I.

Phương pháp định lượng protease

Hoạt tính protease được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến. Protease phân giải
protein tạo thành các acid amin tự do. Thuốc thử Folin Ciocalteau có chứa phosphomolipdic
acid và phosphowolframic acid, hai chất này phản ứng với gốc tyrosine và tryptophan của
phân tử protein tạo thành phức chất màu xanh da trời hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.
Như vậy có thể xác định khả năng phân giải protein của protease thông qua hàm lượng
tyrosine hoặc tryptophan.
Đơn vị hoạt độ enzyme (IU): là lượng enzyme phân giải protein tạo thành các sản phẩm
hòa tan trong trichloracetic acid cho phản ứng màu với thuốc thử Folin trong 1 phút tương
ứng với 1 µmol tyrosine ở điều kiện thí nghiệm.
Hóa chất cần chuẩn bị
- Tyrosine
- Dung dịch 0,5% Casein: casein pha trong đệm có pH mong muốn
- Dung dịch 0,2N Folin: Pha từ Folin gốc 1N bằng nước cất khử trùng (Nên dùng đến
đâu pha đến đấy, không dùng hết có thể bảo quản ở 4C)
Tiến hành
1. Xây dựng đường chuẩn: Tyrosine được pha trong đệm phosphate 0,1M; pH 7,0 với
các nồng độ khác nhau từ 0,1-0,6 µM theo các bước sau:
- Pha dung dịch gốc Tyrosine chuẩn 1mM (1,819 mg/10ml)
- Từ dung dịch gốc 1mM pha các dung dịch tyrosine có các nồng độ khác nhau từ
0,02 -0,3 µmol trong HCl 0,2N theo bảng sau để cho vào ống nghiệm
Dung dịch Các nồng độ tyrosine khác nhau (µmol)

85

Dung dịch tyrosine 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
gốc (ml)

HCl 0,2N (ml) 0,48 0,46 0,44 0,42 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2

- Bổ sung 2 ml 6% Na2CO3, lắc đều

- Thêm 0,5 ml thuốc thử 0,2N Folin, lắc đều và để yên 20-30 phút ở nhiệt độ phòng
- So màu ở bước sóng 750nm
- Dựng đường chuẩn tuyến tính giữa nồng độ tyrosine (µmol) và OD750nm đo
được.
2. Đo mẫu
Mẫu được chuẩn bị gồm ống đo mẫu thí nghiệm và ống đối chứng
- Ống thí nghiệm được thực hiện theo thứ tự: 0,5 ml dịch enzyme cần xác định + 1
ml dung dịch 0,5% casein, ủ lắc ở nhiệt độ thích hợp trong 10-30 phút. Sau đó bổ
 sung 2,5 ml 5%TCA để bất hoạt enzyme. Dịch được ly tâm 10.000 rpm, khoảng 3-
5 phút, thu dịch trong để làm phản ứng màu.
- Ống đối chứng làm tương tự nhưng cho 2,5 ml 5%TCA vào 1 ml dung dịch 0,5%
casein trước, sau đó mới bổ sung 0,5 ml enzyme.
- Phản ứng so màu: lấy 0,5 ml dịch trong sau ly tâm + 2 ml 6% Na 2CO3, lắc đều.
Thêm 0,5 ml thuốc thử 0,2N Folin, lắc đều và để yên 20-30 phút ở nhiệt độ phòng.
So màu ở bước sóng 750nm.
- OD của mẫu thu được là kết quả OD của ống thí nghiệm trừ đi ống đối chứng.
3. Tính hoạt độ enzyme
Hoạt độ protease của 1 ml enzyme được tính theo công thức sau

X= (4 x ax b/t) x 2

Trong đó: X là số đơn vị hoạt độ trong 1 ml dịch enzyme; 4: thể tích của hỗn hợp phản
ứng với TCA; a: số µmol tyrosine tính được dựa vào OD thu được và theo đường
chuẩn đã dựng; b: nồng độ pha loãng của dung dịch enzyme (nếu có); t: thời gian ủ
phản ứng enzyme.