‫אור דואק ‪205731417 :‬‬

‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬

‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫שיקוע‪ ,‬הפרדה וזיהוי חלבונים באמצעות שיטת אלקטרופורזה וזימוגרפיה‬

‫מבוא‪:‬‬
‫אלקטורפורזה של חלבונים בג'ל של ‪ Polyacrylamide‬בנוכחות דטרגנט טעון ( ‪ )SDS=Sodium Dodecyl Sulfate‬היא‬
‫השיטה הנפוצה ביותר להפרדת חלבונים בהתאם למשקלם המולקולרי לצורכי זיהוי‪.‬‬
‫ככל שהתערובת להכנת ג'ל תכיל יותר ביסאקרילאמיד נקבל ג'ל יותר צפוף‪.‬‬ ‫•‬
‫חלבונים גדולים נפריד בג'ל לא צפוף ואילו חלבונים קטנים יופרדו בג'ל צפוף‪.‬‬ ‫•‬
‫מהירות הנדידה של מולקולת החלבון (או כל מולקולה טעונה אחרת) בשדה החשמלי תלויה בעצמת השדה ( ‪ ,)E‬במטען‬
‫‪ . V=E*Z/f‬עיקר החיכוך‪ ,‬בעת אלקטרופורזה בג'ל‪ ,‬נוצר ע"י‬ ‫הכולל שלה (‪ )Z‬ובכוח החיכוך (‪ )f‬ע"פ הנוסחה‪-‬‬
‫התנגשויות בין המולקולות הנעות‪ ,‬בהשפעת השדה החשמלי‪ ,‬לבין שריג הג'ל כך שתנועתן איננה רציפה אלא מורכבת‬
‫ממספר רב של קפיצות קטנות‪.‬‬
‫ג'לים של ‪ Polyacrylamide‬נוצרים ע"י פולימריזציה של ‪ Acrylamide‬בנוכחות קטליזטורים מתאימים (‪TEMED,‬‬
‫‪ .)Ammonium persulfate‬כדי לקבל את מבנה השריג של הג'ל מוספים למערכת הריאקציה ‪ crosslinker‬היוצר קשרים‬
‫בין שרשרות הפולימר‪ .‬ה‪ crosslinker -‬הוא ‪ Methylenebisacrylamide‬המורכב משתי מולקולות של ‪Acrylamide‬‬
‫מצומדות לשייר מתיל‪ .‬ריכוז ה‪ crosslinker -‬בעת הכנת הג'ל קובע את תכונות ההפרדה שלו‪ .‬ככל שכמותו גדלה‪ ,‬יתקבל‬
‫שריג צפוף יותר אשר יאפשר הפרדה של מולקולות קטנות יותר‪.‬‬
‫האלקטרופורזה בנוכחות ‪ SDS‬מאפשרת הפרדה של חלבונים שונים בהתאם למשקלם המולקולרי‪ .‬מולקולות הדטרגנט‬
‫נצמדות למולקולת החלבון‪ .‬הדחייה הקיימת בין ראשיהן הטעונים‪ ,‬גורמת לפתיחת מולקולת החלבון ולהרס המבנה‬
‫המרחבי שלה‪ .‬המטענים הרבים של מולקולות הדטרגנט ממסכים את מטעני מולקולת החלבון וגורמים לטעינתה במטען‬
‫נטו שלילי‪ .‬מכיוון שמולקולות הדטרגנט נצמדות בעיקר לקשרים הפפטידיים‪ ,‬מספרן תלוי באופן ישר באורכה של‬
‫מולקולת החלבון ומכאן גם באופן ישר במשקלה המולקולרי‪ .‬ככל שמולקולת החלבון תהיה ארוכה יותר‪ ,‬תצמדנה אליה‬
‫יותר מולקולות דטרגנט ומטענה השלילי יגדל‪ .‬דבר זה יוצר יחס אחיד של מטען למסה בחלבונים המורצים והכוח‬
‫החשמלי הפועל עליהם פרופוציוני למסתם‪ .‬הגורם העיקרי הקובע‪ ,‬לכן‪ ,‬את מהירות הנדידה של המולקולות בשדה‬
‫החשמלי הוא החיכוך עם שריג הג'ל ( ‪ )f‬אשר עוצמתו תלויה באורכה של מולקולת החלבון ובמשקלה המולקולרי (לא‬
‫ביחס ישר)‪ .‬כתוצאה מכך מתקבלת הפרדה של החלבונים ע"פ משקלם המולקולרי‪.‬‬
‫כדי לקבל הפרדה טובה יותר גם בג'לים קטנים ומרחק הרצה קצר‪ ,‬ישנה אפשרות לגרום לדחיסה של מולקולות‬
‫החלבון בתחילת ההרצה כך שכל חלבון יופיע בתמונת הג'ל כפס ( ‪ )band‬צר ולא ככתם רחב‪ .‬הדבר נעשה בשיטה‬
‫הקרויה )‪ . DISC (Discontinuous Electrophoresis‬בשיטה זו קיים שוני בהרכב חלקו העליון של הג'ל והבופר בו הוא‬
‫נמצא‪ .‬חלק זה נקרא ג'ל דחיסה‪ ,stacking gel -‬בגלל תופעת הדחיסה המתרחשת בו‪ .‬כמות ה‪ Acrylamide -‬וה‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪ crosslinker‬בחלק העליון קטנה יותר והחלבונים נעים בו כמעט בלא התנגדות‪ .‬הבופר בחלק העליון מכיל יוני ‪Cl‬‬
‫ומולקולות של החומצה האמינית גליצין‪ .‬ה‪ pH -‬של הבופר ( ‪ )6.8‬קרוב לנקודה האיזואלקטרית של הגליצין ולכן היא‬
‫טעונה חלקית בלבד במטען שלילי‪ .‬בהשפעת השדה החשמלי תיווצר הפרדה בין יוני הכלור הקטנים לבין מולקולות‬
‫הגליצין הגדולות והטעונות חלקית מכיוון שיוני הכלור ינועו במהירות בעוד שתנועתן של מולקולות הגליצין תהיה איטית‪.‬‬
‫הפרדה זו יוצרת‪ ,‬בחלקו העליון של הג'ל גרדיאנט של השדה החשמלי ( ‪ .)E‬באזור בו מרוכזים יוני הכלור תהיה‬
‫ההתנגדות נמוכה וכך גם עוצמת השדה החשמלי‪ ,‬בעוד שבאזור בו מרוכזות מולקולת הגליצין‪ ,‬בעלות הטעינה החלקית‪,‬‬
‫תהיה ההתנגדות גבוהה ועוצמת השדה החשמלי תגבר‪ .‬כתוצאה מכך ינועו מולקולות החלבון‪ ,‬בחלק העליון של הג'ל‪,‬‬
‫באזור שבעורפו מתקיים שדה חשמלי חזק בעוד שבחזיתו השדה חלש‪ .‬תופעה זו גורמת לדחיסה של מולקולות החלבון‬
‫לפס צר עד הגיען אל ג'ל ההרצה‪ .‬בג'ל ההרצה משתנה ה‪ pH -‬מ ‪ 6.8 -‬ל ‪ 8.8 -‬מולקולות הגליצין נטענות במטען שלילי‬
‫מלא וגרדיאנט השדה מתבטל‪ .‬בנוסף לכך‪ ,‬משתנה צפיפות השריג בג'ל ההרצה והחלבונים מתחילים להיפרד ע"פ‬
‫גודלם‪.‬‬
‫‪ SDS‬הוא חומר אמפיפטי בעל מטען שלילי‬ ‫•‬
‫‪ SDS‬נקשר לקשר הפפטידי של חלבונים וגורם ל‪ )1( :‬פרישת החלבון‪ )2( ,‬מטען שלילי לחלבונים‪.‬‬ ‫•‬
‫חלבנים בנוכחות ‪ SDS‬ינועו לכיוון הקטודה ויופרדו לפי הגודלם‬

‫‪Staining‬‬
 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫תמיסה המכילה את חומר הצבע הכחול ‪ Coomassie brilliant blue G 250‬היוצר קומפלקס חזק אך לא קוולנטי עם‬
‫חלבונים‪ ,‬כנראה עם הקבוצות האמיניות של הקשרים הפפטידיים וגם עם שיירים בסיסיים כגון ארגינין וליזין ושיירים‬
‫ארומטיים‪ .‬החומר משמש גם לקביעה כמותית של חלבונים בשיטת ‪.Bradford‬‬
‫כמות חלבון להטענה על ג'ל‬
‫בתערובת חלבונים הטען‪ 20-25g‬חלבון לבאר‪.‬‬
‫בחלבון מנוקה חלקית הטען כ‪ 10g -‬חלבון לבאר‪.‬‬
‫בחלבון נקי הטען ‪ 3g‬חלבון לבאר‪ .‬בכדי לראות תוצאות נדרש מינימום ‪ 0.5-2g‬חלבון ל'בנד'‪.‬‬
‫זימוגרפיה‬
‫אפיון אנזימים ע"י הרצתם במערכת ג'ל אלקטרופורזה‪ ,‬וקביעת מיקומם ע"י בדיקת פעילותם ע"ג הג'ל‪.‬‬
‫במערכות זימוגרפיה לא יוספו חומרים מחזרים בכדי לשמור על המבנה הרביעוני של האנזימים‪.‬‬
‫לעיתים ניתן להריץ חלבונים שעוברים דנטורציה ב‪ SDS -‬ולאחר הדנטורציה להעביר אותם רנטורציה ע"י שטיפת ה‪-‬‬
‫‪.SDS‬‬
‫אנזימים אחרים אינם עוברים רנטורציה ומאבדים את פעילותם בעקבות החשיפה ל‪ ,SDS -‬ולכן לא ניתן להריצם‬
‫במערכת ג'ל אלקטרופורזה עם ‪ .SDS‬במקרים אלו יש להריץ את החלבונים במערכת ג'ל נטיבי‪.‬‬
‫במקרים בהם רוצים לזהות אנזים‪ ,‬ניתן לאחר הרצת החלבונים‪,‬‬ ‫•‬
‫לחשוף את הג'ל לסובסטרט של האנזים‪.‬‬
‫האנזים חייב להיות פעיל‪ ,‬במצבו הנטיבי‪ ,‬ללא ‪.SDS‬‬ ‫•‬
‫תנאי ההדגרה מתאימים לפעילות האנזים‪.‬‬ ‫•‬
‫האנזים עובר דיפוזיה עם הזמן‪ ,‬לכן זמן ההדגרה חייב להיות קצר‪.‬‬ ‫•‬
‫ככל שריכוז המלח גבוה יותר ישקעו חלבונים פחות מסיסים‪.‬‬ ‫•‬
‫ההפרדה בין החלבונים ששקעו לחלבונים המסיסים מתבצע ע"י (‪ )1‬הדגרה בטמפ' נמוכה‪ )2( ,‬סרכוז‬ ‫•‬
‫(צנטריפוגה)‪ )3( ,‬הפרדת נוזל עליון מהמשקע‪.‬‬
‫חלבונים שלא שקעו ימצאו בנוזל העליון‪.‬‬ ‫•‬
‫אם נוסיף אמוניום סולפט לנוזל העליון נקבל שיקוע של חלבונים נוספים‪.‬‬ ‫•‬
‫לאחר הפרדת החלבון יש לסלק את עודפי האמוניום סולפט‪.‬‬ ‫•‬
‫חלק מהחלבונים ששקעו לא יחזרו להיות מומסים‪ ,‬משמע לא יחזרו למצב הנטיבי \ הטבעי \ הפעיל שלהם‪.‬‬ ‫•‬
‫ג'ל נטיבי‬
‫הרצת חלבונים במערכת ג'ל נטיבית דורשת הכרה של תכונות החלבונים‪ .‬החלבונים במערכת זו אינם טעונים שלילית כי‬
‫אינם חשופים ל‪ ,SDS -‬אלא טעונים במטענם הטבעי ע"פ ה‪ pH -‬של הג'ל‪ .‬חלבונים בעלי ‪ PI‬נמוך מ‪ pH -‬הג'ל ‪ 6.8 -‬יהיו‬
‫טעונים שלילית וירוצו רגיל‪ ,‬ואילו בהרצת חלבונים בעלי ‪ PI‬גבוהה מ‪ , 8.8 -‬אשר יהיו טעונים חיובית‪ ,‬יש לחבר את‬
‫האלקטרודות בכיוון ההפוך לספק הכוח‪.‬‬
‫תקציר‪:‬‬
‫במעבדה זו בחנו טכניקות של הפרדה וזיהוי חלבונים בעזרת טכניקות שונות ‪ ,‬תחילה השתמשנו בטכניקת ‪SDS PAGE‬‬
‫באמצעותה ניתן להפריד חלבונים על פי משקלם המולקולרי‪ -‬על פי המרחק שהם הגיעו בגל ידענו לזהות את סוגם ‪,‬‬
‫חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה לא נעו מרחק רב ולעומתם בעלי משקל נמוך נעו יותר רחוק‪ ,‬ככה יכולנו לזהות‬
‫חלבוני ביצה שעברו שיקוע בריכוזים שונים‪ ,‬לזהות קזאין שעבר שיקוע ולזהות את חלבוני הגבינה השונים‪ .‬לאחר מכן‬
‫בחלקה השני של המעבדה רציתי לבחון שיטות לאפיון חלבונים ואת זאת עשינו באמצעות ג'ל הזימוגרפיה שאיתו ניתן‬
‫לאפיין את האנזים פקטינאז‪.‬‬
 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫מטרות המעבדה‪:‬‬

‫הבנת ההבדל של השיטות האחרות להפרדת חלבונים על ידי גל אלקטרופורזה‪.‬‬ ‫‪‬‬

‫זיהוי הפרדת חלבונים לפי ‪ Mw‬שלהם (משקל מולקולרי) על ידי גל אלקטרופורזה‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫זיהוי חלבוני ביצה שעברו שיקוע באמוניום סולפט בריכוזים של ‪ 50% ,25%‬ו‪.75%‬‬ ‫‪‬‬
‫זיהוי חלבוני חלב ומי גבינה‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫התנסות להכנת גל זימוגרפיה המכילה פקטין בשביל לאפיין את האנזימים‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫זיהוי אנזים פקטינאז על ידי הפרדה בגל זימוגרפיה‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫תוצאות‪:‬‬
‫זיהוי חלבוני ביצע שעברו שיקוע בריכוזים שונים באמצעות ‪SDS PAGE‬‬ ‫‪)1‬‬

‫איור מס ‪ -1‬סימון סטנדרט גודל‬

‫תיאור איור מס ‪:1‬‬
‫סטנדרט גודל‪ -‬סטנדרט גודל הינו נמצא באריות ‪ 9,7,8‬וג'לים ‪ 1,2,3‬התוצאות בג'ל ‪ 3‬זהות לאיור מס ‪ 4‬גם מבחינת כמות‬
‫הנבדים והם גם דומים מבחינת המרחק נדידה והעובי שמאופיין עבורם‪.‬‬
‫חלבון הביצה‪ -‬התוצאה שקיבלנו דומה לבארית משקע מורחף ‪ 75%‬אך הבנדים עבים יותר‪.‬‬
‫משקע מורחף ‪ -50%‬אנו יכולים לראות כי עוצמת הנראות של הבנד הינה נמוכה בהשוואה לחלבונים אחרים‪.‬‬
‫משקע מורחף ‪ -75%‬התוצאה שהתקבלה זהה לחלבונים בבארית ‪ 1-2‬אך התוצאה שהתקבלה הינה תוצאה שהיא‬
‫פחות בולטת‪.‬‬
‫משקע מורחף ‪ - 25%‬נוכחות החלבון וכמות החלבון הינה קטנה העוצמה והעובי והנראות של הנבד הינה עוצמה נמוכה‬
‫בהשוואה לחלבונים אחרים שהרצנו במהלך הניסוי‪.‬‬
‫קזאין‪ -‬התוצאה שקיבלנו בהטענת הג'ל בחלבון הקזאין הינה תוצאה שדומה לזו של התוצאה שקיבלנו בחלב ‪.‬‬
‫מי גבינה‪ -‬ניתן לראות במי הגבינה ובכלל הג'לים כי ישנו שני בנדים של חלבונים שהיא נמצאת בתחתית העמודה ומי‬
‫הגבינה נמצאים בג'לים ‪ 1,2,3‬בבאריות ‪.8,9,10‬‬
 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫איור מס ‪ -2‬הרצת חלבונים ב ‪SDS PAGE‬‬

‫תיאור איור מס ‪ :2‬אנחנו עבדנו על גל הרצה מספר ‪ 3‬והתוצאות הם כדלקמן – בארית ‪ – 1‬שיקוע באמצעות אמוניום‬
‫סולפט ריכוז ‪ - 25%‬אין פסים בכלל ‪ ,‬בארית ‪ - 2‬שיקוע באמצעות אמוניום סולפט ריכוז ‪ - 50%‬אין פסים בכלל בבארית‬
‫‪ 3‬אמוניום סולפט ‪ 4 – 75‬פסים‪ ,‬בארית מספר ‪ 4 – 4‬פסים (חלבון ביצה)‪ ,‬בארית מספר ‪ – 5‬חלב – ‪ 3‬פסים‪ ,‬בארית‬
‫מספר ‪ 2 – 6‬פסים‪ ,‬בארית מספר ‪ – 7‬בופר הטענה – ‪ 4‬פסים‪ ,‬בארית מספר ‪ 8‬סטנדרט גודל – ‪ 6‬פסים (כמו שצריך‬
‫להיות לפי הסטנדרט‪ -‬איור מס ‪ ,)1‬בארית מספר ‪ – 9‬גבן – ‪ 4‬פסים‪ ,‬בארית מספר ‪ – 10‬מי גבינה – ‪ 2‬פסים‪.‬‬

‫איור מס ‪ -3‬הרצת ג'לים בשיטת ‪UV‬‬

‫תיאור איור מס ‪ : 3‬לאחר הניסוי הרצת החלבונים שביצענו בניסוי ניתן לראות שכל הנבדים שהתקבלו הינם נבדים שהם‬
‫ברורים לראיית עין גם מבחינת הנדידה וגם מבחינת העובי‪ .‬אנחנו יכולים לראות באיור כאשר משקע מרחף באריות‬
‫‪ 1,2,3‬ניתן לראות שככל האמוניום סולפט עולה אך גם עובי החלבונים אכן גם עולה‪ .‬סך כל התוצאות שהתקבלו בתוצאות‬
‫הניסוי ‪ UV‬הינם תוצאות שהם דומות לתוצאות שקיבלנו באיור ‪ 2‬באמצעות שיטת ‪ SDS-PAGE‬באמצעות שיטת ה‪UV‬‬
‫לא ניתן לראות במראי העיין את החלבונים בברור מבחינת המיקום הבנדים אך ב‪ SDS -‬רואים את ההבדלים בעובי‪.‬‬

‫הרצת האנזים פקטינאז בשני הג'לים (ג'ל דנטורטיבי ו ג'ל לא מחוזר לזימוגרפיה )‬ ‫‪)2‬‬
 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫‪ #‬התוצאות של הקבוצה ‪ 20.4‬לא כל כך ברורות השתמשנו בתוצאות שהתקבלו בקבוצה של ‪.27.4‬‬

‫איור מס ‪ - 4‬ג'ל זימוגרפיה‬

‫בניסוי הזה השתמשנו בשיטת זימוגרפיה להרצת דוגמאות של אנזים פקטינאז בתמיסה מהולה ברכוזים שונים‪ .‬בדרך‬
‫כלל אפשר לראות צבע הג'ל בשני החלקקים ( העליון והתחתון ) ‪ ,‬החלק התחתון יש פס ארוך ושקוף לאורך כלל‬
‫האנזימים‪ .‬בחלק העליון יש ארבעה בנדים שקופים דקים במקביל אחד לשני בגודל של ‪( kD 31‬הבנד הרביעי של סמן‬
‫הגודל )‪.‬‬

‫תוצאות קבוצה ‪27.4‬‬ ‫תוצאות קבוצה ‪20.4‬‬

‫איור מס ‪ – 5‬ביקורת פקטין‬

‫באיור ה ‪ 5‬היה לנו ‪ 4‬צלחות בדיקת הביקורת של ניסוי ג'ל הזימוגרפיה ‪:‬‬
‫צלחת של ‪ = Ap‬תפוח‪ ,‬צלחת של ‪ = T‬עגבנייה ו שתי צלחות של ‪ = P‬פקטינאז קנוי בריכוזים שיונים ( אחד במהול פי‬
‫‪ K 10‬ו השני במהול פי ‪ ) K 100‬הצלחות היו מחולקות לשני צדדים ( עליני ו תחתוני ) ‪ ,‬בחלק העיוני בדקנו נוכחות‬
‫האנזים בזמן ממושך ו בחלק התחתון נוכחות האנזים בזמן קצר ‪.‬‬
‫בקבוצה של ‪ 20.4‬אפשר לראות שבג'ל הפקטינאז פעילות האנזים הייתה הכי טובה במיוחד במהול פי ‪ K 10‬בשני‬
‫הזמנים ו במהול פי ‪ K 100‬בזמן הקצר בלבד ‪.‬‬
‫בג'לים הנשארים התוצאות לא כל כך ברורים אז נתייחס לתוצאות קבוצה ‪27.4‬‬
 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫בצלחות התפוח אפשר לראות קתמים שקופים יותר וזה מאפשר לנו להסיק שהיה בתפוח יותר פקטינאז למרות‬
‫הצלחות שהכילו נגיעות מעגבנייה מס" הכתמים היה פחות ובהתייחסות לסוגי הג"ל בשניהם היה הג"ל הקנוי ‪ 10K‬הכי‬
‫פעיל בשני הזמנים ‪.‬‬

‫דיון ומסקנות‪:‬‬
‫ניסוי מס ‪ 1‬אלקטרופורזה בג'ל בשיטת ‪SDS-PAGE‬‬
‫‪ SDS‬דטרגנט שגורם לטעינת מולקולות החלבון במטען שלילי שגורם להריסת המבנה המרחבי של מולקולות החלבון‪.‬‬
‫הרצה בג'ל בנוכחות שדה חשמלי עוזרת לנו לסווג מולקולות לפי גודל כך שהחלבונים בעלי משקל מולקולרי גדול יוצרים‬
‫חיכוך רב עם הג'ל ובך מצטברים במקום יותר גבוה ממקומם של המולקולות בעלות משקל מולקולרי קטן יותר‪.‬‬
‫לגבי הפרדת חלבוני הביצה לאחר שיקוע באמוניום סולפט ב‪ SDS-PAGE -‬הטכניקה שהשתמשנו בה לביצוע אפיון‬
‫חלבוני ביצה ששקעו בריכוזים שונים של אמוניום סולפט ‪ ,75%,50%,25%‬שיוצר קשרים עם המים ובכך תופחת כמות‬
‫המים שזמינים ליצירת קשרים עם מולקולת החלבון‪ ,‬לכן חלבוני הביצה שרץ בריכוז נמוך של אמוניום סולפט שקעו יותר‬
‫חלבונים גדולים וכבדים ובכל שנעלה את ריכוז האמוניום סולפט נקבל משקע של חלבונים קטנים יותר‪.‬‬
‫לגבי ניסוי ‪ 2‬של הפרדת חלבונים בעזרת ג'ל שמכיל פקטין בשיטת זימוגרפיה הכנו את הגל הלא מחוזר לזימוגרפיה‬
‫שמאפיין את האנזים פקטינאז שגורם לדנטורציה של החלבון‪ ,‬מכיוון שהוא לא מחוזר הוא לא פוגע במבנה הרבעוני וכך‬
‫הוא מצליח לשמור על פעילות החלבון לכן ניתן לזהות באמצעותו פעילות אנזימתית‪.‬‬
‫השתמשנו ב ‪ RUTHENIUM RED 0.03%‬כדי לזהות את מקום האנזים באופן ויזואלי הוא צובע את הג'ל בצבע ורוד‬
‫בתגובתו עם הפקטין הקיים בג'ל כך נראה שבאזור בו קיים פקטין נראה צבע ורוד ובמקום שהגיב בו פקטינאז נראה כתם‬
‫שקוף לבן בגלל שאנזים פקטינאז פירק את הפקטין‪.‬‬
‫אם הגל נשאר ורוד מסיקים שלא היה אנזים באזור של הג'ל או שהיה אנזים אבל לא פעיל לפי התוצאה שקיבלנו אפשר‬
‫לראות שקיבלנו בס שקוף לאורך כל הג'ל שהראה לנו את פעילות האנזים ומכך מסיקים שלמרות כל המיהולים שעשינו‬
‫והשונות בריכוזי האנזים כל הדוגמאות שנבדקו השפיעו על התוצאה והכיל את האנזים פקטינאז והפעילות האנזימתית‬
‫שלו נשמרה בכולם‪.‬‬
‫עוד ניסוי שביצענו שהיה ביקורת לזימוגרפיה שמטרתו לבחון תגובת האנזים פקטינאז בתגובתו עם פקטין‪ ,‬האנזים‬
‫פקטינאז משמש לפירוק פקטין וניתן להפיק אותו מפירות וירקות שונים מבניהם עגבניות ותפוח ותת היחידות של הפקטין‬
‫צריכות להיות בלי קבוצות מתיל בשביל שהפקטינאז יוכל לפעול‪ ,‬הנחנו קבוצות הביקורת על צלחת אגר שהכילה פקטין‬
‫לכן בתגובות עם הטיפות שמכילות פקטינאז מגורמים שונים ציפינו לקבל כתמים שקופים או לבנים באזורים שהנחנו בהם‬
‫את הטיפות‪.‬‬
‫התוצאה הטובה ביותר שהייתה היא בצלחת הפקטינאז הקנוי ‪ 10K‬כל הצלחת נהפכה לשקופה חוץ מאזור קטן מכך‬
‫אנחנו מסיקים שקיימת פעילות אנזימתית שפירקה את הפקטין שאר הצלחות לא הראו תוצאות כמו שציפינו‪.‬‬
‫טבלה מס ‪ :1‬יתרונות וחסרונות של שיטות שונות להרצת חלבונים מסוג ‪ ,SDS-PAGE‬זימוגרפיה ו‪:western blot -‬‬

‫חסרונות‬ ‫יתרונות‬ ‫שיטה‬

‫דנטורציה למבנה המרחבי של החלבון ובכך‬ ‫‪)1‬‬ ‫הפרדה של חלבונים שונים על‬ ‫‪)1‬‬ ‫‪SDS-‬‬
‫איבוד הפעולה שלו‪.‬‬ ‫אותו גל‪.‬‬ ‫‪PAGE‬‬
‫אין אפשרות לזיהוי חלבון ספציפי לחלבון מסוים‪.‬‬ ‫‪)2‬‬ ‫זיהוי של גודל החלבונים‬ ‫‪)2‬‬
‫לא ניתן לזהות מהו גודל חלבון בעל מספר תתי‬ ‫‪)3‬‬ ‫בתמיסה על פי המשקל‬
‫יחידות בעזרת שיטה זו בלבד עקב פירוק תתי‬ ‫המולקולרי‪.‬‬
‫היחידות (יש לעבוד בשילוב שיטות)‪.‬‬ ‫איפיון תתי היחידה‪ .‬השונים‬ ‫‪)3‬‬
‫של אותו חלבון‪.‬‬
‫צריך להכיר בעומק את מאפייני האנזים‬ ‫‪)1‬‬ ‫שמירה על מבנה האנזים‬ ‫‪)1‬‬ ‫זימוגרפיה‬
‫אין אפשרות לאבחן תת יחידה בודדת של החלבון‬ ‫‪)2‬‬ ‫אפשרות לבחינת פעילות‬ ‫‪)2‬‬
‫הרביעוני‪( .‬יש להשתמש בשיטה נוספת)‪.‬‬ ‫החלבון לאחר ההפרדה‬
‫ניתן לאבחן רק אנזימים המפרקים סובסטרט יחיד‪.‬‬ ‫‪)3‬‬ ‫וההרצה‪.‬‬
 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫מציאת גודל של החלבון‬ ‫‪)3‬‬

‫השלם ולא רק של כל תת‬
‫יחידה בנפרד‪.‬‬
‫יקרה מבחינה כלכלית‪.‬‬ ‫‪)1‬‬ ‫אפיון חלבונים ספציפיים‪.‬‬ ‫‪)1‬‬ ‫‪western‬‬
‫צריך הרבה ידע על החלבון הנבדק והתגובות‬ ‫‪)2‬‬ ‫אפשרות לזיהוי חלבונים חסרי‬ ‫‪)2‬‬ ‫‪blot‬‬
‫שלו‪.‬‬ ‫פעילות‪.‬‬
‫דורשת הרבה זמן ותנאים מדוייקים‪.‬‬ ‫‪)3‬‬

‫נספחים‪:‬‬
‫טבלה מס ‪ :2‬הרצת הג'לים בשיטת ה ‪SDS-PAGE‬‬

‫מס‬
‫‪G4‬‬ ‫‪G3‬‬ ‫‪G2‬‬ ‫‪G1‬‬
‫בארית‬
‫סטנדרט גודל ‪6‬‬ ‫משקע מורחף של‬ ‫משקע מורחף של‬
‫משקע מורחף של ‪25%‬‬ ‫‪1‬‬
‫מק"ל‬ ‫‪25%‬‬ ‫‪25%‬‬
‫משקע מורחף של‬ ‫משקע מורחף של‬ ‫משקע מורחף של‬
‫משקע מורחף של ‪50%‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪25%‬‬ ‫‪50%‬‬ ‫‪50%‬‬
‫משקע מורחף של‬ ‫משקע מורחף של‬ ‫משקע מורחף של‬
‫משקע מורחף של ‪75%‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪50%‬‬ ‫‪75%‬‬ ‫‪75%‬‬
‫משקע מורחף של‬
‫חלבון ביצה‬ ‫חלבון ביצה‬ ‫חלבון ביצה‬ ‫‪4‬‬
‫‪75%‬‬
‫משקע מורחף של‬
‫חלב‬ ‫חלב‬ ‫חלב‬ ‫‪5‬‬
‫‪25%‬‬
‫משקע מורחף של‬
‫קזאין‬ ‫קזאין‬ ‫קזאין‬ ‫‪6‬‬
‫‪50%‬‬
‫משקע מורחף של‬
‫סטנדרט גודל ‪ 6‬מק"ל בופר הטענה ‪ 5‬מק"ל‬ ‫גבן‬ ‫‪7‬‬
‫‪75%‬‬
‫משקע מורחף של‬
‫סטנדרט גודל ‪ 6‬מק"ל‬ ‫גבן‬ ‫מי גבינה‬ ‫‪8‬‬
‫‪25%‬‬
‫אגוז מלך‬ ‫גבן‬ ‫מי גבינה‬ ‫סטנדרט גודל ‪ 6‬מק"ל‬ ‫‪9‬‬
‫טחינה‬ ‫מי גבינה‬ ‫בופר הטענה ‪ 5‬מק"ל בופר הטענה ‪ 5‬מק"ל‬ ‫‪10‬‬

‫טבלה מס ‪ :3‬סדר הרצת הג'לים בשימוש ב‪UV‬‬

 ‫אור דואק ‪205731417 :‬‬
‫דנה שוגן ‪212923254 :‬‬
‫ג'נאן חטיב ‪211400536 :‬‬
‫יוסף קדח ‪322514126:‬‬
‫בושרא מורעב ‪211517610 :‬‬
‫עדן סבח ‪206681843 :‬‬

‫מס בארית‬ ‫‪G1‬‬ ‫‪G2‬‬

‫‪1‬‬ ‫משקע מורחף של ‪25%‬‬ ‫משקע מורחף של ‪25%‬‬
‫‪2‬‬ ‫משקע מורחף של ‪50%‬‬ ‫משקע מורחף של ‪50%‬‬
‫‪3‬‬ ‫משקע מורחף של ‪75%‬‬ ‫משקע מורחף של ‪75%‬‬
‫‪4‬‬ ‫חלבון ביצה‬ ‫חלבון ביצה‬
‫‪5‬‬ ‫חלב‬ ‫חלב‬
‫‪6‬‬ ‫קזאין‬ ‫קזאין‬
‫‪7‬‬ ‫גבן‬ ‫גבן‬
‫‪8‬‬ ‫מי גבינה‬ ‫מי גבינה‬
‫‪9‬‬ ‫סטנדרט גודל‬ ‫סטנדרט גודל‬
‫‪10‬‬ ‫בופר הטענה‬ ‫בופר הטענה‬