoz, az pedig
értékelhetetlen Rf értékekhez vezet. Ha valahol a rétegen folytonossági hiány van (pl. az egyik széle
be van karcolva), a sérült széltől nagyobb távolságra kell felvinni a mintákat. Legjobb azonban, ha a
sérült vonalat meg tudjuk tenni a frontvonal felőli oldalnak. Ugyanezen jelenség miatt nagyon
fontos, hogy mintafelvitelnél ne karcoljuk meg a réteget.